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UNIVERSIDAD VERACRUZANA

ÁREA ACADÉMICA CIENCIAS DE LA SALUD

FACULTAD DE BIOANÁLISIS - XALAPA

LICENCIATURA EN QUÍMICA CLÍNICA

EXPERIENCIA EDUCATIVA:

Microbiología Sanitaria

TEMA:

Análisis de Bacterias en Carnes, pescados y mariscos

EQUIPO 3

INTEGRANTES:

Castañeda Hernández Dania Karina
Mendoza Calles César Amador
Rosendo Gómez Hugo Eduardo
Zamora Córdoba Verónica

M. C. Ana Rosa Castillo Guerrero

2

INDICE

CARNES
INTRODUCCIÓN ….. 3
FUNDAMENTO….. 4
MATERIALY METODOS….. 6
CUADRO DE IDENTIFICACIÓN….. 10

PESCADOS
INTRODUCCIÓN …..37
FUNDAMENTO …..37
MATERIALY METODOS….. 38
CUADRO DE IDENTIFICACIÓN….. 48

MARISCOS
INTRODUCCIÓN….. 49
FUNDAMENTO….. 49
MATERIALY METODOS….. 54
CUADRO DE IDENTIFICACIÓN …..49

REFERENCIAS …..59

3

CARNES
INTRODUCCIÓN

La carne es el producto pecuario de mayor valor. Posee proteínas y aminoácidos, minerales, grasas y ácidos
grasos, vitaminas y otros componentes bioactivos, así como pequeñas cantidades de carbohidratos. Desde el punto
de vista nutricional, la importancia de la carne deriva de sus proteínas de alta calidad, que contienen todos los
aminoácidos esenciales, así como de sus minerales y vitaminas de elevada biodisponibilidad.

Mientras en el mundo desarrollado el consumo de carne no ha registrado importantes variaciones, el consumo
anual per cápita de carne en los países en desarrollo se ha duplicado desde 1980. El crecimiento demográfico y el
incremento de los ingresos, junto con los cambios en las preferencias alimentarias, han producido un aumento de la
demanda de productos pecuarios.

Pronósticos realizados por la FAO, señalan que “la producción mundial de carne se habrá duplicado para el
año 2050 y se prevé que la mayor parte del crecimiento se concentrará en los países en desarrollo. El creciente
mercado de la carne representa una importante oportunidad para los productores pecuarios y los elaboradores de
carne de estos países. No obstante, el incremento de la producción ganadera y la elaboración y comercialización
inocuas de carne y productos cárnicos conformes a las normas higiénicas supone un serio desafío” [1].

La industria cárnica en México es muy importante, existen muchos establecimientos dedicados al
procesamiento de la carne, desde microindustrias, pequeñas y medianas, hasta empresas transnacionales que
compiten por un mismo mercado. Los productos cárnicos gozan de gran aceptación por parte del consumidor, en
nuestros días no existe una ama de casa que deje el refrigerador de su hogar sin estos productos, se han hecho casi
indispensables al momento de comprar la despensa; además por su gran variedad se pueden consumir solos,
acompañados, en el desayuno, comida, cena, días de campo, etc.

El principal problema para estos productos es de tipo microbiológico, debido a las malas prácticas de manejo
e higiene durante el proceso y hasta su consumo, pues como se sabe la carne fresca por su contenido nutricional y su
alto valor de actividad de agua está considerada dentro del grupo de los alimentos altamente perecederos, al igual
que la mayoría de los productos elaborados con ella; sin embargo, de acuerdo a sus características particulares, el
tipo de microorganismos presentes puede variar [2].

A pesar de que el músculo como tal, es prácticamente estéril, los alimentos preparados con base en carne son
muy susceptibles a la contaminación y ofrecen las condiciones necesarias para el crecimiento de microorganismos
involucrados en daños y enfermedades de origen alimentario. En este tipo de productos, sobre todo frescos o con
procesos defectuosos, los microorganismos se multiplican rápidamente, especialmente a temperaturas por encima de
la de refrigeración, resultando en pérdidas de calidad y/o problemas de salud pública.

La contaminación se incrementa en carnes picadas porque ellas generalmente provienen de recortes
sumamente manipulados, en los cuales existe una gran área superficial y las condiciones para el crecimiento y
desarrollo de microorganismos, son mayores, ocasionando grandes deterioros [3].

Los tipos de microorganismos y la cantidad de ellos, presentes en los productos elaborados con base en
carne, dependen de las condiciones sanitarias del medio ambiente del cual provenga el alimento, de las propiedades y
calidad microbiológica de algunos ingredientes adicionados, del cuidado de quien procesa y maneja el producto y de
las condiciones posteriores de almacenamiento, manejo y distribución del mismo.

incluidos el gobierno. cuando se tenga sospecha de que estén contaminados o cuando lamentablemente ya se hayan dado casos de enfermedades debido al consumo de ésta. elimina completamente los microorganismos. empaque y. Listeria monocytogenes y diversos peligros químicos y físicos. La FAO considera que la producción primaria es una fuente importante de peligros relacionados con la carne. minerales. . esta acción dispersa los cúmulos de gérmenes distribuidos en la superficie de la carne. pero solo el tratamiento de esterilización en latas. De acuerdo a la NOM-009-ZOO [6]. depende de factores tales como composición e ingredientes no cárnicos. sin embargo. coli O157:H7. por ejemplo E. reducen el número de bacterias. El suministro de información pertinente sobre los animales destinados a la matanza facilita la aplicación de programas de higiene de la carne basados en el análisis de riesgos y permite que los procedimientos de inspección se adapten a la variedad y la prevalencia de enfermedades y defectos de una población animal determinada. lo cual le permite entrar en contacto con el O2 en sus tejidos profundos. tajado. condiciones de saneamiento durante el procesamiento y la calidad del producto. no sean aprobados para el consumo humano”. y todas las partes interesadas. en general. El procesamiento puede también introducir microorganismos adicionales y seleccionar el tipo que puede proliferar y causar daño durante el almacenamiento. hongos y levaduras. La carne deberá ser inocua y apta para el consumo humano. vitaminas y otros componentes bioactivos. contribuyen al logro de ese objetivo. grasas y ácidos grasos. proteínas y aminoácidos. para ello los indicadores más usados son los mesófilos aerobios. Enterococcus. puede también involucrar el uso de ingredientes no cárnicos que pueden servir como nutrientes o inhibidores para el crecimiento microbiano. sus productos y subproductos. para lo cual detallaremos el procedimiento para dicho análisis. Salmonella. ahumado. Por lo anterior. 4 En productos cárnicos los tratamientos del procesamiento. se define como contaminante “Materia indeseable entre las que se incluyen sustancias o microorganismos que hacen que la carne. es fundamental mantener estrictas condiciones higiénicas y elaborar los productos cárnicos siempre utilizando las buenas prácticas de manufactura ya sea que el alimento se elabore a escala industrial o en pequeña escala. Hay cierto número de peligros presentes en las poblaciones de animales de matanza. Salmonella spp. Por lo cual es importante hacer el procedimiento correcto de proceso sanitario para lograr el mayor control de calidad posible. como por ejemplo la posible exposición a quistes de Trichinella spiralis o Cysticercus bovis. Para conocer las condiciones higiénicas de los alimentos se han usado organismos indicadores para estimar tres factores: seguridad microbiológica. y que los lugares responsables de estas actividades sean lo más éticos para garantizar que todo se hace conforme a la normatividad ya establecida y evitar problemas sanitarios. condiciones de almacenamiento. FUNDAMENTO El Codex Alimentarius define la carne como “todas las partes de un animal que han sido dictaminadas como inocuas y aptas para el consumo humano o se destinan para este fin” [5]. La carne se compone de agua. Campylobacter jejuni. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO En este trabajo se realiza una compilación de los análisis que se llevan a cabo especialmente en carnes. Clostridium perfringes y Pseudomonas entre otros [4]. Además. coliformes. Staphylococcus aureus. temperatura de procesamiento. parásitos o virus que son de importancia clínica para salud del ser humano. y su control durante la producción primaria a menudo presenta dificultades considerables. El picado destruye las barreras naturales de la carne. Ello puede ser especialmente importante en situaciones en las que la presencia de ciertos agentes zoonóticos no es detectable mediante pruebas organolépticas o de laboratorio ordinarios y en las que tal vez haya que adoptar medidas especiales. la industria y los consumidores. así como pequeñas cantidades de carbohidratos. Se analizará la presencia de bacterias. por último. 1. La flora final.

etc. como en las plantas procesadoras de alimentos. La Salmonella puede presentarse en concentraciones bajas y en algunas ocasiones ir acompañada de una gran cantidad de biota microbiana y de otras Enterobacterias y otros géneros bacterianos. cucharones.  Frascos con agua clorada y tiosulfato de sodio. Este microorganismo fue inicialmente identificado en muestras clínicas y los métodos empleados para estos casos se adaptaron posteriormente para su detección en alimentos.  Cerillos o encendedor  Instrumentos para toma de muestra: muestreadores. la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo estudio. cuchillos.  Marcadores indelebles.  Hieleras de poliestireno o de otro material aislante  Papel aluminio. para toma de muestra.  Cinta testigo.) y segundo.  Lámparas de alcohol. espátulas. Las cuales son: ­ Etapa de pre enriquecimiento; ­ Enriquecimiento selectivo; . 10 ml RVS Matraz Erlenmeyer de 500 ml MKTTn . depende en cierta medida del método analítico utilizado para su detección. La determinación de la presencia o ausencia de Salmonella.  Bata. Es por lo que se hace necesario el pre-enriquecimiento para permitir la detección de un número bajo de bacterias o células estresadas de Salmonella.  Algodón. etc. el primero es el debilitamiento o daño a las células bacterianas presentes en un alimento debido al proceso a que está sujeto (por ejemplo: tratamiento térmico. MATERIAL Para la Toma de la muestra [7]. se lleva a cabo acorde a lo descrito en el presente método. Para el análisis microbiológico [8].Aislamiento en medios de cultivos selectivos y diferenciales .Serotipificación. Las modificaciones a los métodos consideraron dos aspectos principales.  Etiquetas auto adheribles. requiriendo 5 etapas sucesivas.  Bolsas de polietileno estériles de varias medidas. cofia y guantes estériles.  Papel estraza. tanto por parte de las autoridades sanitarias.Identificación bioquímica . en cierta cantidad de masa o volumen específico de producto.  Hielo o bolsas refrigerantes. níquel o desechables de 3 mm de diámetro o 10 μl Agua peptonada amortiguada Pipetas graduadas de 1 ml.  Frasco con etanol o Isopropanol al 70 %. pinzas. no tóxico y de tamaño acorde con la cantidad de muestra deseada. (de acero inoxidable o de cualquier otro material que no provoque cambios que puedan afectar los resultados). Aislamiento de Salmonella Material Medios de cultivo Asa de platino. 5 Los miembros del género Salmonella han sido muy estudiados como patógenos cuando se encuentran presentes en los alimentos. El control de este microorganismo. 5 ml. cubreboca.  Frascos de boca ancha con tapa de rosca o tapón esmerilado de material esterilizable. secado.

de lo contrario deben enfriarse a temperatura ambiente y trasladarse en condiciones de refrigeración. No tocar el interior de los envases y evitar que la tapa se contamine. en el nudo o cierre de la bolsa en forma tal que se evite que la muestra sea alterada o violada. etc. Conservación y transporte. con los siguientes datos: a) Fecha b) Lugar c) Hora del muestreo d) Número de lote e) Temperatura de la toma de muestra si es que procede. esto únicamente si el traslado es menor a una hora. Los recipientes para la toma de muestra deben abrirse únicamente al momento de introducir ésta y cerrarlos de inmediato. no requieren precauciones estrictamente asépticas. Los alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la temperatura en que se muestrearon.  La toma de muestra debe hacerse con rapidez. se recomienda que la persona que elabora los alimentos. cucharas. ésta se obtendrá de varios puntos del contenedor para obtener una muestra representativa.  Cuando sea necesario tomar la temperatura. cuchillos. sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estériles con los utensilios que emplea normalmente. . 6 Matraz Kitazato de 1000 ml XLD Cajas Petri estériles de vidrio de 15 mm x 100 mm EH Tubos de ensayo de 16 mm x 150 mm ASB Tubos de ensayo de 20 mm x 100 mm Agar Verde Brillante Gradilla Agar nutritivo Mechero de Bunsen o Fisher TSI LIA Agar Urea de Christensen Indol MÉTODOS I.  Es indispensable identificar el recipiente claramente. pero cuidadosamente.  Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato.  Tratándose de muestrear productos envasados en recipientes grandes.  Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta de una partida a granel.  En el caso de muestras líquidas o semilíquidas se deberá agitar o mezclar hasta conseguir homogeneizar y después efectuar la toma de la muestra en diferentes niveles.  En muestras de productos a granel. inmediatamente antes o después de colocar en él la muestra. Relativo a la muestra. la muestra que se utilice para tal fin deberá ser diferente de la que se envía para su análisis. tomándose del mismo lote y en cantidad suficiente para sus análisis. enviándose al laboratorio tal como se presentan al consumidor. mediante rótulo o etiqueta (indelebles). Etiquetado.  La etiqueta deberá colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco. debe muestrearse con ayuda de utensilios estériles como sacabocados. la caja. es preciso abrir éstos y extraer la muestra en condiciones asépticas para evitar la contaminación microbiana. antes de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida con el flujo.  Si la muestra a obtener está expuesta al aire libre y a otras contaminaciones. Toma de la muestra [9].  La toma de muestra de productos envasados con presentación comercial para venta al menudeo se llevará a cabo en forma aleatoria y no aséptica.  En muestras sólidas cuando sea necesario cortar el producto.

carne y hueso). Incubar 24 ± 2 h a 35ºC. Incubar 24 ± 2 h a 35ºC. Carnes. Adicionar 225 ml de caldo selenito cistina o 225 ml de caldo Tetrationato . agregar los detergentes en las mismas proporciones y con las mismas recomendaciones que para el coco. así como la marca comercial y cualquier otra información que se considere importante. si es necesario. Este método se basa en el análisis de 25 g de la muestra analítica en una proporción de 1:9 de muestra/caldo. La cantidad de los mismos dependerá en gran medida de la composición del alimento. humedezcan o contaminen con otras. las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su recolección. En caso de alimentos congelados. Ajustar. en donde se señale las condiciones sanitarias en el que se encontraban los productos antes de efectuar la toma de muestra o algún otro dato que sea significativo para determinar los análisis microbiológicos que sean necesarios.  Las muestras deben entregarse al laboratorio lo más rápidamente posible. Procedimiento Analítico. sustitutos de carnes.  Los productos con presentación comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura ambiente. a) Productos procesados térmicamente y productos secos: si la muestra es en polvo o molida. Para la refrigeración es recomendable el empleo de recipientes con líquido refrigerante o hielo potable contenido en bolsas de plástico impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de los envases o que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados. 7  El manejo y transporte de las muestras deberá efectuarse de tal manera que se impida su ruptura. 4.  En el caso de muestras no perecederas. 5. a menos que se indique otro) y licuar si es necesario durante un min. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa. siempre y cuando ésta no exceda de 45°C  Para la conservación. productos glandulares y harinas (pescado.2 con hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles. evitar que se dañen. empleando para conservarla hielo seco. Después de reposar. alteración o contaminación. Los alimentos perecederos se transportarán bajo condiciones de temperatura de 2 a 8 °C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta el momento de realizar las pruebas. Adicionar 225 ml del medio de preenriquecimiento estéril (generalmente caldo lactosado. 6. el licuado puede omitirse y el producto puede pesarse directamente en matraces Erlenmeyer estériles de 500 ml.8 ± 0. Mezclar bien y determinar el pH aproximado con papel pH. Los detergentes no serán necesarios en los productos glandulares en polvo. La muestra testigo podrá eliminarse una vez que se obtengan resultados oficiales que indiquen el cumplimento de las especificaciones sanitarias y el particular no decida llevar a cabo su impugnación. mezclar bien y ajustar el pH como se indica en el procedimiento general. b) Clave única que permita la identificación del domicilio del fabricante. 2. Si la muestra es en polvo o molida. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. el licuado puede omitirse. derivados cárnicos. Para emulsionar las grasas. c) Indicar nombre genérico y específico del producto. durante el transporte de las muestras no está permitido el empleo de sustancias químicas. b) Para productos crudos o altamente contaminados: pesar porciones de 25 g de producto en dos vasos para licuadora. Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para trabajar en homogeneizador peristáltico (stomacher). 3. sustancias de origen animal. incluya los siguientes datos: a) Número de unidades y/o cantidad. d) Observaciones.  Las muestras que se entreguen al laboratorio deberán acompañarse de un informe que además de contener la identificación de la muestra. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción.  En el caso de muestras individuales blandas. representante y/o distribuidor. Se recomienda una muestra de 25 g o más. la temperatura no debe ser mayor de 0°C. evitar que la presión que puedan ejercer otros recipientes o una cantidad excesiva de las mismas las deformen u originen derrames y provoquen que el contenido se ponga en contacto con el exterior de la envoltura. 1. a un pH 6. evitando su exposición a la luz solar directa. II.

Aflojar la tapa a 1/4 de vuelta e incubar durante 24h ± 2h a 36°C ± 1°C. 25 g de muestra.  En casos epidemiológicos.  La preparación de la suspensión inicial requiere pesar. especialmente de Salmonella y Shigella.25 L del caldo de pre enriquecimiento precalentado a 36°C ± 1°C. se deberá utilizar la cantidad necesaria de medio de pre enriquecimiento para obtener una dilución 1:10. Si son negativas. en condiciones asépticas. en sustitución del caldo Tetrationato puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport. Incubar las placas inoculadas a 36°C ± 1°C durante 24h ± 3h. Agregar 225 mL de agua peptonada amortiguada estéril y licuar por 2 min. se debe tomar en cuenta que para inocular el caldo selectivo RVS y MKTTn aumentarán las porciones de 10 mL a 100 mL teniendo que inocular 1mL y 10mL respectivamente. sembrar por estría simple 3 placas de los siguientes medios selectivos:  Agar XLD para el aislamiento de colonias típicas y Agar ASB para aislamiento de colonias lactosa positivas y cualquier otro medio selectivo sólido complementario.  Agar EH para el aislamiento de microorganismo Gram negativos entéricos. a 6.  En una situación atípica y justificada. incubar nuevamente durante 18 a 24 horas más.1% y 4. combinar las 10 porciones para obtener 250 g y adicionar 2. Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y agitar suavemente. si 10 muestras de 25 g serán examinadas.  Incubar el caldo RVS a 41. Licuar por dos min y pasar asépticamente a matraces Erlenmeyer de 500 ml. en un vaso de licuadora. 7.5 ml de solución yodo-yoduro a la muestra que se enriquecerá con caldo Tetrationato. Adicionar 2.  En casos excepcionales. Identificación Bioquímica. Terminado este paso se procede a obtener la dilución 1:10. si la porción de muestra utilizada en el ensayo es distinta a 25 g.  Agar Verde Brillante es un medio de enriquecimiento altamente selectivo para el aislamiento de Salmonella spp. inocular a partir de los cultivos obtenidos en el punto anterior.  Sin embargo. transferir respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo Tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina. de tal manera que permita el aislamiento de colonias. 8 (sin verde brillante) a cada muestra analítica.25 ml de solución de verde brillante 0.. cuando es necesario analizar más de una porción de 25 g de un lote específico de alimento y teniendo evidencia de que si hay mezcla de tales porciones no afecta el resultado. si en una placa se encuentran menos de 5 colonias típicas o sospechosas. Homogeneizar e incubar 24 ± 2 h a 35ºC. Para el aislamiento. preferiblemente sin agua de condensación. Se incuba a 35 °C ± 2 °C durante 18 a 24 h para observar la proporción del crecimiento y el tamaño de las colonias. la pigmentación y la selectividad. Una vez obtenido el crecimiento de colonias se procede a las pruebas bioquímicas como se describe a continuación: . excepto Salmonella typhi y Salmonella paratyphi. Como alternativa.5 °C ± 1 °C por 24 h ± 3 h y el caldo MKTTn a 36 °C ± 1 °C por 24 h ± 3 h.  Mantener las placas de agares selectivos y nutritivos entre 2 °C y 8 ºC.8 ± 0. Enriquecimiento Selectivo. identificar al menos 5 colonias sospechosas. Se incuba a 35 °C ± 2 °C durante 48 h.  Para la confirmación. Dejar reposar y ajustar el pH si es necesario. las muestras pueden ser compuestas; es decir. Se incuba a 36 °C ± 1 °C durante 24 h ± 3 h. tomar de cada agar selectivo al menos 1 colonia considerada como típica o en total 3 colonias sospechosas si no existe la primera posibilidad. hasta la conclusión del análisis. Antes de realizar las Pruebas bioquímicas es necesario estriar cada colonia seleccionada en cualquier agar nutritivo.1 mL del cultivo de pre-enriquecimiento a un tubo del 10mL de caldo RVS y 1 mL a un tubo conteniendo 10 mL de caldo MKTTn. Pre-enriquecimiento. Selección en Medios Sólidos.  Transferir 0. confirmar todas las colonias que se encuentren en el medio.2 con hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles.

Con un asa estéril inocular tubos de agar urea de Christensen. de manera que se obtenga una suspensión homogénea y turbia. a) Prueba de urea de Christensen. Debido a que algunas veces los tubos de agar urea de Christensen sin inocular.3 mL de reactivo de Kovac. Rote suavemente la lámina por 30s a 60s. La aglutinación con el antisuero polivalente Poly A-I & Vi. Sembrar por picadura en el fondo y estría en la superficie inclinada. Adicionar 0. debe incluirse. Dejar los tapones flojos de los tubos para mantener condiciones de aerobiosis mientras se incuban evitando excesiva producción de H 2S. 9  A partir del agar nutritivo. e) Prueba de VP (Voges Proskauer).  Incubar los tubos de TSI y LIA a 36°C ± 1°C por 24h ± 3h. Incubar 24 h ± 2 h a 36 °C ± 1 °C. puede usarse como resultado confirmatorio de la presencia de Salmonella spp para las cepas probadas por TSI y LIA. Incubar 36 °C ± 1 °C por 24 h ± 3 h. d) Prueba de Indol.25 mL del agente de detección de la β-galactosidasa y mezclar. un tubo de este agar sin inocular como control en una prueba negativa. sin agitar y resbalando por las paredes. en un portaobjetos perfectamente limpio. b) Caldo L-lisina descarboxilasa. Inocular el caldo con pequeña cantidad de cultivo. Colocar la colonia seleccionada en un tubo conteniendo 0.  Detección de los antígenos Poly A-I & Vi. Observe el resultado sobre un fondo oscuro. agitar para obtener una suspensión homogénea. Si la reacción de LIA fue dudosa. . Disperse con un asa. NOTA: También es posible dispersar parte de la colonia a analizar en una gota de agua y luego mezclar esta solución con una gota de la solución salina.  Eliminación de las cepas autoaglutinables.25 mL de solución salina. Colocar el tubo en un baño de agua a 36 °C ± 1 °C dejar reposar por aproximadamente 5 min. continuar como se indica en Identificación de Salmonella spp para determinar la especie. existen cepas que no aglutinan con el polivalente. Examinar el tubo a intervalos de tiempo. utilizar caldo lisina descarboxilasa para la determinación final de lisina descarboxilasa. la cepa se considera como autoaglutinable deberán identificarse por pruebas bioquímicas complementarias y no someterse a la serotipificación. Deposite una gota de solución salina. con un asa recta estéril.2 mL a 0. tocar ligeramente el centro de la colonia seleccionada e inocular en tubos de agar inclinado de TSI y LIA. pueden virar a rojo púrpura (prueba positiva). tres gotas de solución α-naftol y al final dos gotas de solución de KOH. pero que dan reacciones típicas en TSI y LIA. incluyendo Salmonella arizonae. Pruebas Serológicas. para éstas es necesario confirmar usando la batería completa de bioquímicas. c) Detección de β-galactosidasa. Re-suspender una asada de la colonia seleccionada en un tubo estéril conteniendo 3 mL del medio VP. Si la prueba de LIA fue satisfactoria. parte de la colonia a probar en la gota. Inocular un tubo conteniendo 5 mL del caldo triptona con una suspensión homogénea de la colonia sospechosa. Después de la incubación adicionar dos gotas de solución de creatina. no es necesario repetirla. Si las bacterias se agrupan en grumos de diferentes tamaños. Adicionar una gota de tolueno y agitar. agitar después de cada reactivo. Cerrar la tapa fuertemente e incubar a 36°C ± 1°C por 24h ± 3h. preferiblemente con la ayuda de una lupa. Para los cultivos de TSI que se consideran presuntivos para Salmonella spp. Colocar nuevamente el tubo en el baño de agua a 36°C ± 1°C y dejar por 24 h ± 3 h. Incubar a 36 °C ± 1 °C por 24 h ± 3 h después de la incubación adicionar de 0.

Nota: Existen algunas cepas de Salmonella spp con un comportamiento bioquímico diferente al resto del género. no hay colonias típicas sospechosas en ASB. desoxicolato Muy pocos cultivos atípicos de Salmonella spp. empleando una gota de la solución salina en una lámina de vidrio. las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas. Agar Características atípicas Agar de xilosa. Agar Verde Brillante (VB) Colonias incoloras rosadas o fucsia. Si se produce aglutinación. 10 Empleando una colonia pura no autoaglutinable. grises o negras; algunas veces pueden presentar brillo metálico y el medio circundante a la colonia generalmente es café al principio y a medida que se prolonga el tiempo de incubación. + (-) Otras Salmonellas K A + +++ (-) A= ácido (amarillo). la reacción se considera positiva. Agar Entérico Hektoen (EH) Colonias azul-verdes o azules. en EH y XLD. Si se produce aglutinación. disperse con el asa hasta obtener una suspensión homogénea y agregue una gota del antisuero O. Otras salmonelas atípicas producen ácido a partir de la lactosa y al crecer en XLD dan colonias amarillas con o sin el centro negro. proceda. Morfología de las Colonias. Si después de 48h de incubación (como se explicó anteriormente). Muchos cultivos de Salmonella (XLD) spp pueden producir colonias con un centro negro muy grande o completamente negras. sobre el medio coloreado de rosado a rojo. Muchos cultivos de Salmonella spp pueden producir colonias con un centro negro muy grande o completamente negras. lisina. enviar el cultivo al laboratorio de referencia CCAyAC de la COFEPRIS para su identificación serológica o molecular. Para fines de vigilancia sanitaria. Agar Características típicas Agar de xilosa. con o sin centro negro. TSI Tendido Fondo Gas H2S Salmonella typhi K A . III. lisina. Agar Bismuto Sulfito (ASB) Algunos cultivos producen colonias verdes con un halo oscuro muy pequeño. producen colonias (XLD) rosas salmón o amarillas respectivamente con o sin centro negro. seleccionar 2 o más colonias atípicas. transparentes u opacas. la reacción se considera positiva del antisuero O en lugar de la solución salina. En ausencia de colonias típicas. Después de haber sido incubadas a 36°C ± 1°C durante 24h ± 3h o hasta 48h. por ejemplo S. CUADROS DE IDENTIFICACIÓN. después de haber sido incubadas a 36°C ± 1°C durante 24h ± 3h. pueden aparecer de color negro. Paratyphi A al crecer en XLD genera colonias rosas con el centro más obscuro y no produce H2S. Agar Bismuto Sulfito (ASB) Colonias cafés. K= alcalino (rojo) . desoxicolato Colonias rosas con o sin centro negro. seleccionar 2 o más Agar Entérico Hektoen (EH) colonias atípicas.

H2S += ennegrecimiento del medio ( )= reacciones ocasionales LIA Tendido Fondo Gas H2S Salmonella spp K KoN . pero es inmóvil a 37°C. se debe considerar que:  Las pruebas para la determinación de L. Si se produce aglutinación. +o- Salmonella paratyphi K A +o. K= alcalino (púrpura) Gas +=ruptura del medio. NOTA: con la finalidad de proteger la salud del personal de laboratorio. monocytogenes en los productos de consumo. El color amarillo es indicativo de reacción Detección de β-galactosidasa positiva. Es uno de los patógenos más virulento causante de infecciones alimentarias. la cual se hace evidente en 20 minutos. Tiene flagelos perítricos. Prueba de VP Desarrollo de color rojo ladrillo. con la confirmación mediante pruebas bioquímicas y fisiológicas [11]. L.  Las mujeres embarazadas no deberán manipular los cultivos de L. de color púrpura. que presenta diploformas dispuestas en "V" y anaerobio facultativo capaz de proliferar en un amplio intervalo de temperaturas de 1 °C a 45 °C. Este método permite determinar la presencia o ausencia de L. la reacción se considera positiva. temperatura a la cual sus flagelos se inactivan. 2. Pruebas Serológicas Detección de los antígenos Si se produce aglutinación. Reacción alcalina. monocytogenes bajo ninguna circunstancia. con una tasa de mortalidad entre un 20% a 30%. 11 Gas +=ruptura del medio. gracias a los cuales presenta movilidad a 30°C o menos. la reacción se considera Poly A-I & Vi positiva del antisuero O en lugar de la solución salina. + (-) Salmonella typhi K K . Listeria monocytogenes es una bacteria que se desarrolla intracelularmente y es causante de Listeriosis. se efectúa por medio de un pre-enriquecimiento selectivo y después su aislamiento en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial principalmente por la fermentación de carbohidratos y la actividad hemolítica. por Caldo L-lisina descarboxilasa descarboxilación de la lisina. Prueba de Indol Formación de un anillo de color rojo. no presenta cápsula ni espora. monocytogenes es un bacilo corto Gram positivo. A= ácido (amarillo). -o+ Nota: considerar como negativos los cultivos que produzcan claramente un color amarillo en el fondo del tubo. Listeria monocytogenes. . monocytogenes deberán ser realizadas en laboratorios debidamente equipados y por microbiólogos expertos. MATERIAL Para la Toma de la muestra [7]. cuidando la eliminación de los desechos potencialmente contaminados. más alta que casi todas las restantes tóxico infecciones alimentarias. H2S += ennegrecimiento del medio ( )= reacciones ocasionales Pruebas Bioquímicas complementarias para Salmonella spp Medios Reacciones positivas Urea de Christensen Mantiene su color amarillo-anaranjado original.

. 5 ml. Materiales Asa de platino o níquel de 3 mm de diámetro o 10 μl Pipetas graduadas de 1 ml.  Lámparas de alcohol. Relativo a la muestra. no tóxico y de tamaño acorde con la cantidad de muestra deseada.  Marcadores indelebles. con reducción de la concentración de agentes selectivos Caldo Fraser.  Frasco con etanol o Isopropanol al 70 %.  Frascos con agua clorada y tiosulfato de sodio. pinzas.  Bata. 10 ml Matraz Erlenmeyer de 500 ml Cajas Petri estériles de vidrio de 15 mm x 100 mm Tubos de ensayo de 16 mm x 150 mm Tubos de ensayo de 20 mm x 100 mm Tubos para serología de 10 mm x 75 mm o de 13 mm x 100 mm Gradilla Mechero de Bunsen o Fisher Aceite de inmersión Microscopio de contraste de fases con objetivo de inmersión en aceite Medios de cultivo Caldo de Fraser medio.  Bolsas de polietileno estériles de varias medidas. Para el análisis microbiológico [8].  Cerillos o encendedor  Instrumentos para toma de muestra: muestreadores. 12  Frascos de boca ancha con tapa de rosca o tapón esmerilado de material esterilizable. cucharones.  Cinta testigo. espátulas. cofia y guantes estériles. etc. para toma de muestra.  Algodón.  Hielo o bolsas refrigerantes.  Papel estraza.  Etiquetas auto adheribles. Toma de la muestra [9]. cuchillos. con la completa concentración de agentes selectivos Agar Oxford Agar PALCAM ASTEL CSTEL Agar sangre de cordero Caldo carbohidrato (Ramnosa y Xilosa) Agar movilidad Solución de Peróxido de hidrógeno MÉTODOS I. cubreboca.  Hieleras de poliestireno o de otro material aislante  Papel aluminio. (de acero inoxidable o de cualquier otro material que no provoque cambios que puedan afectar los resultados).

enviándose al laboratorio tal como se presentan al consumidor. la caja. En caso de alimentos congelados. mediante rótulo o etiqueta (indelebles).  Tratándose de muestrear productos envasados en recipientes grandes. cucharas. Los alimentos perecederos se transportarán bajo condiciones de temperatura de 2 a 8 °C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta el momento de realizar las pruebas. humedezcan o contaminen con otras.  La etiqueta deberá colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco. en el nudo o cierre de la bolsa en forma tal que se evite que la muestra sea alterada o violada.  En el caso de muestras líquidas o semilíquidas se deberá agitar o mezclar hasta conseguir homogeneizar y después efectuar la toma de la muestra en diferentes niveles. las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su recolección. . Los recipientes para la toma de muestra deben abrirse únicamente al momento de introducir ésta y cerrarlos de inmediato.  En el caso de muestras no perecederas. cuchillos. esto únicamente si el traslado es menor a una hora. etc.  Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta de una partida a granel. no requieren precauciones estrictamente asépticas.  Si la muestra a obtener está expuesta al aire libre y a otras contaminaciones. es preciso abrir éstos y extraer la muestra en condiciones asépticas para evitar la contaminación microbiana.  La toma de muestra de productos envasados con presentación comercial para venta al menudeo se llevará a cabo en forma aleatoria y no aséptica.  Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato. la muestra que se utilice para tal fin deberá ser diferente de la que se envía para su análisis. la temperatura no debe ser mayor de 0°C. tomándose del mismo lote y en cantidad suficiente para sus análisis. de lo contrario deben enfriarse a temperatura ambiente y trasladarse en condiciones de refrigeración. debe muestrearse con ayuda de utensilios estériles como sacabocados. evitar que la presión que puedan ejercer otros recipientes o una cantidad excesiva de las mismas las deformen u originen derrames y provoquen que el contenido se ponga en contacto con el exterior de la envoltura.  Es indispensable identificar el recipiente claramente. antes de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida con el flujo. con los siguientes datos: a) Fecha b) Lugar c) Hora del muestreo d) Número de lote e) Temperatura de la toma de muestra si es que procede. Conservación y transporte. evitando su exposición a la luz solar directa. pero cuidadosamente. sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estériles con los utensilios que emplea normalmente.  Las muestras deben entregarse al laboratorio lo más rápidamente posible. No tocar el interior de los envases y evitar que la tapa se contamine. alteración o contaminación. evitar que se dañen. 13  La toma de muestra debe hacerse con rapidez. Los alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la temperatura en que se muestrearon. inmediatamente antes o después de colocar en él la muestra.  En el caso de muestras individuales blandas. empleando para conservarla hielo seco.  En muestras sólidas cuando sea necesario cortar el producto.  El manejo y transporte de las muestras deberá efectuarse de tal manera que se impida su ruptura.  En muestras de productos a granel. ésta se obtendrá de varios puntos del contenedor para obtener una muestra representativa. se recomienda que la persona que elabora los alimentos.  Cuando sea necesario tomar la temperatura. Para la refrigeración es recomendable el empleo de recipientes con líquido refrigerante o hielo potable contenido en bolsas de plástico impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de los envases o que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados. Etiquetado.

así como la marca comercial y cualquier otra información que se considere importante. Nota: una coloración obscura puede aparecer.  Tomar una muestra representativa tanto de la superficie externa como del interior.  Transferir 0. Selección en Medios Sólidos. representante y/o distribuidor.  Se debe tener especial cuidado en la disposición de aquellos materiales y equipo que hayan estado en contacto con alimentos sospechosos. Enriquecimiento secundario. 14  Los productos con presentación comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura ambiente. mujeres embarazadas o personas de edad avanzada. Se recomienda una muestra de 25 g o más. b) Clave única que permita la identificación del domicilio del fabricante. Enriquecimiento primario. a fin de obtener una relación 1:10. aislado de áreas de producción de alimentos.  Transferirlo al Caldo Fraser medio. Pesar 25 g o mL a frascos de dilución con 225 mL del Caldo Fraser medio. durante la incubación.  Incubar el medio inoculado a 48 h ± 2 h a 36 °C ± 1 °C. en donde se señale las condiciones sanitarias en el que se encontraban los productos antes de efectuar la toma de muestra o algún otro dato que sea significativo para determinar los análisis microbiológicos que sean necesarios. O2 5%-15%). 1. . para obtener una dilución 1:10 (masa-volumen o volumen-volumen). sembrar por estría cruzada 2 placas de los siguientes medios selectivos:  Agar Oxford  Agar PALCAM 2. Procedimiento Analítico. d) Observaciones. Invertir las placas e incubar un juego de agar Oxford y PALCAM a 30 °C ± 1 °C y el otro a 36 °C ± 1 °C. en un ambiente controlado. siempre y cuando ésta no exceda de 45°C  Para la conservación. antes de desecharlos o volver a utilizarlos. a un tubo conteniendo 10 mL del Caldo Fraser. sembrar por estría cruzada 2 placas de los siguientes medios selectivos:  Agar Oxford  Agar PALCAM 3.  Esta técnica por ningún motivo debe aplicarla personal inmunocomprometido ya sea por enfermedad o por el uso de medicamentos. Inocular a partir de los cultivos obtenidos en el Enriquecimiento primario.  Las muestras que se entreguen al laboratorio deberán acompañarse de un informe que además de contener la identificación de la muestra.  Debe realizarlo un microbiólogo experimentado. incluya los siguientes datos: a) Número de unidades y/o cantidad. durante el transporte de las muestras no está permitido el empleo de sustancias químicas.  Homogeneizar por 1 min o 2 min en licuadora o homogeneizador peristáltico dependiendo del tipo de muestra. La muestra testigo podrá eliminarse una vez que se obtengan resultados oficiales que indiquen el cumplimento de las especificaciones sanitarias y el particular no decida llevar a cabo su impugnación.1 mL del enriquecimiento primario. Inocular a partir de los cultivos obtenidos en el Enriquecimiento secundario. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción. NOTA: Las placas con agar PALCAM se pueden incubar en condiciones de micro-aerofilia (CO2 5% -12%.  Incubar a 30 °C ± 1 ºC por 24 h ± 2 h. Este método se basa en el análisis de 25 g de la muestra analítica en una proporción de 1:9 de muestra/caldo. II. c) Indicar nombre genérico y específico del producto.

 Tomar 1 colonia aislada de ASTEL. a) Prueba de hemólisis. e) Prueba de movilidad. así como la catalasa son indicativos de Listeria spp. innocua).  Incubar por 48 h a 25 °C ± 1 ºC. Las placas NO deben presentar agua de condensación en la superficie del medio.  Después de la incubación a 36 °C ± 1 °C por 24 h ± 2 h. con el sistema óptico de Henry se trata de hacer incidir luz transmitida oblicuamente con una lámpara de luz blanca lo suficientemente potente como para iluminar la placa en un ángulo de 45°. c) Catalasa. inocular una placa con agar sangre de carnero al 5% para determinar la actividad hemolítica. bacilos largos o cortos con una movilidad rápida de nado y que no es característico de Listeria spp. a) Agar ASTEL. . monocytogenes. Pruebas auxiliares confirmatorias. d) Tinción de gram. Simultáneamente utilizar cepas control positiva (L. y suspenderla en un tubo conteniendo CST con extracto de levadura. Si las características morfológicas y fisiológicas. Confirmación de L. inocular agar de movilidad picando 1 colonia obtenida en ASTEL. Después de la incubación por 24 h; si se observa un crecimiento pobre o si no se observan colonias; volver a incubar por 18 h a 24 h.  Incubar estas placas a 36 °C ± 1 °C por 18 h a 24 h o hasta que el crecimiento sea satisfactorio (no más de 72h).  Dibujar una cuadrícula de 20 a 25 espacios en el anverso de la placa de agar sangre de carnero al 5%.  Tomar de cada placa de agares selectivos. b) Luz de Henry.  Se recomienda el uso de cepas (positivo y negativo). Precaución: la agitación del reactivo con la suspensión del microorganismo debe hacerse con un asa de plástico o palillo de madera estéril.  Si el crecimiento no es suficiente.  Depositar una gota de este cultivo entre un portaobjetos y cubreobjetos y examinar en el microscopio.  Tomar una colonia aislada y suspenderla en una gota de solución de peróxido de hidrógeno. 15 4. incubar por 5 días adicionales y observar la picadura al término de ese tiempo.  Examinar el crecimiento alrededor de la picadura. examinar las cepas de prueba y los controles. Observar las placas para detectar la presencia de colonias presuntivas de Listeria spp. La placa puede ser observada a simple vista. 5 colonias sospechosas de Listeria spp.  Examinar las placas de ASTEL con colonias típicas. pero es preferible el uso de un microscopio de disección o lupa.  Esta prueba tiene carácter informativo. tomar para su confirmación todas las colonias que hayan crecido.  La inmediata formación de burbujas indica una reacción positiva.  Sembrar por estría cruzada. para obtener colonias aisladas en cajas con ASTEL.  Utilizando un asa recta. monocytogenes) y negativas (L. Nota: Cultivos incubados a la temperatura de 25 °C ± 1 ºC pueden ser falsos positivos al exhibir dicho movimiento: se recomienda siempre comparar el cultivo de prueba con cepas conocidas de cocos.  Tomar 1 colonia aislada obtenida en ASTEL e inocular por picadura un cuadro por cada cultivo a probar. Si alguna de las placas tiene menos de 5 colonias presuntivas.  Incubar a 25 °C ± 1 ºC por 8 h a 24 h o hasta que se observe el medio turbio.  Realizar la tinción de Gram a 1 colonia aislada obtenida en ASTEL. f) Prueba alternativa de movilidad. evitando el contacto con el reactivo.

Después de 48 h las colonias se observan de color verde de aproximadamente 1. equi. con el centro hundido y rodeadas de un halo negro.  Incubar las placas a 36 °C ± 1 °C por 12 h a 18 h. Oxford Después de 48 horas: las colonias se tornan oscuras con posible brillo verdoso de aproximadamente 2 mm. pero siempre con halos oscuros. Se observan como bacilos cortos con un movimiento Prueba de movilidad giratorio (trumbling). dejar incubar hasta 5 días (alternativamente pueden utilizarse sistemas de bioquímicas miniaturizadas o métodos de biología molecular).  Utilizando un asa bacteriológica. convexas. b) Utilización de Carbohidratos (Ramnosa y Xilosa). Tinción de Gram Se observan bacilos cortos Gram Positivos. aureus y otra línea paralela de R. 16  Examinar las placas con una luz brillante para poder comparar las cepas de prueba con los controles. Si no se obtiene un buen aislamiento. proceder a sembrar nuevamente otra colonia sospechosa de los medios selectivos. Morfología de las Colonias. L. Se Luz de Henry recomienda el uso de cepas (positivo y negativo).  Si después de 48 h de incubación no se observa una reacción positiva clara. con halos negros y centros hundidos. para que recuperen su color de rosa a púrpura. . a veces con centros negros. Agar Características típicas Después de 24 horas: colonias pequeñas (1 mm) grisáceas. c) Prueba de CAMP. Las colonias típicas se observan de 1 mm a 2 mm de diámetro. ivanovii. de tal forma que queden paralelas y diametralmente opuestas para que entre estas pueda estriarse la cepa sospechosa de Listeria. rodeadas por un halo oscuro. grisáceas o verde olivo de PALCAM aproximadamente 1.  Simultáneamente probar cepas control: L. inocular cada uno de los caldos de carbohidratos a probar usando colonias aisladas en ASTEL. Debido al típico movimiento de Listeria spp como resultado Prueba alternativa de movilidad un crecimiento característico en forma de sombrilla. Pruebas auxiliares complementarias Pruebas Reacciones positivas Las colonias aparecen de color azul-gris a azul. CUADROS DE IDENTIFICACIÓN. Para placas incubadas en anaerobiosis dejarlas expuestas al aire por 1h.5 mm a 2 mm de diámetro. innocua y/o L.  En una placa de agar sangre de carnero al 5% sembrar una estría de la cepa de S. Después de 24 h se observan colonias muy pequeñas. sin que lleguen a tocarse entre sí.5 mm a 2 mm de diámetro.  Incubar a 36 °C ± 1 °C por 5 días. monocytogenes. Catalasa Formación inmediata de burbujas. III. incoloras y ASTEL opacas con borde entero.

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Confirmación de Listeria monocytogenes
Pruebas Reacciones positivas
L. monocytogenes produce una zona ligeramente clara
alrededor del punto de la picadura (β-hemólisis).
L. innocua no muestra una zona clara alrededor de la
Prueba de hemólisis
picadura.
L. ivanovii usualmente se observa una zona ancha, clara y
delimitada de β-hemólisis.
Producción de ácido y cambio de color a amarillo cuando se
utiliza base caldo purpura de bromocresol adicionado con
Utilización de Carbohidratos
cada uno de los carbohidratos, dentro de las primeras 24 h a
48 h.
La hemólisis de L. monocytogenes y L. seeligeri se
incrementa cerca de la estría de S. aureus.
La hemólisis de L. ivanovii se aumenta cerca de la estría de
Rhodococcus equi.
Las especies restantes de Listeria no son hemolíticas en
esta prueba.

Prueba de CAMP

3. Staphylococcus aureus.
Es una bacteria altamente vulnerable a tratamientos térmicos y a varios agentes sanitizantes. La presencia de
esta bacteria en los alimentos procesados o en los equipos donde se procesan, es generalmente un indicador de
sanitización inadecuada o manejo inadecuado durante la producción. S. aureus produce enterotoxinas
termorresistentes que al ingerirse pueden causar intoxicaciones alimentarias. Es actualmente responsable de un alto
porcentaje de los brotes de intoxicación alimentaria a nivel mundial [12].

Entre las razones para determinar el Staphylococcus aureus en alimentos están:
 Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de una enfermedad de origen alimentario.
 Determinar si un alimento o ingrediente es fuente potencial de este microorganismo enterotoxigénico.
 Demostrar la contaminación post-proceso la cual es usualmente debida a contacto humano o con superficies
inadecuadamente sanitizadas.

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Los alimentos sujetos a contaminación post-proceso con tipos enterotoxigénicos de Staphylococcus aureus
representan un riesgo por la ausencia de flora competitiva que normalmente restringe el crecimiento del
Staphylococcus aureus y la producción de enterotoxinas. Este tipo de alimentos se vuelven más peligrosos, si además
son sujetos a un inadecuado manejo o son mantenidos a temperaturas de conservación inapropiadas.

Los alimentos perecederos tales como: carnes crudas y procesadas, ensaladas, productos de pastelería y productos
de leche, son los más comúnmente asociados con intoxicación estafilocóccica.

MATERIAL
Para la Toma de la muestra [7].
 Frascos de boca ancha con tapa de rosca o tapón esmerilado de material esterilizable, no tóxico y de tamaño
acorde con la cantidad de muestra deseada.
 Bolsas de polietileno estériles de varias medidas.
 Hieleras de poliestireno o de otro material aislante
 Papel aluminio.
 Papel estraza.
 Etiquetas auto adheribles.
 Cinta testigo.
 Marcadores indelebles.
 Algodón.
 Cerillos o encendedor
 Instrumentos para toma de muestra: muestreadores, cucharones, espátulas, cuchillos, pinzas, etc. (de acero
inoxidable o de cualquier otro material que no provoque cambios que puedan afectar los resultados).
 Lámparas de alcohol.
 Frasco con etanol o Isopropanol al 70 %.
 Frascos con agua clorada y tiosulfato de sodio, para toma de muestra.
 Hielo o bolsas refrigerantes.
 Bata, cubreboca, cofia y guantes estériles.

Para el análisis microbiológico [8].
Materiales
Cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas.
Asa de platino o níquel de 3 mm de diámetro o 10 μl
Pipetas graduadas de 1 ml, 5 ml, 10 ml
Matraz Erlenmeyer de 500 ml
Cajas Petri estériles de vidrio de 15 mm x 100 mm
Tubos de ensayo de 16 mm x 150 mm
Tubos de ensayo de 10 mm x 75 mm
Pipetas Pasteur
Gradilla
Mechero de Bunsen o Fisher
Probetas
Varillas de vidrio de 3.5 mm x 20 cm
Cámara húmeda: caja Petri en la cual se coloca una varilla de vidrio en
forma de “V” rodeada de algodón humedecido con agua

Medios de cultivo
Agar Baird Parker
Solución de Telurito de potasio

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Emulsión de yema de huevo
BHI
Solución reguladora de fosfatos
Agua peptonada
Solución salina 0.85%
Agar Azul de Toluidina-ADN
Plasma de Conejo con EDTA
Agua peptonada amortiguada
Peróxido de hidrógeno al 3%
Caldo rojo de fenol (glucosa y manitol)
Aceite de parafina o mineral estéril
Solución trazable para verificación de potenciómetro

MÉTODOS
I. Relativo a la muestra.
Toma de la muestra [9].
 La toma de muestra debe hacerse con rapidez, pero cuidadosamente. Los recipientes para la toma de muestra
deben abrirse únicamente al momento de introducir ésta y cerrarlos de inmediato. No tocar el interior de los
envases y evitar que la tapa se contamine.
 La toma de muestra de productos envasados con presentación comercial para venta al menudeo se llevará a
cabo en forma aleatoria y no aséptica, tomándose del mismo lote y en cantidad suficiente para sus análisis,
enviándose al laboratorio tal como se presentan al consumidor.
 Tratándose de muestrear productos envasados en recipientes grandes, es preciso abrir éstos y extraer la
muestra en condiciones asépticas para evitar la contaminación microbiana.
 Si la muestra a obtener está expuesta al aire libre y a otras contaminaciones, no requieren precauciones
estrictamente asépticas.
 Cuando sea necesario tomar la temperatura, la muestra que se utilice para tal fin deberá ser diferente de la que
se envía para su análisis.
 Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato, se recomienda que la persona que elabora los
alimentos, sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estériles con los utensilios que emplea
normalmente. Los alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la temperatura en
que se muestrearon, esto únicamente si el traslado es menor a una hora, de lo contrario deben enfriarse a
temperatura ambiente y trasladarse en condiciones de refrigeración.
 En el caso de muestras líquidas o semilíquidas se deberá agitar o mezclar hasta conseguir homogeneizar y
después efectuar la toma de la muestra en diferentes niveles.
 En muestras sólidas cuando sea necesario cortar el producto, debe muestrearse con ayuda de utensilios estériles
como sacabocados, cucharas, cuchillos, etc.
 En muestras de productos a granel, ésta se obtendrá de varios puntos del contenedor para obtener una muestra
representativa.
 Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta de una partida a granel, antes
de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida con el
flujo.

Etiquetado.
 Es indispensable identificar el recipiente claramente, inmediatamente antes o después de colocar en él la
muestra, mediante rótulo o etiqueta (indelebles), con los siguientes datos:
a) Fecha
b) Lugar
c) Hora del muestreo
d) Número de lote
e) Temperatura de la toma de muestra si es que procede.

 Homogeneizar por 1 min o 2 min en licuadora u homogeneizador peristáltico. Este método es adecuado para el análisis de alimentos en los cuales se esperen más de 100 células de Staphylococcus aureus por gramo. . o 0. evitar que se dañen. Procedimiento Analítico.1 mL de la suspensión inicial (dilución 10-1) en el caso de otros productos. representante y/o distribuidor. con la confirmación mediante las pruebas de coagulasa y termonucleasa. transferir 25g o mL a frascos de dilución con 225mL de solución reguladora de fosfatos. b) Clave única que permita la identificación del domicilio del fabricante. para obtener una dilución 1:10. c) Indicar nombre genérico y específico del producto. así como la marca comercial y cualquier otra información que se considere importante. durante el transporte de las muestras no está permitido el empleo de sustancias químicas. II. alteración o contaminación. La muestra testigo podrá eliminarse una vez que se obtengan resultados oficiales que indiquen el cumplimento de las especificaciones sanitarias y el particular no decida llevar a cabo su impugnación. humedezcan o contaminen con otras. Los alimentos perecederos se transportarán bajo condiciones de temperatura de 2 a 8 °C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta el momento de realizar las pruebas.  Las muestras que se entreguen al laboratorio deberán acompañarse de un informe que además de contener la identificación de la muestra. Repetir el procedimiento para las diluciones siguientes si son necesarias. fosfatos o agua peptonada amortiguada. la temperatura no debe ser mayor de 0°C. empleando para conservarla hielo seco. se efectúa directamente en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial. Para la refrigeración es recomendable el empleo de recipientes con líquido refrigerante o hielo potable contenido en bolsas de plástico impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de los envases o que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados. incluya los siguientes datos: a) Número de unidades y/o cantidad. Este método permite hacer una estimación del contenido de Staphylococcus aureus en alimentos. 20  La etiqueta deberá colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco. por duplicado a cajas de agar Baird Parker.  Las muestras deben entregarse al laboratorio lo más rápidamente posible. Selección en medios sólidos. siempre y cuando ésta no exceda de 45°C  Para la conservación. 0. evitando su exposición a la luz solar directa. para preparar una dilución 1:10.  Transferir por medio de una pipeta estéril. evitar que la presión que puedan ejercer otros recipientes o una cantidad excesiva de las mismas las deformen u originen derrames y provoquen que el contenido se ponga en contacto con el exterior de la envoltura. En caso de alimentos congelados. en donde se señale las condiciones sanitarias en el que se encontraban los productos antes de efectuar la toma de muestra o algún otro dato que sea significativo para determinar los análisis microbiológicos que sean necesarios. en el nudo o cierre de la bolsa en forma tal que se evite que la muestra sea alterada o violada.  En el caso de muestras no perecederas.  El manejo y transporte de las muestras deberá efectuarse de tal manera que se impida su ruptura.  Tomar diferentes porciones de la muestra.  Cuando no se disponga de 25g de muestra se deberá justificar y utilizar la cantidad necesaria de solución reguladora de fosfatos. la caja. d) Observaciones. las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su recolección.1 mL de la muestra directa si es líquida.  En el caso de muestras individuales blandas. Conservación y transporte.  Los productos con presentación comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura ambiente. Preparación de la muestra.

en el caso de observar bacilos positivos.0 mL en 3 placas. En ambos casos evitar usar cajas húmedas. aureus.1 mL del cultivo anterior a 0.  Cubrir el caldo con una capa de aceite de parafina o aceite mineral de al menos 25mm. 0. tratar éstas como una sola y seguir los procedimientos de confirmación.  Mantener las placas con las tapas hacia arriba hasta que el inóculo sea absorbido totalmente por el agar. a) Prueba de catalasa. observar hasta las 24h.  Cuidadosamente distribuir el inóculo tan pronto como sea posible. epidermidis. Pruebas confirmatorias.  Mantener los cultivos en AST a no más de 27 °C ± 1 ºC para pruebas posteriores.  Con ayuda de una pipeta Pasteur hacer orificios equidistantes en el agar. aureus.  Utilizar simultáneamente un control positivo de S.  Incubar hasta 5 días a 36°C ± 1ºC. sobre la superficie del agar con varillas estériles de vidrio en ángulo recto.  A partir de un cultivo en AST realizar la prueba de la catalasa en un portaobjetos. si se observan cocos se seguirá con su confirmación.  Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típicas se debe agregar la nota de "valor estimado" al reporte de los resultados.  Preparar portaobjetos con 3mL de agar azul de toluidina ADN. o de cada dilución distribuida en 3 placas como sigue: 0.  En un baño de agua hirviendo calentar durante 15 min.3 mL sobre la superficie de las placas de Agar Baird Parker. se deberá aumentar el límite de detección. aureus y un control negativo de S.  Incluir los controles positivos y negativos.  Inocular un tubo con caldo para la fermentación adicionado de manitol al (0. Pruebas adicionales.  Incubar a 37 °C ± 1 ºC en baño de agua y observar periódicamente a intervalos de 1 h durante las primeras 4 h a 6 h; si no hay formación de coágulo. c) Utilización anaeróbica de la glucosa. 0.3mL de cultivo en BHI. emulsificar una porción del cultivo con una gota de peróxido de hidrógeno al 3%.5%).3 mL y 0.  Incubar a 35ºC ± 1°C en cámara húmeda de 4h a 24h. por lo contrario. formándose un coágulo en 10s-15s.  Seleccionar y sembrar cada colonia típica en tubos con 0.  Utilizando una pipeta Pasteur transferir una gota del cultivo a un orificio del medio.  Para cada lote nuevo de reactivo se deberá realizar la prueba de coagulabilidad del plasma de conejo añadiendo una gota de cloruro de calcio al 5% a 0. repetir para cada cepa incluyendo testigos positivo y negativo.  Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas y atípicas de S.  Incubar a 35 °C ± 1 ºC en baño de agua. Seleccionar por muestra 5 colonias típicas para su confirmación o 5 colonias atípicas. por duplicado. b) Utilización anaeróbica del manitol.  Invertir las placas e incubar por 44 h a 48 h a 36 ºC ± 1 ºC. para la realización de la tinción de Gram.4 mL. con un inóculo abundante. a) Prueba de coagulasa. aureus; si no es posible. durante 20 h a 24 h. b) Prueba de termonucleasa.5 mL de BHI y en tubos con AST.5mL de plasma reconstituido. seleccionar las placas de las diluciones más altas no obstante tengan más de 150 colonias.3 mL de plasma de conejo con EDTA (a menos que el fabricante indique otras cantidades).  Agregar a 0. 21 Nota: Si se sospecha que el alimento contiene bajas cuentas de S. . utilizando una para cada placa y dilución. en un factor igual a 10 inoculando 1 mL de la muestra directa si ésta es líquida.  Si fue inoculado 1. la colonia se tomará como negativa para S.

lisas. 2. circulares. lisas. húmedas y SIN halo claro alrededor. brillantes. 22  Inocular un tubo con caldo para la fermentación adicionado de glucosa al (0. húmedas y CON un halo claro (debido a la actividad de la lecitinasa) alrededor de la colonia. con un inóculo abundante. - Utilización anaeróbica de manitol + + - Utilización anaeróbica de glucosa + . 3. aureus. Tinción de Gram Cocos Gram positivos. brillantes. circulares. Si al menos el 80% de las colonias típicas seleccionadas fueron coagulasa positiva y/o termonucleasa positiva tomar el número total de las colonias contadas como presuntivas de S.  Incluir los controles positivos y negativos. En otros casos. agrupados en racimos. La mayoría de las cepas son negativas (más del 90%). Pruebas adicionales Pruebas Reacciones positivas Prueba de catalasa Producción de burbujas de gas. calcular el número de colonias presuntivas de S. de diámetro de 1 mm a 2 Baird Parker mm y muestran una zona opaca.  Incubar hasta 5 días a 36°C ± 1ºC.  Cubrir el caldo con una capa de aceite de parafina o aceite mineral de al menos 25mm. aureus. Características S. CUADROS DE IDENTIFICACIÓN. de diámetro de 1 mm a 2 Baird Parker mm y muestran una zona opaca. . Agar Características Atípicas Colonias negras. La mayoría de las cepas son positivas (más del 90%). convexas. La aparición de un halo color rosa extendido de por lo menos 1 mm Prueba de termonucleasa alrededor de la perforación. aureus. - +. Interpretación: 1. Pruebas confirmatorias Pruebas Reacciones positivas Cuando el coágulo se forma completamente y es firme al invertir el Prueba de coagulasa tubo. -. III. epidermidis Micrococcus Actividad de catalasa + + + Producción de coagulasa + . Utilización anaeróbica de la Un cambio en la coloración del indicador indica la utilización glucosa anaeróbica de la glucosa y la presencia S.5%). aureus a partir del porcentaje obtenido de colonias coagulasa y/o termonucleasa positivas confirmadas. aureus. - Producción de termonucleasa + . Las pruebas de termonucleasa o coagulasa positiva son consideradas como resultados confirmatorios de S. aureus S. convexas. Agar Características típicas Colonias negras. Morfología de las Colonias. Utilización anaeróbica del Un cambio en la coloración del indicador indica la utilización manitol anaeróbica del manitol y la presencia S.

 Etiquetas auto adheribles. aunque las células vegetativas son fácilmente inactivadas por el calor. aureus considerando el factor de dilución. aureus para cada dilución como se especifica en los puntos anteriores. si la diferencia entre los logaritmos de las dos diluciones es menor a 0. Materiales Cuchillos. MATERIAL Para la Toma de la muestra [7]. etc.3. cubreboca.  Cinta testigo. La intoxicación por esta bacteria también es llamada “de las cafeterías”.3; reportar el valor más bajo. incluye: aves. espátulas. calcular el logaritmo en base diez de cada dilución y realizar la resta de éstos. para toma de muestra.  Bata.  Bolsas de polietileno estériles de varias medidas. Es un organismo bacilar. 10 ml Matraz Erlenmeyer de 500 ml Cajas Petri estériles de vidrio de 15 mm x 100 mm Tubos de ensayo de 16 mm x 150 mm Tubos de ensayo de 10 mm x 75 mm Pipetas Pasteur . su crecimiento óptimo se presenta en condiciones de temperatura entre 37-45 °C.  Frascos de boca ancha con tapa de rosca o tapón esmerilado de material esterilizable. no tóxico y de tamaño acorde con la cantidad de muestra deseada. Cuando en dos diluciones consecutivas se obtienen cuentas entre 15 y 150 colonias (típicas o atípicas) calcular el número de S. es capaz de proliferar en presencia de NaCl al 2% (pero no al 6. carne cruda de vaca o ternera. pinzas. perfringens son causados por ingestión de carnes o productos cárnicos preparados. (de acero inoxidable o de cualquier otro material que no provoque cambios que puedan afectar los resultados). Si por el contrario la diferencia entre los logaritmos es mayor a 0. espátulas. 23 4.5%). Para el análisis microbiológico [8]. sus esporas presentan termorresistencia (pueden hervir varias horas conservando su viabilidad) [13].  Hieleras de poliestireno o de otro material aislante  Papel aluminio. 5. gram positivo. cucharones.  Hielo o bolsas refrigerantes. pinzas. Clostridium perfringens. Promediar los resultados de los duplicados. Los brotes de C. esporulado.  Marcadores indelebles.  Frascos con agua clorada y tiosulfato de sodio. salsas o jugos de carnes.  Lámparas de alcohol. anaerobio estricto. 5 ml. Asa de platino o níquel de 3 mm de diámetro o 10 μl Pipetas graduadas de 1 ml.  Frasco con etanol o Isopropanol al 70 %.  Papel estraza. 4.  Algodón. reportar el promedio de las dos diluciones. tijeras. cuchillos. cucharas.  Cerillos o encendedor  Instrumentos para toma de muestra: muestreadores. calcular la cuenta de S. cofia y guantes estériles.

debe muestrearse con ayuda de utensilios estériles como sacabocados.  En muestras sólidas cuando sea necesario cortar el producto. se recomienda que la persona que elabora los alimentos.  Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta de una partida a granel.  En muestras de productos a granel.  La toma de muestra de productos envasados con presentación comercial para venta al menudeo se llevará a cabo en forma aleatoria y no aséptica. 24 Gradilla Mechero de Bunsen o Fisher Medios de cultivo Agua peptonada al 1% Agar Triptosa sulfito cicloserina con yema de huevo Agar Triptosa sulfito cicloserina sin yema de huevo Caldo hígado cocido Medio fluido de Tioglicolato Medio acidificado de leche fierro Agar gelatina lactosa Agar movilidad nitratos Caldo para esporulación Caldo Tioglicolato más 1% de salicina Caldo Tioglicolato más 1% de rafinosa Caldo Tioglicolato más 1% de glucosa Caldo Tioglicolato más 1% de arabinosa Caldo Tioglicolato más 1% de manitol Caldo Tioglicolato más 1% de lactosa Agar de esculina inclinado MÉTODOS I. Relativo a la muestra. Toma de la muestra [9]. tomándose del mismo lote y en cantidad suficiente para sus análisis. Etiquetado. de lo contrario deben enfriarse a temperatura ambiente y trasladarse en condiciones de refrigeración. Los recipientes para la toma de muestra deben abrirse únicamente al momento de introducir ésta y cerrarlos de inmediato.  Tratándose de muestrear productos envasados en recipientes grandes.  Cuando sea necesario tomar la temperatura. es preciso abrir éstos y extraer la muestra en condiciones asépticas para evitar la contaminación microbiana. cuchillos. ésta se obtendrá de varios puntos del contenedor para obtener una muestra representativa. cucharas.  La toma de muestra debe hacerse con rapidez.  En el caso de muestras líquidas o semilíquidas se deberá agitar o mezclar hasta conseguir homogeneizar y después efectuar la toma de la muestra en diferentes niveles. No tocar el interior de los envases y evitar que la tapa se contamine.  Si la muestra a obtener está expuesta al aire libre y a otras contaminaciones. enviándose al laboratorio tal como se presentan al consumidor.  Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato. esto únicamente si el traslado es menor a una hora. la muestra que se utilice para tal fin deberá ser diferente de la que se envía para su análisis. . pero cuidadosamente. antes de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida con el flujo. etc. sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estériles con los utensilios que emplea normalmente. no requieren precauciones estrictamente asépticas. Los alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la temperatura en que se muestrearon.

con los siguientes datos: a) Fecha b) Lugar c) Hora del muestreo d) Número de lote e) Temperatura de la toma de muestra si es que procede. Conservación y transporte.  Las muestras que se entreguen al laboratorio deberán acompañarse de un informe que además de contener la identificación de la muestra. La muestra testigo podrá eliminarse una vez que se obtengan resultados oficiales que indiquen el cumplimento de las especificaciones sanitarias y el particular no decida llevar a cabo su impugnación. alteración o contaminación. en donde se señale las condiciones sanitarias en el que se encontraban los productos antes de efectuar la toma de muestra o algún otro dato que sea significativo para determinar los análisis microbiológicos que sean necesarios. incluya los siguientes datos: a) Número de unidades y/o cantidad. Procedimiento Analítico. agar triptosa-sulfito cicloserina.  La etiqueta deberá colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco. perfringens tipo A. evitando su exposición a la luz solar directa. d) Observaciones. empleando para conservarla hielo seco. las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su recolección. en el nudo o cierre de la bolsa en forma tal que se evite que la muestra sea alterada o violada. II. Éste método especifica el método de recuperación de C. representante y/o distribuidor. perfringens [14]: a) Aislamiento y numeración presuntiva en agar sangre neomicina y confirmación por la reacción de Naegler y la neutralización de la reacción antitoxina de C. Ésta técnica analítica tienen como principio el de inocular diluciones decimales de en placas de agar TSC. siempre y cuando ésta no exceda de 45°C  Para la conservación. numeración e identificación de C.  En el caso de muestras individuales blandas. mediante rótulo o etiqueta (indelebles). evitar que se dañen. perfringens mediante el método de cultivo convencional y es aplicable a cualquier alimento en el cual C.  Las muestras deben entregarse al laboratorio lo más rápidamente posible. En caso de alimentos congelados. c) Indicar nombre genérico y específico del producto. b) Aislamiento y numeración en placas de tipo agar triptosa sulfito cicloserina y fermentación de carbohidratos. b) Clave única que permita la identificación del domicilio del fabricante. en donde el Clostridium perfringens se manifiesta por la reducción de sulfitos a sulfuros. Para la refrigeración es recomendable el empleo de recipientes con líquido refrigerante o hielo potable contenido en bolsas de plástico impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de los envases o que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados. humedezcan o contaminen con otras.  En el caso de muestras no perecederas. Los alimentos perecederos se transportarán bajo condiciones de temperatura de 2 a 8 °C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta el momento de realizar las pruebas. 25  Es indispensable identificar el recipiente claramente. inmediatamente antes o después de colocar en él la muestra. la caja. . así como la marca comercial y cualquier otra información que se considere importante. Actualmente existen 2 métodos diferentes para el aislamiento.  El manejo y transporte de las muestras deberá efectuarse de tal manera que se impida su ruptura. evitar que la presión que puedan ejercer otros recipientes o una cantidad excesiva de las mismas las deformen u originen derrames y provoquen que el contenido se ponga en contacto con el exterior de la envoltura. los cuales reaccionan con las sales de hierro. durante el transporte de las muestras no está permitido el empleo de sustancias químicas.  Los productos con presentación comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura ambiente. la temperatura no debe ser mayor de 0°C. perfringens esté viable y presente. produciendo color negro de sulfuro ferroso.

 Después examinar el desarrollo microbiano de cada cultivo mediante tinción de Gram y comprobar la pureza de las colonias desarrolladas.  Inocular por picadura los tubos con medio gelatina lactosa y medio movilidad nitratos.  Colocar las placas sin invertir dentro de una jarra para anaerobios con generador y catalizador para incubar de 20-24 h a 35° C  Selecciona las placas que contengan entre 20-200 colonias negras. en caso de no tener colonias sospechosas en agar TSC. .  Inocular 0. a) Prueba de leche-fierro. para ver si el crecimiento solamente está a lo largo de la picadura.1mL de cada dilución sobre placas de agar TSC con yema de huevo y distribuir con varilla. Selección en medios sólidos – Método alternativo. b) Gelatina-lactosa. guardar en refrigeración específicamente la dilución 1:10 Selección en medios sólidos.1% dilución 1:10. agitar perfectamente y dejar que se absorba por completo la muestra. en este caso de agua peptonada al 0.  Después de que el inóculo se ha absorbido. aureus tomando en cuenta el volumen inoculado en cada placa TSC el cual puede ser de 1 mL o 0.  Verter 8mL de agar TSC sin yema de huevo a cada placa. perfringens de los tubos de Caldo hígado cocido o medio de carne. seleccionar colonias características y sembrarlas nuevamente sobre placas de agar TSC con yema de huevo e incubar anaeróbicamente durante 24 horas a 35 + 2 ° C.  Incubar durante 24 h a 35 + 2 °C. Dejar solidificar. Este procedimiento también es usado para aislar C.  Pesar en condiciones de asepsia. observar los tubos de movilidad-nitratos. 25 g del alimento y añadir 225mL de diluyente. 26 Preparación de la muestra.  Por duplicado.  Contar y calcular el número de colonias de clostridios por g de alimento  Verificar la manera de efectuar los cálculos en la técnica analítica de S.  Homogeneizar durante 1-2 minutos a velocidad baja y efectuar diluciones decimales hasta 10-4 con la menor aireación posible. con el fin de evitar derramamientos accidentales.  Esta prueba es suficiente para casos de prueba presuntiva. colocar en las cajas de TSC con yema de huevo 1mL de cada dilución.  Posteriormente en el caso específico de la gelatina lactosa  Enfriar el tubo 1 hora a 5°C y observar si hubo licuefacción de la gelatina.  Es recomendable utilizar tubos largos para esta prueba. Identificación bioquímica.1 mL. c) Movilidad de nitratos  Como C. a partir de cultivos puros de caldo Tioglicolato fluido o colonias aisladas en el agar TSC. Si existe evidencia de contaminación. si el medio de gelatina lactosa permanece sólido.  Incubar de 15-24 horas a 35 + 2 °C. perfringens no es móvil. añadir una sobrecapa de 8mL de agar TSC sin emulsión con yema de huevo. incubar adicionalmente 24 h a 35 + 2 °C y observar.  Seleccionar 10 colonias típicas e inocular en medio fluido del Tioglicolato desaireado y enfriado.  Incubar a 35+ 2 ° C por 24h.  Incubar a 46+ 1 °C durante 2 horas.  Inocular medio de leche-fierro con 1 mL del cultivo del Tioglicolato fluido-del paso anterior.

 Incubar durante 24 h a 38 + 1 °C  Posteriormente examinar el medio después de adicionar un indicador ácido-base.  Inocular caldo para esporulación. para lo cual se añaden 0. Incubar 24 h a 35 + 2 °C  Refrigerar los cultivos esporulados por si se requieren pruebas adicionales. por la actividad de la lecitinasa. f) Fermentación de otros carbohidratos. Morfología de las Colonias. Identificación Bioquímica Prueba Comportamiento Movilidad - Reducción de nitratos + Licuefacción de la gelatina a 22 °C + Fermentación de la glucosa + Fermentación de la rafinosa +.  Incubar durante 24 h a 38 + 1 °C. 27  Por otra parte C. Bioquímica diámetro. gas y acidez Fermentación de la sacarosa + Fermentación de la arabinosa - Fermentación del manitol - Fermentación de la salicina - Fermentación de la lactosa + Fermentación tormentosa de la leche + Hidrólisis de la esculina - .  Inocular el caldo Tioglicolato adicionado del carbohidrato seleccionado. perfringens reduce nitratos a nitritos. con zonas opacas de 2-4mm de TSC. Agar Características típicas TSC con yema Colonias con diámetro aproximado de 2 a 4 mm opacas con una zona de huevo blanca alrededor de la colonia debido a la actividad de la lecitinasa.2 mL del reactivo B. g) Hidrólisis de Esculina.  Tomar una asada de caldo Tioglicolato enriquecido e inocular por estría únicamente la pendiente del tubo de agar esculina. III. d) Caldo de esporulación. e) Fermentación de salicina y rafinosa. 1 mL de caldo Tioglicolato fluido. CUADROS DE IDENTIFICACIÓN.  Inocular el caldo Tioglicolato que contiene salicina o rafinosa con una asada del cultivo de caldo Tioglicolato enriquecido. con una asada del cultivo de caldo Tioglicolato enriquecido. Colonias con color amarillo grisáceo.  Incubar durante 24 h a 35 + 1 °C.5 mL de reactivo A y 0.

Campylobacter jejuni. Las especies del género Campylobacter agrupan bacilos Gram negativos curvos. Para el análisis microbiológico [8]. no tóxico y de tamaño acorde con la cantidad de muestra deseada. espátulas. ovejas. cubreboca.  Bata. pinzas. En cultivos de varios días (más de tres) degeneran en formas esféricas u ovoides (cocoides) que han perdido su viabilidad [15]. cuchillos. etc. agua contaminada o alimentos de origen animal. cucharas. Se considera que un alto porcentaje de infecciones es provocado por consumo de carne de ave mal cocida. (de acero inoxidable o de cualquier otro material que no provoque cambios que puedan afectar los resultados).  Hielo o bolsas refrigerantes. 28 5. siendo afectados todos los grupos étnicos de ambos sexos. MATERIAL Para la Toma de la muestra [7]. En países desarrollados. cofia y guantes estériles. perros. Asa de platino o níquel de 3 mm de diámetro o 10 μl Pipetas graduadas de 1 ml.  Marcadores indelebles. En países en vías de desarrollo la enfermedad parece ser más frecuente en niños de corta edad.  Lámparas de alcohol. cucharones. cabras.  Bolsas de polietileno estériles de varias medidas.  Frasco con etanol o Isopropanol al 70 %.  Cinta testigo. roedores silvestres o domésticos y toda variedad de aves de corral.  Algodón. 10 ml Matraz Erlenmeyer de 500 ml Cajas Petri estériles de vidrio de 15 mm x 100 mm Tubos de ensayo de 16 mm x 150 mm Tubos de ensayo de 10 mm x 75 mm Pipetas Pasteur Gradilla . Campylobacter se halla habitualmente como comensal del tracto gastrointestinal de vacas. cerdos. para toma de muestra. gatos.  Frascos de boca ancha con tapa de rosca o tapón esmerilado de material esterilizable. la diarrea por Campylobacter es más frecuente en los meses de verano. Muchos de los casos de enteritis humana han sido asociados al contacto con animales.  Etiquetas auto adheribles.  Hieleras de poliestireno o de otro material aislante  Papel aluminio.  Frascos con agua clorada y tiosulfato de sodio. espátulas. pinzas. tijeras. espirilados o en forma de S que presenta un flagelo único en uno o ambos extremos.  Cerillos o encendedor  Instrumentos para toma de muestra: muestreadores.  Papel estraza. Materiales Cuchillos. 5 ml. La campilobacteriosis es una zoonosis de distribución mundial.

en el nudo o cierre de la bolsa en forma tal que se evite que la muestra sea alterada o violada.  Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta de una partida a granel. Conservación y transporte.  En el caso de muestras líquidas o semilíquidas se deberá agitar o mezclar hasta conseguir homogeneizar y después efectuar la toma de la muestra en diferentes niveles. etc. de lo contrario deben enfriarse a temperatura ambiente y trasladarse en condiciones de refrigeración.  En muestras de productos a granel. esto únicamente si el traslado es menor a una hora.  En muestras sólidas cuando sea necesario cortar el producto. la muestra que se utilice para tal fin deberá ser diferente de la que se envía para su análisis. se recomienda que la persona que elabora los alimentos.  Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato. inmediatamente antes o después de colocar en él la muestra. enviándose al laboratorio tal como se presentan al consumidor. con los siguientes datos: a) Fecha b) Lugar c) Hora del muestreo d) Número de lote e) Temperatura de la toma de muestra si es que procede. Los alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la temperatura en que se muestrearon. cuchillos. pero cuidadosamente. la caja. antes de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida con el flujo.1% Agar selectivo para Campylobacter Caldo nitrato Medio SIM Prueba de oxidasa MÉTODOS I. Etiquetado.  Tratándose de muestrear productos envasados en recipientes grandes.  Es indispensable identificar el recipiente claramente. Los recipientes para la toma de muestra deben abrirse únicamente al momento de introducir ésta y cerrarlos de inmediato. Toma de la muestra [9].  La toma de muestra debe hacerse con rapidez. tomándose del mismo lote y en cantidad suficiente para sus análisis. No tocar el interior de los envases y evitar que la tapa se contamine. cucharas. mediante rótulo o etiqueta (indelebles). . ésta se obtendrá de varios puntos del contenedor para obtener una muestra representativa.  La toma de muestra de productos envasados con presentación comercial para venta al menudeo se llevará a cabo en forma aleatoria y no aséptica. debe muestrearse con ayuda de utensilios estériles como sacabocados. sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estériles con los utensilios que emplea normalmente.  Si la muestra a obtener está expuesta al aire libre y a otras contaminaciones.  Cuando sea necesario tomar la temperatura. es preciso abrir éstos y extraer la muestra en condiciones asépticas para evitar la contaminación microbiana.  La etiqueta deberá colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco. no requieren precauciones estrictamente asépticas. Relativo a la muestra. 29 Mechero de Bunsen o Fisher Medios de cultivo Agua peptonada al 0.

 Mantener las placas en su posición hasta que el inoculo sea absorbido por el agar. en donde se señale las condiciones sanitarias en el que se encontraban los productos antes de efectuar la toma de muestra o algún otro dato que sea significativo para determinar los análisis microbiológicos que sean necesarios.0 mL del mismo diluyente. humedezcan o contaminen con otras. II.  Colocar un círculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas de reactivo de oxidasa.  Homogenizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en licuadora o velocidad mínima.  Para el caso de muestras solidas colocar 25 g de la muestra. Alternativamente se puede utilizar un disco reactivo comercial. siempre y cuando ésta no exceda de 45°C  Para la conservación. las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su recolección. así como la marca comercial y cualquier otra información que se considere importante.  Las muestras que se entreguen al laboratorio deberán acompañarse de un informe que además de contener la identificación de la muestra. incluya los siguientes datos: a) Número de unidades y/o cantidad. Los alimentos perecederos se transportarán bajo condiciones de temperatura de 2 a 8 °C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta el momento de realizar las pruebas. Procedimiento Analítico.1 mL de las diluciones 10-1.  Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio estéril. entre 5 y 10 minutos aproximadamente. 10-3 y 10-4 a cajas Petri con agar selectivo para Campylobacter.0 mL de diluyente estéril al 0. iniciando a partir de la mayor dilución (Método de inoculación por extensión en superficie). evitar que se dañen. a) Prueba de oxidasa. representante y/o distribuidor. 30  El manejo y transporte de las muestras deberá efectuarse de tal manera que se impida su ruptura.  En el caso de muestras individuales blandas.  Invertir las placas e incubar en condiciones micro-aerofílicas 42-43°C.1% a la licuadora o bolsa Stomacher. Preparación de la muestra [16]. b) Clave única que permita la identificación del domicilio del fabricante.  Transferir 0. evitando su exposición a la luz solar directa. . Estas se presentan como gotas de agua extendidas a lo largo de la estría. durante el transporte de las muestras no está permitido el empleo de sustancias químicas. c) Indicar nombre genérico y específico del producto. la temperatura no debe ser mayor de 0°C.  Las muestras deben entregarse al laboratorio lo más rápidamente posible. d) Observaciones. Identificación Bioquímica.10-2. empleando para conservarla hielo seco. La muestra testigo podrá eliminarse una vez que se obtengan resultados oficiales que indiquen el cumplimento de las especificaciones sanitarias y el particular no decida llevar a cabo su impugnación.  Adicionar 90. alteración o contaminación. para muestras liquidas 25 mL de la muestra  Transferir la muestra pesada o medida a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estéril. evitar que la presión que puedan ejercer otros recipientes o una cantidad excesiva de las mismas las deformen u originen derrames y provoquen que el contenido se ponga en contacto con el exterior de la envoltura.  Después de incubar observar las colonias características de este microorganismo en el agar selectivo para Campylobacter.  En el caso de muestras no perecederas. Para la refrigeración es recomendable el empleo de recipientes con líquido refrigerante o hielo potable contenido en bolsas de plástico impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de los envases o que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados. en forma de “L”. En caso de alimentos congelados. Selección en medios sólidos. durante 24 a 48 horas.  Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el número de diluciones está en función de la procedencia de la muestra) en tubos de 16 X 150 mm conteniendo cada tubo 9.  Los productos con presentación comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura ambiente.

síndrome urémico hemolítico (SUH) y púrpura trombocitopénica trombótica. + Crecimiento aerobio - Movilidad + 6. Morfología de las Colonias. . Identificación Bioquímica Prueba Comportamiento Oxidasa + Catalasa + Reducción de nitratos + Producción de H2S +. + Hidrólisis de hipurato + Crecimiento a 37 °C y 42 °C +.  Si esta coloración no se observa. El ganado vacuno es señalado como el principal reservorio de STEC.  Para la lectura se debe agregar 0. el desarrollo de un color naranja confirma una prueba negativa (presencia de nitratos).  Inocular en medio SIM.2 mL del reactivo de cadmio.2 mL del reactivo C. le han permitido ser clasificado como uno de los patógenos transmitidos por los alimentos de más alto riesgo para la salud pública. CUADROS DE IDENTIFICACIÓN.  La formación inmediata de burbujas indica que la prueba es positiva. adicionar 0. y a la carne picada insuficientemente cocida como el vehículo más frecuente de los brotes [17]. incubar por 48 horas a una temperatura de 37 °C III.  Incubar a 35C por 5 días. La gravedad de las enfermedades producidas. Escherichia coli O157:H7.2 mL de reactivo A y 0. Agar Características típicas Colonias planas grisáceas. especialmente cuando afectan a la población infantil. y las bajas dosis infectivas que caracterizan no sólo a los brotes sino también a los casos esporádicos (menos de 100 UFC/g). c) Reducción de nitratos.  En forma alternativa adicionar al cultivo en caldo nitratos 0. b) Prueba de catalasa.  Un color naranja indica una prueba positiva (presencia de nitritos).  Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos. Si las colonias provienen de agar base con sangre.  Precauciones: la emulsión debe realizarse con un asada platico o palillo de madera estéril evitando el contacto del metal con el reactivo.2 mL de reactivo B. con una gota de solución de peróxido al 3%. no hemolíticas.  Emulsificar un cultivo puro. Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un patógeno emergente asociado a enfermedades transmitidas por alimentos. 31  Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en agar Skirrow y depositarlo en el papel filtro anterior. que puede causar enfermedades severas en el hombre como colitis hemorrágica (CH). translúcidas y de borde Selectivo continuo o discretamente irregular.2 mL del reactivo B y 0. cualquier contaminación con eritrocitos puede dar pruebas falsas positivas. d) Movilidad.

tijeras.  Hieleras de poliestireno o de otro material aislante  Papel aluminio.  Bata.  Lámparas de alcohol. etc. no tóxico y de tamaño acorde con la cantidad de muestra deseada. Materiales Cuchillos. cucharones.  Marcadores indelebles.  Algodón. espátulas. 10 ml Matraz Erlenmeyer de 500 ml Cajas Petri estériles de vidrio de 15 mm x 100 mm Tubos de ensayo de 16 mm x 150 mm Tubos de ensayo de 10 mm x 75 mm Pipetas Pasteur Gradilla Mechero de Bunsen o Fisher Medios de cultivo Solución salina bufferada con 0.  Etiquetas auto adheribles. cubreboca. cucharas. espátulas.  Cerillos o encendedor  Instrumentos para toma de muestra: muestreadores. pinzas. pinzas.  Frascos con agua clorada y tiosulfato de sodio.  Frascos de boca ancha con tapa de rosca o tapón esmerilado de material esterilizable.  Bolsas de polietileno estériles de varias medidas.  Papel estraza. (de acero inoxidable o de cualquier otro material que no provoque cambios que puedan afectar los resultados).  Hielo o bolsas refrigerantes.rojo de metilo Caldo sorbitol al 1 % en medio base con indicador Medio urea de Christensen Medio para lisina descarboxilasa . para toma de muestra. Para el análisis microbiológico [8].  Cinta testigo. Asa de platino o níquel de 3 mm de diámetro o 10 μl Pipetas graduadas de 1 ml.  Frasco con etanol o Isopropanol al 70 %. 5 ml. cuchillos.05% de Tween 20 Solución fisiológica Solución de novobiocina Caldo triptona soja modificado con novobiocina Agar MacConkey sorbitol con cefixima-telurito Medio Cromogénico Agar tripticasa de soja Agar TSI Agar Citrato de Simmons Agar SIM Caldo Voges Proskauer . cofia y guantes estériles. 32 MATERIAL Para la Toma de la muestra [7].

tomándose del mismo lote y en cantidad suficiente para sus análisis. alteración o contaminación.  En el caso de muestras líquidas o semilíquidas se deberá agitar o mezclar hasta conseguir homogeneizar y después efectuar la toma de la muestra en diferentes niveles. mediante rótulo o etiqueta (indelebles).  Las muestras deben entregarse al laboratorio lo más rápidamente posible.  La etiqueta deberá colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco.  Es indispensable identificar el recipiente claramente. etc.  La toma de muestra debe hacerse con rapidez. cucharas. ésta se obtendrá de varios puntos del contenedor para obtener una muestra representativa.  Si la muestra a obtener está expuesta al aire libre y a otras contaminaciones.  Cuando sea necesario tomar la temperatura. 33 Medio para ornitina descarboxilasa MÉTODOS II.  El manejo y transporte de las muestras deberá efectuarse de tal manera que se impida su ruptura.  Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato. inmediatamente antes o después de colocar en él la muestra.  Tratándose de muestrear productos envasados en recipientes grandes. se recomienda que la persona que elabora los alimentos. la temperatura no debe ser mayor de 0°C. de lo contrario deben enfriarse a temperatura ambiente y trasladarse en condiciones de refrigeración. Los alimentos perecederos se transportarán bajo condiciones de temperatura de 2 a 8 °C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta el momento de realizar las pruebas. Para la refrigeración es recomendable el empleo de recipientes con líquido refrigerante o hielo potable . pero cuidadosamente. En caso de alimentos congelados. empleando para conservarla hielo seco. debe muestrearse con ayuda de utensilios estériles como sacabocados.  La toma de muestra de productos envasados con presentación comercial para venta al menudeo se llevará a cabo en forma aleatoria y no aséptica.  En muestras de productos a granel. la muestra que se utilice para tal fin deberá ser diferente de la que se envía para su análisis. antes de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida con el flujo. en el nudo o cierre de la bolsa en forma tal que se evite que la muestra sea alterada o violada. enviándose al laboratorio tal como se presentan al consumidor.  Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta de una partida a granel. evitando su exposición a la luz solar directa. cuchillos. esto únicamente si el traslado es menor a una hora. Etiquetado. No tocar el interior de los envases y evitar que la tapa se contamine. Los recipientes para la toma de muestra deben abrirse únicamente al momento de introducir ésta y cerrarlos de inmediato. las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su recolección. no requieren precauciones estrictamente asépticas. Los alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la temperatura en que se muestrearon. sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estériles con los utensilios que emplea normalmente.  En muestras sólidas cuando sea necesario cortar el producto. Toma de la muestra [9]. Relativo a la muestra. Conservación y transporte. es preciso abrir éstos y extraer la muestra en condiciones asépticas para evitar la contaminación microbiana. con los siguientes datos: a) Fecha b) Lugar c) Hora del muestreo d) Número de lote e) Temperatura de la toma de muestra si es que procede. la caja.

representante y/o distribuidor. evitar que se dañen. Cerrar la tapa.  Las muestras que dan un resultado positivo en el test de screening se consideran PRESUNTIVAMENTE POSITIVAS para E. Prueba de tamizaje (test de Screening). colocar en una bolsa de Stomacher  Agregar 585 ml ± 11. . siempre y cuando ésta no exceda de 45°C  Para la conservación. Nota: En el caso de carne de vaca cruda molida. Llevar a dilución 1:4 con 975 ml ± 19.5 ml de caldo TSBm+n y homogeneizar durante 2 minutos en Stomacher.7 ml de caldo TSBm+n  Homogeneizar durante 2 minutos en Stomacher  Incubar a 42 °C ± 1ºC durante 15 h a 22 h. La muestra testigo podrá eliminarse una vez que se obtengan resultados oficiales que indiquen el cumplimento de las especificaciones sanitarias y el particular no decida llevar a cabo su impugnación. Preparación de la muestra. d) Observaciones.5 g.  Pesar 65 g ± 2 g de la muestra.  Incluir un control positivo.  Las muestras que se entreguen al laboratorio deberán acompañarse de un informe que además de contener la identificación de la muestra. en donde se señale las condiciones sanitarias en el que se encontraban los productos antes de efectuar la toma de muestra o algún otro dato que sea significativo para determinar los análisis microbiológicos que sean necesarios. y recortes de carne. pasteles o empanadas rellenos con carne cocidos. III.  Del caldo de enriquecimiento realizar el test de screening siguiendo las instrucciones del fabricante.  En el caso de muestras individuales blandas. coli O157:H7/NM y se continúa con la concentración inmunomagnética. Tomar con la pipeta 20 µl y colocar en los tubos. y carne de vaca cruda molida mezclada con pollo o cerdo. incluya los siguientes datos: a) Número de unidades y/o cantidad. durante el transporte de las muestras no está permitido el empleo de sustancias químicas. así como la marca comercial y cualquier otra información que se considere importante. coli O157 y equipo Dynal MPC-S NOTA: en caso de utilizar otro kit comercial seguir las especificaciones del fabricante. coli O157:H7/NM. coli O157 hasta que desaparezca el pellet. otro negativo y un medio sin inocular como controles para cada grupo de muestras analizadas. evitar que la presión que puedan ejercer otros recipientes o una cantidad excesiva de las mismas las deformen u originen derrames y provoquen que el contenido se ponga en contacto con el exterior de la envoltura. se pueden combinar 5 muestras de 65 g para obtener una muestra compuesta (pool) de 325 g ± 32. Procedimiento Analítico.  Los productos con presentación comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura ambiente. 34 contenido en bolsas de plástico impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de los envases o que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados. humedezcan o contaminen con otras.  Las muestras que dan un resultado negativo en el test de screening se consideran NEGATIVAS para E. Concentración inmunomagnética: Procedimiento para Kit marca Dynabeads anti-E.  Agregar con pipeta 1 ml del preenriquecimiento.  En el caso de muestras no perecederas. b) Clave única que permita la identificación del domicilio del fabricante.  Resuspender Dynabeads anti E. c) Indicar nombre genérico y específico del producto.  Colocar el número de tubos Eppendorf que sean necesarios en el Dynal MPC-S (concentrador magnético de partículas). sin el plato magnético.

Re-suspender una asada de la colonia seleccionada en un tubo estéril conteniendo 3 mL del medio VP. dificultando el aislamiento de E. coli O157.  Abrir los tubos utilizando el abridor. coli O157. coli O157 y sembrar en forma aislada con un ansa o espátula de Drigalsky. la cual puede revertir al estado liso realizando sucesivos pasajes en agar sangre o en agar Mueller Hinton.11. agitar después de cada reactivo. hasta observar un botón en la pared que contacta el imán. aunque esto puede aumentar también el límite de detección de la técnica. a) Prueba de urea de Christensen. coli O157 o equivalente. invertir varias veces. Incubar las placas a 35°C ± 1°C durante 18 h a 24 h. Debido a que algunas veces los tubos de agar urea de Christensen sin inocular. Incubar a 36 °C ± 1 °C por 24 h ± 3 h después de la incubación adicionar de 0. tres gotas de solución α-naftol y al final dos gotas de solución de KOH. Nota 1: Si la muestra aglutina por sí misma no se debe continuar con el ensayo.  Remover el plato magnético. sin agitar y resbalando por las paredes. c) Prueba de VP (Voges Proskauer). b) Prueba de Indol.  En una placa de CT-SMAC y sembrar en forma aislada con un ansa o espátula de Drigalsky.  Dispensar 50 µl de las partículas concentradas.  Incubar las placas a 35°C ± 1°C durante 18 h a 24 h. NOTA: Dependiendo del tipo de alimento y su flora microbiológica la incubación del caldo de enriquecimiento por 20 h a 24 h puede aumentar el crecimiento de otras bacterias en los agares selectivos. a) Detección del antígeno somático O Látex anti-O157: kit de ensayo comercial MicroScreen E.2 mL a 0. un tubo de este agar sin inocular como control en una prueba negativa. aspirar el sobrenadante con precaución de no desprender las perlas de la pared que contacta con el imán. Después de la incubación adicionar dos gotas de solución de creatina. Identificación Bioquímica. en una placa de medio cromogénico para E. Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos con suave agitación para evitar depósitos.3. Incubar 36 °C ± 1 °C por 24 h ± 3 h. Incubar 24 h ± 2 h a 36 °C ± 1 °C. Selección en medios específicos.3. . Antisuero anti-O157  Colocar separadamente dos gotas de 20 µl de solución fisiológica (SF) en una placa de vidrio  Mezclar una asada del cultivo en TSA con SF  Observar las dos suspensiones iluminando la placa con luz de una lámpara.  Dispensar 50 µl de las partículas concentradas 3. Seguir instrucciones dadas por el fabricante. puede aumentar la posibilidad de obtener colonias aisladas de E. o con la siembra de un volumen menor a 50 µl. La inoculación de los medios selectivos con diluciones de las partículas concentradas.3 mL de reactivo de Kovac. Con un asa estéril inocular tubos de agar urea de Christensen. 20 veces). Identificación Serológica. pueden virar a rojo púrpura (prueba positiva). Dejar en reposo 3 minutos. debe incluirse. Una muestra autoaglutinada corresponde a una cepa rugosa. 35  Agitar en vórtex 15 segundos y luego invertir el Dyna MPC-S unas cuantas veces (aprox. Inocular un tubo conteniendo 5 mL del caldo triptona con una suspensión homogénea de la colonia sospechosa.  Insertar el plato magnético.

 Agregar 15 µl del suero anti-H7 a una de las dos suspensiones y mezclar (la suspensión sin el agregado de antisuero se utiliza como control negativo).  Observar la apariencia de las suspensiones con luz de una lámpara. coli E.  Mover la placa mediante rotación suave durante un minuto. - Producción de gas + + Utilización de citrato . b) Detección del antígeno flagelar H7. Nota 3: En cada ensayo se deben realizar control de los reactivos utilizando cepas patrones positivas y negativas. Comentario: Si la muestra aglutina por sí misma no se debe continuar con el ensayo. translúcidas y de borde Selectivo continuo o discretamente irregular. coli O157:H7 Fermentación de glucosa + + Fermentación de lactosa + + Fermentación de sacarosa + + Formación de H2S . Identificación Bioquímica Prueba E. CUADROS DE IDENTIFICACIÓN. Agar Características típicas Colonias planas grisáceas. no hemolíticas. Nota: En cada ensayo se debe realizar el control de los reactivos utilizando cepas patrones positivas y negativas. Morfología de las Colonias. III. coli E.  Observar la apariencia de las suspensiones con luz de una lámpara. Nota 2: La suspensión sin el agregado de antisuero se utiliza como control negativo. coli O157:H7 Antígeno somático O Suspensión + antisuero Aglutinación Positivo O157 Suspensión + SF No presenta aglutinación Suspensión + antisuero No presenta aglutinación Negativo Suspensión + SF No presenta aglutinación .  Mover la placa mediante rotación suave durante un minuto.  Colocar separadamente dos gotas de 20 µl de solución fisiológica (SF) en una placa de vidrio  Mezclar una asada del cultivo en TSA con SF  Observar las dos suspensiones iluminando la placa con luz de una lámpara. 36  Agregar 15 µl del suero anti-O157 a una de las dos suspensiones y mezclar. - Producción de Indol + + Movilidad Puede tener los 2 movilidad Fermentación de sorbitol + - Producción de ureasa -/+ -/+ Actividad lisina descarboxilasa + (90%) + (100%) Actividad β-glucuronidasa + - Identificación Serológica Prueba E.

motivo por el cual son muy vulnerables a manejarse en estado “alterado”. preocupándose principalmente por aprovecharlos para suministrar productos alimenticios a su población y aumentar las fuentes de trabajo. Es la captura de peces y otros organismos en aguas salada (mar). Además de las capturas comerciales. entre otras. 3) raramente son el origen de enfermedades en el hombre. [20] Fundamento: Las enfermedades transmitidas por alimentos. 37. así como de instalaciones de investigación científica y tecnológica. salobre (esteros) o dulce (lagos. debido a que estos productos en su origen están sometidos a una contaminación microbiológica y química. [18] La mayor parte de la pesca la realizan los países desarrollados. mariscos y otros productos marinos para consumo humano o como materia prima de procesos Según estadísticas de la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO). en su mayoría son de tipo infeccioso. la producción pesquera mundial en 2001 fue de 130. [19] Los productos cárnicos marinos o dulceacuícolas. lo que representa un alto riesgo para la salud de los consumidores. con lo que finalmente se garantice que sean productos alimenticios seguros y saludables que compitan nacional e internacionalmente con productos de otro origen. donde cada país tiene una zona económica exclusiva para navegar y pescar. Fuera de ese límite. Entre los alimentos involucrados resaltan los pescados frescos-refrigerados y congelados. y que aunado a la forma de consumo generan enfermedades para el consumidor. gracias a sus poderosas flotas y al potencial científico. lagunas.4 km (200 millas náuticas) de extensión de la costa hacia mar adentro. en comparación con los de otro origen. que les ha permitido desarrollar una extensa red de centros docentes para la industria pesquera. deben cumplir con las siguientes especificaciones: Físicas:  Parásitos ESPECIFICACIONES LIMITE MAXIMO Parásitos 2/ kg/ unidad de muestra . 37 Antígeno flagelar H7 Suspensión + antisuero Aglutinación Positivo H7 Suspensión + SF No presenta aglutinación Suspensión + antisuero No presenta aglutinación Negativo Suspensión + SF No presenta aglutinación Identificación de Microorganismos en Pescado Introducción: Industria pesquera o sector pesquero es la actividad económica del sector primario que consiste en pescar y producir pescados. La mayor producción proviene del mar. de 370. aunque también de origen químico como las intoxicaciones. que ocupan el segundo lugar entre las enfermedades transmisibles de notificación obligatoria. en donde tienen cuadros altamente calificados de científicos e ingenieros pesqueros que han confeccionado los métodos modernos de explotación de los recursos pesqueros. pues se consideran aguas internacionales. pero son extremadamente perecederos. 2) se presentan a la inspección en cantidades muy grandes debido a la concentración en los puntos de desembarque (de hasta más de 500 toneladas por día en un solo lugar para un solo producto). estanque o ríos).9 millones de toneladas fueron producidas en acuicultura (plantas acuícolas).[21] Especificaciones sanitarias [21] Los productos objeto de este ordenamiento. sigue constituyendo uno de los problemas de salud pública más extendidos en el mundo contemporáneo y permanecen como una de las causas principales de morbilidad. la captura de especies marinas es libre. Lo anterior nos obliga al aseguramiento de la calidad de los productos de la pesca y sus derivados (inspección e investigación). presentan características diferenciales principalmente en 1) una alta diversidad de especies que son comercializadas.2 millones de toneladas. La incidencia de estas enfermedades. técnico y económico con el que cuentan.

Aves frescas refrigeradas y congeladas enteras y troceadas. con un doblez terminal en ángulo recto de 4cm.  Aditivos alimentarios. son los siguientes: Antioxidantes: ascorbato de potasio y ascorbato de sodio en una cantidad no mayor de 1g/kg expresado como el ácido Retenedores de humedad: fosfato tribásico de calcio. pirofosfato tetrasódico.  Balanza granataria de 2000 g de capacidad y 0.2 g de sensibilidad. Los aditivos alimentarios permitidos para los pescados congelados. . Heptacloro y Kapone u otros prohibidos en el Catálogo de Plaguicidas publicado en el Diario Oficial de la Federación. polifosfato de sodio. Endrin.  Balanza analítica de 120 g de capacidad y 5 mg de sensibilidad. determinará los casos en los que se habrá de identificar la presencia de este agente biológico. con la finalidad de aceptar o rechazar el lote. Técnicas y Procedimientos para la Investigación de Vibrio cholerae [22] Material y reactivos:  Licuadora y vasos de licuadora estériles. La determinación de nitrógeno amoniacal se efectuará con el método contemplado en la NOM-087-SSA-1993. fosfato monosódico. Dieldrin.  Químicas ESPECIFICACIONES LIMITE MAXIMO Nitrógeno amoniacal en 100 g 30 mg  Microbiológicas ESPECIFICACIONES LIMITE MAXIMO Mesofílicos aerobios UFC/g 10 000 000 Coliformes fecales NMP/g 400 Staphylococcus aureus UFC/g 1 000 Vibrio Cholerae O 1 toxigénico en 50 g* Ausente Salmonella spp en 25 g Ausente * Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secretaría de Salud sin perjuicio de las atribuciones de otras Dependencias del Ejecutivo.0 * Es necesario únicamente en los casos en que el mercurio total supere el nivel de referencia establecido.  Varilla de vidrio de 3mm de diámetro y 20cm de largo.5 Plomo (Pb) 1. solos o combinados.  Contaminación por metales pesados ESPECIFICACIONES LIMITE MAXIMO Cadmio (Cd) 0.  Contaminación por plaguicidas Los productos objeto de esta Norma no deben contener residuos de plaguicidas como Aldrin. fosfato monopotásico. Especificaciones sanitarias. trifosfato pentapotásico y trifosfato de sodio.0 Mercurio como metil mercurio* 0. químicas y microbiológicas que se establecen en esta Norma se deben aplicar los métodos de prueba señalados en el Capítulo de referencias y en el apéndice Normativo A. Métodos de prueba: [21] Para la verificación de las especificaciones físicas. Para la determinación de Vibrio Cholerae aplicar el método establecido en el apéndice Normativo A de la NOM-031-SSA1- 1993 de Moluscos bivalvos frescos-refrigerados y congelados. en una cantidad no mayor de 5 g/kg expresado como P2O5.  Frascos de vidrio de boca ancha tipo tarro de 500 ml de capacidad con tapa de rosca. Especificaciones sanitarias.5 Mercurio (Hg) 1. 38  Materia extraña Los pescados frescos-refrigerados y congelados deberán estar exentos de materia extraña. polifosfato tetrapotásico.

No esterilizar.  Tubos de cultivo o de ensayo de 16 x 150 mm y 20 x 150 mm.  Aparato de filtración y membranas de 0. Medios de cultivo  Agua Peptonada Alcalina (APW) FORMULA Peptona 10 g Cloruro de sodio 10 g Agua destilada 1 000 ml Disolver los ingredientes.5± 0. Dejar secar las placas de 37-45ºC antes de usar. Enfriar a 50ºC y colocar en cajas de Petri.  Tijeras y pinzas estériles. Sales Biliares y Sacarosa (TCBS) FORMULA Extracto de levadura 5 g Proteosa peptona 10 g Sacarosa 20 g Tiosulfato de sodio.  Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro de nicromel o platino. Ajustar el pH de tal forma que después de esterilizar éste sea de 8. Citrato.  Potenciómetro.  Papel pH (rango 1-14) con un máximo de graduación de 0. de 5 y 10 ml con graduación de 0. 39  Incubadoras de 39-40ºC.2.  Pipetas estériles de 1 ml con graduación de 0.  Bolsas de polietileno de 28 x 37 cm con tapa resellable.01 ml.  Agar modificado con Celobiosa.2H2O 10 g Sales biliares 3 g Bilis de buey 5 g Cloruro de sodio 10 g Citrato férrico 1 g Azul de bromotimol 40 mg Azul de timol 40 mg Agar 15 g Agua destilada 1 000 ml Preparar en un matraz por lo menos tres veces más grande que el volumen requerido de medio.2ºC y 35-37ºC.  Lámpara (para observar reacciones serológicas).  Tubos para bioquímicas o ensaye de 10 x 75 mm o 13 x 100 mm.5H2O 10 g Citrato de sodio.  Agar Tiosulfato. Esterilizar en autoclave 10 minutos a 121ºC. Adicionar los ingredientes en agua destilada tibia y calentar con agitación constante hasta ebullición e inmediatamente retirar del calor.4 unidades de pH por cambio de color.  Baño de agua de 42 ± 0.  Cucharas estériles u otros instrumentos apropiados para transferir muestras de alimentos. Polimixina B y Colistina (mCPC) SOLUCION 1: FORMULA Peptona 10 g Extracto de carne 5 g Cloruro de sodio 20 g Solución Stock de colorante 1 000 1 ml .45 micras.  Cajas Petri estériles de 15 x 100 mm de plástico.1 ml.  Mecheros.

agregue la solución 2 a la solución 1 mezcle y distribuya en cajas Petri. Esterilice en autoclave 15 minutos a 121ºC.  Agar Gelatina (GA) FORMULA Peptona 4 g Extracto de levadura 1 g Gelatina 15 g Agar 15 g Agua destilada 1 000 ml Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución de la gelatina y el agar. si lo desea inclinado.2 ± 0. alginolyticus. Enfríe y agregue los antibióticos. SOLUCION STOCK DE COLORANTES 1 000 X: FORMULA Azul de bromotimol 4 g Rojo de cresol 4 g Etanol al 95% 100 ml Para obtener un color firme del medio usar una solución colorante stock en lugar de estar pesando repetidamente los colores en polvo. Esterilice por filtración.2. Enfríe de 48-55ºC.5 g .2.6. para placas enfríe el medio de 45-50ºC y distribuya en cajas Petri estériles.  Agar T1N1 (Agar Triptona y Sal) FORMULA Triptona o tripticasa 10 g Cloruro de sodio 10 g Agar 20 g Agua destilada 1 000 ml Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución del agar.  Caldo Glucosa de Hugh-Leifson FORMULA Peptona 2 g Extracto de levadura 0. Agregue 1 ml de esta solución a cada litro de agar mCPC. Enfríe de 45-50ºC. ajuste el pH a 7. Ajuste el pH de 7. use de 25-30 g de agar por litro. Hierva hasta que se disuelva el agar. Disuelva el colorante en etanol hasta obtener una solución al 4% (peso/volumen). distribuya en tubos. Deje solidificar los tubos inclinados. coloque en cajas Petri. la cual tendrá al final 40 mg de azul de bromotimol y 40 mg de rojo cresol por litro.2 ± 0. Enfríe de 45-50ºC y distribuya en cajas Petri estériles. Esterilice en autoclave 15 minutos a 121ºC. Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolver la gelatina y el agar.  Agar Gelatina con Sal (GS) FORMULA Preparar agar gelatina (GA). pero adicionando 30 g de cloruro de sodio por cada litro. Esterilice en autoclave 15 minutos a 121ºC. Esterilizar por autoclave 15 minutos a 121ºC. Si es necesario para inhibir la diseminación de Vibrio spp tal como V. 40 Agar 15 g Agua destilada 900 ml Ajustar el pH a 7. SOLUCION 2: FORMULA Celobiosa 10 g Colistina 400 000 UI Polimixina B 100 000 UI Agua destilada 100 ml Disuelva la celobiosa por calentamiento en agua destilada.

 Caldo Triptona y Caldos Triptona Sal T1N0. Lisina y Ornitina) FORMULA BASE Peptona 5 g Extracto de levadura 3 g Dextrosa (D-glucosa) 1 g Púrpura de bromocresol 0.2. Distribuya dentro de tubos o matraces.60. Como control.  Medio Base de Descarboxilasa (Arginina.015 g Agar 3 g Agua destilada 1 000 ml Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolver el agar. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Deje solidificar los tubos inclinados o deje enfriar de 45-50ºC y distribuya en cajas Petri. Distribuya 225 ml en matraces de 500 ml o tubos.2. tape los tubos.5 g Agua destilada 1 000 ml Suspenda los ingredientes en agua destilada y caliente hasta disolución. agregar 15 g de cloruro de sodio.5 g Dextrosa 2. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121ºC.  Caldo Soya Tripticasa (TSB) FORMULA Peptona de tripticasa (Triptona) 17 g Peptona de fitona (Soytona) 3 g Cloruro de sodio 5 g Fosfato dipotásico 2.T1N8 y T1N10 FORMULA Triptona o tripticasa 10 g Cloruro de sodio 0.5 ± 0. para T1N0 no agregue cloruro de sodio. adicionar 15 g de cloruro de sodio por litro. Para Vibrio spp halofílicos.  Agar Soya Tripticasa (TSA) FORMULA Peptona tripticasa (Triptona) 15 g Peptona de fitona (Soytona) 5 g Cloruro de sodio 5 g Agar 15 g Agua destilada 1 000 ml Suspenda los ingredientes en agua destilada y hierva durante un minuto hasta disolución del agar. T1N6.10.30. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Distribuya en tubos y esterilice en autoclave 10 minutos a 121ºC. 41 Cloruro de sodio 20 g Dextrosa 10 g Púrpura de bromocresol 0. Distribuya en tubos de tapón de rosca de 16 x 150 mm. Para T1N3 usar 30 g de NaCl por litro (3% w/v concentración de cloruro de sodio). Ajuste el pH a 7.80 o 100 g Agua destilada 1 000 ml Disuelva los ingredientes en agua destilada. El pH final debe ser de 7.3 ± 0.2. lisina y ornitina. para T1N1 use 10 g de cloruro de sodio (1% w/v concentración de cloruro de sodio).4 ± 0. Para Vibrio spp halofílicos.2 ± 0.T1N3. El pH final debe ser de 7.2. Ajuste el pH de tal manera que después de la esterilización sea de 6. Coloque en tubos y esterilice en autoclave 15 minutos a 121ºC.2. adicione 5 g de L-aminoácido a 1 litro de base. . use base sin suplemento (aminoácido). así respectivamente.02 g Agua destilada 1 000 ml Para caldo de arginina. Ajuste el pH a 7.T1N1.2 ± 0.

0 g Agua destilada 1 000 ml Suspender los ingredientes y hervir hasta disolución del agar.025 g Agar 15. Esterilizar en autoclave de 10 a 12 minutos a 121ºC. y distribuir en cantidades de 5 ml a tubos de 13 x 100 mm. Mezclar bien y calentar a ebullición. agitando ocasionalmente hasta completa disolución.4 ± 0.3 g Púrpura de bromocresol 0.0 g .0.0 g L-Lisina 10.5 g Rojo de fenol 0.2.025 g Agar 13 g Agua destilada 1 000 ml Disolver los ingredientes en agua destilada.2 g Tiosulfato de sodio 0.5 g Agua destilada 1 000 ml Suspender los ingredientes en agua destilada. Distribuir en tubos de tapón de rosca.0 g Extracto de levadura 3.0 g Glucosa 1.8 a 7. Enfriar a 60ºC y ajuste el pH de 7.  Agar Arginina Glucosa Inclinado (AGS) FORMULA Peptona 5 g Extracto de levadura 3 g Triptona 10 g Cloruro de sodio 20 g Glucosa 1 g L-Arginina(hidrocloruro) 5 g Citrato férrico amónico 0. hervir hasta disolución del agar. 42  Agar de Hierro Kligler (KIA) FORMULA Peptona polipeptona 20 g Lactosa 20 g Dextrosa 1 g Cloruro de sodio 5 g Citrato férrico amoniacal 0. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121ºC.3 ± 0.  Agar Triple Azúcar y Hierro (TSI) FORMULA Polipeptona 20 g Cloruro de sodio 5 g Lactosa 10 g Sacarosa 10 g Glucosa 1 g Sulfato ferroso amónico 0. Ajustar el pH de 7.  Agar de Hierro y Lisina (LIA) FORMULA Peptona o gelisato 5. Dejar solidificar los tubos inclinados.2 g Agar 13.2 g Rojo de fenol 0.5 g Tiosulfato de sodio 0. Ajustar el pH de 6. Deje solidificar el medio inclinado.1.5 g Tiosulfato de sodio 0.

0.5 g Tiosulfato de sodio 0.4 ± 0.02 g Agar 15. Esta prueba es para comprobar la presencia del diacetilo.1 g Alcohol etílico 300 ml Agua destilada 200 ml Disolver el rojo de metilo en el alcohol y diluir con el agua destilada. Para Vibrio spp halofílicos. Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4. Los tubos se enfrian en posición inclinada. añadir 5 gotas de la solución a 5 ml del cultivo problema.  Prueba de oxidasa. Distribuir en tubos con tapón de rosca. agregar 15 g más de cloruro de sodio (para una concentración final del 2%).7 ± 0. Un color amarillo se reporta como prueba Negativa.2 ml de una solución acuosa al 40% de KOH a 1 ml de cultivo. Ajustar el pH de 6.2. para llevar a cabo la prueba.1. 43 Citrato férrico amónico 0.0 g Agua destilada 1 000 g Disolver los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien. REACTIVO FORMULA Rojo de metilo 0. Ajustar el pH de 7. de tal modo que se obtengan columnas de medio de 3 cm y una parte inclinada de 2 cm.15 minutos a 121ºC. Esterilizar en autoclave 12 minutos a 121ºC.2. Resultados: El desarrollo de una coloración roja en 15 minutos constituye una reacción Positiva. . Soluciones y reactivos  Prueba de rojo de metilo.  Caldo Rojo de Metilo y Vogues Proskauer(RM-VP) FORMULA Peptona 7 g Glucosa 5 g Fosfato dipotásico 5 g Agua destilada 1 000 ml Disolver los ingredientes en 800 ml de agua tibia. calentar hasta ebullición con agitación frecuente hasta conseguir la disolución completa. enfriar a 20ºC y diluir a 1 litro. Esterilizar en autoclaves durante 12 . Para Vibrio spp halofílicos agregar 15 g más de cloruro de sodio (para una concentración final del 2%).04 g Púrpura de bromocresol 0. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121ºC.6 ml de la solución de alfa naftol y 0. Enfriar de 50-60ºC y ajustar el pH de 6. REACTIVO FORMULA Alfa naftol 5 g Alcohol etílico absoluto 100 ml Añadir 0.  Medio para prueba de movilidad (semisólida) FORMULA Peptona 10 g Extracto de carne 3 g Cloruro de sodio 5 g Agar 4 g Agua destilada 1 000 ml Calentar con agitación y hervir de 1 a 2 minutos hasta disolución del agar.5 y la prueba es Positiva. Distribuir en volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Distribuya en tubos.  Prueba de Vogues-Proskauer. Filtrar.9 +/.

6. 7. sales biliares y sacarosa (TCBS) o al agar modificado con celobiosa. citrato. De cada submuestra tomar 25 g. Las colonias de V. Incubar las tres diluciones entre 35°C y 37°C. [21] 5. Se deberán preparar las siguiente diluciones 10-1 . que están estrechamente relacionadas con la especie anterior. se puede inocular a los agares gelatina (GA) y gelatina sal (GS) en el segundo día. Agregar 0. cholerae en pescados. gota a gota y agitando. Incubar 48 horas a 35ºC.  Reacción de indol. son verdes (sacarosa negativas). lisas. amarillas (positivas para la fermentación de la sacarosa) y ligeramente achatadas.Agar TCBS.. antes de las pruebas bioquímicas. Incubar 18 horas a 35ºC. Los resultados serán confiables si las placas de aislamiento muestran colonias puras. Resultado: La reacción positiva se observa por la producción de un color azul en un minuto. De esta dilución preparar la dilución 1:100 y 1:1000. transferir el inóculo de la película (crecimiento superficial) con un asa de 3-5 mm de diámetro a una placa por lo menos. REACTIVO DE KOVAC FORMULA P-dimetilaminobenzaldehído 5. Procedimiento: Determinación de V. y sin agitar.0 g Alcohol amílico. Se debe conservar a 4ºC.N. cortar en piezas pequeñas e introducirlas en un vaso de licuadora de 500 ml de capacidad que contenga 225 ml de agua peptonada alcalina (APW) y homogeneizar por 2 minutos a la máxima velocidad.37°C. Incubación de las muestras entre 35°C . de cada uno de los medios de cultivo selectivos: Agar con tiosulfato. mimicus. seleccionar por lo menos 3 colonias sospechosas de cada placa y aplicarlas con estría cruzada para aislar en agar T1N1 o en agar soya tripticasa con sal (al 2% de concentración de NaCl) e incubar durante 12-18 horas a 35-37°C. 10-2 y 10-3 . a. 4. Es necesario hacer un cultivo en un medio no selectivo a fin de garantizar la pureza de las colonias. en 9 o 90 ml de agua peptonada alcalina. el color del reactivo va del amarillo al café claro. polimixina B y colistina (mCPC). Incubar el agar TCBS durante 18 a 24 horas de 35-37ºC y el agar mCPC durante 18 a 24 horas de 39-40ºC. la polimixina inhibe al biotipo Clásico de V. Después de la incubación.N-Tetrametil-p-Fenilendiamino 0. 1.  Preparación de la muestra.3 ml de reactivo. 2. Esta es la dilución 1:10. cholerae (El Tor y Clásico) son grandes. Las colonias de V.N.2 a 0. [22] Morfologia colonial [22] Examinar las placas a fin de determinar si se presentan las características coloniales que a continuación se describen. con el centro opaco y los bordes translúcidos.5 g Agua destilada 100 ml Conservar en frasco oscuro a 5-10°C. Se toma carne del área de las vísceras incluyendo éstas. La mayoría de las demás especies de vibrio crecen en agar TCBS y producen colonias amarillas y verdes. 44 REACTIVO FORMULA N. Sembrar en un tubo de base de gelosa para sangre. Nota: Las especies de vibrio no producen colonias pequeñas de color crema en agar TCBS. 3. El reactivo se conserva durante 14 días.3 ml del reactivo. Debe conservarse en frasco ámbar con tapón esmerilado.o alcohol isoamílico 750 ml Acido clorhídrico concentrado 25 ml Disolver el p-dimetilaminobenzaldehído en el alcohol amílico y agregar el ácido clorhídrico lentamente. cholerae. . El desarrollo de un color intenso constituye una prueba Positiva para indol. Agregar de 0. Sembrar un tubo con 5 ml de caldo triptona.

El V. picar y estriar en el agar inclinado. T1N0 y T1N3 o GA y GS. El V. el papel se tornará púrpura oscura o azul en pocos segundos. Inocular las colonias individuales en medios de cultivo TSI (Agar de Triple Azúcar y Hierro). crecerán en T1N3 únicamente de la familia vibrionaceae crece solamente en T1N3. Aeromonas. y caldo glucosa de Hugh-Leifson. Inocular colonias individuales en tubos duplicados con caldo de glucosa de Hugh-Leifson.Agar mCPC. KIA (Agar de Hierro Kliger) y AGS.Leer los resultados de las prueba bioquímicas de TSI... que comúnmente se aíslan del pescado y los mariscos con métodos de enriquecimiento que se usan para las especies de vibrio. sacar un poco de cultivo de la placa y tocar el papel humedecido. Realizar la prueba de oxidasa con cultivos puros de agar soya tripticasa (2% de NaCl) u otro medio que no contenga carbohidratos fermentables. 45 b. observará un halo opaco alrededor de la colonia de los microorganismos gelatinasa positivos. Inocular las colonias en los caldos T1N0 y T1N3 e incubar durante 18 a 24 horas de 35-37ºC.. tanto de GA como de GS con cada cultivo puro. Las colonias de V. vulnificus produce colonias amarillas achatadas. cholerae y el V. inocular una línea recta en el centro de un sector de las placas. metschnnikovii). Incubar durante 18 a 24 horas de 35-37ºC. utilizan la glucosa sólo para la oxidación d. Con un palito aplicador de madera.Prueba de oxidasa.. Incubar ambos tubos durante 18 a 24 horas de 35-37ºC. mimicus crecerán en T1N0 y T1N3.. La mayoría de las especies vibrio spp. si hay microorganismos oxidasa positivos. durante 18 a 24 horas de 35-37ºC. La mayoría de las demás especies de vibrio no crecen fácilmente en agar mCPC. Incubar los tubos inoculados. 01. Identificación y confirmación [22] a. Diferenciación: [22] Diferenciación de los vibrios sospechosos de los microorganismos que no son vibrios. Para leer la reacción de la gelatinasa sostener la placa sobre una superficie negra. con el centro opaco y los bordes translúcidos. El vibrio spp halofílico crecerá en ambas placas. El V. Un método fácil consiste en colocar un círculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas de reactivo de oxidasa. Recubrir un tubo con una capa de aceite mineral estéril o vapor líquido (50% de petrolato y 50% de parafina) unos dos centímetros de grueso. c. Las especies de Vibrio spp utilizan la glucosa tanto para la oxidación como para la fermentación. mimicus crecerán. cholerae No.KIA y agar inclinado de Arginina y Glucosa (AGS). .TSI. cholerae El Tor son púrpuras (negativas para la fermentación de la celobiosa). Las especies patógenas de vibrio son oxidasa positivas (excepto el V. Las especies de pseudomonas. porque ellos no requieren de sal. Una alternativa consiste en usar agar gelatina (GA) y agar gelatina con 3% de NaCl (GS) para determinar la tolerancia de los cultivos puros a la sal. incluyen algunos V. cholerae y el V.. KIA. con el tapón no muy apretado. Sólo en la placa con GS. Plesiomonas shigella y otras bacterias.Caldo glucosa de Hugh-Leifson. un mondadientes o una asa de platino estéril. cholerae en medios de TSI y LIA no crecen en T1N3.Caldo triptona al 3% de NaCl (T1N3). Algunas especies de bacterias que no son vibrios y que presentan reacciones similares a las de V. AGS. Dividir las placas en ocho sectores. a. Se recomiendan estos medios porque las reacciones permiten efectuar una diferenciación presuntiva entre la mayoría de las especies de vibrio. b.

Crecimiento a 42ºC: positivo.. e. mimicus. El suero para la clasificación de V. negativo Clásico y V. picadura ácido. no se pueden tipificar con estos antisueros. Seguir las instrucciones del antisuero.. como en TSA o agar infusión cerebro corazón (BHI). 3. 4. Características mínimas para la identificación de V. crecen en caldo T1N0 o en placas con GA.. 46 b. La fórmula para todos los medios bioquímicos deberá contener por lo menos un 2% de NaCl. En vez de medios convencionales se pueden usar tiras AP120E.Los cultivos que aglutinan con el antisuero del grupo 01. cholerae se puede usar solución salina fisiológica (0. Son gelatina y oxidasa positivos. tienen los 3 factores (A. en el caldo de cultivo de Hugh-Leifson. Estría ácido. Uso de anticuerpos policlonales y/o monoclonales será para el antígeno del complejo 01 1. d.Prueba de la lisinadescarboxilasa: positivo. Las características que permiten suponer la presencia de V. 01. pero no aglutinan con antisueros Inaba y Ogawa. si se usa un medio más rico. y los controles salinos para cada antisuero usado.. con 2% de NaCl como diluyente. KIA y AGS. Sin embargo.. presentan reacciones características en TSI. Para el V.Prueba de halofilia con NaCl. gas negativo y H2S negativo. son de V.Prueba de Hugh-Leifson. Siebeling. mimicus o son celobiosa negativos (verde-púrpura) en agar mCPC.. Nota: Los cultivos puros que se someterán a las demás pruebas serológicas y bioquímicas para el V.J. cholerae 01 o No. Usar antisuero de diagnóstico del grupo 01 y del subgrupo Inaba (factores AC) y Ogawa (Factores AB) para el antígeno del serotipo 01.Prueba de VP: Positivo El Tor. pero el anti-B y anti-C reaccionan opuestamente con bacterias de otras especies. cholerae como mínimo son las siguientes: 1. Fermentación de la glucosa y oxidación positiva. Usar cultivos de 16 a 24 horas producidos en TSA. B y C) y son del serotipo Hikojima. Incluir cultivos positivos y negativos. tanto en la oxidación como en la fermentación. 9. 7.Los cultivos que se aglutinan en el antisuero del grupo 01 y en solución salina.. 5. cholerae son sacarosa positivos (amarillo) en agar TCBS y sacarosa negativos (verdes) en el caso de V.. 3.. .Prueba de la dihidrolasa arginina: negativo. .. no se pueden clasificar según el tipo.Pruebas bioquímicas.. cholerae y otras especies bacterianas afines figuran en el cuadro anexo. 2. Como es posible que los antígenos de los antisueros estén relacionados entre sí..85% de NaCl) como diluyente. Las reacciones bioquímicas para identificación de V.Los cultivos de V.Morfología.Hacer una tinción de Gram a un cultivo de 18 a 24 horas en caldo o agar. Nota: Anticuerpos monoclonales están disponibles. cholerae del grupo 01 si las reacciones bioquímicas confirman que el cultivo puro es de V.Los cultivos que aglutinan con el antisuero polivalente.Citocromo-oxidasa positivo.. hay que realizar pruebas bioquímicas para confirmar que el cultivo puro sea de V.Prueba serológica de aglutinación. cholerae No 0:1 según el tipo se puede obtener de R. 8. .Aspecto en TSI. se puede eliminar esta autoaglutinación. 6. cholerae. 2. cholerae.Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente (grupo 01) y con los antisueros Inaba y Ogawa. cholerae cuya identidad se haya confirmado con métodos bioquímicos y que no aglutinen con el antisuero del grupo 01 son V. esporogénico y gram negativo.. Los cultivos que se aglutinan con este antisuero para grupos específicos pueden ser clasificados según el subtipo con anticuerpos Inaba y Ogawa. Bacilo o bacilo encorvado. pero no en solución salina fisiológica simple.. cholerae 0:1. son bacilos curvos gram negativos y producen ácido a partir de la glucosa. c.

.0/129 sensitiva: sensible para 10 y 150 µg 0/129 REACCIONES DE ALGUNOS Vibrio EN AGAR KIA.7 ml de agua). El ácido hexacoloroplatínico puede cristalizar.Prueba de ONPG: positivo. 47 0%: positivo. 3%: positivo.Fermentación de la arabinosa: negativo. en otros el agua favorece la formación de cristales en las gotas trabajadas. 11. 6%: usualmente negativo.shigelloides K o A A K o A A N N * = Raramente K = Alcalino A = Acido a = Ligeramente ácido N = Neutro Procedimiento al trasluz para la detección de parásitos. 10..vulnificus K o A A K(A)* A K A V. Cuando sea detectado el olor a orina se debe reportar como tal. de 45% de traslucidez y una fuente luminosa de 1500 lux a una distancia de 30 cm por encima de la lámina. El amoníaco se presenta como cristales de hexacloroplatinato de amonio formadas. Proceder a exprimir las membranas tratando de obtener la mayor cantidad de líquido que sea posible.5 . Determinación con luz ultravioleta Observar el área manchada manteniendo el cuarto oscuro. Adicionar una pequeña gota de ácido hexacloroplatínico en solución al 10%. TSI Y AGS.. Esto se puede observar a los treinta minutos de la preparación en varias formas de cristales.mimicus K A K(A)* A K A V. en las gotas trabajadas. Los cristales se observan y detectan por medio del microscopio en la lente 100X. Agregar una pequeña gota de mezcla de ureasa (suspensión de 25 mg de tabletas de ureasa. Algunas cepas de V.cholerae K A A(K)* A K a V.algino lyticus K A A A K A V. Microorganismos KIA TSI AGS Estría Picadura Estría Picadura Estría Picadura V. 12. . Analizar y marcar con un lápiz el área empleando la luz ultravioleta. utilizando una fuente de luz ultravioleta de 366 nm. cholerae NO 01 se desarrollan a 0% de NaCl. 13. mimicus). Sin embargo. [21] Para detectar los parásitos se coloca una muestra sobre una lámina acrílica de 5 mm de espesor. Prueba de ureasa Colocar la muestra en 1 o 2 membranas en un vaso de precipitados de 5 ml mantener la muestra cubierta con agua tibia. en 0. los cristales presentes son diferentes a los del hexacloroplatinato de amonio. Materia extraña [21] Residuos de orina en alimentos. Algunos de los componentes orgánicos son volátiles.Fermentación de la sacarosa: positivo para V. cubrir la preparación y agitar.0. La infestación parasítica podrá detectarse mediante este procedimiento al trasluz. Colocar 2 o 3 gotas del microcultivo en la base del cilindro.hidrophyla K o A A K o A A K K V.. cholerae (negativo para V. por examen visual. después abrirla cuando las gotas se encuentren en el centro de la base del cilindro.parahe-molyticus K A K A K A V.

48 .

al menos durante 15 minutos. salmón. FUNDAMENTO Las infecciones por mariscos son debido a intoxicaciones. La parasitación puede llegar a afectar entre el 40% y el 80% de las piezas capturadas. ANALISIS MICROBIOLOGICO Los metabolitos producidos por los microorganismos (trimetilamina y ácidos grasos) se pueden usar como indicadores de una alteración inminente de los productos de pesca. Listeria monocytogenes. CUADRO DE IDENTIFICACIÓN RECUENTO DE ORGANISMOS PSICROTROFOS PRESENCIA-AUSENCIA DE Vibrio cholerae y relacionados Mantener las muestras a 5ºC hasta el momento de Preparar la dilución 1/10 de la muestra en diluyente e procesarlas. 49 MARISCOS INTRODUCCIÓN ¿Cuáles son los riesgos de consumir pescados o mariscos crudos? El consumo de productos del mar crudos o insuficientemente cocinados está relacionado con un mayor riesgo de padecer enfermedades por bacterias patógenas (Ej. Es importante considerar. En la intoxicación por mariscos. Vibrio vulnificus. Estos grupos susceptibles incluyen a las siguientes personas:  Mujeres embarazadas  Niños pequeños  Adultos mayores  Personas con problemas del sistema inmunológico  Personas con acidez estomacal disminuida Este grupo de personas deben evitar además los pescados y mariscos ahumados refrigerados. Clostridium botulinum tipo E). caballa. Estas bacterias son sensibles al calor y por lo tanto se destruyen fácilmente con las temperaturas de cocción. pueden consumir los mariscos ahumados enlatados o envasados. sardina. Anisakis . Existen muchos tipos diferentes de intoxicación por mariscos. los ingredientes tóxicos son toxinas producidas por organismos similares a algas llamados dinoflagelados. Además. que algunas personas tienen un mayor riesgo de padecer enfermedades transmitidas por consumo de pescados o mariscos crudos o insuficientemente cocinados. Agregar igual . Vibrio parahaemolyticus. o el incubar durante 4 . merluza.6 horas a 30ºC. Las bacterias patógenas pueden proceder del hábitat de los peces (contaminado o no con aguas residuales) y/o manipulación durante el procesamiento y preparación. Vibrio cholerae. que se acumulan en algunos tipos de productos de mar. En el caso de los mariscos ahumados refrigerados pueden consumirse cocinados en un guiso. Tomar 10 g de la muestra molida. El parásito se inactiva sometiendo el pescado a cocción a temperaturas sobre 60º C. Los mejor conocidos son la intoxicación paralítica por mariscos. dependiendo de la especie y de su procedencia. o si es congelado a -20º C durante más de una semana o a -35ºC por 15 horas. virus y parásitos. jurel. es un parásito que habita naturalmente un gran número de peces (Ej. la intoxicación neurotóxica por mariscos y la intoxicación amnésica por mariscos.

6 horas a 30ºC. Observar las colonias de 2 a 3 mm de colonias irregulares. azul de bromotimol 0. agua 1 litro. Incubar a 37ºC masajear la superficie durante 2 minutos.04 g. con flagelos polares.5 g. Multiplicar el número de Petri estériles obtenido por el factor de dilución correspondiente para obtener las ufc/g o cm2. Agregar 10 mL de medio de de medio de enriquecimiento concentrado. Peptona 10 g. volumen igual de caldo NF de doble concentración e Incubar a 37ºC durante 24 horas. a ambos. agua arabinosa al 25% esterilizada por filtración 1 litro. Triptona 10 g. centro de color negro y rodeadas de un halo verde. bilis 8 g. Triptona 2. pH 8. extracto de levadura 1 g. Incubar uno a enriquecimiento concentrado. Hacer diluciones decimales (10-1 a 10-6) en levadura 10 g. violeta nitrofurantoína al 0. cloruro de sodio 1. Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos. Enfriar a 50ºC y agregar 100 mL de cloruro de sodio 60 g. color amarillo.5 g.1 g. agua 1 litro. y colocarlo en una bolsa plástica con 100 doble. azul de bromotimol 0. sulfato de magnesio hidratado 0. sodio 10 g. durante 24 horas. oxidantes de glucosa y no DILUYENTE SALADO. Agitar y verter en cajas de Petri PRESENCIA-AUSENCIA DE Aeromonas spp.2% en polietilén-glicol. Son bacilos Gram-negativos. citrato de hierro 1 varilla de vidrio en L. Mantener las muestras a 5ºC hasta el momento de Colocar dos porciones de 25 de muestra en sendos procesarlas. sin halo negro. de etilo 0. incoloras o de tonos verde azulado o diámetro. verdosas o azuladas. Triptona 30 g. Si se observan colonias sin centro negro pero con placa con solución de yodo durante 2 minutos. Agregar diluyente y dejar durante 4 . sin pardo. opacas.2. con centro opaco. cloruro de potasio 1 g. Calentar a 100ºC Peptona 16 g. cloruro de sodio 20 g. agua 1 litro. extracto de remanente.1 mL sobre agar agotamiento en estría sobre agar TCBS. dextrina 5 g. tiosulfato de sodio 10 g. sendas placas de agar para recuento en placa o agar.2. pH 8. agar luego 3 días a 7ºC. PRESENCIA-AUSENCIA DE Shigella spp. Enfriar a 50ºC y agregar la mezcla de cetrimida 10 mg. agua 1 litro.6. AGUA PEPTONA ALCALINA estéril 10 mL de líquido. Sembrar 0. Observar las durante 24 horas. Peptona 1 g. citrato de sodio 10 g. redondas. Añadir. hidrolizado de caseína 10 g. Inocular 1 mL de la dilución 1/10 de la recipientes 225 mL de diluyente estéril. durante 20 minutos. Triptona 30 g. pH 9. periferia estéril y una vez descongelada extraer con una jeringa traslúcida. pH 7. Sembrar por mL de peptona al 0. el mismo diluyente. Contar las colonias de las placas que 15 g.04 g. pH 7.6. Observar las colonias de 2 a 3 mm de una muestra congelada colocarla en una bolsa plástica diámetro. oxidasapositivos. Medir el volumen del líquido (doble concentración). extracto de levadura 5 g. Depositar 0.4 g. agar 15 g. Agitar y agotamiento en estría sobre agar TCBS. Sembrar por agotamiento en estría sobre agar AD.06 g. glucosa-triptona-levadura y distribuir el inóculo con una sacarosa 20 g.0. Agregar un igual volumen de caldo Horie de concentración doble.6 horas a 30ºC. Incubar a 17ºC durante 16 hs y g.1 mL de las diluciones en AGAR TCBS. agua 1 litro. PRESENCIA-AUSENCIA DE Vibrio parahaemolyticus RECUENTO DE Pseudomonas spp Preparar la dilución 1/10 de la muestra en diluyente Preparar la dilución 1/10 de la muestra en solución salado e incubar durante 4 . Incubar a 37ºC CFC e incubar a 25ºC durante 48 horas. CALDO NF.002 g. lisas. cloruro de sodio 20 fermentativos. Si se trata de durante 24 horas. AGAR AD. cloruro de magnesio 1. Incubar a 30ºC durante 24 37ºC y otro a 42ºC. fucidina 10 mg y cefaloridina 50 mg disueltos en 5 mL de etanol al 50%. enfriar a 50ºC y volcar en cajas 15 a 150 colonias fúngicas. Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos.1% u otro diluyente. Esterilizar a 120ºC CALDO DE HORIE. igual volumen la temperatura ambiente. en placas de agar XLDN incubando una a 37ºC y otra a Incubar a 30ºC durante 24 horas. cloruro de sodio 10 g. Si se halo rojo se presume la presencia de Shigella sp observan colonias con un halo claro sobre el fondo rojo púrpura se presume la presencia de especies de Aeromonas sp. 50 material obtenido por extracción de una capa superficial volumen de agua peptona alcalina de concentración o por hisopado. Incubar a 37ºC durante 6 horas. azul de timol 0. sulfato de durante 30 minutos. AGAR CFC. agitar bien e muestra en 9 mL de diluyente y dejar durante 6 horas a incubar 2 a 4 hs a 30ºC. . Sembrar por incubar a 42ºC por 24 horas. Sembrar alícuotas horas. cloruro de g. Después inundar la 42ºC. Enfriar y agregar 20 mL de potasio 10 g. extracto de carne 6 g. Calentar a ebullición para presentan 30 a 300 de bacterias o de las que muestran disolver los ingredientes.

listerias y patógenos fecales (1).5 mL de NaOH 5N diluído al 1% (pH 8). vulnificus y V.5 mL de azul de bromotimol al 1% y 4. etc) son cocidos. agar 7. agua 500 mL. añadir 5 mL de ampicilina al 0. V. parahaemolyticus habitan los ambientes marinos costeros templados. Este proceso facilita la recontaminación con estafilococos. pelados a mano y congelados. Las especies de Vibrio son anaerobios facultativos.5 g. cholerae. V.005 g. mimicus.05 g.1% esterilizada por filtración y volcar en cajas de Petri Los crustáceos (camarones. crecen en medios alcalinos con sales biliares y algunas son halófilas estrictas. desoxicolato de sodio 0. . Disolver y agregar 4. 51 cloruro férrico 0. Enfriar a 50ºC. V. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos.

Incubar hasta 48 hrs. 3. a 35°C y resembrar en placas. Las pruebas negativas se dejan en estufa por 18 hrs. La siembra en los medios sólidos se realiza con la técnica adecuada para obtener colonias aisladas. agregar caldo NaCl al 1% al tubo original.. las que pueden ser húmedas. ya que se producen colonias amarillas en V. maltosa. c. b. . ayuda a diferenciar preliminarmente las especies de Vibrio.fluvialis y V. Es común que los cultivos puros de Vibrio en cualquier medio. e. adicionales. esta prueba se hará de agar sangre o agar soya. Si no se obtiene desarrollo la cepa se informará como “no viable”. Todos los medios se incuban a 35°C por 18 hrs. Se debe hacer notar que la prueba de oxidasa no debe realizarse a partir de un cultivo en agar TCBS. Identificación bacteriana Desde el cultivo puro de la placa de agar sangre observar y anotar la hemólisis. NaCl 0%. 2 y 3) Conservar la cepa en caldo glicerol al 20% y congelar a –70°C. en atmósfera normal. d. debido a que generalmente el laboratorio ha sido alertado por la historia clínica del paciente. La inclusión de sacarosa en el agar TCBS. NaCl 1%. arabinosa. a 35°C. mientras que V. (Tabla N° 1. Si no se obtiene desarrollo. V. anotar reacción de sacarosa: colonias amarillas = sacarosa positiva colonias verdes = sacarosa negativa. Propiedades del género Vibrio y diferenciación de otros géneros fenotípicamente similares. Incubar 18 hrs. Anotar los resultados de la lectura de pruebas bioquímicas e interpretar utilizando las tablas de identificación de vibrios.cholerae. producen colonias verdes indicando que no han fermentado sacarosa. [23] Tabla 1. incubar 2-3 hrs.mimicus y la mayoría de los V. hacer prueba de oxidasa y sembrar batería de identificación: TSI-LIA-Ornitina-Arginina. V.vulnificus. ocasionalmente rugosas.parahaemolyticus. convexas a planas.alginolyticus. 52 Siembra e incubación de muestras o cepas a. en atmósfera normal. tengan una morfología múltiple de las colonias. extendidas a delimitadas. Si hay desarrollo en agar TCBS. La búsqueda activa se realiza sembrando en placa de agar sangre o agar soya y agar TCBS.

de incubación a 36ºC. 53 a : El número indica el porcentaje de cepas que son positivas después de 48 h. .

Estas toxinas son raramente encontradas en cepas ambientales de V. (Test de Kanagawa: placas de agar con eritrocitos O humanos con una incubación a 35 °C durante 48. pero no hay productos comerciales que detecten la segunda hemolisina observada en las cepas de V. que ha sido utilizada extensivamente para V.72 h. Sin embargo.+ o +.vulnificus y comercialmente disponibles.+ * * El MIO no es muy sensible para la prueba de indol de Vibrio .parahaemolyticus. test difícil de realizar.parahaemolyticus. Entre ellos se encuentra la detección por PCR y la electroforesis de campo pulsado (PFGE). estas son herramientas epidemiológicas o taxonómicas que no se encuentran comercialmente ni fáciles de adaptar en un laboratorio clínico.. Sistemas de tipificación Los esquemas de tipificación forman dos grupos.parahaemolyticus. Un gran número de métodos de tipificación molecular ha sido exitosamente usado para detectar la migración clonal de V. producen una hemolisina directa termostable (TDH) codificado por dos genes. solo para los dos primeros mencionados.cholerae. tdh y tdh2x. TDH puede ser detectada por una prueba de látex comercial (Oxoid). Lectura de pruebas presuntivas: Agar TCBS: colonias sacarosa negativa (verdes) Oxidasa: positiva TSI: K/A-..cholerae y V.MIO: +.-.+.parahaemolyticus y V. aunque los esquemas descritos son para V.parahaemolyticus.parahaemolyticus. Se han desarrollado ensayos por PCR para TDH y TRH pero no se encuentran comercialmente disponibles.LIA: K/K-. al medio estándar se le agrega 1% de NaCl **HIB: Caldo infuso-corazón La mayoría de las cepas clínicas de origen humano de V.) Al igual que la toxina del cólera. la serotipificación es la más utilizada. V. Esta hemolisina puede ser detectada observando la hemólisis en los eritrocitos del agar Watgatsuma. uno tradicional y otro molecular. 54 * Recomendado para la identificación de rutina de Vibrio. Entre las técnicas tradicionales.

2 a 25ºC. 55 Medios de cultivo y reactivos 1. Agua Peptonada Alcalina La viabilidad de Vibrio spp.6 ± 0. de materia fecal y de otras muestras. . se mantiene intacta a pH alcalino y el uso de agua peptonada alcalina ha sido recomendado para incrementar la recuperación de Vibrio spp. El medio contiene peptona de carne. cloruro de sodio y el pH final es de 8.

Conservar refrigerado. No se debe autoclavar. guardar a temperatura ambiente y en oscuridad. Se autoclave 15 minutos a 121º C 3. Como la reacción tiene lugar en medio ácido. Agar LIA (Lisina Hierro) Principio La decarboxilación de la lisina a cadaverina produce una alcalinización del medio y un viraje al violeta del indicador púrpura de bromocresol. Incubar a 35ºC por 18 a 24 horas.2 y esterilizar a 121°C por 15 minutos.). distribuir 6-8 ml por tubo y esterilizar a 121°C por 15 minutos 2. C. Materiales Se detecta utilizando el tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de oxidasa) que contiene este compuesto que va a ser oxidado por la enzima. desaminan la lisina a ácido α- cetocarbónico que forma compuestos pardo-rojizos en el medio de cultivo con la sal de hierro y en aerobiosis.6.5ml Agua 1000ml Ajustar pH a 7. Prueba de la Oxidasa Principio El objetivo de esta prueba es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa que es una enzima de la cadena respiratoria perteneciente al grupo de las hierro porfirinas.2 ml de agua destilada. Principio El medio fue diseñado para determinar la habilidad de las bacterias de fermentar hidratos de carbono y producir sulfuro de hidrógeno (H2S). Tras unos 30 segundos. Guardar en refrigeración Agregar al caldo base de fermentación la cantidad suficiente para una concentración final de 1% 8. La formación de H2S produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro producido. Consideraciones El test se debe leer entre las 18 y 24 horas. Son estables por un año en oscuridad a 4ºC. Lecturas tempranas pueden dar falsos resultados ácido/ácido. El indicador de pH es el rojo fenol y el sulfato ferroso pone en evidencia la formación de H2S. citrato. Por su doble indicador (azul de timol y azul de brotimol) vira a amarillo con pequeñas variaciones de pH por la acidificación de la sacarosa. se puede humedecer el disco con una gota de agua y luego colocar sobre el mismo material de una de las colonias en estudio.6% en etanol 2. autoclavar a 121ºC por 15 minutos y enfriar inclinado dejando un fondo de 5 a 10 mm. Peptona (Difco) 10g Na Cl 10g Agua 1000ml Ajustar pH a 8.1%) de glucosa y 10 partes (1. D. pero fermentan la glucosa producen un viraje al amarillo en todo el medio. mientras que lecturas tardías pueden dar falsos resultados alcalino/alcalino. es necesaria la fermentación previa de la glucosa. 10. Disolver el polvo en agua destilada y dispensar en volúmenes de . Aeromonas.0%) de lactosa y sacarosa. Salmonella spp. Se encuentra presente en los géneros Pseudomonas.0 ml en tubos con tapa a rosca de 12 x 120. anaerobios facultativos y estrictos. pero no en los miembros de la familia Enterobacteriaceae.. La producción de H2S se manifiesta por un ennegrecimiento del medio.2. tanto la punción como la estría aparecerán de color amarillo. Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa). Si el microorganismo fermenta glucosa. distribuir 4 ml por tubo y esterilizar a 121°C por 15 minutos. En un trozo de papel filtro se impregna el reactivo de oxidasa y a partir de la placa de agar sangre o TSA se toma una asada de la bacteria problema y se pone sobre el papel filtro. 56 Se incuba 6 a 8 horas y se siembra en los medios de cultivo. 5. También existen discos comerciales. El sustrato es estable por 3 meses. Esterilizar a 121°C por 15 min. Sembrar dos picadas. colocar un disco del reactivo. Agar conservación de cepas Extracto levadura 3g Peptona 10g NaCl 20g Agar 10g Agua 1000ml Ajustar pH a 7. Vibrio.45 micrones. etc. 6. Con un asa estéril tomar la cepa en estudio. E. Se considera positiva esta prueba cuando toma un color púrpura la muestra. Caldo Base Fermentación Peptona 10g Extracto carne 3g NaCl 10g Bromocresol púrpura solución al 1. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración. Se prepara según las recomendaciones del fabricante. Materiales El medio está disponible comercialmente. 4. El medio contiene: tiosulfato. la estría permanecerá ácida (amarilla). Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa solamente (Shigella spp. Resultados Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa.6 g de NaCl según la concentración que se quiera preparar. B. se observa si ha ocurrido algún cambio. Agar Tripticasa soya (TSA) Es un medio utilizado para propósitos generales que favorece el desarrollo y el aislamiento de una gran variedad de microorganismos aerobios. Agar TSI (Hierro Tres Azucares) I. Las bacterias del grupo Proteus-Providencia. coli. sacarosa y/o lactosa (E. Si hay escaso número de colonias sospechosas. Retirar el asa y estriar sobre la superficie del agar. Caldo Tolerancia Na Cl 0-1-6% Triptona 1g Agua 100ml Agregar 1. Procedimiento A. Procedimiento A. sales biliares y sacarosa y está disponible comercialmente. B. Punzar el fondo en el centro. 9.0-7. Se prepara una solución al 1% en agua destilada. Los microorganismos que no decarboxilan lisina. C. Si el organismo fermenta lactosa y/o sacarosa. Ajustar pH a 7. Disolver en agua destilada y dispensar volúmenes de 3. Preparación de Azucares Preparar solución de azúcar al 20% en agua destilada Filtrar por filtro 0. El medio contiene 1 parte (0. la estría se vuelve alcalina (roja). Materiales El medio está disponible comercialmente. 7. En un tubo de Khan preparar una suspensión espesa del microorganismo en estudio en aproximadamente 0.). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o producirán productos alcalinos y el medio TSI permanecerá rojo. Precipitado negro en el fondo: producción de H2S (Salmonella spp). poner tapón de goma. coli). Agar TCBS Es un medio selectivo para el aislamiento de Vibrio cholerae. Se prepara según las indicaciones del fabricante. Burbujas o roturas: producción de gas (E. con excepción de Morganella morganii. Si no fermenta lactosa. Dejar la tapa floja para permitir intercambio de aire.0 Distribuir 3 ml en tubo de Khan.

La sensibilidad del ensayo se aumenta por el agregado de α-naftol antes del agregado de KOH. se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estéril. Conservar refrigerado. Dejar enfriar antes de su empleo y guardar a 4-8ºC para su conservación. Fraccionar en volúmenes de 3 a 4 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121ºC por 10 minutos. el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos aldehídos para formar un compuesto coloreado. B. Resultados Ensayo positivo: medio turbio y púrpura a púrpura amarillento.0 gr • Agua destilada 1000 ml A este caldo se le incorpora triptofano en una concentración del 1%.3-butanodiol (diacetilo). Para la preparación del caldo RMVP. Como indicador de la presencia del aldehído se usa el reactivo de Erlich. Agregar los aminoácidos a 3 porciones del medio. Incubar a 35ºC en atmósfera normal. Los microorganismos que no decarboxilan la lisina y fermentan glucosa producen un viraje al amarillo. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo. B. Es especialmente útil en la identificación preliminar de Escherichia coli. acético o fórmico. formando la correspondiente amina. 2) Incubar a 35ºC por 18 a 24 horas. ver el . registrando los resultados día por día. 95% 95. 12. El ensayo constituye un método rápido para detectar organismos productores de indol. El test se debe acompañar con un tubo control que contiene el medio base sin aminoácido. La formación de H2S se indica por la aparición de una coloración negra.0 ml Se disuelve el aldehído en el alcohol (puede requerir un calentamiento suave). Este último proceso de lugar a la formación de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador al color violeta. se observa un anillo amarillo. la acetoína se oxida a diacetilo. Prueba del Indol Principio El indol es uno de los productos del metabolismo del aminoácido triptofano. Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase. En presencia de oxígeno e KOH. Como la decarboxilación es una reacción anaeróbica. 4) Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo.2. Los tres aminoácidos que se ensayan en la identificación de Enterobacterias son arginina. Identificar el reactivo con una etiqueta indicando la fecha de expiración y guardar refrigerado en botellas color caramelo. El sustrato es estable por 3 meses. que da un complejo rojo . segundos después de agregar el reactivo. Tomar la cepa en estudio con un asa e inocular el tubo control y los tubos con los aminoácidos.0 ml • ácido clorhidríco. Test de Decarboxilasa-Dihidrolasa Principio La decarboxilación es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los aminoácidos. Incubar a 35ºC por 18 a 24 horas en atmósfera normal. Efectuar las lecturas día por día hasta 4 días. mientras que arginina da citrulina por acción de una dihidrolasa. El pH se debe ajustar después de agregar el aminoácido y antes de esterilizar a 6 – 6. La acidificación es necesaria para que ocurra la decarboxilación. cuando la prueba es negativa. Con un medio rico en triptofano. concentrado 20. Resultados Los microorganismos que decarboxilan la lisina producen un viraje al violeta. 13. lisina y ornitina. Esterilizar a 121ºC por 15 minutos. Materiales El medio basal más comúnmente utilizado es el medio de decarboxilasa de Moeller. 5) En la reacción positiva se observa un anillo de color rojo. 3) Transferir 2 ml de la suspensión de caldo a un segundo tubo. El proceso ocurre en dos etapas: por fermentación de la glucosa se produce una acidificación del medio (pH < 6. Rotular los tubos y conservar refrigerado. Fraccionar el medio base en 4 porciones de 250 ml cada una. y para diferenciar Edwardsiella (+) de Salmonella (-). D. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estéril. Materiales A. El reactivo de color amarillo es estable por un año.0). Procedimiento A. Otros metabolizan el piruvato por el camino del butilenglicol para formar como productos finales acetoína (acetilmetilcarbinol) y 2. Prueba de Voges- Proskauer Principio El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. Enfriar de manera de tener estría y fondo. Reactivo de Erlich • p-dimetilaminobenzaldehido 1.0 gr • Cloruro de sodio 5. Las concentraciones de aminoácidos a usar son: 1% para la forma L y 2% para la forma DL. Caldo triptófano • Peptona 20. Procedimiento 1) Con un asa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que contiene triptofano. luego se agrega lentamente el ácido.0 g • alcohol etílico. Materiales A. 57 3 ml en tubos con tapa a rosca de 12 x 120. El medio está disponible comercialmente. La decarboxilación de lisina y ornitina da cadaverina y putrescina (diaminas). apareciendo color amarillo. Procedimiento A) Inocular punzando el fondo y luego estriar la superficie del agar. El medio se esteriliza a 121ºC durante 15 minutos. El ensayo de VogesProskauer (VP) detecta estos productos metabólicos. Ensayo negativo: color amarillo Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo es un fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo). 11. C. Preparación del medio El medio está disponible comercialmente. Algunos lo rompen para formar como productos finales ácidos láctico. A partir del ácido pirúvico un microorganismo puede seguir varios caminos.

Preparación de solución de α-naftol Disolver 5. F. Preparación de la solución de KOH Disolver los pellets de KOH en agua destilada y luego llevar el volumen final a 100 ml (trabajar sobre baño de agua fría para evitar recalentamiento). B) Con esa suspensión. 6. 6. B. Crecimiento en NaCl Principio Es una prueba que se usa para diferenciar distintas especies del género Vibrio. El reactivo es estable por 1 año. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración.2 ml del reactivo de KOH. Ensayo negativo: no hay desarrollo de color.1. E. con tapa a rosca. Guardar en heladera en frascos color caramelo. se siembran los tubos con 0. Observar la formación de un color rosado a rojo. D.2 con solución de NaOH al 30% Agregar NaCl al 1. La solución debe ser incolora. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de color rojo dentro de los 15 minutos. B. 10% de NaCl Resultados Ensayo positivo: desarrollo de turbidez por crecimiento Ensayo negativo: ausencia de turbidez por falta de crecimiento Control Vibrio cholerae al 0% y 1% de NaCl + Vibrio cholerae al 8 y 10% de NaCl –.5 ml de la suspensión a otro tubo. Procedimiento A) Hacer una suspensión de la bacteria en un tubo de agua peptona sin NaCl. Agregar 0. El reactivo es estable por 1 año. C.0 gr de α- naftol en una pequeña cantidad de alcohol absoluto y luego llevar el volumen a 100 ml. 8.6 ml del reactivo de α-naftol. Tomar una asada de la cepa en estudio e inocular un tubo de caldo RM/VP. Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos.[24] . Materiales Peptona 20g Agua destilada: Completar a 100ml Ajustar el pH a 8-8. Agregar 0. 8 y 10% y fraccionar 3 ml en tubos de 13x100. C. Transferir 2. esterilizar 15 minutos a 121ºC. Procedimiento A. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración. Incubar a 35ºC por un mínimo de 48 horas. 58 procedimiento indicado para el test de rojo de metilo. G.

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