CROMATOGRAFIA

Contenido
1. INTRODUCCIN ...........................................................................................................................2
2. MARCO TEORICO .......................................................................................................................2
2.1. CROMATGRAFO GAS LQUIDO (GLC) ....................................................................3
2.2. CROMATOLOGA IONICA .................................................................................................5
2.2.1. FUNDAMENTO .............................................................................................................5
2.2.2. PROPIEDADES DE LOS INTERCAMBIADORES INICOS ................................6
2.2.3. PROCEDIMIENTO ........................................................................................................6
2.2.4. FACTORES QUE AFECTAN LA RETENCIN .......................................................7
2.2.5. INSTRUMENTACIN ...................................................................................................9
2.2.6. APLICACIONES ............................................................................................................9
2.3. CROMATOLOGIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION .............................................. 10
2.3.1. INSTRUMENTACIN ................................................................................................ 10
SISTEMA DE SUMINISTRO DE FASE MVIL. ................................................................... 11
2.3.2. LA BOMBA. ................................................................................................................ 11
2.3.3. SISTEMA DE MEZCLA DE FASE MVIL............................................................. 12
2.3.4. SISTEMA DE INYECCIN. ...................................................................................... 13
2.3.5. CONDUCCIONES Y CONEXIONES....................................................................... 14
2.3.6. DETECTORES. .......................................................................................................... 14
2.3.7. La columna................................................................................................................. 15
3. CONCLUSIN ............................................................................................................................ 17

Ilustracin 1: Diagrama de bloques de un cromatgrafo de gas lquido (GLC) ....................... 4

Ilustracin 2: Principio bsico de la cromatografa de intercambio inico ............................... 5
Ilustracin 3: Mezclado a alta presin .................................................................................. 13
Ilustracin 4: Mezclado baja presin ................................................................................... 13

Grfico 1: El poder de elusin (fuerza inica) y el porcentaje de protena eluda ................... 8

Grfico 2: Porosidad .............................................................................................................. 9
Grfico 3: Instrumentacin Crom. inica ................................................................................ 9
Grfico 4: Bombas neumticas y elctricas ......................................................................... 12

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Figura 1: Ejemplo de una grabacin de GLC para una anlisis de sangre de niveles de
fenobarbital ............................................................................................................................ 5
Figura 2: Esquema de un cromatgrafo de liquidos ............................................................. 11

CROMATOGRAFIA

1. INTRODUCCIN

La cromatografa, como indica su nombre proviene del griego el cual significa color y registrar
o mejor dicho registro de color, fue empleada originalmente con sustancias coloreadas.

En 1859, Runge comenz a describir algunos principios bsicos de cromatografa, pero luego,
con Mijal Tsvet empleo por primera vez en 1906 el trmino de cromatografa. Esto no fue muy
popular hasta 1931 ya que sus publicaciones estaban en ruso y adems no era muy famoso
la publicadora.

La evolucin de la cromatografa fue muy rpida y dio muchos frutos y avances a la ciencia.
Muchas de las mayores aplicaciones que esta brinda se encuentran en los campos de
bioqumica, medicina, fisiologa y biologa. Actualmente, la cromatografa lquida de alta
resolucin es la tcnica ms empleada.

2. MARCO TEORICO

La cromatologa es bsicamente un grupo de mtodos para separar una mezcla de sustancias

en sus componentes. (Aunque el uso del trmino cromatologa est firmemente establecido,
en realidad es un nombre inapropiado: En modernas tcnicas, los colores de la mezcla de
componentes no son realmente usados para identificar sustancias.) Una fase es fija liquido
o solido y el otro es movible gas o lquido. Cuando una fase de lquido estacionario es
usada, el proceso es llamado particin. Cuando una fase de solido estacionario es usado, el
proceso es llamado absorcin.

En toda la cromatologa, las diferencias en la velocidad de movimiento de

componentes de la mezcla en la fase mvil, causado por una interaccin de estos
componentes con la fase estacionaria, son usadas para separar los componentes. Las cuatro
posibles combinaciones de fases estacionarias y mviles han sido usadas en los mtodos
cromatogrficos.

Desde el punto de vista del laboratorio clnico, estos mtodos son usados
principalmente para la deteccin de sustancias complejas como drogas y hormonas. Por

2
ejemplo, cromatgrafo de gas lquido (GLC) y cromatografa de capa fina (CCF) han sido
usadas para determinar que droga o drogas han sido tomadas en caso de sobredosis. La
habilitacin de esta informacin es de vital importancia para el clnico quien debe seleccionar
una apropiada terapia. Las caractersticas del GLC son presentados aqu como un importante
ejemplo del uso de los mtodos de cromatologa en el laboratorio clnico.

2.1. CROMATGRAFO GAS LQUIDO (GLC)

Los bsicos componentes de un GLC son mostrados en la figura. Antes de ser inyectado en
el GLC, la muestra del paciente generalmente debe someterse a alguna purificacin inicial, la
extensin de la que depende en la determinacin que se est realizado. Las funciones del
mayor de los subsistemas son los siguientes:

Inyector. El inyector es usado para introducir en el GLC de 1 a 5 ml de la muestra del

paciente incluido el solvente en donde est contenido (usualmente un solvente
orgnico voltil). La temperatura del inyector se ajusta para rpida evaporacin (flash-
evaporate) de la muestra y el solvente.
Gas portador. El gas portador inerte (usualmente N2 o He) es la fase mvil de la
cromotografa. Esto barre la muestra evaporada y gas solvente bajo la columna.
Columna. La columna tpicamente es 1 metro de longitud y menos de 7 mm en
dimetro. Esto es llenado con el material de soporte slido (como diatomeas de tierra).
El soporte solido es cubierto con la fase lquida. El pequeo tamao de las slidas
perlas produce la separacin de los componentes. La columna es puesto en un horno
cuya temperatura es cuidadosamente controlada. Un programador de temperatura
gradual incrementa la temperatura de la columna en una secuencia designada para
mxima eficiencia de separacin para el tipo de sustancia que se analiza.
Detector. El detector es localizado al final de la columna. Su funcin es proveer una
salida elctrica proporcional a la cantidad del compuesto en el gas efluente. Un nmero
de tipos de detectores son permitidos para usar con diferentes tipos de muestras. Ellas
incluyen detectores ionizantes, detectores termo-conductivo, y detector de captura de
electrones. Los detectores de ionizacin son los ms comnmente usados en
aplicacin de laboratorio clnico.

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 Suministrador de gas
portador

Control de Presin

Muestra
Inyector Columna Detector Grabador

Control de temperatura

Ilustracin 1: Diagrama de bloques de un cromatgrafo de gas lquido (GLC)

Todos los detectores son sensitivos para clasificar los compuestos, no solo a algunos
compuestos particulares de inters. Por lo tanto, tanto las concentraciones de los
compuestos detectados y los tiempos de duracin de la operacin de la columna
cuando estas concentraciones ocurridas son usadas en determinar los tipos y
cantidades de compuestos presentes en la muestra. La salida del detector est
conectado al grabador.
Grabador. En el grabador, el eje x representa el tiempo, y el eje y la salida del detector.
La grabacin proporciona una visualizacin de ambas en cantidad de un compuesto
que estaba presente y el tiempo al que se extrajo de la columna. Desde esta
informacin, los compuestos presentes pueden ser identificados por el tiempo que
tomaron para salir de la columna o, preferiblemente, por comparar con las grabaciones
obtenidos por compuestos analizados de conocidos compuestos con el GLC.
En la figura 2 muestra una grabacin obtenida desde el anlisis de una muestra
de sangre para los niveles de los importantes frmacos anticonvulsivos fenobarbital y
fenitona. Una moderada cantidad de heptabarbital fue aadido a la muestra para
servir como un estndar interno. El rea bajo los picos de fenobarbital y fenitona es
comparado con el rea bajo el pico de heptabarbital al calcular los niveles de sangre
de esas drogas.
La Cromatologa Gas Lquido ofrece un nmero de ventajas importantes en
el anlisis de compuestos complejos. Ellas incluyen velocidad, habilidad de operar con
pequeas cantidades de muestra, y gran sensibilidad. Muchos instrumentos pueden
completar anlisis de sustancias clnicamente importantes en menos de una 1 hora, y

4
 a menudo en 15 minutos o menos. Solo se necesitan cantidades de mililitros de la
muestra. La sensibilidad del dispositivo depende en el detector usado, pero
instrumentos de alta calidad pueden detectar cantidades de 1 ng del compuesto.

Figura 1: Ejemplo de una grabacin de GLC para una anlisis de sangre de niveles de fenobarbital

2.2. CROMATOLOGA IONICA

La cromatografa de intercambio inico es un mtodo que permite la separacin de molculas

basada en sus propiedades de carga elctrica. Se compone de dos fases: la fase estacionaria
o intercambiador inico, y la fase mvil. La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie
cargas electrostticas fijas, que retienen contracciones mviles que pueden intercambiarse
por iones de la fase mvil, la cual suele ser una disolucin acuosa con cantidades moderadas
de metanol u otro disolvente orgnico miscible con agua que contiene especies inicas
generalmente en forma de buffer. Los iones de sta compiten con los analitos por los sitios
activos de la fase estacionaria.

2.2.1. FUNDAMENTO

El principio bsico de la cromatografa de intercambio inico es que las molculas cargadas

se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas molculas pueden
ser asociadas o disociadas cambiando el ambiente inico. La separacin mediante
intercambiadores inicos se realiza por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias
a separar se unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una unin fuerte y
estable; a continuacin, se eluye de la columna con buffers de diferentes pH o diferente fuerza
inica, compitiendo los componentes del buffer con el material por los sitios de unin. R+ A-
es un intercambiador aninico en la forma A- y B- representa a los aniones en la disolucin.

Ilustracin 2: Principio bsico de la cromatografa de

intercambio inico
2.2.2. PROPIEDADES DE LOS INTERCAMBIADORES INICOS

Un intercambiador inico es, por lo general, un polmero que tiene grupos cargados unidos.
La mayora de las protenas son estables dentro de un margen de pH determinado (es decir,
hay un margen en el que no se desnaturalizan), en el que estn cargadas positiva o
negativamente. Por lo tanto si una protena es estable a valores de pH por encima del punto
isoelctrico, se debe utilizar un intercambiador anicnico. Si es estable a valores de pH
situados por debajo del punto isoelctrico, debe utilizarse un intercambiador catonice.

INTERCAMBIADORES ANINICOS: Son portadores de grupos con cargas positivas

que unen aniones de forma reversible. Si el grupo cargado es positivo, es un
intercambiador de aniones. Los intercambiadores dbilmente bsicos ms corrientes
son los grupos aminos alifticos o aromticos.
INTERCAMBIADOR CATINICO: Los intercambiadores catnicos son portadores de
grupos con carga negativa que unen cationes de modo reversible. Un grupo tpico que
se utiliza en los intercambiadores de cationes es el grupo sulfnico, SO-3. Si se une
un H+ al grupo, se dice que el intercambiador se encuentra en forma cida y puede,
por ejemplo, intercambiar un H+ por un Na+ o dos H+ por un Ca+2. El grupo cido
sulfnico es un intercambiador de cationes fuertemente cido. Otros grupos de
utilizacin corriente son el carbonilo e hidroxilo fenlico, dos intercambiadores
catinicos dbilmente cidos.
2.2.3. PROCEDIMIENTO

Esta tcnica est basada en 4 etapas:

1- Equilibrio:

El primer paso es el equilibrio de la fase estacionaria con las condiciones iniciales deseadas.
Cuando el equilibrio se ha logrado, toda la fase estacionaria se encuentra asociada a iones
complementarios (que pueden ser cloro o sodio). Por ejemplo, un intercambiador catinico
sulfonado asociado a Na+ producto de la disociacin de NaOH.

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2- Aplicacin y Lavado:

El paso siguiente es sembrar la muestra a la cual queremos filtrar a travs de la columna

mediante un lavado especfico. Para ello es necesario aplicar un buffer con el mismo pH y
fuerza inica que el buffer inicial para que todas las protenas cargadas se unan al
intercambiador. Por ejemplo: A la forma sdica de la resina lavada se le aade una solucin
cida (pH=3) de la mezcla de aminocidos; a dicho pH los aminocidos se encuentran en
forma de cationes con carga neta positiva. Los aminocidos catinicos tienden a desplazar
algunos de los iones ligados a las

partculas de resina. A pH 3 los aminocidos ms bsicos se unirn a la resina de forma ms

estrecha que los ms cidos.

3- Elusin:

Las molculas captadas por el intercambiador son eludas debido a cambios en la

composicin del buffer. La elusin puede realizarse de dos formas diferentes; la ms usual
consiste en aumentar progresivamente la concentracin de un contra in, de modo de
desplazar el equilibrio de unin de la macromolcula hacia la forma libre. El contrain es
normalmente una sal, disuelta en eluyente (NaCl, KCl, etc).

Las macromolculas de una mezcla se irn desplazando de manera secuencial, de acuerdo

a la fuerza de unin: las que posean menos densidad de carga eluiran antes, mientras que
para las de mayor carga neta el tiempo de retencin ser mayor.

4- Regeneracin:

Por ltimo, se remueven las partculas que an estn asociadas al intercambiador. Los iones
que se adhieren a los sitios activos de la resina son de muy diferente tipo y pueden ser
removidos total o parcialmente durante el proceso de regeneracin. Una vez agotadas las
resinas, se pueden regenerar a su forma inicial para reanudar la operacin de intercambio.
As, el intercambio inico es un proceso cclico y no continuo. La regeneracin de las resinas
se hace segn reacciones inversas.

2.2.4. FACTORES QUE AFECTAN LA RETENCIN

Tiempo de retencin (Tr): En la cromatografa de intercambio inico la retencin est basada

en la atraccin entre iones del soluto y la carga complementaria de la fase estacionaria. Los
intercambiadores inicos favorecen la unin de iones de mayor carga y radio inferior. Cuando

7
la retencin de los compuestos se ve afectada, se favorece la elusin de ellos para ser
recolectados en una serie de fracciones.

pH: Las resinas cidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy cidas, en
cambio las resinas cidas dbiles se protonan a un pH prximo a 4 y pierden su capacidad de
intercambio catinico, reducindose as, el tiempo de retencin. Los grupos muy bsicos de
amonio cuaternario siguen siendo catinicos a cualquier valor de pH. Los bsicos dbiles de
amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente bsicas y pierden entonces
su capacidad, reducindose tambin el tiempo de retencin.

Cargas: La fuerza de enlace de la muestra depende de la magnitud de la carga. La fuerza de

retencin es mayor y, por consiguiente la de elusin es menor, mientras ms cargado se
encuentre el compuesto, ya sea negativa (aniones) o positivamente (cationes).

Gradiente: Aumentando la concentracin de la fase mvil, los iones compiten cada vez ms
favorablemente con la muestra por los sitios activos cargados de la fase estacionaria.

Grfico 1: El poder de elusin (fuerza inica) y el porcentaje de protena eluda

Esquema del gradiente del Buffer con contraiones cargados negativamente. Se presenta un
grfico con el poder de elusin (fuerza inica) y el porcentaje de protena eluda, que muestra
una gradiente directamente proporcional.

Porosidad: El tamao del poro de la resina al que se une el compuesto mvil por intercambio
inico influye directamente en la capacidad de unin. En membranas cuyo tamao de poro es
pequeo (menor de 600) no hay espacio suficiente para unir el in dentro de dichos poros
por lo que la cantidad de intercambiador por unidad de superficie es menor. Sin embargo, en
membranas con tamao de poro mayor (mayor de 600) se puede unir el compuesto mvil

8
dentro de dichos poros, con lo que se incrementa la cantidad de intercambiador por unidad de
superficie. La porosidad busca una mayor superficie de intercambio.

Grfico 2: Porosidad

Donde existe mayor porosidad (derecha), se puede unir el compuesto mvil dentro de estos
poros incrementando la cantidad de intercambiador de superficie.

2.2.5. INSTRUMENTACIN

Grfico 3: Instrumentacin Crom. inica

2.2.6. APLICACIONES
Medicin de la hemoglobina glicosilada. El mtodo de cromatografa de intercambio
inico se basa en la elusin diferencial de la hemoglobina glicosilada por el cambio de
carga que se produce en la molcula debido a la glicacin del grupo amino terminal de
la cadena. Para realizar el procedimiento se utiliza carboximetil celulosa cargada (-).
Determinacin de PBG y ALA en orina. Las porfirias son un grupo de enfermedades
de origen gentico o adquirido que tienen como caracterstica comn una alteracin

9
 en la actividad de una o varias enzimas de la va metablica del grupo HEM, lo que
ocasiona niveles anormalmente elevados deporfirinas o sus precursores. Estos se
acumulan en los tejidos y se excretan en la orina y las heces. Las manifestaciones
patolgicas son producidas casi en su totalidad por los efectos sobre el sistema
nervioso y la piel
Extraccin y purificacin de cidos nucleicos. La cromatografa de intercambio
inico es el mtodo ms utilizado para la separacin de cidos nucleicos. Un cido
nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unir a un intercambiador inico con grupos
cargados positivamente, pero eluir de la columna al cambiar el pH del tampn
(tampn de elusin) ya que los iones del tampn de elusin interaccionan con los
grupos cargados del cido nucleico o del intercambiador inico. Primero fluirn de la
columna las molculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria
y posteriormente, al aadir el tampn de elusin, eluiran las molculas con poca carga
negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta
2.3. CROMATOLOGIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION

La cromatografa liquida de alta eficacia se encuadra dentro de la cromatografa de elucin.

En esta, un liquida (fase mvil) circula en intimo contacto con un slido u otro liquido inmiscible
(fase estacionaria); al introducir una mezcla de substancias (analitos) en la corriente de fase
mvil, cada analito avanzara a lo largo del sistema con una velocidad diferente que depender
de su afinidad por cada una de las fases. Esto supone que despus de terminado el recorrido
de la muestra por la columna, cada una de las substancias introducidas en el sistema eluira
con un tiempo diferente, es decir, estarn separadas.

2.3.1. INSTRUMENTACIN

Si bien es cierto que para realizar una cromatografa liquida tan solo es necesario disponer de
las dos fases implicadas en el proceso y de la columna, la moderna cromatografa de lquidos
de alta eficacia, debido al pequeo dimetro de las partculas de fase estacionaria que se
utilizan requiere de la utilizacin de unos dispositivos que constituyen el cromatgrafo.

Los componentes bsicos de un cromatgrafo de lquidos son:

Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de mezclado de eluyentes)

Dispositivo de inyeccin
Conducciones y conexiones
Detector y registrador

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 Columna

Figura 2: Esquema de un cromatgrafo de liquidos

SISTEMA DE SUMINISTRO DE FASE MVIL.

2.3.2. LA BOMBA.

La misin de la bomba es la de suministrar un caudal constante y libre de pulsos de la fase

mvil a travs de la columna, sin que el flujo sea influido por la presin en cabeza de columna,
ya que sta puede variar por obstruccin de las lneas de conduccin del filtro de la cabeza
de la columna.

Un sistema de bombeo ideal debe cumplir las siguientes caractersticas:

Estar construido con materiales qumicamente inertes frente a la fase mvil.

Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.
Proporcionar un flujo libre de pulsaciones o llevar asociado un amortiguador.
Suministrar flujos adecuados para los diferentes tipos de columnas. El rango de
caudales para las columnas que se utilizan habitualmente vara desde los 10ul/min
hasta los 10ml/min.
El caudal que suministran debe ser constante a los largo del tiempo, ya que de l
depende la reproducibilidad de los tiempos de retencin.

Tipos de bombas.

Una primera clasificacin de las bombas utilizadas en la CLAE, se puede realizar atendiendo
a la fuerza motriz, as se tendrn:

Bombas neumticas: Bombas de desplazamiento directo y amplificadores de aire.

Bombas de motor elctrico: Bombas de jeringa y alternantes.

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 Grfico 4: Bombas neumticas y elctricas

2.3.3. SISTEMA DE MEZCLA DE FASE MVIL

En cromatografa de lquidos, es posible trabajar en dos modalidades; isocrtico, cuando la

fase mvil mantiene la misma composicin durante la elucin, y en gradiente,, cuando la
composicin de la fase mvil cambia segn una funcin dependiente del tiempo. Para trabajar
en la modalidad de gradiente, es necesario que el equipo cromatogrfico tenga un dispositivo
capaz de realizar mezclas de disolventes con control preciso y reproducible.

Los dos principales mtodos de mezclado de los componentes de la fase mvil se conoce
como mezclado a alta presin y mezclado a baja presin.

Mezclado a alta presin. Este sistema de mezclado utiliza una bomba para cada uno
de los disolventes que se van a mezclar, estando la salida de cada bomba conectada
a una conexin en T o a una pequea cmara de mezcla. La denominacin de mezcla
en alta presin es debida a que la mezcla se realiza una vez que los disolventes han
pasado la bomba y, por lo tanto, han adquirido la presin de trabajo. Ofrecen buena
reproducibilidad de las mezclas.

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 Ilustracin 3: Mezclado a alta presin

Mezclado a baja presin. El mezclado de los diferentes componentes se lleva a cabo

antes de stos entren en la bomba controlndose el caudal del sistema cromatogrfico
por medio de una sola bomba. El mezclado de los componentes se realiza por medio
de vlvulas porcentuales controladas por rels, que estn calibradas para dar la
mezcla adecuada. El dispositivo de control simplemente abre cada vlvula durante un
periodo de tiempo adecuado, que ser en funcin del porcentaje de cada componente
que se precise en la mezcla. Baja reproducibilidad y bajo costo.

Ilustracin 4: Mezclado baja presin

2.3.4. SISTEMA DE INYECCIN.

Un mal sistema de inyeccin puede dar lugar a ensanchamientos de la banda cromatogrfica

que deterioren la eficacia del sistema cromatogrfico.

Un inyector ideal debe tener las siguientes caractersticas:

Introducir la muestra en la columna como una banda lo ms estrecha posible.

13
 Ser de fcil manejo.
Dar lugar a resultados reproducibles, tanto en la cantidad de muestra inyectada como
en el ensanchamiento que origina en la banda cromatogrfica.
Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.

Fundamentalmente existen dos tipos de inyectores manuales: los de jeringa y los de vlvula.

2.3.5. CONDUCCIONES Y CONEXIONES

La presencia de volmenes muertos es uno de los grandes problemas de los equipos de

cromatografa de lquidos, ya que estos dan origen a prdidas en la eficacia del sistema y en
la capacidad de separacin. En particular, todas las conducciones y conexiones entre inyector
y columna, y entre columna y detector son de la mxima importancia.

El tubo de conduccin puede considerarse como un volumen muerto del sistema y es de vital
importancia la utilizacin para esta finalidad de tubos capilares en los que el dimetro interno
sea pequeo y evitar al mximo posible la utilizacin de grandes longitudes de tubo de
conexin.

2.3.6. DETECTORES.

Es un dispositivo que permite medir, a la salida de la columna, una propiedad fsica del
eluyente, que deber depender de la composicin de ste. La deteccin en cromatografa se
realiza, habitualmente, en continuo, aunque es posible la utilizacin de colectores de
fracciones para identificacin y cuantificacin de pequeas fracciones del eluyente.

Las caractersticas de un detector para cromatografa, son principalmente:

Caractersticas que no afectan a la eficacia de la separacin.

o Respuesta. Es la seal ofrecida por el detector ante una determinada variacin de la
propiedad fsica del eluyente que es medida. La respuesta de un detector suele ser lineal,
lo que implica que la seal generada por el detector varia linealmente con la concentracin
o la masa de soluto que, por unidad de tiempo, sale de la columna.
o Ruido. Es cualquier perturbacin de la seal generada por el detector y que no es
originada por la salida de un soluto de la columna.
o Deriva. Es la variacin de la seal de base a lo largo del tiempo, que origina una variacin
lenta y progresiva de la lnea base.

14
 o Sensibilidad. La sensibilidad se define como la mnima concentracin o cantidad de
soluto que debe pasar por el detector para que la seal a que ste da lugar sea dos veces
mayor que la del ruido de fondo.
o Rango dinmico. Es el rango de concentraciones de soluto entre las cuales el detector
produce una respuesta dependiente de la concentracin de soluto a la salida de la
columna. El valor mnimo, se corresponde con la sensibilidad del detector, y el mximo,
con la concentracin de soluto a partir de la respuesta del detector es constante.
Caractersticas que afectan a la eficacia de la separacin.
o Volumen de la cubeta. El volumen de la cubeta puede provocar una prdida
considerable de la eficacia del sistema, ya que volmenes grandes de clula originan un
efecto de disolucin exponencial del soluto que sale de la columna, deformndose el pico
y pudindose mezclar dos solutos que salen separados de la columna.
o Constante de tiempo. La constante de tiempo del detector indica el tiempo que necesita
la electrnica del detector para asumir la seal instantnea originada por el soluto. Para
anlisis convencionales, son apropiadas constantes de tiempo inferiores a 100 ms.

Los detectores, hasta el momento los de uso ms extendido son:

Detector de ultravioleta
Detector ndice de refraccin
Detector de fluorescencia
Detector de conductividad elctrica
Detector electroqumico
2.3.7. La columna.

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La columna es el elemento fundamental de una cromatgrafo de
lquidos, puesto que es en ella donde tiene lugar la separacin por
lo tanto, resulta fundamental una correcta eleccin de la columna
adecuada para cada separacin, ya que con una columna
inadecuada o de mala calidad nunca se obtendrn buenos
resultados aunque se disponga del mejor instrumental.

Las columnas ms utilizadas cromatografa de lquidos son las de

relleno; estas columnas consisten en un tubo, generalemente de
acero, relleno de una fase estacionaria adecuada al tipo
separacin que se pretende llevar a cabo. El dimetro interno
vara entre 2 y 60 mm dependiendo su utilizacin, a secala
analtica o sempreparativa, y su longitud vara entre 5 y 30 cm.

Las caractersticas de la columna que influyen sobre su capacidad

de separacin son:

Dimetro interno. Para su eleccin se realiza en funcin

de la cantidad de muestra a separar. Para las
separaciones a escala analtica se suelen usar columnas
de pequeos dimetros (1 a 6 mm) mientras que en los trabajos a escala preparativa
se superan los 10 mm de dimetro interno.
Longitud de la columna. La eficacia de la columna depende tambin de la longitud
de la columna. Se debe tener en cuenta que, a mayor longitud de la columna, la presin
en cabeza se eleva considerablemente, por lo que hay decidir bien la columna, entre
eficacia y cada de presin. La longitud de la columna no podr ser superior a 20 cm
sin riesgo de que la presin en cabeza de columna sea excesivamente elevada.
Conexiones. En los extremos de la columna se montan los sistemas de conexin para
poderlas unir al detector y a los sistemas de inyeccin y bombeo de eluyentes. La
conexin es una unin reductora de comprensin radial, que permite una perfecta
unin del tubo de la columna con el capilar que la conecta a los restantes dispositivos
del cromatgrafo. Estas uniones no deben presentar volumen muerto, deben permitir
el paso de secciones anchas de tubo a capilares, y deben ser fcilmente montables y
desmontables.
Relleno. Las fases estacionarias en cromatografa de lquidos, estn constituidas
generalmente por partculas de materiales rgidos o semirgidos, y en la mayora de

16
 los rellenos se suelen utilizar slice (arena), aunque tambin es posible encontrar
rellenos basados en polmeros sintticos.
Tamao de partcula. Juega un papel importante en la calidad y eficacia de la
columna. Los mayores avances se han realizado al reducir los tamaos de las
partculas del relleno a unos niveles en los que se consiguen grandes incrementos en
la eficacia de la columna sin que por ello se tengan unas presiones tan excesivamente
elevadas en cabeza de columna que hagan inviable el anlisis. En la actualidad, los
tamaos de partcula habituales se encuentran comprendidos entre 10 y 3 m de
dimetro, aunque en la mayora de los casos, los anlisis se estn realizando con
rellenos de 10 5 m. Por ltimo, cuanto menor sea el tamao de particula, la presin
en cabeza se incrementa de forma proporcialmente inversa al cuadrado del tamao
de la partcula. Por eso, no se encuentran rellenos menores a 3 m.
3. CONCLUSIN

Este tipo de tcnica es muy usada para el campo del anlisis y pruebas en el campo de la
ciencia. La parte de instrumentacin por lo general es muy compleja sobretodo en la parte de
la columna la cual tiene que tener una especificidad y mucho detalle en su construccin, as
como tambin en las diferentes etapas del instrumento. Es tambin importante mencionar
que, los detectores que usa el cromatgrafo son dispositivos generales como ser el
espectrgrafo, fluorescencia entre otros.

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