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Manual de Inmunología
Manual de Inmunología
MANUAL DE LABORATORIO DE
INMUNOLOGÍA
AUTORES:
M. en C. JUAN CARLOS BENITEZ SERRANO
M.S.P. CARLOS CABRERA MALDONADO
M. en C. ALMA LOPEZ GARCÍA
M. en C. LAURA MARTINEZ PEREZ
M. en C. NIDIA GARY PASOS SALAZAR
M. en C. OSCAR PEREZ TORIZ
M. en C. ALEJANDRO CESAR RUIZ TAGLE
2013
1
INDICE
Práctica 1 Diluciones 3
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BENÉMERITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
PRÁCTICA No. 1
DILUCIONES
Introducción
Se les llama diluciones a las soluciones con concentración menor obtenidas al agregar
volúmenes conocidos de diluyente a una solución de concentración conocida. Las diluciones
se expresan en forma de una proporción, por ejemplo 1/10 (1:10) donde la primera cifra o
numerador (1) corresponde al volumen de lo que se está diluyendo y la segunda cifra o
denominador (10) al volumen total en que se encuentra.
Objetivo
Aprenderá a calcular diluciones en forma directa o en serie.
Desarrollo
Así, una dilución 1/10 indica que se tiene un volumen de la solución original contenido o
diluido en 10 volúmenes totales, de los cuales 9 corresponden al diluyente. Dado que en una
dilución lo que se indica es la relación entre el volumen de la solución original y el volumen
total en que se encuentra, una dilución 1/10 puede prepararse de diferentes maneras:
Por ejemplo:
1 mL de muestra en 9 mL de diluyente
0.1 mL de muestra en 0.9 mL de diluyente
0.5 mL de muestra en 4.5 mL de diluyente
3
Dilución directa.
Para realizar una dilución directa se puede hacer uso de la siguiente expresión:
Así:
1/10=5 mL/Vt
despejando Vt tenemos que Vt=10 x 5/1=50 mL
volumen de diluyente = volumen total-volumen de muestra
volumen de muestra = 50-5 = 45 mL
Ejemplo N°2
Prepare exactamente 200 mL de una dilución 1/50.
Sustituyendo los valores conocidos tenemos:
1/d=1/50
Vm=?
Vt= 200 mL
Así:
1/50=Vm/200
Despejando Vm tenemos que Vm=200 x 1/50=4 mL
Volumen de diluyente = volumen total-volumen de muestra
Volumen de diluyente = 200-4=196 mL
4
Sin embargo, las diluciones directas tienen el inconveniente de que cuando es
necesario hacer una dilución alta por ejemplo 1/ 10 000, se desperdicia mucho reactivo o se
incurre en un error de medición. Así, una dilución 1/ 10 000 se prepararía con 1 mL de
muestra y 9 999 mL de diluyente o bien 9.999 mL de diluyente y 0.001 mL de muestra.
Dilución seriada
Este tipo de dilución soluciona los inconvenientes que presenta el cálculo directo de
las diluciones altas. Además, en microbiología permite el cálculo de la población microbiana
en la muestra de estudio, de la cual se toma una alícuota que se diluye en varios tubos y se
siembra por vertido en placa (ver figura 1). La diferencia entre la dilución de dos tubos
consecutivo se conoce como factor de dilución, siendo 2, 4 y 10 los más usados. En el
ejemplo de la dilución 1/ 10 000, la muestra se puede diluir 1/ 100 (Vm= 0.1 mL + 9.9 de
diluyente Vt= 10 mL) en un primer tubo y colocar 0.1 mL de esta dilución en un segundo
tubo con 9.9 de diluyente. El segundo tubo tendrá una dilución 1/ 100, sin embargo como la
muestra ya se encuentra diluida previamente 1/ 100, multiplicando sus denominadores
tenemos:
1/ 100 x 1/ 100= 1/ 10 000
5
Figura 1.Esquema e diluciones seriadas
En este caso el factor de dilución es de 100. Debe insistirse en que solo el primer tubo
lleva la alícuota de la muestra sin diluir, los demás tubos toman la alícuota ya diluida del tubo
previo. El número de tubos y las diluciones intermedias se plantean considerando el volumen
de los tubos así como el volumen mínimo que se puede medir fácil y exactamente con las
pipetas disponibles.
Cuestionario
1. ¿Cómo lograr exactamente 40 mL de una dilución 1:40000?
2. Obtener 60 mL de una dilución 108
3. Prepara 5 mL de una dilución 1:100000, utilizando diluciones seriadas
4. ¿Qué dilución se obtendrá si mezclo 2 mL de muestra en 58 mL de diluyente?
5. Para realizar diferentes pruebas de diagnóstico, usted requiere 500 µl de una dilución
1:30 000 de una muestra de suero y solamente cuenta con 4 mL de solvente.
Utilizando diluciones seriadas indique como obtendría dicha dilución.
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DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
PRÁCTICA No. 2
TOMA DE MUESTRA
Introducción
En el laboratorio de inmunología la muestra a estudiar es principalmente sangre y sus
derivados suero o plasma. En el plasma o suero se determina principalmente la presencia de
anticuerpos, los cuales desde el descubrimiento de la alta especificidad de las reacciones
antígeno-anticuerpo (Ag-Ac), se comprueban con propósitos de diagnóstico
(inmunodiagnóstico).
Objetivo
Aprender el procedimiento apropiado para la obtención de sangre venosa de las venas del
dobles del codo.
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Desarrollo
Obtención de muestra de sangre. Para efectuar análisis serológicos, las muestras de sangre
pueden ser de sangre capilar o periférica y de sangre venosa. Sangre capilar o periférica. La
sangre capilar o periférica es la que fluye después de aplicar una punción superficial cutánea.
Se puede obtener de la yema del dedo. Algunas pruebas pueden realizarse con sangre capilar
o periférica y se aconseja cuando no es posible obtener una muestra de sangre venosa o no se
desea puncionar la vena.
Sangre venosa. Esta muestra se obtiene por punción de una de las tres venas del
pliegue del codo: la basílica, la cefálica o la mediana cubital. Se emplean jeringas desechables
con agujas de tipo 21x32, 20x32 o el sistema para la extracción de sangre intravenosa al vacío
Vacuntainer . Previamente se realiza la limpieza del área elegida con torunda y alcohol.
Antes de puncionar se coloca el torniquete aproximadamente a 8 cm de distancia arriba del
pliegue del codo. No debe olvidar soltarlo tan pronto empiece a obtenerse la muestra. La
cantidad máxima de sangre a extraer será estrictamente la necesaria para las pruebas.
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Figura 2. Tubos del sistema vacutainer
Cuestionario
1. Explique la diferencia entre suero y plasma.
2. ¿Es importante solicitarle al paciente que se presente en condiciones de ayuno para la
realización de pruebas diagnósticas no metabólicas?
3. Mencione pruebas de laboratorio en donde se utilice plasma y en donde se requiera de
suero.
4. ¿Qué concentración de NaCl se usa en la preparación de solución salina isotónica?
5. Mencione los factores que pueden causar hemólisis en las muestras.
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PRÁCTICA No. 3
CUENTA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS
Introducción
Los cinco principales tipos de leucocitos son los neutrófilos (50-70%), los eosinófilos (1-5%),
basófilos (0.5-1.0%), linfocitos (20-30%), y monocitos (2 –6%). Por cuenta diferencial se
entiende la determinación del porcentaje relativo de cada tipo de leucocito en una muestra de
sangre. Se realiza en extendidos (frotis) preparados cuidadosamente y teñidos con colorantes
tales como Wright, el cual tiñe el núcleo de los leucocitos de un color púrpura que facilita la
diferenciación (ver figura 3).
Objetivo
Identificar los diferentes tipos de leucocitos en un frote teñido
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Material y equipo
Portaobjetos
Lancetas desechables
Algodón
Colorante de Wright
Solución reguladora pH 6.4
Microscopio
Desarrollo
1. A partir de la muestra de sangre preparar 2 extendidos (frotis) siguiendo las
indicaciones del instructor.
2. Dejar secar completamente los frotis, colocar en un puente de tinción y cubrirlos
(contar el número de gotas) con colorante de Wright. Dejar el colorante 1 minuto y
añadir el mismo número de gotas de solución reguladora pH 6.4 durante 8 minutos.
3. Lavar suavemente la preparación por 30 segundos y secar el exceso de agua.
4. Cuando la preparación esté completamente seca, colocar una gota de aceite de
inmersión y observar al microscopio.
5. Para facilitar la identificación consultar las láminas a color que ilustran los diferentes
leucocitos.
Cuestionario
1. Elabore una tabla que muestre la principal participación en la respuesta inmunitaria de
cada una de las células blancas.
2. Investigue otra técnica de tinción diferente a la de Wright.
3. Señale los porcentajes normales de los diferentes tipos de leucocitos que se encuentran
en sangre.
4. Indique cual es la población de leucocitos que predominantemente aumenta en el caso
de infecciones causadas por bacterias, parásitos, hongos, virus.
5. ¿Qué indicaría una neutrofilia en un paciente?
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PRÁCTICA No. 4
DETERMINACIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO
Introducción
Alrededor de 1900 Karl Landsteiner descubrió que en el humano existen cuatro tipos de
sangres con respecto a la presencia o ausencia de dos antígenos específicos denominados A y
B. Estos cuatro grupos se conocen actualmente como tipos A, B, AB y O. Este último se
caracteriza por la ausencia de los antígenos A y B. En 1940 Landsteiner y Wiener reportaron
que el suero de conejo producido contra eritrocitos de mono Rhesus podía aglutinar los
eritrocitos del 85% de una población caucásica. Este antígeno se designó inicialmente como
factor Rh, posteriormente se encontró que existe como seis antígenos a los cuales Fisher y
Race designaron con letras C, D, E, c, d, e. Uno de estos antígenos, el D es responsable de la
condición Rh positivo. La tipificación de eritrocitos en el laboratorio se realiza con antisueros
específicos contra los antígenos A, B y D, y puede realizarse por métodos en tubo o en
portaobjetos (ver figura 4).
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Objetivo
Demostrar por medio de una reacción de aglutinación la presencia de los Ag eritrocitarios A,
B y D.
Materiales y equipo
Muestras de sangre con anticoagulante
Pipetas graduadas de 1 y 5 mL
Tubos de ensayo de 10 X 75 mm
Solución salina isotónica
Lancetas desechables
Aplicadores de madera o palillos
Sueros tipificadores anti-A
anti-B
anti-D (Rh)
Placa oscilatoria
Desarrollo
Método en tubo
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10. Se agrega una gota del suero de Coombs y se agita suavemente, se centrífuga y se
busca la aglutinación
Interpretación:
Si aglutina en el paso 6 es Rh positivo
Si aglutina en el paso 10 es Du
Si persiste la negatividad es Rh negativo.
Método en portaobjetos
Cuestionario
1. ¿Cuántos sistemas existen para clasificar a la sangre?
2. ¿Cómo defines aglutinación y cuáles son sus ventajas y desventajas?
3. ¿Puede una persona de grupo A y una B tener como descendencia a un hijo de grupo
O? Explique
4. Mencione las ventajas y desventajas de determinar el grupo sanguíneo por los dos
métodos empleados en la práctica.
5. ¿Qué es el factor Du y qué función tiene el suero de Coombs?
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PRÁCTICA No. 5
DETERMINACIÓN DEL TITULO DE ANTICUERPOS ABO DEL
SUERO.
Introducción
El sistema de grupo sanguíneo ABO posee una característica única; la presencia de
anticuerpos fuertemente reactivos en el suero de los que carecen de los antígenos
correspondientes. Estos anticuerpos pertenecen a la clase IgM y son producidos en respuesta
a una inmunización. Se dice que estos anticuerpos se producen de manera “natural” en base
a que los inmunógenos son probablemente de origen bacteriano, dado que algunas bacterias
presentan sustancias similares a los antígenos A o B.
Objetivo
Establecer a través de diluciones seriadas el concepto de título aplicado en las reacciones
serológicas
Material
Suspensión de eritrocitos de grupo A o B al 5 % en SSI
Suero (plasma) de grupo O
Pipetas graduadas de 1 y 5 mL
Tubos de ensayo de 10 X 75 mm
Solución salina isotónica
Lancetas desechables
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Aplicadores de madera o palillos
Sueros tipificadores anti-A
anti-B
Desarrollo
1. Colocar en una gradilla una serie de 6 tubos rotulados del 1 al 6 y se agregar 0.1 mL
de solución salina cada uno de ellos.
2. Agregar 0.1 mL del suero problema al tubo n° 1, mezclar bien y transferir 0.1 mL al
tubo n° 2 y así sucesivamente hasta el tubo n° 6 del cual se desechan 0.1 mL.
3. Agregar 4 gotas de la suspensión de eritrocitos a cada tubo y mezclar.
4. Incubar a 37°C por 15 minutos, mezclan suavemente y centrifugar a 1000 r.p.m.
durante 1 minuto.
5. Desprender el botón suavemente y buscar la presencia de aglutinación.
Interpretación
Cuestionario
1. ¿Cuál es la dilución utilizada en cada uno de los tubos?
2. Explique porqué puede variar el título de Ac en la muestra para cada paciente
3. ¿Qué es lo que se diluye en cada uno de los tubos para la cuantificación, los Ac o los
eritrocitos?
4. Porque es importante determinar el título de anticuerpos en una muestra serológica.
5. Cite tres ejemplos de pruebas serológicas donde la determinación del título de
anticuerpos ayude en el diagnóstico y vigilancia de una determinada enfermedad.
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PRÁCTICA No. 6
PRUEBAS CRUZADAS
Introducción
El objetivo de una transfusión es el proporcionar al paciente (receptor) el tipo preciso de
sangre. Por supuesto este objetivo es difícil de lograr, pero es posible aproximarse mucho si
se realizan las pruebas correctas de hemaglutinación. En primer lugar, deben determinarse con
exactitud los anfígenos de los grupos sanguíneos principales: el grupo ABO y el Rh del
paciente, sobre la base de estos grupos se selecciona la unidad de sangre de grupo ABO y Rh
compatible y se procede a efectuar las denominadas pruebas cruzadas mayor y menor.
Objetivo
Realizar las pruebas de compatibilidad sanguínea denominadas “Pruebas Cruzadas”
Material
Muestras de sangre con y sin anticoagulante
Pipetas graduadas de 1 mL y 5 mL
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8 tubos de ensaye de 10 X 75 mm
Solución salina isotónica.
Baño serológico
Centrífuga
Solución de albúmina bovina al 10%
Desarrollo
1. Se obtiene una muestra de sangre del donador y receptor y se procede igual a lo
descrito en los incisos 1 y 2 de la práctica anterior.
2. Se disponen 4 tubos etiquetados como sigue:
PM/S =Prueba Mayor en solución salina
pm/s =Prueba Menor en solución salina
PM/A =Prueba Mayor en albúmina
pm/a =Prueba Menor en albúmina
3. Se agregan a cada tubo los siguientes reactivos en el orden indicado:
PM/S. 2 gotas del suero del receptor + 4 gotas de eritrocitos (al 5%) del donador
pm/s. 2 gotas del suero del donador + 4 gotas de eritrocitos (al 5%) del receptor
PM/A. 2 gotas del suero del receptor + 4 gotas de albúmina + 1 gota de eritrocitos (al
5%) del donador
pm/a. 2 gotas del suero del donador + 4 gotas de albúmina + 1 gota de eritrocitos (al
5%) del receptor
4. Se mezclan bien y se incuban a 37°C por 30 minutos.
5. Se centrifugan 1 minuto a 2000 r.p.m. y se busca la presencia de aglutinación.
6. En caso de que no se presente la aglutinación, los tubos se centrifugan nuevamente y
se descarta el sobrenadante. Se lava el paquete celular de cada tubo con 1 mL de
solución salina y se centrifuga nuevamente descartando el sobrenadante. Repetir el
lavado 2 veces.
7. Al paquete celular se le agrega un agota del suero de Coombs y se busca la presencia
de hemaglutinación.
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Figura 5. Compatibilidad entre grupos sanguíneos
Interpretación:
Si hay aglutinación en cualquiera de los tubos, será indicativo de que hay
incompatibilidad entre el posible donador y el receptor (paciente). Si no la hay, las sangres
son compatibles.
Cuestionario
1. ¿Qué significa una prueba cruzada positiva y una negativa?
2. ¿Qué factores pueden interferir en los resultados de una prueba cruzada?
3. ¿Qué características debe tener un donador sanguíneo ideal?
4. ¿Cuál es el objetivo de utilizar a la albúmina?
5. ¿Porque a las personas con grupo O Rh positivo se les conoce como donadores
universales? ¿Esto es correcto?
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PRÁCTICA No. 7
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE INFECCIÓNES BACTERIANAS
(REACCIONES FEBRILES)
Introducción
La aglutinación de células bacterianas con antisueros es una de las pruebas serológicas más
antiguas de la inmunología práctica. Se inició como un método para el diagnóstico de las
infecciones bacterianas y fue propuesta por Widal en 1896. La pruebas de aglutinación
bacteriana tienen dos aplicaciones principales en el diagnóstico; las células bacterianas
desconocidas pueden identificarse por medio de anticuerpos conocidos, o bien utilizando
bacterias conocidas pueden identificarse los anticuerpos en el suero del paciente.
Objetivo
Demostrar en el suero problema anticuerpos contra los antígenos bacterianos.
Material
Muestras de sueros problema
Placa de vidrio marcada en 6 cuadros
Pipetas graduadas de 1 y 0.2 mL
Pipeta Pasteur
Placa oscilatoria
Equipo con antígenos:
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“O” de Salmonella typhi
“H” de Salmonella typhi
“H” de Salmonella enteritidis Paratyphi A
“H” de Salmonella enteritidis Paratyphi B
Brucella abortus
Proteus OX-19
Desarrollo:
1. En una placa de vidrio perfectamente limpia se depositan 0.08 mL del suero problema
en cada una de las seis divisiones.
2. Se agrega una gota de cada antígeno comenzando por la izquierda arriba, respetando el
orden establecido.
3. Se mezclan las gotas con palillos diferentes y se agita suavemente en la placa de
rotación durante dos minutos.
4. La lectura se hace observando la aglutinación macroscópica.
5. Si aparece aglutinación con alguno de los antígenos, continuar con el siguiente paso.
6. Se toma otra placa y se depositan 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, y 0.005 mL del suero
problema.
7. Se agrega una gota del antígeno seleccionado, se mezclan con un palillo y se revisa la
presencia de aglutinación.
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Interpretación:
Cuestionario
1. ¿Cuál es el fundamento del método para la determinación de las reacciones febriles y
mencione 3 enfermedades que se diagnostiquen por este método?
2. ¿Cuál sería un título clínicamente significativo en las reacciones febriles y como se
interpretaría?
3. ¿Cuál es la razón de utilizar una suspensión de Proteus OX-19 para el diagnóstico de
tifo?
4. ¿Por qué se dice que es un método cuantitativo?
5. Además de las reacciones febriles, que otras pruebas de laboratorio de deben realizar
para diagnosticar Salmonelosis y Brucelosis.
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PRÁCTICA No. 8
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE SIFILIS
(Prueba Rápida de Reagina, RPR)
Introducción
La prueba de RPR es una prueba de floculación no treponémica macroscópica que es utilizada
para detectar y cuantificar reaginas, un anticuerpo anti-lipídico encontrado en el suero o
plasma de personas con sífilis y ocasionalmente en personas con infecciones agudas o
crónicas en otras condiciones aparte de la sífilis.
Objetivo
Demostrar en el suero problema anticuerpos anti-lipídicos de personas con sífilis.
Material
Muestras de sueros problema
Tarjetas de Prueba (círculos de aproximadamente de 18 mm)
Pipetas graduadas de 1 y 0.2 mL
Equipo con antígeno: Suspensión de Antígeno RPR conteniendo micropartículas de carbón
activado.
Control Positivo RPR.
Control Negativo RPR.
Rotador mecánico
Lámpara
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Desarrollo
Procedimiento cualitativo
1. Lleve a temperatura ambiente la suspensión del antígeno de RPR, los controles y las
muestras.
7. Transcurrido este tiempo retire la tarjeta del rotador y agítela breve y suavemente.
Interpretación
Reactivo: Presencia de flóculos grandes o pequeños en el centro o la periferia del
círculo de prueba.
Débil reactivo: Presencia de flóculos pequeños pero definidos.
No reactivo: Apariencia lisa, uniforme pero sin flóculos visibles.
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Los resultados positivos deben ser confirmados mediante pruebas de las muestras
utilizando procedimientos cuantitativos. Se recomiendan pruebas serológicas confirmativas
como el ensayo de microhemaglutinación para anticuerpos treponémicos (MHA-TP). El
diagnóstico final debe estar en base a la correlación de los resultados de prueba junto con
otros hallazgos clínicos.
Procedimiento cuantitativo
1. Seleccione los sueros positivos obtenidos en la prueba cualitativa.
2. Colocar en una gradilla cuatro tubos 12 x 75 mm y numerarlos.
3. Agregar a cada uno de ellos 0.5 mL de solución salina.
4. Depositar 0.5 mL de suero problema en el tubo No. 1 y mezclar.
5. Pasar 0.5 mL del tubo No. 1 al tubo No. 2 y mezclar.
6. Continuar esta operación hasta el tubo No. 4.
7. Depositar 0.05 mL de cada una de las diluciones sobre anillos diferentes de la placa de
reacción. Extienda sobre el total de la superficie de cada círculo donde se colocaron
las diluciones.
8. Añadir una gota de la suspensión del antígeno previamente resuspendido, exactamente
sobre cada una de las gotas de las diluciones anteriores utilizando el frasco gotero al
cual se le ha insertado la aguja No. 18 sin bisel.
9. Agite por 8 min a 100 rpm en un rotador mecánico.
10. Transcurrido este tiempo retire la tarjeta del rotador y agítela breve y suavemente.
11. Leer el resultado macroscópicamente.
Interpretación
La última dilución que contenga agregados macroscópicos indica el título de la muestra (ver
tabla 1).
Tabla 1. Ejemplo de lectura para obtener el título
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El título del suero problema será: 1:8.
Limitaciones de la prueba
Cuestionario
1. Menciona al agente etiológico de la sífilis y menciona las características de la
enfermedad, tomando en cuenta signos y síntomas del paciente
2. ¿Porque se han clasificado las pruebas para el diagnóstico de sífilis en treponémicas y
no treponémicas?, menciona una de cada una
3. Menciona el fundamento del VDRL e indica algún caso en donde sea solicitada la
prueba 4.- ¿Qué ventajas tiene la prueba de RPR sobre el VDRL?
4. ¿Qué enfermedades pueden dar resultados falsos positivos en las pruebas no
treponémicas.?
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PRÁCTICA No. 9
FACTOR REUMATOIDE
Introducción.
Los factores reumatoides son anticuerpos dirigidos contra los determinantes antigénicos de la
región Fc de las IgG. En personas sanas, estos anticuerpos pueden hallarse en baja
concentración, sin embargo se encuentra aumentado en la mayoría de los pacientes con artritis
reumatoide. La determinación del factor reumatoide se lleva a cabo con partículas de latex
cubiertas de IgG.
Objetivo
Realizar la determinación del Factor Reumatoide por aglutinación en placa.
Material y equipo
Muestras de sueros
Placa de vidrio oscuro marcada
Pipetas graduadas de 1 y 0.2 mL
Aplicadores de madera o palillos
Pipeta Pasteur
Reactivo de latex-FR
Solución amortiguadora de glicina-cloruro de sodio pH 8.2
Solución salina isotónica
Placa rotatoria
Desarrollo
Factor Reumatoide (FR). Por el método de aglutinación en látex en placa, utiliza una
suspensión estabilizada de partículas de látex sensibilizadas con IgG humana.
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1. El suero se inactiva previamente calentando en baño serológico a 56°C por 15 min o
60°C por 1 min. Ya inactivado se diluye 1:20 con amortiguador de glicina-cloruro de
sodio colocando 0.1 mL de suero y 1.9 mL del amortiguador.
2. Se coloca una gota de la dilución en la placa de vidrio oscura y se añade una gota del
reactivo látex-FR.
3. Se mezcla y se agita suavemente en la placa rotatoria durante dos minutos.
4. Se busca la aglutinación macroscópica.
5. La prueba semicuantitativa utiliza diluciones del suero 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y
1/640, las cuales se preparan con 0.5 mL de la dilución 1/20 en 0.5 mL del
amortiguador para una dilución 1/40 y así consecutivamente.
Cuestionario
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PRÁCTICA No. 10
PROTEINA C REACTIVA
Introducción
La Proteína C reactiva forma parte de las proteínas de fase aguda, un conjunto de proteínas
del suero cuya concentración aumenta de manera drástica durante el daño tisular, la infección
o el estrés. No es específica de una enfermedad sino que es un indicador del proceso
inflamatorio.
Material
Muestras de sueros
Placa de vidrio oscuro marcada
Pipetas graduadas de 1 y 0.2 mL
Aplicadores de madera o palillos
Pipeta Pasteur
Reactivo de látex- Proteína C reactiva
Solución amortiguadora de glicina-cloruro de sodio pH 8.2
Solución salina isotónica
Placa rotatoria
Desarrollo
Proteína C reactiva (PCR). Por el método de aglutinación en látex en placa. Utiliza una
suspensión acuosa de partículas de látex recubiertas de anticuerpos específicos anti- Proteína
C reactiva.
1. El suero problema se diluye 1/5, 1/40 con solución salina isotónica y se coloca una
gota de la dilución en una placa de vidrio oscuro.
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2. Se añade una gota del reactivo latex-PCR se mezcla bien y se agita suavemente en la
placa rotatoria por 3 min.
3. Se busca la aglutinación macroscópica.
4. La prueba semicuantitativa utiliza diluciones del suero a partir de 1/80.
Cuestionario
1. ¿Qué es la proteína C reactiva y explique el fundamento de la prueba?
2. Indique de que están hechos los controles positivos y negativos para la prueba de
proteína C reactiva
3. Explique cómo se calcula el título para PCR
4. Explique el significado clínico de una prueba PCR positiva
5. ¿Cuál es el valor diagnóstico de la Proteína C reactiva?
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PRÁCTICA No. 11
DETERMINACIÓN DE ANTIESTREPTOLISINAS
Introducción
Las estreptolisinas son enzimas hemolíticas producidas por la mayoría de los estreptococos
del grupo A, destruyen la membrana de los eritrocitos ocasionando la hemólisis. Este
producto bacteriano es una de las muchas toxinas extracelulares y enzimas producidas por los
estreptococos.
Objetivo
Determinar el título de anticuerpos contra la estreptolisina “O” en el suero problema
Material
Muestras de suero
Suspensión de eritrocitos al 5%
Amortiguador para ASO (fosfatos pH 6.5)
Estreptolisina O
Baño serológico
Centrífuga
Pipetas graduadas de 1 mL y 5 mL
15 tubos de ensaye de 10 X 75 mm
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Desarrollo
1. Preparar a partir del suero problema las siguientes diluciones iniciales:
a) 1:10 con 0.2 mL del suero problema + 1.8 mL de solución amortiguadora
b) 1:100 con 0.3 mL de la dilución 1:10 + 2.7 mL de solución amortiguadora
c) 1:500 con 0.6 mL de la dilución 1:100 + 2.4 mL de solución amortiguadora
2. Rotular los tubos de ensaye con números del 1 al 12 y dos más como control (+) y
control (-).
3. Preparar diluciones secundarias añadiendo primero el volumen de solución
amortiguadora y posteriormente el volumen del suero diluido según se indica en la
tabla 2.
mL amortiguador 0.1 0.4 --- 0.1 0.2 0.3 0.35 --- 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.75
mL suero diluido 0.4 0.1 0.5 0.4 0.3 0.2 0.15 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 --- ---
Unidades Todd 12 50 100 125 166 250 333 500 625 833 1250 2500
Cuestionario
1. ¿Qué son las antiestreptolisinas e indica el fundamento de la prueba?
2. Menciona dos motivos para montar el control negativo y dos motivos para montar el
control positivo
3. ¿Por qué la enzima estreptolisina se tiene que activar en el momento de utilizarla?
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4. ¿A partir de qué dilución, un suero positivo se considera sugestivo de infección por
Streptococcus?
5. ¿Qué complicaciones pueden presentarse debido a una infección por Streptococcus
pyogenes?
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BENÉMERITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
PRÁCTICA No. 12
DETERMINACIÓN DE LA HORMONA GONADOTROPINA
CORIONICA HUMANA
Introducción
Las pruebas de laboratorio para el diagnóstico del embarazo se basan en la determinación de
la gonadotropina coriónica humana (hGC), hormona producida por la placenta y que puede
detectarse tanto en el suero como en la orina. La excreción de hGC alcanza su máximo
durante la duodécima a decimocuarta semana de gestación y a partir de entonces desciende de
nivel. Hasta los años 60, las pruebas de embarazo eran bioensayos en los cuales la presencia
de la hGC en el suero o en la orina se demostraba por su efecto en animales.
Las primeras pruebas utilizaban ratones y conejos, las pruebas ulteriores ratas hembra
o ranas. Actualmente estas pruebas han sido sustituidas por pruebas inmunológicas. Las
pruebas inmunológicas dependen del anticuerpo anti-hGC. La presencia de hGC en el suero u
orina se demuestra por un sistema indicador.
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detectar concentraciones menores de hGC, por ejemplo las pruebas con eritrocitos tienden a
ser más sensibles que la que emplean partículas de látex.
Objetivo
Determinar la presencia de la hormona Gonadotropina Coriónica Humana en una muestra de
orina.
Material
Muestra de Orina (10 mL)
Muestra de suero
Equipo de diagnóstico de hGC
Desarrollo
El método que se utilizará en esta práctica es un inmunoensayo de flujo lateral. (STICK
hGC). El método utiliza una combinación única de conjugado anticuerpo monoclonal y
anticuerpos policlonales en fase sólida. La sensibilidad del método es de 10 mIU/mL. El
método consiste en introducir la tira reactiva en la orina centrifugada hasta la marca,
esperando a que migre hasta la marca superior por medio de capilaridad. El conjugado
anticuerpo-colorante se une a la hGC formando un complejo anticuerpo-antígeno. Este
complejo se une al Anti-hGC que se encuentra fijo en la zona de prueba generando una banda
color rosa. En ausencia de la hormona no se forma este complejo. La mezcla de reacción
continúa migrando a lo largo de la tira hasta la zona control. El conjugado libre aún, se une a
los anticuerpos fijos contra la fracción FC de los anti-hGC dando lugar a una banda rosa,
demostrando que el reactivo está funcionando correctamente y que migro por toda la tira (ver
figura 7).
Interpretación
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Prueba negativa: Si solo aparece una banda coloreada transversal en la zona control.
Prueba positiva: Además de la banda en la zona control debe aparecer una segunda banda
en la zona prueba de la tira.
No válido: Si no aparece la banda en la zona control
Zona control
Zona prueba
NEGATIVO POSITIVO
Figura 7. Interpretación de la tira reactiva
Cuestionario
1. Mencione otros métodos serológicos para determinar la hormona hGC
2. Investigue que tipo de sustancias presentes en la orina de la paciente pueden interferir
y dar un resultado falsamente positivo
3. Indique la diferencia en determinar la hormona, en una muestra de orina o en una
muestra de suero
4. ¿Cuál es la estructura de la hGC y hacia qué subunidad están dirigidas las pruebas de
embarazo?
5. En qué casos diferentes a embarazo la hGC podrá resultar positiva
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BIBLIOGRAFÍA
2. Janeway, C. A. and Travers P. 1996. Immunobiology the immune system in health and
disease. 2ª Edición. Current Biology-Garland.
6. Roitt, I., Brostoff, J. and Male D. 2000. Inmunología 5ª edición. Ediciones Harcourt.
España
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