2013-I

MANUAL DE BACTERIOLOGIA

ALUMNO: Puican Popuche Gianfranco J.

GRUPO: 2-7
 PRACTICA 1
CULTIVO PURO

Las bacterias, son microorganismos que se encuentran ampliamente distribuidas en la

naturaleza; habitan el suelo, aire, agua, organismos animales, vegetales y el hombre. Su
estudio en tan diversos hábitat requiere de técnicas adecuadas para descubrir la compleja
población mixta y separarlas en sus partes integrantes, es decir cultivar una sola especie.
Se entiende por cultivo puro, una población de bacterias que proceden de una célula. Es un
estado artificial que se obtiene en el laboratorio, pero requiere proporcionar las
condiciones adecuadas para el desarrollo y conservación.
Para obtener un cultivo puro, se siguen los siguientes pasos:
1. Selección y tratamiento de la muestra.
2. Aislamiento primario.
3. Aislamiento secundario.

1. Selección y tratamiento de la muestra

Debido a la diversidad de las bacterias y a la especificidad del hábitat, es importante
seleccionar la muestra. Por ejemplo, si se desea obtener un cultivo puro de bacterias que
ocasionan la tifoidea (Salmonella typhi) se puede considerar como muestras las heces,
sangre; para el caso de Rhizobium sp., las muestras ideales son la tierra o los nódulos de
leguminosas.
Las muestras, deben ser procesadas o tratadas cuando el caso lo requiere; por ejemplo,
muestras sólidas como heces, tierra o alimentos se disuelven previamente. Si las muestras
seleccionadas contienen bacterias patógenas y exigentes, se someten a un proceso de
enriquecimiento.

2. Aislamiento primario
Consiste en separar las bacterias de la muestra seleccionada. Para ello, se utilizan medios
de cultivo sólidos, que pueden ser, básicos, si es que la bacterias que se aíslan no son
exigentes; enriquecidos (agar, sangre, agar tripticasa soya, etc.) o selectivo - diferenciales
(Mc Conkey, Chapman, TCBS, etc.) en caso contrario.
Se emplean muchas técnicas para el aislamiento primario
a. Técnica de siembra en placa: en estría y en superficie.
b. Técnica de vertido en placa, con preparación de diluciones seriadas de las muestra.
Se emplea cuando se tiene conocimiento de que la muestra contiene muchas
bacterias.
c. Técnicas de enriquecimiento del cultivo; para mejorar las probabilidades de aislar
algunas bacterias poco frecuentes en la muestra.
El crecimiento de las bacterias se evaluara, por la formación de colonias en el medio
después de un periodo de incubación de 24 a 48 horas, dependiendo del tiempo
generacional de las bacterias. Por ejemplo M. tuberculosis, requiere de 2 a 3 semanas o E.
coli 20 minutos.

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3. Aislamiento Secundario
Se realiza de la colonia seleccionada. Consiste en transferir una porción de la colonia a un
tubo con medio de cultivo inclinado, y que reúne las condiciones que requiere la bacteria
para su crecimiento y conservación. Después de un período de incubación de 24 a 48 horas
de crecimiento, éste constituye el “cultivo puro”.

ESTUDIO MORFOLÓGICO DE LAS COLONIAS

Consiste en la observación de la forma tamaño, bordes, elevación, consistencia, color,
características que varían de una colonia a otra.
 Con relación a la forma; las colonias bacterianas pueden ser circulares, ovoides media
luna o irregulares.
 El tamaño varía según la cepa, de 1mm a más de 5mm en las colonias filamentosas.
 Los bordes pueden ser enteros, lobulados, festoneados, arborescentes o irregulares.
 La elevación: cóncavas, aplanadas, convexas, semielevadas.
 La consistencia: mucoide, lisa, seca, elástica, pastosa.
 Aspecto: pulvurulenta, granulosa, acuosa brillante transparente.
 Color: las colonias pueden ser pigmentadas o no pigmentadas o incoloras.

MÉTODOS DE OBSERVACIÓN DE LAS BACTERIAS

 De bacterias muertas, en preparaciones secas y teñidas por las técnicas de tinción
simple o diferencial (doble), como la tinción Gram y de Ziehl-Neelsen o tinciones
especiales para observación de estructuras. Su aplicación exige 3 pasos importantes:
Extensión, fijación y coloración.

 De bacterias vivas:
a) Gota Pendiente, que utiliza una lámina excavada. La técnica consiste en colocar en el
centro de una laminilla o cubre objeto una gota del cultivo líquido (si es sólido se
prepara una emulsión con una gota de salina fisiológica estéril). Se coloca la laminilla con
la superficie excavada haciendo coincidir la gota del cultivo con excavación, obteniendo
de esta manera la gota pendiente. Observar con objetivo de menor aumento y luego con el
de mayor aumento.
Esta técnica permite observar además de la forma el tipo de movimiento de las bacterias
relacionado con los tipos de flagelos que poseen, peritricos o polares.

b) Entre porta y cubre objeto

Para ambos métodos los bordes de los preparados se cubre con vaselina para evitarla
desecación.

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA
 Conocer como se aíslan las diferentes especies bacterianas en cultivo puro
 Aplicar correctamente las técnicas adecuadas para obtener un cultivo puro.

2
MATERIALES
 Muestra: tierra, agua, alimentos, secreción nasofaríngea (SNF), heces, sangre.
 Placas con agar nutritivo (AN), agar sangre (AS), agar tripticasa soya (ATS).
 Tubo con medio SIM
 Tubo con caldo nutritivo
 Asa bacteriológica
 Lámina excavada y laminilla

PROCEDIMIENTO
 Seleccionar la muestra
 Realizar el aislamiento primario, utilizando la técnica de siembra por estría en la
superficie del medio sólido
 Incubar las placas a 37°C por 24 horas en ambiente aeróbico
 Efectuar el estudio morfológico de las colonias
 Proceder al estudio microscópico de la morfología de las bacterias
 Realizar el aislamiento secundario en tubo con medio sólido inclinado Obtener el
cultivo puro
 Comprobar la pureza del cultivo puro. Tinción de Gram
 Determinar la movilidad de las bacterias
-Técnica de gota pendiente
-Técnica de motilidad en medio semisólido. Observar la movilidad de las bacterias
por desplazamiento perpendicular a la estría vertical de siembra por picadura
 Determinar las características de crecimiento en medio líquido: turbidez, sedimento,
película, flóculos, etc.

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 RESULTADOS
CULTIVO EN PLACA

MORFOLOGIA COLONIA 1
FORMA

TAMAÑO

COLOR

CONSISTENCIA

BORDE

ELEVACION

MORFOLOGIA BACTERIANA: Tinción de Gram

MORFOLOGIA BACTERIA
FORMA

DISPOSICION

REACCION TINTORAL

ENDOSPORAS:
Forma ______________________
Ubicación ______________________
Cápsula ______________________

GOTA PENDIENTE PRUEBA DE LA CATALASA

CULTIVO PURO COLONIA 1 CATALASA

MOTILIDAD

TIPO DE FLAGELO

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TECNICA DE MOTILIDAD EN MEDIO SEMISOLIDO

CARACTERISTICAS DE CRECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO

CULTIVO PURO

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 CUESTIONARIO

1. ¿Se podría simplificar los pasos para obtener un cultivo puro? ¿Por qué?
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¿Qué pasos sugiere usted?

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2. Considera que un cultivo puro podría mantenerse en un medio selectivo diferencial?

¿Por qué?
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3. ¿Qué tiempo podrían mantenerse las bacterias en un cultivo puro?

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4. ¿Qué características se deben tener en cuenta para prolongar el tiempo de conservación

de un cultivo puro?
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 PRACTICA 2

FAMILIAS: STAPHYLOCOCCACEAE Y
MICROCOCCACEAE

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE
Géneros: Staphylococcus y Micrococcus

I.-INTRODUCCIÓN:
Las bacterias gram positivas, en particular los cocos son los microorganismos aislados
con mayor frecuencia a partir de muestras clínicas humanas en el laboratorio de
microbiología. Estas bacterias son ampliamente distribuidas en la naturaleza y pueden
hallarse en el medio ambiente o como habitantes comensales de la piel, las mucosas y
otros lugares del cuerpo de los seres humanos y de los animales.
Las familias Staphylococcaceae y Micrococcaceae, agrupa a las bacterias de los géneros
Staphylococcus y Micrococcus respectivamente, entre otros géneros, cuyos hábitat
naturales son los mamíferos para el primero y el suelo y agua para el segundo. Sus células
son esféricas (cocos), se disponen en agrupaciones irregulares en pares, aisladas, como
consecuencia de la división celular en dos planos. Con excepción de los Staphylococcus,
forman además tetradas. Producen pigmentos, blanco, dorado (Staphylococcus), rosa,
anaranjado, amarillo (Micrococcus).

Estas especies de géneros diferentes, anteriormente relacionados taxonómicamente, com

Micrococcus que raramente producen infecciones en humanos, tienen características
fenotípicas muy similares desde el punto de vista morfológico y bioquímico a los
estafilococos, por lo que conviene saber diferenciar ambas especies de las del género
Staphylococcus.Son Gram positivas, inmóviles con algunas excepciones, aeróbicas
estrictas (Micrococcus) y aerobias o anaeróbicas facultativas (Staphylococcus). Son
catalana positiva y la mayoría de especies son saprofitas, con excepción de S. aureus que
es patógena.

II.-OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA;

 Aislar S. aureus de muestras clínicas, haciendo uso correcto de las técnicas de

aislamiento e identificación.
 Identificar por lo menos una especie de Micrococcus.

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 Género Staphylococcus
III.-MATERIALES:

1. Aislamiento
 Muestra: secreciones, pus, leche, quesos
 Placa Petri con agar sangre
 Placa Petri con agar Chapman o agar manitol salado, o agar Baird Parker
 Placas Petri estériles
 Asa bacteriológica
 Tubos con agar nutritivo.

2. identificación,
 Batería de Gram
 Agua oxigenada o peróxido de hidrógeno (H2O2)
 1 tubo con plasma citratado estéril
 1 tubo con cultivo líquido de 24 hrs.
 1 tubo estéril
 1 tubo con medio gelatina
 1 tubo con caldo nitrato
 1 tubo con caldo manitol
 1 tubo con caldo arginina

PROCEDIMIENTO

1. Aislamiento:
 Preparar la muestra utilizando un diluyente, si el caso lo requiere.
 Sembrar con el asa bacteriológica estéril en la superficie de los medios sólidos:
agar sangre (AS), agar Chapman (A.CH.), o agar manitol salado utilizando la
técnica de agotamiento y estría.
 Incubar las placas invertidas a temperatura de 37 °C por 24 hrs. Las placas de agar
sangre deben incubarse dentro de la Jarra de Brewer.
 Observar las colonias características y anotar:
o Morfología de la colonia: forma, bordes, tamaño, pigmento, elevación
o Morfología de la bacteria (tinción Gram): Forma, disposición Reacción
tintorial.
o Hemólisis.
 Seleccionar una colonia característica y transferirla a un tubo con agar cepa o A.N.
Sembrar por estría en la superficie inclinada para obtener un cultivo puro y
mantener la cepa.

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2. Identificación:
2.1. Prueba de catalasa:
 Sobre una lámina porta objetos, limpia y desengrasada, colocar una gota de agua
oxigenada, luego añadir una porción de cultivo con un mondadientes.
 Observar la reacción. Si la bacteria produce la enzima catalasa, se observa un
burbujeo característico, por descomposición del peróxido.

2.2. Prueba de coagulasa:

 Preparación del cultivo
o En un tubo con caldo común, sembrar una asada del cultivo puro.
o Incubar a 37 °C por 24 hrs.
 Obtención del plasma
o En un tubo estéril con 0,5 ml de citrato de sodio (anticoagulante), depositar
5 ml de sangre extraída asépticamente.
o Centrifugar por 15 minutos a 2 000 rpm o dejar el tubo en posición vertical
en refrigeración por algunas horas.
o Separar el plasma (sobrenadante) en un tubo estéril.
 Prueba
o Tomar 0,5 ml de plasma en un tubo estéril, luego añadir 0,5 ml de cultivo
de Staphylococcus de 24 hrs.
o Incubar a 37 °C durante 4 hrs.
o Observar cada 30 minutos.
 Interpretación
o Si no hay cambio la prueba es negativa
o Sí hay formación de coágulo, la prueba es positiva

2.3. Fermentación del manitol en anaerobiosis

 Sembrar la cepa de Staphylococcus en un tubo con caldo manitol
 Incubar el tubo dentro de la Jarra de Brewer a 37 °C por 24 hrs.
 Observar el desarrollo y la actividad fermentativa. Si fermenta el manitol, el
indicador rojo de fenol del medio vira a un color amarillo debido a la reacción
ácida del medio.

2.4. Prueba de hidrólisis de la gelatina

 Sembrar la cepa en medio gelatina por la técnica de picadura.
 Incubar a 37 ºC por 48 hrs. y en refrigeración por 3 hrs.
 Observar la reacción. Si actúa la enzima gelatinasa, se observa licuefacción de la
gelatina, el medio no solidifica a temperatura de refrigeración. La ausencia de
enzima se pone de manifiesto porque la gelatina solidifica a temperatura de
refrigeración.

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TABLA 01: CARACTERISTICAS DIFERENCIALES DE LOS GÉNEROS Staphylococcus,
Micrococcus y Planococcus
PRUEBAS DIFERENCIALES Staphylococcus Micrococcus Planococcus
Células esféricas G+ + + +
Disposición: - racimos + + -
- tétradas - v +
Fermentación de glucosa + - -
Movilidad - - +
Pigmento amarillo-marron - - +
Voges Proskawer + - -
Reducción de nitratos + - -
Hidrólisis de Arginina + - -
Peroxido de Hidrogeno - - -
Catalasa + + +
Hemolisis + - -
G+C mol % en ADN 30-40 66-75 39-52

TABLA 02: CARACTERISTICAS DIFERENCIALES DE LAS ESPECIES DE

Staphylococcus
PRUEBAS DIFERENCIALES S. aureus S. epidermidis S. saprophyticum
Coagulasa + - -
Ferm. Manitol: - aerobiosis + V V
- anaerobiosis + - -
Ferm. Glucosa anaerobiosis + + -
Alfa toxina + - -
Endonucleasa resistente cal + - -
Pared celular: - Ribitol + - -
- Glicerol - + -
- Proteína A + - -
Sensibilidad a Novobiocina S S R

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 RESULTADOS
1. CULTIVO EN PLACA: Colonias características en:

Agar Manitol Salado o Agar Chapman Stone

MORFOLOGIA COLONIA 1
FORMA
TAMAÑO
COLOR
CONSISTENCIA
BORDE
MANITOL
CATALASA

AGAR SANGRE

MORFOLOGIA COLONIA 2
FORMA
TAMAÑO
COLOR
CONSISTENCIA
BORDE
HEMOLISIS

2. OBSERVACION MICROSCOPICA: de bacterias teñidas y bacterias vivas

MORFOLOGIA Célula Bacteriana

FORMA

DISPOSICION

REACCIÓN
TINTORIAL

MOVILIDAD

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3. CULTIVO PURO

4. IDENTIFICACION DE LA CEPA

 Prueba de la catalasa: ____

 Prueba de coagulasa:  Reducción de Nitratos

 Ferm. de Manitol en Anaerobiosis  Hidrólisis de Arginina

 Prueba Hidrolisis de la Gelatina

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5. RESUMEN

PRUEBAS RESULTADOS
Coagulasa
Catalasa
Fermentación del Manitol en Anaerobiosis
Hemolisis
Movilidad

6. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

7. CONCLUSION

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 CUESTIONARIO
1. ¿Cree usted que las pruebas realizadas para identificar S. aureus son suficientes?¿Por
qué?
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2. ¿Cómo actúa la enzima catalasa de S. aureus? Efectué la reacción.

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3. ¿Por qué vira el indicador rojo fenol del caldo manitol cuando se desarrolla S. aureus
en anaerobiosis? Fundamente su respuesta bioquímicamente.
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4. ¿Cómo se reconoce q S. aureus produce coagulasa? ¿Qué a sucedido?

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_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

5. ¿Considera importante alguna otra prueba para identificar S. aureus?

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_____________________________________________________________________

6. ¿Qué otros medios de cultivo puede utilizarse para aislar S. aureus?

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 Género Micrococcus

MATERIALES:

1. Aislamiento
 Muestra: agua, suelo,
 Placa petrí estéril,
 Medio de cultivo: agar nutritivo,
 Pipeta del y 10 ml.
 Tubos de ensayo con agar nutritivo o agar cepa.

2. Identificación
 3 tubos de 160 x 15 mm, con 10 ml de medio O - F (Hugh - Leiffson),
 Lámina porta objeto
 Agua oxigenada
 Batería de Gram.

PROCEDIMIENTO
1. AISLAMIENTO: Técnica de la placa vertida
 Pesar 1 g de suelo en forma aséptica.
 Colocar la muestra en un tubo con 9 ml de agua destilada estéril (dilución 10-1)
Homogeneizar con la misma pipeta, luego tomar 1 ml y llevar a un segundo tubo
con 9 mi de agua destilada (dilución 10-2). Con una nueva pipeta tomar 1 ml de esta
dilución y llevar a un tercer tubo con 9ml de diluyente (dilución 10-3). Así se puede
preparar más diluciones, según el contenido de las bacterias en la muestra.
 De la última dilución, tomar 1 ml y llevar a una placa petrí estéril. Inmediatamente
adicionar 15 - 20 ml de agar nutritivo, calentando y enfriando a 45 ºC. Homogenizar
el ínóculo con el medio y dejar enfriar.
 Incubar la placa en aerobiosis a una temperatura de 30 ºC por 24 a 48 hrs.
 Observar el crecimiento de colonias circulares, pigmentadas, cremosas, en la
superficie del medio.
 Realizar una tinción de Gram de la colonia para observar la morfología de la bacteria
 Seleccionar la colonia característica y transferir una porción de ella con aguja
bacteriológica, a un tubo con AN inclinado; efectuar la siembra por estría en la
superficie inclinada, después de incubación a 30 ºC por 24horas se obtiene el
cultivo puro o cepa.

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2. IDENTIFICACIÓN

2.1. Morfología microscópica: forma de las células, disposición, movilidad

2.2. Prueba de oxidación – fermentación (O-F)

 Sembrar la cepa, por puntera, en dos tubos con medio O - F (Hugh -Leiffson)
que contiene glucosa como sustrato. A uno de los tubos adicionar 1 ml de parafina o
vaselina fundida estéril, para excluir el oxígeno. Taponar ambos tubos.
 Incubar los tubos a 35 OC por 48 hrs.
 Observar la producción de acidez por oxidación de la glucosa, que se manifiesta por
el viraje del indicador purpura de bromocresol a color amarillo en el tubo sin
parafina. Indicar tipo de metabolismo.

TABLA 03: CARACTERISTICAS DIFERENCIALES DE LAS ESPECIES DEL GENERO

Micrococcus
M. M. M. M. M.
CARACTERISTICA
luteus roseus halobius agilis varians
Pigmento: - Amarillo + - - - +
- Rojo - + - + -
O-F Glucosa: acido tubo abierto - + + - +
Lactosa: acido - - + - -
A. Nutritivo 7,5% NaCl + + + - +
Arginina: NH3 - - - - -
Pared celular: L-lisina + - -
Hidrólisis de gelatina + - - + +
Reducción de Nitratos - + - - +
Motilidad - + - + -
G+C en ADN 71-75 66-75 66-72

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 RESULTADOS

1. CULTIVO EN PLACA: Crecimiento de colonias bacterianas en Agar nutritivo

MORFOLOGIA COLONIA
FORMA
TAMAÑO
COLOR
CONSISTENCIA
BORDE
ELEVACIÓN
CATALASA

2. OBSERVACION MICROSCOPICA: Colonia seleccionada

MORFOLOGIA Célula Bacteriana

FORMA
DISPOSICION
REACCIÓN TINTORIAL
MOVILIDAD

3. CULTIVO PURO o CEPA:

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4. IDENTIFICACIÓN DE LA CEPA

 Prueba de Acides de Glucosa: Medio O-F

PRUEBA DE OXIDO FERMENTACIÓN

O-F TUBO 1 TUBO 2 REACCION

AMARILLO
VIOLETA

 Tolerancia a NaCl
 Reducción de Nitratos

 Hidrolisis de la Gelatina

18
5. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

6. CONCLUSIÓN

CUESTIONARIO
1. Por los resultados de la prueba O-F. ¿Qué tipo de metabolismo tienen las
bacterias del genero Micrococcus que Ud. aisló?
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2. ¿Por qué se emplea el medio O-F para saber si la bacteria utiliza glucosa?
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 PRACTICA 3

FAMILIAS: STREPTOCOCCACEAE Y
ENTEROCOCCACEAE

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE LOS GENEROS:

Streptococcus, Lactococcus y Enterococcus

I.-INTRODUCCIÓN:

Los géneros, Streptococcus y Enterococcus comprenden una variedad de especies con

hábitat muy diferentes, cuyas actividades son de importancia práctica considerable para el
hombre. Algunas especies son patógenas para humanos y animales. Los lactococos, se
encuentran en la leche y productos lácteos
Las células miden de 0,5 a 1,0 µm de diámetro, no pasan de 2,0 µm, son esféricas u
ovoides en los estreptococos, esféricas en los enterococos y lactococos, se disponen en
pares o cadenas de varias células. No forman endosporas y son inmóviles Gram positivos.
Tienen requerimientos nutricionales generalmente complejos y variables, necesitan
aminoácidos, purinas, pirimidinas, péptidos, vitaminas y tensión de CO2 a excepción de S.
bovis que sólo requiere glucosa y amonio inorgánico para crecer. Son quimiorganótrofos y
tienen un metabolismo fermentativo cuyo producto final predominante es el ácido láctico.
Algunas especies fermentan ácidos orgánicos (málico y cítrico) y aminoácidos (serina y
argínina).
La proporción de G+C contenido en su ADN, se encuentra en el rango de 33-42 moles %.
Las especies pueden diferenciarse en grupos más limitados por medio de pruebas
fisiológicas (Sherman, 1957) o en grupos serológicos de Lancefield por medio de
reacciones de precipitación. También es importante considerar la hemólisis en agar sangre
para subdividir el género en 0 hemolíticos, a hemolíticos o no hemolíticos.

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA
 Aislar Streptococcus, Enterococcus y Lactococcus de muestras de secreción
nasofaríngea, leche, heces utilizando medios de cultivo enriquecidos y selectivos.
 Identificar las especies de los Géneros, Streptococcus, Enterococcus y Lactococcus
mediante pruebas de crecimiento a diferentes temperaturas, tolerancia a sal y pruebas
bioquímicas.
 Utilizar correctamente las técnicas y claves para identificar grupos y especies de
Streptococcus, Enterococcus y Lactococcus.

20
II.-MATERIALES:

1. Aislamiento
 Muestra: Secreción nasofaríngea, heces, leche.
 Medio de cultivo: agar sangre y agar Packer.
 Hisopo estéril y asa bacteriológica,
 Jarra de Brewer,
 Tubos con medio tripticasa soya.

2. Identificación
 Lámina y reactivo peróxido de Hidrógeno.
 Batería de Gram.
 Tubos con caldo extracto de levadura triptosa a pH 7 para crecimiento a 10°C y 45
°C, y para resistencia al calor a 63°C por 30 minutos.
 Tubos con leche que contienen 0,1 % de azul de metileno.
 Tubos con caldo extracto de levadura. triptosa con 6.5 % de NaCl para prueba de
tolerancia a la sal.
 Tubos con caldo extracto de levadura triptosa a pH 9,6.
 Tubos con caldo Arginina.
 Tubos con leche tornasolada para prueba de reducción y coagulación.
 Tubos con caldo bilis al 40%.
 Placa con agar sangre y disco de bacitracina, para prueba de bacitracina (S.
pyogenes).

III.-PROCEDIMIENTO

1. Tome de Muestra:
 Con hisopo estéril frotar la región nasofaríngea,
 La muestra de heces, recogerla en frasco estéril con tapa de rosca, diluirla con agua
destilada estéril.
 La muestra de leche, recogerla en frasco estéril con tapa de rosca.

2. Aislamiento:
 Con el hisopo estéril embebido de la muestra de secreción nasofaríngea, heces
diluidas o leche, sembrar directamente en la superficie de los medios sólidos agar
sangre y agar Packer, agotando la muestra en un extremo de la placa y continuando
la siembra con el asa bacteriológica (técnica de estriado),
 Las muestras de leche y heces diluidas, se siembran en nuevas placas de agar
sangre y agar Packer, utilizando el asa bacteriológica estéril y la misma técnica.

21
  Las placas se colocan invertidas dentro de la Jarra de Brewer y se incuban 37°C
durante 48 horas en la estufa bacteriológica.
 Transcurrido el tiempo de incubación, evaluar el crecimiento bacteriano
observando la morfología de las colonias (forma, tamaño, color, aspecto, borde,
constancia) de cada placa y la actividad hemolítica.
 Realizar la tinción de Gram de las colonias características para observar la
morfología de las células y su reacción tintorial.

3. Cultivo Puro
 Transferir 3 a 5 colonias características a tubos con caldo extracto de levadura
triptosa. Incubar a 37°C por 24 horas. Sembrar una asada del cultivo líquido
característico en tubos con agar tripticasa soya para obtener el cultivo puro.
 Del cultivo puro, realizar tinción de Gram, para observar las características
morfológicas de las células y su reacción tintorial.

4. Identificación
 Prueba de catalasa,
 Crecimiento a 10°C y 45°C se realiza esta prueba en caldo extracto de levadura
triptosa a pH 7, se observa crecimiento por la turbidez del caldo después del
período de incubación.
 Crecimiento a pH 9,6.
 Crecimiento en bilis al 40%,
 Prueba de resistencia térmica a 63°C por 30 minutos.
 Fermentación de inulina, trehalosa, sorbitol.
 Prueba de Hidrólisis de la arginina e hipurato de sodio.
 Prueba de Voges Proskawer.

TABLA 01: CARACTERES DIFERENCIALES DE LOS COCOS GRAM POSITIVOS

CARACTERISTICA Streptococcus Enterococcus Lactococcus
Plano de división 1 1 1
Disposición Pares, cadenas Pares, cadenas Pares, cadenas
cortas cortas
Ferm. De Glucosa A.L (D) A.L (L) A.L (L)
Catalasa - - -
Citocromo presente K ND -
Hemolisis α β α (β) -
T° Optima 37 °C 37°C 30°C
Movilidad - D -
Mol % G+C en ADN 56-61 34-42 38-40

22
A.L.: Ac láctico (D): Dextrógiro (L): Levógiro (β): algunos β hemolíticos
d: de 11-89% son positivas ND: no determinado k: pocas cepas lo sintetizan
TABLA 02: PRUEBAS DIFERENCIALES PARA ESPECIES DE Streptococcus,
Enterococcus y Lactococcus

ESPECIES Bilis Hemo- Desarrollo NaCl Hidrólisis Fibri- Grupo

40% lisis 6.5% nolisis
10°C 45°C Hipurato Arginina

S. pyogenes - Β - - - - + + A
S. agalactiae + Β - - - + + - B
S. equisimiles - Β - - - - + + C
S. zooepidemi - Β - - - - + - C
S. equi - Β - - - - + - C
S.
dysgalactiae - Α - - - + + + C

S. bovis + Α - + - + - - D
S. equinus + Α - + - - - - D
S. avium Α + + + - - QoD
S. sanguis + Α - - - - + - H
S. pneumoniae - Α - - - - + - N.T
S. salivarius - NH - - - - - - K
E. faecalis + β NH + + + + + - D
E. faecium + Α + + + + - D
L. lactis + α/- + - - + + - N

NH: no hemolítico N.T: no tiene grupo

TABLA 03: PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DE ALGUNAS ESPECIES DE

ENTEROCOCOS
Bilis Ph NaCl 60°C TeO Movi-
ESPECIES 45°C Sorbitol ATTC
40% 9.6 6.5% x 30’ 0.05% lidad
E. faecalis + + + + + + + + (-)
E. faecium + + + + + + - - (-)
E. durans + + + + - + + ± -
E. bovis + + - - - - - - -
E. equinus + + - - - - - - -
(-): 11-12% son móviles

23
 TABLA 04: PRUEBAS DIFERENCIALES PARA ESPECIES DE Lactococcus
HIDRÓLISIS ACIDO
ESPECIE VP
Arginina Hipar. PYR G L M S MN R
L.lactis
Sub sp lactis + + - V + + + + + -
Sub sp cremoris + - + - + + - - - -
Sub sp hordniae + + - - + - - + - -
L. garviae + + - + + V + V + -
L. plantarum + - - - + - + + + -
L. raffinolactis + - - - + + + - + +
L. xylosis + + - - + - + + + -

IV.-RESULTADOS

1. AISLAMIENTO PRIMARIO: Desarrollo de colonias características, después de 48

hrs. de incubación:

AGAR SANGRE AGAR PACKER

MORFOLOGIA COLONIA 1 COLONIA 2 COLONIA 3

FORMA
TAMAÑO
COLOR
CONSISTENCIA
BORDE
ELEVACIÓN
HEMOLISIS

24
2. OBSERVACION MICROSCOPICA

COLONIA 1

MORFOLOGIA Célula Bacteriana

FORMA
DISPOSICION
REACCIÓN TINTORIAL
MOVILIDAD

COLONIA 2

MORFOLOGIA Célula Bacteriana

FORMA
DISPOSICION
REACCIÓN TINTORIAL
MOVILIDAD

COLONIA 3

MORFOLOGIA Célula Bacteriana

FORMA
DISPOSICION
REACCIÓN TINTORIAL
MOVILIDAD

25
3. CULTIVO PURO o CEPA:

COLONIA 1 COLONIA 2 COLONIA 3

COLONIA 1 COLONIA2

COLONIA 3

26
4. IDENTIFICACION

Streptococcus

 Prueba de la Catalasa: ____

 Desarrollo a 10°C y 45 °C  Fermentación de la Lactosa

 Resistencia térmica
 Tolerancia a la sal (NaCl)

 V.P
 Hidrólisis de Arginina

27
 Enterococcus
 Prueba de la Catalasa: ____

 Tolerancia a la Sal: NaCl 65%  Resistencia Térmica

 Crecimiento pH 9.6  Hidrólisis de Arginina

 Crecimiento a 10°C y 45°C  V.P

28
 Lactococcus
 Prueba de la catalasa: ____

 Fermentación de Glucosa  Fermentación de Manitol

 Fermentación de Maltosa  V.P.

 Fermentación de Sacarosa  Hidrólisis de Arginina

 Fermentación de Lactosa

29
5. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

6. CONCLUSIONES

30
 CUESTIONARIO

1. ¿Qué pruebas de identificación utilizaría para reconocer S. pyogenes?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2. ¿Qué ventajas le proporciona el Agar Packer para el reconocimiento de

Streptococcus?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

3. ¿Qué diferencias morfológicas encuentra en los estreptococos, enterococos y

lactococos observados microscópicamente de una colonia y de un cultivo
líquido?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

31
 PRACTICA 4

FAMILIAS: BACILLACEAE Y
CLOSTRIDIACEAE

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE LOS GÉNEROS:

Bacillus y Clostridium
I.-INTRODUCCIÓN:

El género Bacillus está formado por un grupo grande de bacilos grampositivos, catalasa
positivos y facultativos caracterizados por la capacidad para formar esporas en
condiciones aerobias.

Los clostridios son bacilos anaerobios formadores de esporas y en general grampositivos.

Casi todas las especies son anaerobias obligadas pero unas pocas especies son
aerotolerantes y pueden proliferar en forma mínima en el aire con la presión atmosférica.
Algunas especies son sacarolíticas y producen acido y gas a partir de los hidratos de
carbono; muchas son proteolíticas.

Estos bacilos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y se encuentran

presentes en los suelos y en el tracto gastrointestinal de los seres humanos y los animales.

Los bacilos son aerobios o anaerobios facultativos, productores de catalasa, en cambio, los
clostridios son anaerobios estrictos no productores de catalasa. Ambos necesitan una
temperatura óptima de 30 a 37 °C para desarrollar, son muy activos metabólicamente,
sintetizan muchas enzimas para utilizar los sustratos necesarios, carbohidratos, proteínas,
aminoácidos como fuente de energía, de carbono y de nitrógeno.

OBJETIVOS DE LO PRÁCTICA

 Aislar B. anthracis, B. subtilis y C. tetani de muestras de tierra, tejidos de animales

enfermos y estiércol utilizando medios de cultivo enriquecidos para estudiar las
características de crecimiento y morfología celular.
 Identificar a B. anthracis, B. subtilis y C. tetani por medio de pruebas bioquímicas
que ponen de manifiesto las diferentes actividades metabólicas.

32
 Bacillus anthracis y B. subtilis

MATERIALES:

1. Aislamiento
 Muestra: Suelo, tejidos de animales, estiércol.
 3 tubos de ensayo con 9 ml de agua destilada estéril o solución salina fisiológica.
 Pipetas de 1.0 ml.
 Placa con agar sangre y agar nutritivo.
 Asa bacteriológica.
 Tubo de ensayo con agar nutritivo inclinado para cultivo puro.
 Frasco de boca ancha con tapa de rosca.

2. Identificación
 Batería de Gram,
 Lámina y peróxido de hidrógeno para prueba de catalasa.
 Tubo con medio nitrato motilidad.
 Tubo con Medio gelatina.
 Tubo con caldo glucosa.
 Tubo con caldo lactosa.
 Tubo con caldo sacarosa.
 Tubo con caldo maltosa.
 Tubo con caldo manitol.
 Tubo con caldo arabinosa.
 Batería de colorantes y reactivos para coloración de esporas

PROCEDIMIENTO

1. AISLAMIENTO:

1.1 Preparación de la muestra

 Pesar 10 g. de muestra de fierra, adicionar 90 ml de agua destilada estéril o
solución salina fisiológica. Agitar fuertemente. Dejar reposar y separar el
sobrenadante en un tubo estéril
 Llevar el tubo a un baño de agua hirviente por 5 minutos o a 80 °C por 10 minutos.
Enfriar bruscamente en agua fría,
 Con estiércol, se prepara igual que con la muestra de tierra,
 Con tejidos, se macera en mortero o se lava con agua destilada estéril.

33
1.2 Siembra
 De las muestras tomar una asada y sembrar en la superficie de los medios agar
sangre y agar nutritivo empleando la técnica del estriado.
 Incubar las placas a 37°C por 24 horas en aerobiosis.

1.3 Evaluación del crecimiento

 Observar las colonias de B. anthracis características: irregulares, de 2 a 4mm de
diámetro, filamentosas ("cabellera de medusa"), rugosas con tendencia a
presentarse en forma de coma. En agar sangre, las colonias no son hernolíticas. B.
subtilis desarrolla colonias pequeñas circulares y lisas al inicio de su crecimiento,
pero rapidamente se hacen medianas y la superficie se toma granulosa, parduzcas.
En agar sangre, están rodeadas por una zona de lisis no específica debido a la
actividad enzimática.
 Efectuar tinción de Gram de las colonias características para observar la
morfología bacilar y la reacción al Gram: Los bacilos grandes de extremos y rectos
cadenas enmarañadas, Gram positivos, endospora esférica de posición central
corresponden para la primera especie y los bacilos delgados y largos de extremos
romos, aislados, en pares o cadenas y endospora central para la segunda especie.

1.4 Cultivo puro

Transferir una porción de colonia característica a un tubo con agar nutritivo para
mantenerla en cultivo puro.

2. Identificación

 Prueba de catalasa
 Prueba de hemólisis. Actividad que se observa en agar sangre.
 Fermentación de carbohidratos: glucosa, maltona, sacarosa y lactosa.
 Prueba de reducción de nitratos
 Prueba de hidrólisis de gelatina

34
 TABLA 01: CARACTERISTICAS DE LA ESPECIE DEL GENERO Bacillus
1. Esporas ovales o cilíndricas, aerobias facultativas, hidrolizan caseína y el almidón.
1.1. Esporangios no hinchados
1.1.1. Pared de la espora delgada
1.1.1.1. termófilos y acidofilos ………. B. coagulans espora central
B. acidocaldarius espora terminal
1.1.1.2. Mesofilos…………………………. B. lincheniformis espora central
B. cereus espora central
B. anthracis espora central
B. megaterium espora central
B. subtilis espora central
1.1.1.3. Patógenos de insectos………... B. thuringiensis espora central
1.2. Esporangio hinchado
1.2.1. Pared de la espora gruesa
1.2.1.1. Mesofilos…………………………... B. polymixia espora terminal
B. macerans espora terminal
B. circulans espora
cent/term
2. Esporas esféricas, aerobias obligadas, no hidrolizan caseína ni almidón.
2.1. Esporangios hinchados…………………….….. B. sphaericus espora terminal
B. pasteurii espora terminal

TABLA 02: PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN S DE ALGUNAS ESPECIES DE Bacillus

ESPECIES VP G A X M Al Gl I L U N H An Mo
B. coagulans + + ± ± ± + - - - - - - + +
B.
+ + + + + + + - - - + V + +
lincheniformis
B. cereus + + - - - + + - + - V V + +
B. anthracis + + - - - + + - + - V - + -
B. megaterium - + ± + D + + - - - - - - +
B. subtilis + + + + + + + - - - + V - +
B. polymixia + AG AG + + + + - - + - + V
B. macerans - AG AG + + + + - - - + - + V
B. sphaericus - - - - - - - - - - - + - -
B. mycoides + + - + + + -©
B. thuringiensis + + - + + + +/-
B. pasteurii - - - - - - - - - + - - + +
G:glucosa A:arabinosa X:xilosa M:Manitol Al: Almidón Gl:
gelatina
I:indol L:lactinasa U:urea H:hemolisis Mo: movilidad
©90-100% de las cepas son negativas +/- 50-80% se cepas son positivas

35
 RESULTADOS

1. AISLAMIENTO PRIMARIO: desarrollo de colonias después de 48 horas de

incubación en los medios.

AGAR SANGRE AGAR NUTRITIVO

MORFOLOGIA COLONIA 1 COLONIA 2

FORMA
TAMAÑO
COLOR
CONSISTENCIA
BORDE
ELEVACIÓN
HEMOLISIS

2. OBSERVACION MICROSCOPICA:

MORFOLOGIA Célula Bacteriana

FORMA
DISPOSICION
ENDOSPORA
Forma _____________________
Ubicación _____________________
tumefacción _____________________
REACCIÓN TINTORIAL
MOVILIDAD
COLONIA 1

36
3. CULTIVO PURO o CEPA

COLONIA 1

4. IDENTIFICACION

FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS

 Glucosa  Arabinosa
 Sacarosa

 Manitol
 Lactosa

37
 Hidrólisis de la gelatina  Hidrólisis de almidón

 Crecimiento en caldo nutritivo

 Prueba de V.P.

38
 Bacillus
IDENTIFICACION
Colonia 1 Colonia 2
Ferm. Glucosa
Ferm. Sacarosa
Ferm. Lactosa
Ferm. Arabinosa
Ferm. Manitol
Hidrólisis de gelatina
Prueba V.P
Caldo nutritivo
Hidrólisis de Almidón

5. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

6. CONCLUSIONES

39
 Clostridium tetani
MATERIALES:

1. Aislamiento
 Tubos con medio Robertson.
 Placas de Petrí con Agar sangre.
 Placas con agar Clostridium.
 Tubo con agar Clostridium
 Asa bacteriológica.
 Pipetas de 1 ml.

2. Identificación
 Batería de Gram
 Lámina y solución de peróxido de hidrógeno.
 Tubo con caldo nitrato.
 Tubo con medio gelatina.
 Tubos con caldo glucosa, maltosa, sacarosa y lactosa.
 Tubo con medio nitrato - movilidad.
 Placa con agar sangre.

PROCEDIMIENTO

1. TRATAMIENTO DE LA MUESTRA
 A una porción de estiércol agregarle 2 partes de agua destilada estéril. Agitar
fuertemente para disolver. Dejar reposar, pasar el sobrenadante a un tubo y llevar a un
baño de agua hirviente por 5 minutos. Enfriar bruscamente introduciendo en un
recipiente con agua fría.

2. ENRIQUECIMIENTO
 Tomar 1 ml de la muestra tratada y llevar a un tubo con medio Robertson.
 Sellar el medio con parafina liquida.
 Incubar el tubo dentro de la jarra de Brewer, en estufa bacteriológica a 37°C 72 horas.
 Evaluar el crecimiento. Observar estado de la carne, color, turbidez, gas, etc.

3. AISLAMIENTO
 Sembrar una asada del cultivo de Medio Robertson en agar sangre y agar Clostridium
en superficie y en profundidad respectivamente
 Incubar las placas por 24 horas en anaerobiosis a 37°C.
 Lectura de las placas: Observar colonias características: En agar sangre colonias
pequeñas. Se observa el fenómeno de swarming y actividad beta hemolítica.

40
4. CULTIVO PURO
 Sembrar una porción de colonia en un tubo con agar cepa utilizando aguja
bacteriológica y la técnica de picadura o puntura.
 Incubar a 37 °C por 24 horas para obtener el cultivo puro.

5. IDENTIFICACIÓN
 Forma y localización de la espora,
 Prueba de catalana,
 Acción fermentativa sobre los carbohidratos: glucosa, maltona, sacarosa y lactosa,
 Hidrólisis de la gelatina.
 Reducción de los nitratos,
 Motilidad. Crecimiento expansivo a lo largo de la línea de picadura en medio nitrato
motilidad.
 Hemólisis en agar sangre.

41
 TABLA 01: CARCTERISTICAS DIFERENCIALES DE ALGUNAS ESPECIES DE Clostridium
CARNE
ESPECIE COLONIAS EN A.S. MORFOLOGIA PROT/SACAR G L S M I Gl H2S Mot
COCIDA
Grandes, redondas,
Bacilos gruesos, espora Roja, presencia
C. perfringes enteras, hemolíticas o
oval subterminal
sacarolítico
de gas
+ + + + - + + -
no

Bacilos delgados, curvos, Roja, presencia

C. tetani Pequeñas, hemolíticas
espora esférica terminal
proteolítico
de gas
- - - - + d + +

Transparentes, Bacilos gruesos, espora Roja, presencia

C. septicum irregulares, hemolíticas oval central o subterminal
sacarolítico
de gas
+ + - + - + + +

Transparentes
Bacilos grandes y gruesos, Roja, presencia
C. novyi aplanadas, difusas,
espora oval subterminal
sacarolítico
de gas
+ - - ± d + + +
hemolíticas

Grandes, irregulares, Bacilos gruesos espora oval Roja, presencia

C. fallax transparentes subterminal
sacarolítico
de gas
+ + + + - - v +

Pequeñas,
Bacilos gruesos, espora Roja, presencia
C. tertium transparentes, enteras,
oval central o subterminal
sacarolítico
de gas
+ + + + - - v +
no hemolíticas
Bacilos grandes y delgados,
Negro,
C.sporongenes Irregulares, hemolíticas esporal oval central o proteolítico
presencia de gas
+ - - + - + + +
subterminal
Pequeñas,
transparentes, enteras, Bacilos delgados y cortos, Negro,
C. histolycum irregulares, no espora oval subteminal
sacarolítico
presencia de gas
- - - - - + - +
hemolíticas
Pequeñas,
Bacilos gruesos, espora Negro,
C. bifermentans transparentes, difusas,
grande oval o subterminal
sacarolítico
presencia de gas
+ - - + + + + +
hemolíticas

42
 RESULTADOS
1. CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO: Medio Robertson, después de 72 hrs. de
incubación en anaerobiosis:
CULTIVO MEDIO ROBERTSON RESULTADO 72 Hrs
CARACTERISTICAS DE LA CARNE
Color ____________________
Digestión ____________________
CARACTERISTICAS MEDIO
LIQUIDO
Gas ____________________
Olor ____________________

2. OBSERVACIÒN MICROSCOPICA: Clostridium tetani de medio Robertson

MORFOLOGIA Célula Bacteriana

FORMA
DISPOSICION
ENDOSPORA
Forma _____________________
Ubicación _____________________
tumefacción _____________________
REACCIÓN TINTORIAL
MOVILIDAD

3. AISLAMIENTO PRIMARIO: Desarrollo de colonias después de 24 horas de

incubación en anaerobiosis.

MORFOLOGIA COLONIA 1
FORMA
TAMAÑO
COLOR
CONSISTENCIA
BORDE
ELEVACIÓN
SWARMING
CATALASA
HEMOLISIS
AGAR CLOSTRIDIUM

43
 AGAR SANGRE
MORFOLOGIA COLONIA 2
FORMA
TAMAÑO
COLOR
CONSISTENCIA
BORDE
ELEVACIÓN
SWARMING
CATALASA
HEMOLISIS

4. OBSERVACION MICROSCOPICA: Clostridium tetani, tinción de Gram de:

Colonia 1

MORFOLOGIA Célula Bacteriana

FORMA
DISPOSICION
ENDOSPORA
Forma _____________________
Ubicación _____________________
tumefacción _____________________
REACCIÓN TINTORIAL
MOVILIDAD

5. CULTIVO PURO o CEPA

COLONIA 1

44
6. IDENTIFICACION

FERMENTACIÒN DE CARBOHIDRATOS

 Glucosa  Sacarosa

 Maltona  Lactosa

 Hidrólisis de la gelatina.

 Reducción de los nitratos.

 Medio nitrato motilidad.

45
 Clostridium
IDENTIFICACION
Colonia 1
Ferm. Glucosa
Ferm. Sacarosa
Ferm. Maltosa
 Ferm. Lactosa
Hidrólisis de gelatina
Reducción de NO3
Medio nitrato motilidad

46
7. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

8. CONCLUSIONES

47
 CUESTIONARIO

0. ¿Qué características mas saltantes le permite diferenciar a B. anthracis de B.

subtilis y C. tetani de otros bacilos y clostridios?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

1. Considera que las pruebas realizadas son suficientes para identificar B. anthracis,
B. subtilis y C. tetani?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2. ¿Qué característica(s) observa en sus resultados que le permite definir el género?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

48
 PRACTICA 5

FAMILIA LACTOBACILLACEAE

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DEL

Género: Lactobaccillus
I.-INTRODUCCIÓN:

Los lactobacílos, son bacilos grampositivos, que forman parte de la flora normal de la
vagina, el tubo digestivo y la orofaringe humanos. Están ampliamente distribuidos en
diferentes ámbitos (aguas de fuentes naturales, aguas servidas, silos) y comprenden parte
de la flora normal de muchas otras especies animales. También se encuentran en distintos
alimentos (p.ej., productos lácteos, granos, comidas, peces, chucrut) en gran parte debido a
su amplia gama de capacidades fermentativas. Algunas especies de lactobacilos se agregan
ahora a alimentos como prebióticos, tal vez por sus efectos beneficiosos para la salud.
Las células individuales de especies de Lactobacillus a menudo son largas y delgadas,
aunque pueden observarse bacilos “corineformes” o “cocobacilos” más pequeños. Algunas
especies pueden formar cadenas largas de bcilos, la mayoría son inmóviles, son aerobias
facultativas, aunque algunas crecen mejor en condiciones anaerobias o microaerófilas,
sobre todo en el aislamiento primario.
Para identificar los aislamientos de Lactobacilos, se debe determinar primero a que grupo
fisiológico pertenecen, luego la condición de homofermentafivo o heterofermentativo por
la capacidad para producir CO2 a partir de la glucosa en el medio semisólido de Gibson.
Debe determinarse además la capacidad de crecimiento a 15 °C y a 45 °C en caldo MRS.
Otra prueba importante es la capacidad para producir amoníaco a partir de arginina siendo
ideal para esta prueba el caldo MRS cota de Arginina. Según la temperatura, los
lactobacilos pueden ser: mesófilos o termófilos.

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA
 Aislar cepas de lactobacilos de productos lácteos.
 Identificar especies de lactobacilos mediante pruebas de crecimiento, de
crecimiento, de tolerancia, de resistencia y de pruebas bioquímicas.
 Aplicar correctamente las técnicas de aislamiento e identificación.

MATERIALES:
1. . Aislamiento
 Muestra: yogurt, leche fresca, quesos
 medio de cultivo: caldo MRS y agar Rogosa.
 Placas Petri estériles
 Asa bacieriológica
 Agua peptonada al 0,1%
 Tubo con agar Rogosa.

49
2. Identificación
 Batería de Gram,
 Lámina y solución de peróxido de hidrógeno para prueba de catalasa,
 Tubo con caldo MRS con NaCl 2%,
 Tubo con caldo MRS con NaCl 4%,
 Tubo con caldo MRS con 0,3% de arginina
 Tubo con caldo MRS con 1 % de glucosa
 Tubo con caldo MRS con 1 % de lactosa
 Tubo con caldo MRS con 1 % de sacarosa
 Tubo con caldo MRS con 1 % de manitol,
 Tubo con caldo MRS con 1% de arabinosa
 Tubo con caldo MRS con 1% de esculina.

PROCEDIMIENTO
1. Enriquecimiento de Lactobacilos:
 Homogenizar la muestra
 Transferir 1 ml. de la muestra a un tubo con 10 ml. de caldo MRS
 Incubar el tubo a 37 °C por 48 horas con un atmósfera de 5 a 8% de CO2

2. Aislamiento:
 Sembrar una asada del cultivo líquido en la superficie del medio agar Rogosa
aplicando la técnica del estriado,
 Incubar la placa dentro de la jarra de Brewer en la estufa bacteriológica a 37 °C por
48 horas
 Evaluar el crecimiento: colonias brillantes, convexas o lenticulares de 1 a 2 mm de
diámetro
 Efectuar la unción de Gram de las colonias características para observar
morfología bacilar y reacción tintorial,
 Repicar colonia característica a un tubo con agar Rogosa para mantener la cepa y
proceder a su identificación.

3. Identificación
 Prueba de catalasa,
 Prueba de resistencia térmica a 65° C por 30 minutos
 Prueba de crecimiento a 45 °C
 Prueba de tolerancia a la sal a las concentraciones de 2% y 4% de NaCl,
 Prueba de fermentación de azúcares: glucosa, maltona, lactosa, manitol y
arabinosa,
 Prueba de hidrólisis de arginina con producción de amoníaco.

50
 TABLA 01: CARACTERISTICAS DIFERENCIALES DE LAS ESPECIES DE
Lactobacillus
CARACTERISTICAS ESPECIES G+C%

I. Homofermentativos
Acido láctico es el principal producto(85% de glucosa) no
forma gas a partir de glucosa, Aldolasa presente.
1. Crece a 45°C pero no a 15°C, bacilos largos, acido L. dulbrueckii 50
teicoico de glicerol. L. acidophilus 32-37

2. Crece a 15°C desarrollo variable a 45°C, bacilos cortos y L. casei 45-46

corineformes, acidos teicoicos de ribitol y glicerol. L. plantarum 45-46
L. curvatus 42-44
II. Heterofermentativos
Produce alrededor del 50% de acido láctico a partir de L. fermentii
53
glucosa; produce CO2 y etanol, aldolasa ausente, L. brevis
45
fosofocetolasa presente, bacilos largos y cortos, acido L. buchneri
41
teicoico de glicerol. L. kefir

TABLA 02: PRUEBA DE IDENTIFICACION DE ESPECIES DE Lactobacillus

HOMOFERMENTATIVOS HETEROFER.
TERMOFILO MESOFILO TERM. MESO.
PRUEBAS L. L.
L. L. L. L.
delbrueecki lactis L. casei L. plantarum L. brevis
helveticus jugurti (b) (b) acidophilus fermentii

Cult. 15°C - - - - - + + - -
Cult. 45°C + + + + + D + + -
60°C/90’ + - - + - - - - -
65°C/30’ - - + - - - - -
CO2 (azuc) - - - - - - - + +
NH3
- - - - - - - + +
(arginina)
NaCl 2% - - + + + + + +
NaCl 4% - - - - - + + + +
1, 2, 3, 4,
Ferm. de 1, 2, 1, 2, 3, 4, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 1, (4, 5),
1 (4) (4) - 5, 6, 7, 8, 1, 5
azucares 3, 4 (5), 6, 7
9, 0
7, 8, 9, 0 8

Hl.
- - - - - + + - +/-
Esculina
Grupo
A A E E B, C D F E
serológico
Todas las especies fermentan la glucosa, galactosa y lactosa. Los otros azucares fermentados se
designan: 1)maltosa; 2)salicina; 3)sacarosa; 4)trehalosa; 5)melibiosa; 6)amigdalina; 7)celobiosa;
8)rafinosa; 9)manitol; 0)sorbitol. Las cifras ( ) significan un resultado variable entre las cepas.
b: L. delbrueecki sub especie bulgaricus y sub especie lactis

51
 RESULTADOS

1. OBSERVACIÓN MICROSCOPICA: Lactobacilos, a partir de cultivo de

enriquecimiento

MORFOLOGIA Lactobacillus
FORMA
EXTREMOS
TAMAÑO
DISPOSICION
REACCION
TINTORAL

2. AISLAMIENTO PRIMARIO: Desarrollo de las colonias características después de

24 horas de incubación.

MORFOLOGIA COLONIA 1
FORMA
TAMAÑO
COLOR
CONSISTENCIA
BORDE
ELEVACIÓN
CATALASA
MOVILIDAD

MORFOLOGIA COLONIA 2
FORMA
TAMAÑO
COLOR
CONSISTENCIA
BORDE
ELEVACIÓN
CATALASA
MOVILIDAD

52
3. OBSERVACIÓN MICROSCOPICA

COLONIA 1

MORFOLOGIA COLONIA 1
FORMA
TAMAÑO
DISPOSICION
REACCION TINTORIAL

COLONIA 2

MORFOLOGIA COLONIA 2
FORMA
TAMAÑO
DISPOSICION
REACCION TINTORIAL

4. CULTIVO PURO

COLONIA 1 COLONIA 2

53
5. IDENTIFICACION

Lactobacilo mesófilo

FERMETACION DE CARBOHIDRATOS

 MRS - Glucosa  MRS - Lactosa  MRS - Manitol  MRS - Sacarosa

 Crecimiento 15°C  Resist. Térmica 65°C/30’  Hidrólisis de Arginina

 Crecimiento 45°C  Tolerancia a NaCl 2%

 Resist. Térmica 60°C/90’  Tolerancia a NaCl 4%

54
 Lactobacilo termófilo

FERMETACION DE CARBOHIDRATOS

 MRS - Glucosa  MRS - Lactosa  MRS - Manitol  MRS - Sacarosa

 Crecimiento 15°C  Resist. Térmica 65°C/30’  Hidrólisis de Arginina

 Crecimiento 45°C  Tolerancia a NaCl 2%

 Resist. Térmica 60°C/90’  Tolerancia a NaCl 4%

55
 IDENTIFICACIÓN Lactobacillus
C1 C2
Ferm. Glucosa
Ferm. Lactosa
Ferm. Manitol
Ferm. Sacarosa
Crecimiento 15°C
Crecimiento 45°C
Resist. Térmica
60°C/90’
Resist. Termica
65°C/30’
Tolerancia a NaCl 2%
Tolerancia a NaCl 4%
Hidrólisis de Arginina

6. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

7. CONCLUSIONES

56
 CUESTIONARIO

1. ¿Qué otros medios de cultivo se utiliza para el aislamiento primario de lactobacilos.

Fundamente
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2. ¿Por qué empleo para el aislamiento primario Agar Rogosa?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

3. ¿Qué pruebas utilizaría para diferenciar L. casei de L plantarum?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

4. ¿Qué muestras utilizaría para aislar L. bulgaricus y L. helveticus? Fundamente.

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

57
 PRACTICA 6

FAMILIA LISTERIACEAE

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DEL

Género: Listeria

El género Listeria consiste en bacterias con forma de bacilos regulares, grampositivos, no

esporuladas, anaerobias facultativas, tienden a presentarse en cadenas cortas de tres a
cinco microorganismos. En los preparados teñidos a menudo adopta una disposición
difteroide típica en empalizada, propiedad que fue motivo de su anterior clasificación
incorrecta con las corinebacterias.
En los cultivos de 3 a 5 dias de antigüedad a menudo se presentan como estructuras
filamentosas largas de 6 a 20 um y a veces más, en especial en las colonias rugosas.
Los bacilos son anaerobios facultativos, quimioorganótrofos y tienen un metabolismo
fermentativo. Son catalasa positivos y oxidasa negativos. Las reacciones de Voges
Proskawer y rojo de metilo son positivas, hidrolizan la esculina en pocas horas pero no la
urea ni la gelatina, no producen indol ni H2S. Producen ácido de D-glucosa y de otros
azúcares.
La naturaleza ubicua de las bacterias, su capacidad para multiplicarse a temperaturas de
refrigeración, su tolerancia térmica y su resistencia a bajos pHs así como, su tolerancia a
altas concentraciones de sal, hacen difícil el control del potencial patogénico de estas
bacterias en los productos alimenticios

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA
 Aislar e identificar por lo menos una especie de Listeria, haciendo uso correcto de las
técnicas de siembra, aislamiento e identificación.

MATERIALES:
1. Aislamiento
 Muestra: carne de pollo, quesos
 Medio de cultivo: agar Listeria
 Placas Petri estériles.
 Asa bacteriológica.
 Agua peptonada al 0,1
 Tubo con agar tripticasa soya
2. Identificación
 Batería de Gram,
 Lámina y solución de peróxido de
hidrógeno para prueba de catalasa.
 Una placa con agar sangre
 Tubo con caldo manitol
 Tubo con caldo hipurato
 Tubo con caldo xilosa
 Tubo con caldo ramnosa
 Una placa con agar almidón
 Tubo con caldo nitrato

58
PROCEDIMIENTO

1. Enriquecimiento de Listeria
 Preparar un homogenizado de la muestra con caldo de enriquecimiento de Listeria,
utilizando 5 g de muestra con 45 ml de caldo.
 Incubar el homogenizado a 37 °C durante 24 horas con un atmósfera de 5 a 8% de
CO2

2. Aislamiento:
 Sembrar una asada del cultivo líquido en la superficie del medio agar Listeria
aplicando la técnica del estriado,
 Incubar la placa dentro de la jarra de Brewer en la estufa bacteriológica a 37 °C por
48 horas,
 Evaluar el crecimiento: colonias convexas, de borde entero, de 0,8 a 1,0 mm de
diámetro, amarillas, brillantes.
 Efectuar la tinción de Gram de las colonias características para observar
morfología bacilar y reacción tintorial,
 Separar las colonias características a un tubo con ATS para mantener la cepa y
proceder a su identificación.

3. Identificación
 Morfología microscópica de la colonia
 Prueba de catalasa
 Prueba de hemólisis
 Prueba de fermentación de: manitol, arabinosa, xilosa y ramnosa
 Prueba de reducción de los nitratos
 Prueba de hidrólisis de hipurato
 Prueba de hidrólisis del almidón
 Prueba de CAMP
 Pruebas RM-VP

TABLA 01: PRUEBAS DIFERENCIALES PARA LA IDENTIFICACION DE ESPECIES DE Listeria

𝛽- Acido Acido Acido Hidrólisis Hidrólisis Red.
ESPECIE CAMP
hemol Manitol ramnosa Xilosa Almidón Hipurato NO3
L. gravi - - + - - + - -
L. innocua - - - D - - + -
L. ivanovil + - - - + - + -
L. monocytogenes + + - + - - + -
L. murrayi - - + D - + - +
L. seeligeri + + - - + ND ND ND
L. welshimeri - - - D + ND ND ND

59
 RESULTADOS

1. OBSERVACION MICROSCOPICA: Listeria a partir de cultivo de enriquecimiento

MORFOLOGIA Listeria
FORMA
EXTREMOS
TAMAÑO
DISPOSICION
REACCION
TINTORAL

2. AISLAMIENTO PRIMARIO: Desarrollo de las colonias características después de

48 horas de incubación.

MORFOLOGIA COLONIA 1
FORMA
TAMAÑO
COLOR
CONSISTENCIA
BORDE
ELEVACIÓN
CATALASA
MOVILIDAD

3. OBSERVACIÓN MICROSCOPICA

COLONIA 1

MORFOLOGIA COLONIA 1
FORMA
TAMAÑO
DISPOSICION
REACCION TINTORIAL

60
4. CULTIVO PURO
COLONIA 1

5. IDENTIFICACIÓN

Prueba de fermentación de:

 Manitol

 Hidról. Almidón

IDENTIFICACIÓN Listeria
Hidrol. Almidón
Ferm. Manitol
Ferm. Xilosa
Ferm. Arabinosa

61
6. INTERPRETACION DE RESULTADOS

7. CONCLUSIONES

62
 CUESTIONARIO

1. ¿Qué características hacen que Listeria sea considerada como contaminante

peligroso de los quesos y otros alimentos?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2. Cree Ud. Que las pruebas utilizadas para la identificación de Listeria son
suficientes. ¿Por qué?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

3. Según la practica, la temperatura y tras condiciones ambientales que se utilizan en

el laboratorio, son los factores mas indicados para favorecer el aislamiento de
Listeria. ¿Por qué?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

4. De que otras muestras Ud. Puede aislar Listeria.

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

63
 PRACTICA 7

FAMILIA CORYNEBACTERIACEAE

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DEL

GÉNERO: Corynebacterium

El género Corynebacterium esta compuesto por bacilos grampositivos pleomorfos con

forma de porra o maza que son catalasa positivos, inmóviles, no esporulados y no ácido-
alcohol resistentes. La mayoría de las especies de Corynebacterium contienen ácidos
micólicos, arabinosa y galactosa en sus paredes celulares. Las descripciones clásicas de
éste género incluyen su tendencia a formar disposiciones en “cerca” y en “letras chinas”
sobre los extendidosteñidos con tinción Gram.
La mayoría de las especies son facultativas y son fermentativas en su metabolismo de
hidratos de carbono, aunque algunas son no fermentativas o utilizan los hidratos de
carbono en forma oxidativa.

OBJETIVOS DE IN PRÁCTICA:
 Aislar Corynebacterium en medio Lóffler, haciendo uso correcto de las técnicas de
siembra, aislamiento e identificación.
 Identificar una especie de Corynebacterium, por sus características morfológicas y
bioquímicas.

MATERIALES:

1. Aíslamíento

 Muestra: secreción nasofaríngea,

 1 placa patri con agar Lóffler (A.L.).
 1 hisopo estéril
 Asa bacteriológica
 1 tubo con agar suero.

2. Identificación
 Lámina y agua oxigenada (Peróxido de Hidrogeno) para la prueba de catalasa,
 1 placa de agar sangre: hemólisis,
 2 tubos con medio O - F glucosa,
 1 tubo caldo nitrato,
 1 tubo estéril,
 Tubos con caldo glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, manitol y xilosa,


64
1 tubo con caldo glucosado (Voges - Proskawer),
 1 tubo con medio gelatina,
 1 tubo con caldo urea,
 1 tubo con caldo Arginina.

PROCEDIMIENTO

1. Aislamiento:
 Técnica de siembra en placa, en superficie y estría de muestra nasofaríngea, tomada
con hisopo estéril.

2 . Identificación:
 Prueba de catalasa
 Prueba de hemólisis
 Prueba de Oxidación - Fermentación (O-F)
 Prueba de reducción del nitrato
 Prueba de fermentación de carbohidratos
 Prueba de Voges - Proskawer (V-P)
 Prueba de ureasa
 Prueba de gelatinasa.

TABLA 01: CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS DE LAS COLONIAS DE

Corynebacterium, EN AGAR SUERO
COLONIAS BACTERIAS
Grises, con centro elevado más oscuro C. diphtheria
Grandes, planes, 1.5 – 2.5mm, bordes
irregulares (en forma de margarita), centro C. diphtheria, tipo gravis
elevado, estriación radial.
Pequeñas, de 1.5 – 2.0mm, redondas convexas,
C. diphtheria, tipo mitis
lisas, negras, región periférica grisácea
Pequeñas, planas, lustrosas o casi suaves, de
0.5 – 0.75mm, borde sinuoso, centro elevado, C. diphtheria, tipo intermedius
grisácea.
Pequeñas, redondeadas, blancas o grises,
C. pseudodiphtheriae
rugosas en cultivos masivos, de 0.5 – 1.0mm
Negras, brillantes, de diversos tamaños C. xerosis y otros

TABLA 02: COMPORTAMIENTO DIFERENCIAL DE LAS ESPECIES DE

65
 Corynebacterium
ESPECIES Cat. Hem. O-F NO3- MOT Gluc. Lact. Sac. Malt.
5% Gluc. NO2 22°C
C. diphtheriae
Var. Gravis + γ F/O + - A - - A
Var. Mitis + β F/O +7 - A - - A
Var. Intermedius + γ F/O + - A - - A
C. xerosus1 + γ F + - A - A A
C. pseudotuberculosis2 + V F V - A V V A
C. haemolyticum - β F - - A11 A A A
C. pseudodiphthericum + γ - + - - - - -
C. renale + v F + - A - - -
C. pyrogenes - β F - - A A - A
C. ulcerans + β F - - A - - V
C. equi + γ5 F6 +10 - - - - -
C. aquaticum + γ O6 V + A8 - A4 A2

ESPECIES Sali. Mani. Treh. Xilo. V.P Gel. Ure. Arg.

C. diphtheriae
Var. Gravis - NR - NR - - - -
Var. Mitis - NR - NR - - - -
Var. Intermedius - NR - NR - - - -
C. xerosus1 - NR - NR - - - -
C. pseudotuberculosis2 - V - V - - V+ -
C. haemolyticum - - - - - + - NR
C. pseudodiphthericum - - - - - - + -
C. renale - - - NR + - + +
C. pyrogenes - - - A - V+ V- NR
C. ulcerans - NR A11 NR - + + -
C. equi - - - - - - +11 -
C. aquaticum NR NR NR NR - V V- NR

1: difteroides 10: rápido

2: clasificado anteriormente C. avis 11: lento
3: clasificado anteriormente C. hofmannii O: oxidación
4: β = zona estrecha, excepto C. pyogenes F: fermentación
5: Colonias pigmentadas (rosadas) y humedas F/O: Oxido-fermentación
6: en medio hidrato de carbono común, inerte (-) V: resultados variables
7: C. diphtheria var. Mitis cepa helfanti es negativo NR: no se dispone de resultados
8: Solo aeróbicamente
9: D

66
 RESULTADOS

1. AISLAMIENTO PRIMARIO: Desarrollo de colonias en Agar Loffler, después de 24

horas de incubación.

MORFOLOGIA COLONIA 1
FORMA
TAMAÑO
COLOR
CONSISTENCIA
BORDE
ELEVACIÓN
CATALASA

2. OBSERVACION MICROSCOPICA DE Corynebacterium. Tinción de Gram.

MORFOLOGIA COLONIA 1
FORMA
TAMAÑO
DISPOSICION
REACCION TINTORIAL
GRANULOS
METACROMATICOS
MOTILIDAD

3. CULTIVO PURO.

COLONIA 1

67
4. IDENTIFICACION

 Prueba de Oxidación - Fermentación (O-F) glucosa

Fermentación de carbohidratos
 Glucosa  Sacarosa  Manitol

 Lactosa  Maltosa  Xilosa

 Reducción NO3
 Voges - Proskawer (V-P)

68
  Prueba de hemólisis
 Prueba de ureasa

 Prueba de gelatinasa.

IDENTIFICACIÓN Corynebacterium
Oxidación - Fermentación (O-F) glucosa
Ferm. Glucosa
Ferm. Lactosa
Ferm. Sacarosa
Ferm. Maltosa
Ferm. Manitol
Ferm. Xilosa
Reducción NO3
Voges - Proskawer (V-P)
Ureasa
Gelatinasa
Hemolisis

69
5. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

6. CONCLUSION

70
 CUESTIONARIO
1. ¿Por qué se emplea medio Loffler para aislar Corynebacterium? Fundamente
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2. ¿En que otros medios se podría aislar Corynebacterium? ¿Por qué?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

3. ¿Corynebacterium produce hemolisinas solubles?¿Produce Hemolisis?¿porque?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

71
 PRACTICA 8

FAMILIA MYCOBACTERIACEAE

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DEL

GÉNERO: Mycobacterium

La familia Mycobacteriaceae, agrupa bacilos alcohol ácido-resistente ligera mente curvos

o rectos, con extremos redondeados. Ocasionalmente forman ramificaciones en los
cultivos viejos, no forman esporas, son inmóviles, aerobios, de metabolismo oxidativo. No
se colorean fácilmente con el método de Gram. La coloración diferencial de Ziehl-Neelsen
se usa para teñir estas bacterias, que aparecen como bastones teñidos de rojo brillante en
un fondo azulado. Algunas se tiñen irregularmente y aparecen como rosarios debido a su
contenido de gránulos de polifosfato y vacuolas.
La especie más importante por su patogenicidad para el humano es Mycobacterium
tuberculosis.

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA
 Reconocer a los bacilos alcohol - ácido resistentes, después de aplicar la técnica de
tinción de Ziehl-Neelsen.
 Aislar Mycobacterium en medio de cultivo, a partir de esputo, aplicando correctamente
la técnica.
 Identificar a Mycobacterium tuberculosis, por sus características morfológicas y
fisiológicas.

MATERIALES:

1. Tinción de Ziehl – Neelsen

 Colorante fucsina fenicada,
 Solución alcohol - ácido clorhídrico
 Colorante azul de metileno
 Mechero de alcohol
 Pipetas
 Tubos de centrífuga estéril
 Tubo estéril.

2. Muestra: esputo de paciente con tuberculosis

 Solución de HCl 4%,
 Solución NaOH 4%,
 Solución rojo de fenol estéril.

72
3. Aislamiento
 1 tubo con medio Lówenstein – Jensen.
 Asa bacteriológica.

PROCEDIMIENTO:

1. Examen Microscópico Directo: Tinción de Ziehl - Neelsen:

 Extender cuidadosamente la muestra de esputo, con el asa bacteriológica,

 Fijar, al calor suave del mechero,
 Colorear, cubriendo la extensión con el colorante fucsina fenicada. Calentar la lámina
hasta la emisión de vapor; repetir 3 veces y luego dejar la lámina hasta completar 5
minutos.
 Lavar con agua corriente,
 Decolorar con alcohol - ácido clorhídrico, eliminando el exceso de colorante.
 Lavar la lámina con agua corriente,
 Cubrir el frotis con azul de metileno y dejar 1 minuto.
 Lavar la lámina con agua corriente.
 Observar con objetivo de inmersión.

2. Cultivo:

Preparación de la muestra: (Método de Petroff)

 Colocar en un tubo de centrífuga graduado, 1 volumen de esputo y 1 volumen de
solución de NaOH,
 Incubar por 1 hora, retirando de la estufa a los 30 minutos para agitar fuertemente la
muestra del tubo,
 Centrifugar el tubo a 3000 rpm por 20 minutos,
 Retirar el sobrenadante, en otro tubo,
 Utilizar sólo el sedimento. Adicionar 1 - 2 gotas de solución rojo de fenol estéril.
Neutralizar el sedimento con HCl. El color ámbar indica neutralización.

Aislamiento
 Sembrar la muestra neutralizada utilizando el asa bacteriológica, sobre la superficie
inclinada del medio Lówenstein - Jensen,
 Incubar el tubo con tapa de rosca floja, a 37 °C por 2 - 3 semanas,
 Retirar el tubo y observar el crecimiento de colonias características: colonias secas,
amarillentas, lobuladas, de 2 - 3 mm de diámetro.

73
 RESULTADOS
1. BACILOS ALCOHOL-ACIDO RESISTENTES: de muestras de esputo, teñidas por
la técnica de Ziehl-Neelsen

2. AISLAMIENTO: Bacilos alcohol resistentes en medios Lowenstein-Jensen de

colonias características.

MORFOLOGIA COLONIA 1
FORMA
TAMAÑO
COLOR
CONSISTENCIA
BORDE
ELEVACIÓN
CATALASA

3. CONCLUSIONES.

74
 CUESTIONARIO

1. ¿Porqué no se recomienda utilizar la técnica de tinción de Gram, para colorear

Mycobacterium?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2. ¿Además de las pruebas realizadas en práctica, qué otras pruebas recomendaría para la
identificación de Mycobacterium tuberculosis? Fundamente
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

3. ¿Por qué se emplea el medio Lówenstein - Jensen, para su aislamiento?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

75
 PRACTICA 9

FAMILIA STREPTOMYCETACEAE Y NOCARDIACEAE

AISLAMIENTO E IDENTIFICRICION DE LOS

GÉNEROS: Streptomyces y Nocardia

Los géneros Streptomyces y Nocardia, están representados por un gran número de

especies que habitan ambientes acuáticos (de agua dulce, mar) y terrestres (de preferencia
alcalinos y neutros)
Se caracterizan por ser filamentosos, cada filamento mide de 0,5 - 10 µm de diámetro y
tiene una longitud indefinida, no fragmentaria y muy ramificado en los Streptomyces,
fragmentados en Nocardia. Los filamentos aéreos pueden ser rudimentarios o extensos, y
pueden presentarse en forma de espiral, hélices o con ramificaciones múltiples. En éstos
filamentos se originan las esporas denominadas "conidias", que se disponen a menudo en
cadenas. Las diferencias con la forma y disposición de los filamentos aéreos y las
estructuras que sostienen las esporas, se utilizan para diferenciar grupos de Streptomyces.
En Nocardia las esporas o conidias, se separan de los filamentos adoptando la forma
cocoide o bacilar
Las conidias y los filamentos aéreos pueden ser pigmentados e influyen en el color típico
de la colonia madura. A veces los pigmentos se producen por el micelio del sustrato y
colaboran con el color final de la colonia. Las colonias crecen lentamente, requiriendo
muchos días para hacerse visible. Son pegajosas y se adhieren al agar a medida que los
filamentos penetran en el medio. Después de 7 - 10 días las colonias presentan un aspecto
deslustrado, compacto y enroscado. La colonia madura tiene una imagen polvorienta.
En cultivos líquidos estacionarios, los Streptomyces crecen en la superficie como una
'estera', que luego se hunde por su propio peso. En cultivos aireados crecen como
microcolonias esféricas y no producen filamentos aéreos. El crecimiento se reconoce por
su olor característico terroso.
Son bacterias inmóviles, aerobias, catalasa y oxidasa positivas con un metabolismo
respiratorio, algunas hidrolizan la urea.
Estas bacterias son importantes para la industria farmacéutica, porque de ellas se extraen
muchos antibióticos: estreptomicina, cloranfenicol, etc.

OBJETIDOS DE LA PRÁCTICA
 Aislar Streptomyces y Nocardiia, de suelos alcalinos, en medio de cultivo sólido.
 Identificar las colonias de Streptomyces y Nocardia, por sus características
morfológicas.
 Identificar Streptomyces y Nocardia, por observaciones microscópicas de las
estructuras portadoras de esporas y formas filamentosas.

76
MATERIALES:
1. Aislamiento
 Muestra: Tierra de cultivo,
 Solución salina fisiológica estéril (S.S.F),
 1 frasco de vidrio estéril, con tapa de rosca,
 1 placa con agar streptomyces,
 1 tubo con agar nutritivo,
 1 tubo con caldo común.

2. ldentíficación
 Batería de Gram,
 Agua oxigenada y lámina porta objeto,
 1 tubo con caldo arabinosa,
 1 tubo con caldo galactosa.
 1 tubo con caldo glucosa, maltosa, lactosa, sacarosa, manitol, xilosa
 1 tubo con caldo úrea
 1 placa con agar almidón
 1 placa con agar caseína

PROCEDIMIENTO

1. Preparación de la muestra
 En un frasco estéril pesar 10 g de muestra de tierra, adicionar luego 90 ml de S.F.F.
Agitar el frasco y dejar reposar.

2. Aislamiento primario
 Con el asa de Kolle estéril, tomar la muestra de la superficie y sembrar en la placa
por la técnica de estría en superficie,
 Incubar la placa a 25 - 30 °C por 7 - 10 días en aerobiosis,
 Observar el desarrollo bacteriano: colonias características de 2 - 4 mm de diámetro,
compactas, pigmentadas y, con olor a tierra húmeda.
 Seleccionar la colonia, para observar su morfología microscópica, mediante la
técnica de tinción de Gram.

3. Aislamiento secundario
 Replicar la colonia seleccionada, en un tubo con agar nutritivo, para obtener un
cultivo puro.

4. Identificación
 Prueba de catalasa,
 Prueba de acidez de carbohidratos.
 Prueba de hidrólisis de la urea, almidón y caseína
 Prueba de resistencia térmica.

77
 TABLA 01: CARACTERISTICAS DIFERENCIALES DE Streptomyces y Nocardia
Nocardia Streptomyces

N. aerodorigenes
N. transvalensis

N. dassonvillei
N.autotrophica

S. somaliensis
N. brasilensis
N. asteroides

S. lavenduve
N. orientalis
PROPIEDADES

N. pelletieri
N. madurae

S. rinosus
S. griseus
N. carnea
N. caviae

S. albus
Bastones filamentosos, fragmentación en Filamentos
MORFOLOGIA
bacilos cortos ramificados
Profundo + +
Filamen
Aéreo v +
tos
Fragment. + -
Esporas V +
Requer. De O2 A A
Quimica de P. C. IV I
G+C (moles %) 64-72 69 - 78
Ac. Micolicos (N° de
+ (46-60) -
C)
Catalasa + +
Acidofilia v v v v v - - - - - - - - - - -
Caseina - - - - v + - - + - - - - - + +
Urea + - + + + + + + v - - - v + v +
Resistencia a
+ + + + + - - + - - - - v + -
lisozima
Resistenciaa
+ + + + + - V - - v v - - + + -
Rifampicina
Hidrólisis de
v - v - - v V v + - - - - v v v
hipurato
Hidrolisis de
v v v v + + + + + + - v + - + +
Almidón
Nitrito de Nitrato + + + + + v V v + + + - v v v v
Supervivencia
+ + + - + v V v + + + v - + + +
50°C/8h
Acido de Arabinosa - - v - - v + + v + - - v - v v
Acido de Glucosa + + + + + + + + + + + v + + + +
Acido de Lactosa - - - - - - + + - v - - v + + +
Acido de Maltosa - - - - - + V + + v - v + + + +
Acido de Manitol - + v + v + + + + + - - - + + +
Acido de Ramnosa v - - - - - V v v + - - - - - v
Acido de Trehalosa v + v + v + V + v + + - v + +
Acido de Xilosa - - - - - + + + v + - v + v +
A: aerobios F: facultativos An: anaerobiosis I: acido LL-diaminopimelico y glicina
IV: DL-DPA-arabinosa y galactosa V: Lisina y ornitina VI: Lisina, acido aspartico y galactosa
v: variable NO: no se observa

78
 RESULTADOS

1. AISLAMIENTO PRIMARIO: Desarrollo de colonias en Agar Nutritivo.

MORFOLOGIA COLONIA 1 COLONIA 2

FORMA
TAMAÑO
COLOR
CONSISTENCIA
BORDE
ELEVACIÓN
CATALASA

2. OBSERVACION MICROSCOPICA DE:

Streptomyces. Tinción de Gram.

MORFOLOGIA COLONIA 1
FORMA
TAMAÑO
DISPOSICION
ESPORAS
UBICACION
REACCION TINTORIAL

Nocardia. Tinción de Gram.

MORFOLOGIA COLONIA 2
FORMA
TAMAÑO
DISPOSICION
ESPORAS
UBICACION
REACCION TINTORIAL

79
3. CULTIVO PURO.

COLONIA 1 COLONIA 2

4. IDENTIFICACION

Streptomyces

Prueba de acidez de carbohidratos.

 Arabinosa  Maltosa  Sacarosa  Xilosa

 Glucosa
 Lactosa  Manitol  Galactosa

80
  Prueba de resistencia térmica.  hidrólisis de la urea

 hidrólisis almidón  hidrólisis caseína

Nocardia
Prueba de acidez de carbohidratos.

 Arabinosa  Maltosa  Sacarosa  Xilosa

 Glucosa  Lactosa  Manitol  Galactosa

81
 Prueba de resistencia térmica.  hidrólisis de la urea

 hidrólisis almidón  hidrólisis caseína

IDENTIFICACIÓN Streptomyces Nocardia

Acidez de Arabinosa
Acidez de Maltosa
Acidez de Sacarosa
Acidez de Xilosa
Acidez de Glucosa
Acidez de Lactosa
Acidez de Manitol
Acidez de Galactosa
Resistencia térmica
Hidrólisis de Almidón
Hidrólisis de urea
Hidrólisis de caseína

82
5. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

6. CONCLUSION

CUESTIONARIO

1 . ¿Qué diferencias morfológicas (macroscópicas y microscópicas) observó en

Streptomyces y Nocardia?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2 . ¿Qué otras pruebas se pueden utilizar para identificar las especies de Streptomyces y
Nocardia?. Indíquelas y explique porqué?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

3 . ¿Qué son las geosminas y que función cumplen?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

83
 PRACTICA 10

FAMILIA NEISSERIACEAE
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DEL
GÉNERO: Neisseria

Son cocos Gram negativos, de 0,6 - 1,0 µm de diámetro, que se disponen en pares con los
lados adyacentes aplanados, semejando la forma de un grano de café o arriñonados. No
forman esporas, la formación de cápsula es variable, son aerobios y anaerobios
facultativos, oxidasa y catalasa positiva, inmóviles.
Son muy susceptibles a condiciones cambiantes adversas, como desecación, enfriamiento,
exposición a un pH desfavorable o a la luz solar. Para su desarrollo algunas cepas
requieren hierro y factores de crecimiento.
Este género tiene dos especies importantes, por su patogenicidad: Neisseria meningitidis y
Neisseria gonorrhoeae, además de especies saprófitas, que habitan la región nasofaríngea.

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA
 Aislar una cepa de Neisseria, de secreción nasofaríngea.
 Reconocer las colonias de Neisseria por sus características morfológicas.
 Identificar una especie de Neisseria, haciendo uso de las pruebas bioquímicas y de las
tablas de identificación.

MATERIALES:
1. Aislamiento
 Muestra: secreción nasofaríngea (SNF), líquido cefalorraquídeo, secreción uretral,
 Agar chocolate o agar Thayer - Martín,
 Jarra de Brewer,
 Asa bacteriológica,
 1 tubo con medio de transporte: Medio Stuart,
 Hisopo estéril,
 1 tubo con agar tripticasa soya.

2. Identificación
 Lámina y solución de agua destilada,
 Reactivo oxidasa,
 Tubo con caldo nutritivo
 1 placa de agar sangre de carnero
 1 tubo con medio gelatina
 Tubo con caldo nitrato
 Tubos con medio semisólido de carboh.: glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa y manitol
 Placa con agar sacarosa al 5%


84
1 placa con agar nutritivo
PROCEDIMIENTO
1. Aislamiento
 Siembra en placa de agar chocolate, con la técnica de estría y agotamiento sobre la
superficie
 Incubación a 37 OC por 24 hrs con atmósfera de CO2 al 5% (Jarra de Brewer),
 Observación de colonias características: 1 - 3 mm, lobuladas o circulares, brillantes,
transparentes u opacas, pigmentadas, de elevación media, mucoides o pastosas,
 Transferir la colonia seleccionada en un tubo con agar tripticasa soya, para
obtener cultivo puro, después de un período de incubación 37 OC por 24 hrs.

2. Identificación
 Prueba de oxidasa,
 Prueba de catalana,
 Prueba de hemólisis, con agar sangre de carnero,
 Prueba de acidez de: glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa y manitol,
 Prueba de reducción de nitrato,
 Prueba de gelatinasa,
 Prueba de crecimiento 22 °C,
 Prueba de síntesis de polisacáridos, a partir de sacarosa al 5%; que consiste en:
o Sembrar la cepa (técnica de siembra en superficie y en estría) en la superficie del
medio hipersacarosado,
o Incubar a 37 °C por 24 hrs en aerobiosis,
o Observar el crecimiento de colonias,
o Colocar algunas gotas de la solución de lugol sobre el cultivo para observar
formación de polisacáridos (almidón) por el color azul oscuro del medio que rodea
las colonias. (por la formación de dextrinas se puede observar el color rojo).

TABLA 01: PROPIEDADES DEL GENERO Neisseria

FERM.
GENERO MORFOLOGIA OXIDASA G+C MOL%
GLUCOSA
Neisseria Cocos Gram - + + 47-52

TABLA 02: CARCTERISTICAS DIFERENCIALES DE LAS ESPECIES DE GENERO Neisseria

CARÁCTER. N. lactamica N. gonorrhoeae N. meningitidis N. sicca N. flavesces N. mucosa
Ac. de Glucosa + + + + - +
Ac. de maltosa + - + + - +
Ac. de sacarosa - - - + - +
Ac. de lactosa + - - - - -
Polisac. De
+ - - + + +
sacarosa 5%
Red. Nitratos - - - - - +
Red. Nitritos + - +- + + +
Pigmento - - - +- + -
CO2 para
- + + - - -
crecimiento

85
 RESULTADOS
1. AISLAMIENTO PRIMARIO: Desarrollo de colonias en Agar Chocolate.

MORFOLOGIA COLONIA 1
FORMA
TAMAÑO
COLOR
CONSISTENCIA
BORDE
ELEVACIÓN
CATALASA

2. OBSERVACION MICROSCOPICA DE: Tinción de Gram.

MORFOLOGIA Neisseria
FORMA
DISPOSICION
REACCION
TINTORIAL

3. CULTIVO PURO

COLONIA 1

86
4. IDENTIFICACION

Prueba de acidez de:

 Glucosa  Sacarosa  Manitol

 Maltosa  Lactosa

 Reducción de nitrato  Gelatinasa  Crecimiento a 22 °C

 Síntesis de polisacáridos  Hemólisis

87
 IDENTIFICACION Neisseria
Acidez de Glucosa
Acidez de Sacarosa
Acidez de Manitol
Acidez de Maltosa
Acidez de Lactosa
Reducción de nitrato
Gelatinasa
Crecimiento a 22 °C
Síntesis de polisacáridos
Hemolisis

5. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

6. CONCLUSION

88
 CUESTIONARIO

1 . ¿Qué componentes del agar chocolate, permiten el desarrollo Neisseria? ¿Por qué?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2 . ¿Por qué se emplea agar Thayer - Martin, para aislar Neisseria?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

3 . ¿Qué características le permiten diferenciar a Neisseria de otros géneros de la familia?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

4 . Fundamente la prueba oxidasa. Haga la reacción química.

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

89
 PRACTICA 11

FAMILIA PSEUDOMONADACEAE

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DEL

GÉNERO: Pseudomonas

El género Pseudomonas, agrupa bacilos Gram negativos, rectos o ligeramente curvados,

no formadoras de esporas, móviles mediante flagelos monotricos o lofotricos, o inmóviles
(P. malles). Con frecuencia elaboran pigmentos difusibles, fluorescentes, de color verdoso,
azulado, violeta, lila, rosa, amarillo o de otros matices; algunas veces, los pigmentos
pueden ser, rojo brillante o amarillo no difusible; sin embargo existen, muchas especies
que no desarrollan ninguna pigmentación.

Son aerobios estrictos, catalasa y oxidasa positivos. La mayoría de las especies oxidan la
glucosa a ácido glucónico, ácido 2-ceto glucónico y a otros compuestos intermedios.
Generalmente son inactivos para la oxidación de la lactosa. Reducen con frecuencia los
nitratos a nitritos, NH3 o a nitrógeno molecular.

Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, habitando comúnmente el suelo

y agua, inclusive el agua del mar y aún en salmueras concentradas. Algunos son patógenos
para las plantas, animales y el hombre; otras especies son saprofitas y desempeñan un
papel importante en la descomposición de la materia orgánica.

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA
 Aislar Pseudomonas aeruginosa, de muestras clínicas (pus) o agua.
 Identificar Pseudomonas aeruginosa, por la producción de pigmento difusible y
pruebas bioquímicas.

MATERIALES:
1. Aislamiento
 Muestra: pus (quemados), agua, suelo.
 1 placa con agar glutamato o agar cetrimide.
 1 tubo con agar nutritivo.
 Asa bacteriológica.

2. Identificación
 Reactivo oxidasa,
 Lámina porta objeto y agua oxigenada,
 2 tubos con medio O - F glucosa,
 2 tubos con medio O - F maltosa,
 2 tubos con medio O - F lactosa,

90
 2 tubos con medio O - F manitol,
 1 tubo con caldo nutritivo
 1 tubo con caldo nitrato
 1 tubo con medio LIA
 1 tubo con caldo RM-VP
 1 tubo con caldo NaCl 6,5%
 1 tubo con medio gelatina
 1 tubo con caldo peptonado
 1 tubo con medio gelatina.

PROCEDIMIENTO

1. Aislamiento
 Siembra de la muestra por la técnica de estría,
 Incubación 37 OC por 24 hrs,
 Observar:
o Desarrollo de colonias características: circulares,
o Producción de pigmento de color azul, difusible en el medio.
 Efectuar tinción de Gram, para observar:
o Morfología de la bacteria,
o Reacción tintorial.
 Repicar la colonia seleccionada en un tubo inclinado con agar nutritivo, para
obtener cultivo puro.

2. Identificación
 Prueba de oxidasa
o Frotar una porción de colonia tomada con un palito mondadientes en papel de
filtro impregnado con el reactivo oxidasa. El color azul que aparece en pocos
segundos, indica que la prueba es positiva.
 Prueba de catalasa,
 Prueba de acidez por oxidación de glucosa, maltosa, lactosa y manitol. Se realizará
en medio O - F,
 Prueba de crecimiento 42 °C. Se realizará en un tubo con caldo nutritivo.
 Prueba de reducción del nitrato,
 Prueba de lisina descarboxilasa,
 Prueba de Voges Proskawer,
 Prueba de arginina dihidrolasa,
 Prueba de gelatinasa,
 Prueba de crecimiento 22 °C,
 Prueba de indol,
 Prueba de crecimiento en NaCl 6,5%,

91
 TABLA 01: DIFERENCIACION DE LAS ESPECIES DE Pseudomonas

P. pseudoalcaligenes
P. pseudomallei

P. acidovarans
P. testosteroni

P. maltophilia
P. fluorescens

P. alcaligenes
Pruebas de

P. aeruginosa

P. vesicularis

P.putrefacis
P. diminuta
P. stutzenri
Identificación

P. cepacia
P. putida

P. mallei
Oxidasa + + + + + V+ + V+ V + + - + +2 +
Agar Mac Conkey C C C C C C C C C C C C C C C
O-F Glucosa O O O O - - O O O - O O O - O
Reducción de nitrato + V + + NR NR V - + NR NR - - - +
Motilidad a 37°C + + V+ + + + + - + + + + + + +
Licuef. De la gelatina a
+3 - + - + - + + V4 - - + - - +
22°C
Indol - - - - - - - - - - - - - - -
Citrato de Simmons + NR + NR + NR + - + NR NR - NR NR NR

H2S(AHK/AHTA) - - - + - - - NR - - + - - - +
KCN C NR V NR NR NR C NR NR NR NC C NR NR NR

Ureasa V NR V NR NR NR V- V- + NR NR - NR NR NR

Rojo de Metilo
Voges-Proskauer
Argnina dehidrolasa:
NH3
Lisina Descarboxilasa
Ornitina descarboxilasa
Fenilalanina deaminasa
Gluconato
ONPG
Lectinasa
Hidrólisis de Almidón
Caldo de NaCl 6,5%
Pigmento fluorescente
- - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - -
+ + + - + + + + - - - - - - -
- - - - - - - - + - - + - - -
- - - - - - - - - - - - - - +
- - - V - V - NR - - - - - - -
+ + + - - - + V NR - - - - - -
- - - - - - - NR + - - + - - -
- + + - NR - + NR V - - - - - -
- - - + - - + V - - - - - - -
NC NC NC C NC NC NC NR NC NC NC NC NC NC C
V+ + + - - - - - - - - - - - NR

Pigmento fenazina + - V - - - - - V+ - - - NR NR NR

C: crecimiento NC: No crecimiento V: resultado variable 10-89% en un sentido o en otro(+/-) O:

oxidativo
V+: Resultado variable en su mayoría positivos V-: Resultado variable en su mayoría negativos
NR: no se dispone de resultados +2: Intensa +3: rápida +4: Lenta

TABLA 02: IDENTIFICACION DE 4 ESPECIES DE Pseudomonas

Pruebas P. aeruginosa P. cepacia P. mallei P. maltophilia P. fluorescens
Oxidac. Glucosa + + + + +
Oxidac. maltosa - + + + d
Oxidac. Lactosa - + + + d
Oxidac. Manitol D + d + D
NO3-N2 D - - - -
Piocianina D - - - -

92
Lisina descarb. - + - + -
Arginina dihidr. + - + - +
Crec. a 42°C + d - d -

RESULTADOS

1. AISLAMIENTO PRIMARIO: Desarrollo de colonias en Agar Glutamato, después de

24 horas de incubación.

MORFOLOGIA COLONIA 1
FORMA
TAMAÑO
PIGMENTO
CONSISTENCIA
BORDE
ELEVACIÓN
CATALASA

2. OBSERVACION MICROSCOPICA DE: Tinción de Gram.

MORFOLOGIA Pseudomonas
FORMA
DISPOSICION
REACCION
TINTORIAL

3. CULTIVO PURO.

COLONIA 1

93
4. IDENTIFICACION

Prueba de acidez por oxidación de: (Se realizará en medio O – F)

 Glucosa  Lactosa

 Maltosa  Manitol

 Reducción de nitrato

 Voges Proskawer
 Lisina descarboxilasa (LIA)

94
  Prueba de indol
 R-M

 Prueba de crecimiento en NaCl 6,5%

 Arginina dihidrolasa

 Prueba de gelatinasa
 Prueba de crecimiento 42 °C.  Prueba de crecimiento 22 °C,

IDENTIFICACION Pseudomonas
Acidez de Glucosa
Acidez de Lactosa
Acidez de Maltosa

95
 Acidez de Manitol
Reducción de nitrato
LIA
RM
V-P
Arginina dihidrolasa
Indol
Gelatinasa
Crecimiento en NaCl 6,5%
Crecimiento 42 °C
Crecimiento 22 °C
5. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

6. CONCLUSION

CUESTIONARIO

1. ¿Es P. aeruginosa una bacteria exigente nutricionalmente? Porqué?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2. P. aeruginosa produce acidez de la glucosa, ¿Qué vía metabólica sigue para obtener
energía de la glucosa?. Haga el esquema bioquímico.
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

3. ¿Qué reacción química lleva a cabo P. aeruginosa cuando utiliza el nitrato. ¿Qué

96
enzimas intervienen?
 _____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

4. ¿Cómo se manifiesta la actividad de P. aeruginosa, frente a la gelatina

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

97
 PRACTICA 12
FAMILIA RHIZOBIACEAE

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DEL

GÉNERO: Rhizobium

Son bacterias que viven en el suelo, pero dada su movilidad, se aproximan a las
leguminosas apropiadas para infectarla y causar la formación de nódulos y participar en la
adquisición simbiótica del nitrógeno (N2). Presentan una variedad de formas durante su
ciclo vital; bastones móviles, formas cocoides, formas helipsoidales muy pequeños y
altamente móviles, bacteroides, formas irregulares en X y Y. En cultivo puro, se observan
como bacilos desprovistos de esporas, Gram negativos, con tamaños que varían de 0,5 -
0,9 µm de ancho y de 1,2 - 3,0 µm de largo, a veces capsulados y móviles, comúnmente
poseen gránulos poli-Bhidrooxibutirato. Móviles por un flagelo polar o subpolar o 2 a 6
flagelos peritricos.
Es difícil el cultivo de las bacterias en medios ordinarios, pero el desarrollo en agar
manitol es rápido, con tendencia a la diseminación. Las colonias son circulares, convexas,
brillantes, semitranslúcidas y mucilaginosas, usualmente de 2 a 4 mm de diámetro
alrededor de 3 a 5 días
Son bacterias aerobias estrictas, poseen un metabolismo respiratorio con oxígeno como
aceptor final de electrones, su temperatura óptima 25 a 30°C utilizan la glucosa y en
algunos casos otros azúcares, produciendo acidez con aausencia de gas. Juegan un gran
papel en la agricultura, porque enriquecen los suelos con el N2 que fija, haciendo posible
que siga funcionando el ciclo del nitrógeno.

OBJETIVOS DE IR PRÁCTICA
 Aislar Rhizobium, a partir de nódulos de leguminosas, aplicando correctamente las
técnicas de esterilización y tratamiento de los nódulos.
 Identificar por lo menos una especie de Rhizobium, por sus características
morfológicas, fisiológicas y de relación simbiótica.

MATERIALES:

1. Aislamiento
 Muestra: Nódulos de raíces de leguminosas,
 Solución al 0,1 % de bicloruro de mercurio acidificado (HgCl2 = 1g; HCl = 5cc)
 Agua corriente esterilizada,
 Etanol 95%,
 Placa con agar extracto de levadura manitol,
 Asa bacteriológica
 Tubo con agar extracto de levadura manitol

98
2. Identificación
 Batería de Gram,
 1 placa con agar nutritivo.
 1 tubo con caldo glucosa.

PROCEDIMIENTO

1. Obtención de nódulos
 Escoger plantas de leguminosas de mayor desarrollo, de color verde intenso, que en lo
posible sobresalgan del resto; extraerlas con cuidado, observando si los nódulos
presentes tienen características de 'efectividad' (grandes, rojisos).
 En el laboratorio, escoger los mejores nódulos de las raíces y cortarlos de manera tal
que quede adherida una parte de la raíz, con el objeto de facilitar su manipulación.

2. Tratamiento de los nódulos

 Los nódulos seleccionados, deben colocarse dentro de tubos con tapa de rosca para ser
lavados enérgicamente, primero con agua corriente y luego con agua destilada, con la
finalidad de eliminar toda la tierra.
 Los nódulos deben ser, luego, desinfectados en placas estériles:
o Sumergirlos en alcohol de 95%, por algunos segundos,
o Sumergirlos en una solución al 0,1% de bicloruro de mercurio acidificado durante
1 - 30 minutos, según el tamaño del nódulo y la intensidad de la esterilización que
haga falta-, por lo común basta un período de 3-4 minutos
o Lavar con fuerza, no menos de seis veces, utilizando agua corriente estéril.

3. Aislamiento
 El nódulo desinfectado, se aplasta o diseca asépticamente con una pinza desinfectada,
y se extiende el jugo lechoso del interior sobre la superficie de una o dos placas de
agar extracto de levadura con manitol.
 Incubar las placas a 30 °C por tiempo variable, generalmente entre 3 - 5 días,
dependiendo de la velocidad de crecimiento de las bacterias.
 Observar las colonias características, relativamente grandes y gomosas al cabo de 4-5
días, otras serán mucho más pequeñas aún después de lo días. Aunque la mayoría de
colonias son acuosas, translúcidas u opacas y blanquecinas, también se han registrado
colonias rosadas.
 De la colonia característica, hacer un frotis y teñir por la técnica de Gram. Observar
bacilos Gram negativos, delgados y tamaños diferentes.

4. Cultivo puro
 De una colonia aislada y analizada, repicar a un tubo inclinado con agar extracto de
levadura manitol, registrando número de cepa, huésped y fecha de aislamiento, para su
conservación por uno o dos años a baja temperatura o en ambiente.

99
5. Identificación
 Prueba de crecimiento en caldo nutritivo,
 Prueba de acidez de glucosa, arabinosa y galactosa
 Prueba de catalasa
 Prueba de crecimiento en 2% de Na Cl
 Prueba de resistencia térmica a temperaturas de 39 - 40°C

TABLA 01: IDENTIFICACIÓN DE 4 ESPECIES DE Rhizobium

CARACTERISTICAS R. galagae R. leguminosarum R. loti R. meliiloti
Flagelo simple polar o
d - d -
subpolar
1 a 2 flag. Polar o subp d - - -
2 a 6 flag. Peritricos - + - +
Aglut. Con antisuero contra
- - - +
R. meliiloti
Crec. a 39 – 40 °C - - - d
Crec. en NaCl 2% - +- - d
Produce H2S - - - d
Hidrólisis de caseína - - - -
Acidez de:
Glucosa +
Lactosa +
Maltosa +

100
 RESULTADOS

1. NODULOS: descripción de los nódulos empleados y esquematice en la planta.

2. OBSERVACION MICROSCOPICA: De muestra nodular, después de la

desinfección. Tinción Gram.

MORFOLOGIA Rhizobium
FORMA
DISPOSICION
TAMAÑO
REACCION TINTORIAL

3. AISLAMIENTO PRIMARIO: Desarrollo de colonias características en Agar extracto

de levadura de Manitol.

MORFOLOGIA COLONIA 1
FORMA
TAMAÑO
PIGMENTO
CONSISTENCIA
BORDE
ELEVACIÓN
CATALASA

101
4. OBSERVACION MICROSCOPICA DE Rhizobium. Tinción de Gram.

MORFOLOGIA Rhizobium
FORMA
DISPOSICION
TAMAÑO
REACCION TINTORIAL

5. CULTIVO PURO.

6. IDENTIFICACION
Prueba de acidez de:
 Glucosa  Arabinosa  Galactosa

 Crec. caldo nutritivo  Crec. en 2% de NaCl  Crec. 39 - 40°C

102
 IDENTIFICACION Rhizobium
Acidez de Glucosa
Acidez de Arabinosa
Acidez de Galactosa
Crec. caldo nutritivo
Crec. en 2% de NaCl
Crec. 39 - 40°C

7. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

8. CONCLUSION

103
 CUESTIONARIO

1. ¿Cree Ud. que los pasos descritos son los necesarios para el aislamiento de Rhizobium?
¿Por qué?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2. ¿Qué características tiene el medio extracto de levadura manitol que permite el

desarrollo de Rhizobium?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

3. ¿Qué diferencias morfológicas encuentra en los Rhizobium de nódulo y de cultivo

puro? ¿Por qué?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

4. ¿Tiene conocimiento de alguna otra técnica de desinfección de los nódulos de

Rhizobium? Descríbala.
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

104
 PRACTICA 13

FAMILIA AZOTOBACTERIACEAE

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DEL

GÉNERO: Azotobacter

Son bacterias de vida libre fijadoras de nitrógeno (N2), aerobias obligadas. Comprende
bacilos grandes y gruesos, llegan a medir de 3 - 6µm de largo, con extremos redondeados,
a veces formas ovoides y grandes, que se disponen como diplobacilos gigantes. Tienden a
presentar cambios ciclógenos, desde grandes formas bacilares, cocoides a etapas sin
forma. Se disponen aislados, en pares o en pequeñas cadenas. Las células están rodeadas
por una capa gelatinosa de grosor variable, que se vuelve pardusca en cultivos viejos.
Son Gram negativas, móviles mediante flagelos peritricos o no móviles. Forman una
estructura no regular de resistencia, que recibe el nombre de 'quiste'. Su hábitat natural son
los suelos neutros o alcalinos. Desarrollan a una temperatura óptima de 25 - 30 °C.
Utilizan pocos compuestos nitrogenados: N2, amonio, nitrato, nitrito, urea y
ocasionalmente una molécula que contenga nitrógeno orgánico, crece más rápidamente
sobre NH3, aún cuando éste reprime la fijación de N2.
En medios que contienen carbohidratos, desarrollan grandes cápsulas. El metabolismo de
los compuestos de carbono es oxidativo estricto y los ácidos y otros productos de
fermentación se producen rara vez.

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA
 Aislar Azotobacter, de suelos fértiles, en medios de cultivo libre de nitrógeno.
 Reconocer el crecimiento de Azotobacter en medios líquidos y sólidos.
 Identificar Azotobacter por sus características morfológicas y fisiológicas.

MATERIALES:
1. Aislamiento
 Muestra: suelos neutros o alcalinos, de cultivo.
 1 tubo con 10 ml de caldo Azotobacter.
 1 placa con agar Azotobacter.
 Asa bacteriológica.
 1 tubo con agar Azotobacter.

2. Identificación
 Batería de Gram,
 1 tubo con caldo nutritivo,
 1 tubo con medio gelatina,
 1 tubo con caldo glucosa, maltosa, lactosa,
 1 tubo con medio almidón.

105
PROCEDIMIENTO

1. Proceso de enriquecimiento:
 Pesar 1 g de suelo y colocarlo en el tubo con caldo Azotobacter; mezclar cui-
dadosamente y dejar a temperatura ambiente por 3 - 5 días para su desarrollo.
 Observar las características de crecimiento, en la superficie del medio.
 Realizar un frotis para teñirlo por la técnica de Gram.
 Observar las células de Azotobacter y su reacción tintorial.

2. Aislamiento:
 Sembrar el cultivo en agar Azotobacter, por la técnica de estría en superficie.
 Incubar a una temperatura de 25 - 30 °C por 3 - 5 días.
 Observar las colonias características, grandes, mucoides, brillantes, lobuladas
semielevadas.
 Efectuar la tinción Gram, de la colonia seleccionada, para estudiar la morfología de
la bacteria.
 Repicar la colonia en un tubo con agar Azotobacter, para obtener un cultivo puro.

3. Identificación:
 Prueba de crecimiento en caldo nutritivo.
 Prueba de gelatinasa.
 Prueba de fermentación de carbohidratos: glucosa, maltosa, lactosa.
 Prueba de hidrólisis del almidón.

TABLA 01: IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE Azotobacter

CARACTERISTICAS A. chroococcus A. beijerinckii A. vinelandii
Flagelos peritricos inmóvil peritricos
Formacion de
+ + +
quistes
G+C mol % 66 66 66
Crec. pH 4.5 - - -
Pigmentos:
- celulares Pardos Amarillo -
- solubles - - Verdes
Habitad típico:
- suelo + + -
- agua - - +
Utilización de
Ramnosa - - +
Acidos aromat. + + +
Manitol + d +
malonato d + +

106
*tropical en su mayoría
RESULTADOS

1. CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO y OBSERVACION MICROSCOPICA: de

Azotobacter en medio liquido

MORFOLOGIA Azotobacter
FORMA
TAMAÑO
DISPOSICION
REACCION
TINTORAL

2. AISLAMIENTO PRIMARIO

MORFOLOGIA COLONIA 1
FORMA
TAMAÑO
PIGMENTO
CONSISTENCIA
BORDE
ELEVACIÓN
CATALASA

3. OBSERVACION MICROSCOPICAS: del aislamiento primario

MORFOLOGIA Azotobacter
FORMA
TAMAÑO
DISPOSICION
REACCION
TINTORAL

107
4. CULTIVO PURO

5. IDENTIFICACION

Prueba de fermentación de carbohidratos:

 Glucosa  Maltosa  Lactosa

 Crecim. caldo nutritivo

 Prueba de gelatinasa
 Hidrólisis de Almidón

108
6. CONCLUSIONES

CUESTIONARIO:
1. ¿Cuáles son las características de crecimiento en caldo Azotobacter ?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2. Al observar los quistes de Azotobacter ¿Qué diferencias encuentra con las endosporas?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

3. ¿Qué permite el desarrollo de Azotobacter en el medio de cultivo utilizado?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

109
4. Esquematice el proceso de fijación del nitrógeno

110
 PRACTICA 14

FRMILIA: ENTEROBACTERIACEAE

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE GÉNEROS:

Escherichia, Salmonella, Shigella y otras

Esta familia está compuesta por especies bacterianas bacilares. Gram negativas, móviles
por flagelos peritricos o inmóviles (atricos). Metabolizan la glucosa por fermentación, con
producción de gas (aerogénicas) o sin él (anaerógénicas). Son bacterias oxidasa negativos.
Los bacilos suelen ser aerobios o anaerobios facultativos, no formadores de esporas;
algunas especies forman una amplia cápsula que se refleja en colonias mucoides y
viscosas; otras son hemolíticas en agar sangre, como sucede con cepas de Escherichia y
Proteus. Rara vez producen pigmentos bajo ciertas condiciones de cultivo Serratia
produce un pigmento rojo y en Erwinia las colonias tienen una coloración que va del
crema al amarillo.
En medios bacteriológicos ordinarios, las colonias muestran tendencia a ser lisas,
convexas, con bordes enteros, húmedos brillantes y de color grisáceo. Con frecuencia se
pueden observar colonias rugosas.
La familia Enterobacteriaceae lo constituyen un gran número de especies estrechamente
relacionadas, que habitan en el intestino grueso del hombre y animales; suelo, agua y
materia en descomposición. Debido a su hábitat normal en el hombre, se les llama 'bacilos
entéricos'. En este grupo se incluyen a los patógenos intestinales (Salmonella, shigella),
también otros que no causan enfermedad, pero en el huésped alterado pueden tener la
oportunidad de invadir otros sitios del cuerpo (Klebsiella, Escherichia). Por otro lado, las
enterobacterias han desempeñado un papel importante en el campo de la Biología
Molecular y la Genética.

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA
 Aislar por lo menos 4 cepas de Enterobacterias en medios de cultivo selectivo-
diferenciales, aplicando correctamente las técnicas de aislamiento
 Identificar 4 especies de enterobacterias, aplicando correctamente las pruebas
bioquímicas y tablas de identificación.

MATERIALES:
 Muestra: Heces, orina, aguas servidas.
 1 tubo con medio Amies o Cary -Blaird para el transporte de muestras.
 1 Hisopo estéril.
 1 tubo con caldo selenita o caldo tetrationato.
 1 placa con agar Mc Conkey.
 1 placa con agar Salmonella - Shigella (SS).
 Tubos con agar TSI (triple azucar y hierro).

111
 Tubos con agar LIA (agar lisina hierro).
 Tubos con caldo peptonado.
 Tubo con caldo RM - VP (caldo glucosa buffer fosfato).
 Tubos con caldo úrea.
 Tubos con agar citrato.
 Tubos con caldo nitrato.
 Lámina y agua oxigenada.
 Reactivo oxidasa.
 Batería de Gram.

PROCEDIMIENTO

1. Obtención y transporte de la muestra:

 La muestra se obtiene con hisopo estéril, el cual se acondicionará previamente
sumergiéndolo en el medio; luego se introduce en el recto, aproximadamente unos 3
cm, imprimiendo movimientos de rotación, para extraer la muestra.
 Inmediatamente introducir el hisopo en el espesor del medio Amies o Cary y Blair
hasta muy cerca del fondo del tubo. En estas condiciones el patógeno permanece
viable por varios días a temperatura ambiente.
 Colocar una etiqueta en el tubo con los datos que identifique la muestra, si es que debe
enviarse a lugares distantes.

2. Aislamiento directo:
 Diluir la muestra sólida 1/10 en solución salina fisiológica estéril
 Sembrar con el asa bacteriológica por la técnica de estriado, la muestra diluí-da o la
muestra líquida, directamente en placas de Mc Conkey y SS
 Si la muestra fue tomada con hisopo, dejar una porción de la muestra en un borde
externo de la placa. Con el asa estéril distribuir uniformemente, haciendo estrías por la
técnica de siembra rutinaria,
 Incubar las placas a 37 °C por 18 - 24 hrs,
 Observar el crecimiento por el desarrollo de colonias,
 Seleccionar las colonias lactosa positivos (rojas) y negativas (incoloras) características,
para realizar una tinción de Gram, y observar la morfología de las bacterias y su
reacción tintorial,
 Repicar las colonias lactosa positivas y negativas en tubos con agar cepa o A.N. para
mantenerlos en cultivo puro.

3. Aislamiento indirecto con enriquecimiento de cultivo:

 Sembrar 1 g de la muestra fecal o un hisopado de la misma, en un tubo con caldo
selenito o tetrationato,
 Incubar a 37 °C por 18 - 24 hrs,
 Observar las características del caldo, que habrá cambiado a un color rojo ladrillo, por
la presencia de Salmonella,

112
 Con una asada del cultivo, sin agitar, proceder a sembrar en la superficie del medio SS.
 Incubar la placa a 37 °C por 18 - 24 hrs,
 Observar las colonias características:
o Salmonella: Colonias translúcidas e incoloras, algunas con centro negro.
o Shigella: Colonias translúcidas e incoloras.
 Realizar una tinción de Gram de las colonias seleccionadas,
 Repicar las colonias en superficie inclinada de agar nutritivo, para obtener las cepas o
cultivos puros.

4. Identificación:
 Prueba de catalasa
 Prueba de fermentación de los carbohidratos glucosa, sacarosa y lactosa
o Se realiza por inoculación de la cepa en medio TSI, empleando la técnica de
picadura y estriado en superficie inclinada,
o Incubar a 37 OC por 24 hrs,
o Lectura:
 Acidez, se manifiesta por el viraje del indicador rojo de fenol a color amarillo.
Se simboliza con la letra A,
 La presencia de gas, por el resquebrajamiento del medio o burbujas de aire. Se
simboliza su intensidad de 1+ a 4+,
 La producción de hidrógeno sulfurado (H2S) se manifiesta por el color negro
en el medio. Se simboliza de acuerdo a su intensidad 1+ a 4+,
 La alcalinidad en este medio se manifiesta por el cambio al color grosella y e
simboliza con la letra K,
o Se interpreta de la siguiente manera: La fermentación sólo de la glucosa, se
manifiesta por la alcalinidad en la parte inclinada (K) y acidez en el fondo (A). La
fermentación de lactosa y/o sacarosa, se manifiesta por el cambio total del medio al
color amarillo.
o La simbología: A/A ++, - significa:
Acidez en superficie inclinada, acidez en el fondo, gas positivo, e hidrógeno
sulfurado negativo.
o La simbología: K/A -, + significa:
Alcalinidad en la superficie inclinada y acidez en el fondo, gas negativo, e
hidrógeno sulfurado positivo.
o La simbología: K/A ++, ++++ significa:
Glucosa fermentada, produciendo acidez, gas positivo 2+, e hidrógeno sulfurado
positivo 4+. En estos casos el negro es tan abundante que no es posible observar el
color amarillo del fondo.
 Prueba de utilización de la lisina
o Se realiza en medio LIA. Con el asa que se inoculó el medio TSI (sin volver a
tomar colonia); se pica el medio 3 veces hasta el fondo del tubo, terminando en
estría en la superficie inclinada,
o Incubar los tubos a 35 - 37 °C por 18 - 24 hrs,

113
o Lectura:
  Descarboxilación de la lisina, produce alcalinidad en todo el medio, por lo tanto
se intensifica el color violeta. Se simboliza K / K, se considera lisina positiva,
 Desaminación de la lisina, empieza en la parte inclinada, virando a un color rojo
ladrillo, el fondo se torna amarillo. Se interpreta como lisina negativa y se
simboliza R / A,
 Negativos. Es decir no se producen las dos reacciones anteriores. Puede
observarse además violeta en la superficie y amarillo en el fondo; también se
simboliza K / A; si es totalmente amarillo se simboliza A / A. En ambos casos se
interpretan como lisina negativa.

 Pruebas de IMViC
o Prueba de Indol:
 Sembrar el cultivo puro en caldo peptonado
 La lectura se hace por adición de 3 a 5 gotas del reactivo de Kovacs,
 Interpretación:
 Anillo rojo = Indol positivo.
 Anillo marrón = Indol negativo.
o Prueba de Rojo de Metilo y Voges Proskawer:
 Se utiliza un tubo con caldo glucosado,
 El cultivo se divide en dos tubos, a uno se agrega 3 - 4 gotas del reactivo Rojo de
Metilo, y al otro 2 gotas del reactivo (x-naftol y 4 gotas de KOH,
 Interpretación:
 Rojo de Metilo +, si el cultivo se tiñe de color rojo intenso.
 Voges Proskawer +, si el medio se torna de color rosado.
o Prueba de utilización de Citrato:
 Sembrar un tubo con agar citrato, por picadura y superficie inclinada, Incubar a
35 °C por 48 hrs,
 Interpretación:
 Utilización de citrato = medio vira a color azul.
 No utiliza citrato = no desarrolla.

 Prueba de ureasa
o Interpretación:
 Ureasa positiva = medio vira a color grosella.
 Ureasa negativa = medio vira a color amarillo.

 Prueba de reducción del nitrato

 Prueba de gelatinasa
 Prueba de motilidad: Técnica de gota pendiente.

114
 TABLA 01: COMPORTAMIENTO BIOQUIMICO EN LA IDENTIFICACION DE LOS
GÉNEROS DE LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE

Enterobacter

Providencia
Escherichia

Morganella

Salmonella
Citrobacter

Klebsiela
PRUEBA

Shigella
Serratia
Proteus
Arginina ± ± - - - - - ± - -
Utiliz. De Citrato + + - + - ± + ± + -
DNAsa - - - - - - - - - -
Fenialalanina - - - - + + + - - -
Gas de glucosa + + + ± ± ± ± ± ± -
Glucosa (acidez) + + + + + + + + + +
H 2S ± - - - - + - ± - -
Produccion de Indol ± - + ± + ± + - - ±
Lisina descarboxilasa - ± + + - - - + + -
Movilidad + + ± - + + + + + -
Ornitina ± + ± - + ± - + + ±
descarboxilasa ± - ± + - ± ± - + -
Sacarosa - - - ± + + ± - - -
Ureasa
Voges-Proskawer - + + + - - - - + -
Fermentación en TSI Al(A) A A A Alc Alc Alc Alc Alc(A) Alc
AG AG AG AG AG AG AG AG A A
A=acidez Alc= alcalino G=gas

TABLA 02: COMPORTAMIENTO DE LAS ESPECIES DE Klebsiella, Enterobacter, Echerichia

PRUEBA K. pneumoniae K. oxytoca K. azaenae E. cloacae E. aerogenes E. coli
Indol - + - - - +
RM - - + - - +
VP + + - + + -
Citrato + + + + + -
TSI A/G A/G A/G A/G A/G A/G
H2S - - - - - -
Lisina
+ + + - + +
Descar.
Ureasa + + - + - -
Lactosa + + +- + V V
Motilidad - - - + + +

TABLA 03: COMPORTAMIENTO DE LAS ESPECIES DE Shigella y Salmonella

PRUEBA S. dysenteriae S. flexneri S. boydii S. sonnei S. typhi
Indol ± ± ± - -
RM + + + + +
VP - - - - -
Citrato - - - - -
H2S - - - - +
Lisina Descar. - - - - +
Ureasa - - - - -
Manitol - + + + -
Lactosa - - - - -
Motilidad - - - - +
Sacarosa

115
- - - - -
 TABLA 04: PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DE ALGUNAS ESPECIES DE LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEA
Sub sp de Salmonella enterica Sub sp enterica En En Kp Kp Sh Sh
PRUEBA Cf Cd en bon ari in chol typhy Pv Pm Ec Eh Eb Yp Ye Sm Sl Sr
a c p O s d
Indol - + - - - - - + + + + - - - - - - d - d + + +
RM + + + + + + + + + + + + - - (-) + + + (+) + - - -
VP - - - - - - - - - - - - + + + - - - - - + + +
Citrato + + + + + + - (-) - - - d + + + D - - - - + + +
H 2S + - + + + + + + + - - - - - - - - - - - - - - -
Ureasa d d - - - - - - + + - - - - d + - - - - (+) - - -
LDC - - + + + + + + - - + - + + - + D - - - - + + d
ODC (-) + + + + + + - - + d + + + + - - + - + + + -
Crec. KCN + - + - - - - + + - + - + + + (+) - - - + + (-)
Hid. Gel 22°C - - - - - + - - + + - - - - - - - - - - - + + +
Arginina Dih d d + d - d - - (-) - - - + - - - - - - - - -
Gas de Glucosa + + + (+) + (+) + - (+) + + + + + + + + - - - - d (+) d
Utiliz. Acetato (+) (+) + + (+) + (-) (-) + (+) - d (+) (+) - - - - - d d (+)
Movilidad + + + + + + + + + + + + - + + - - - - - - + + +
Pig. Amarillo - + - - - - - - - - - - - -
Pig. rojo - - - - - - - - - - - d - +
Acidez
Lactosa d d - - (-) (-) - - - - + d - + + + d - - - - - - +
Xilosa + + + + + + + (+) + + + + + - - + + - - + d - + +
Manitol + + + + + + + - - + + - - - + d + + + + + +
Glucosa + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + +
Arabinosa + + + + + + - - - + + + + + + + + d + + - + +
Swarming - - - - - - - - + +
Red. NO3 + + + + + + + + + + + + + + + (+) + + (+) + + + +
DNAsa 25°C - - - - - - - (+) d + + - - - - - - d - - + (+) +
Catalasa + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Oxido-Ferm. F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F
Cf. Citrobacter freundii Cd. Citrobacter diversus en. Salmonella entérica sub sp. entérica bon. Salmonella entérica sub sp bongori ari. Salmonella entérica sub sp arizone in. Salmonella entérica sub sp
indica chol. Salmonella entérica serotipo Cholerasius typhy*. Salmonella entérica serotipoTyphi Pv. Proteus vulgaris Pm. Proteus mirabilis Ec. Escherichia coli Eh. Escherichia hermani
Eb. Escherichia blantae En a. Enterobacter aerogenes En c. Enterobacter cloacae Kp p. Klebsiella pneumoniae sub sp pneumoniae Kp o. Klebsiella pneumoniae sub sp ozaenae Sh s. Shigella sonei
Sh d. Shigella dysenteriae Yp. Yersinia pestis Ye. Yersinia enterocolitica Sm. Serratia marcescesns Sr. Serratia rubidaea
(+) 76-89% de cepas positivas (-) 11-25% cepas positivas -: de 0-19% cepas positivas +: >90% cepas positivas d. 26 -75% cepas positivas

116
 RESULTADOS

1. OBSERVACION MICROSCOPICA DEL CULTIVO MIXTO

2. AISLAMIENTO PRIMARIO DIRECTO: desarrollo de colonias características en

Agar Mc Conkey. y Agar Salmonella-Shigella

Agar Mc Conkey Agar Salmonella-Shigella

CARACTERISTICAS C1 C2
Forma
Tamaño
Elevación
Consistencia
Bordes
Lactosa
Catalasa
H2S
Motilidad

117
3. OBSERVACIÓN MICROSCOPICA DE Enterobacteriaceas: Tincion Gram de:

COLONIA 1 COLONIA 2

COLONIA 1 COLONIA 2

4. CULTIVO PURO

COLONIA 1 COLONIA 2

118
5. IDENTIFICACION

COLONIA 1

 Ferm. de Carbohidratos (TSI)  Utilización de Lisina (LIA)

IMViC
 Indol  RM  VP  citrato

 Hidr. De urea
(Ureasa)  Reducción de NO3  Gelatinasa

119
 COLONIA 2

 Ferm. de Carbohidratos (TSI)  Utilización de Lisina (LIA)

IMViC
 Indol  RM  VP  citrato

 Hidr. De urea
(Ureasa)  Reducción de NO3  Gelatinasa

ENTEROBACTERIACEAE
IDENTIFICACION
COLONIA 1 COLONIA 2
TSI
LIA
Indol
RM
VP
Citrato
Hidrólisis de la Urea
Reducción de NO3

120
Gelatinasa
6. CONCLUSIÓN

CUESTIONARIO

1. ¿Qué color tienen los medios originales TSI y LIA, y a q se deben?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2. ¿En que medios se pueden aislar las Enterobacterias?¿Por qué?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

3. ¿Por qué se emplea un cultivo de enriquecimiento?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

4. ¿Cuáles son las pruebas básicas para diferenciar Salmonella y Shigella?

5. ¿Cómo podría reconocer a E. coli en agar Mc Conkey?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

6. ¿Si utiliza la serología que tipo de identificación podría hacer?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

121
 PRACTICA 15
FAMILIA VIBRIONACEAE.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DEL
GENERO: Vibrio

Comprende bacilos Gram negativos rectos o curvados, de 0,5 a 0,8 um de ancho x 1,4 a
2,6 um de largo, aislados o unidos formando espirales. Móviles por uno o más flagelos
polares los cuales son envueltos en una vaina continua con la membrana externa de la
pared celular, No forman esporas. No son capsulados.
Crecen bien y rápidamente en los medios de cultivo ordinarios; el agar sales biliares-
citrato-tiosulfato (TCBS) es el medio que se utiliza preferentemente para el aislamiento
primario. Los iones sodio estimulan el crecimiento de todas las especies, son aerobios y
anaerobios facultativos, su temperatura óptima varía considerablemente, todos crecen a
20°C, más crecen a 30°C, su pH óptimo 7,0, pero pueden tolerar condiciones alcalinas con
pH 9,5. Son oxidasa y catalasa positivas. Muchas especies son sensibles al agente
vibriostático O/129.

Se encuentran ampliamente distribuidos como formas saprofitas en el agua dulce y salada,

y como formas patógenas que afectan al humano; entre éstas V. cholerae agente causal del
“cólera” y V. parahemolyticus que produce “gastroenteritis”.

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA
 Aislar bacterias del género Vibrio en medio TCBS de muestra de aguas servidas, de
mar y heces.
 Identificar por lo menos 3 especies de Vibrio, mediante pruebas bioquímicas de
crecimiento y tolerancia a diferentes concentraciones de sal.

MATERIALES
1. Muestra:
 Heces de paciente con “cólera”, aguas servidas y agua de mar,

2. Enriquecimiento:
 1 tubo con caldo peptona alcalina pH 8,5.

3. Aislamiento:
 1 placa con agar TCBS,
 Asa bacteriológica,
 Tubos con agar tripticasa soya (ATS).

4. Identificación:
 Batería de Gram
 Reactivo oxidasa,
 Lámina y agua oxigenada,
 3 tubos con medio LIA
122
 3 tubos con caldo arginina,
 3 tubos con caldo peptona,
 Reactivo de Kovac,
 3 tubos con agar TSI,
 3 tubos con caldo V-P (caldo glucosa fosfato),
 3 tubos con caldo peptona sin sal,
 3 tubos con caldo peptona con NaCl 3%,
 3 tubos con caldo peptona con NaCl 8%,
 3 tubos con caldo peptona con NaCl 10%
 3 tubos con caldo nitrato.

PROCEDIMIENTO

1. Obtención de lo muestro de heces:

 La muestra de heces de un paciente sospechoso de “cólera”, debe obtenerse antes de la
administración de cualquier antibiótico,
 La muestra se obtiene con un hisopo estéril, se lubrica introduciéndolo primero eh el
medio de transporte y luego en el recto a unos 3 cm de profundidad, imprimiendo
movimientos de rotación para obtener la muestra.
 Introducir el hisopo con la muestra hasta él fondo del tübo, qué contiene el medio de
transporte, que puede ser Amies o Cary Blair,
 Si las deposiciones son evacuadas en un recipiente, la muestra se obtiene directamente
con el hisopo
 No se debe refrigerar la muestra.

2. Aislamiento directo:
 Sembrar la muestra directamente por la técnica de estría en la superficie del agar
TCBS,
 Incubar las placas a 37 °C por 24 hrs.

3. Aislamiento indirecto:

3. 1 Enriquecimiento:
 Sembrar (0,5 - 0,1 g), en un tubo con 10 ml de caldo peptonado alcalino, pH 8,5
 Incubar a 37 °C por 8 hrs,
 Observar crecimiento (turbidez).

3.2 Aislamiento en placa:

 Sembrar una asada de cultivo de 8 hrs en la superficie del agar TCBS, por la técnica de
estría
 incubar la placa a 37 oc por 24 hrs.

3.3 Lectura:

123
Observar el crecimiento de colonias características:
 Las colonias de V. cholerae, son amarillas, más intensa en la parte central;
redondeadas, cremosas, ligeramente convexas, de 2 - 3 mm de diámetro.
 Las colonias de V. parahaemolyticus, son verde azuladas.

3.4 Cultivo puro

 Las colonias características, repicarlas a tubos con ATS inclinado, incubarlas a la
misma temperatura para obtener un Cultivo puro.

4. Identificación:
 Prueba de oxidasa
 Prueba de catalasa
 Prueba del cordón (String test)
 Sobre una lámina, colocar una gota de desoxicolato de sodio al 0,5%,
 Hacer una suspensión con una porción de colonia. Interpretación:
 La prueba es positiva si la suspensión se vuelve viscosa y se observa la formación
de cordón al levantar suavemente el asa.
 Prueba de lisina descarboxilasa
 Prueba de arginina dihidrolasa
 Prueba de indol
 Prueba de fermentación de carbohidratos (TSI)
 Prueba de Voges Proskawer (V-P)
 Prueba de tolerancia a la sal. Son pruebas complementarias.

TABLA 1. CARACTERISTICAS DIFERENCIALES DE LOS GENEROS

Vibrio, Aeromonas y Plestomonas
PRUEBAS VIBRIO AEROMONAS PLESTOMONAS
Oxidasa + + +
Reducción de
+ + +
NO3 a NO2
Indol + + -
Gelatinasa + + -
O-F de glucosa F F F
Manitol + + -
Inositol - - +
Lisina
+ - +
descarboxilasa
Arginina
- + +
dihidrolasa
Ornitina
+ - +
descarboxilasa
Inhibición O/129 + - ±

124
 TABLA 2. PROPIEDADES BIOQUIMICAS DE ESPECIES DE VIBRIO
V. V. V. V. V
PRUEBAS V. cholerae
parahaemolyticus alginolyticus vulnificus hollisae mimicus
Oxidasa + + + + + +
Arginina
descarb
- - - - - -
Utiliza
- - - D - -
lactosa
Ferm
.sacarosa
+ - + - - -
Producción de
H2S
- - - - - -
Lisina
+ + + + - +
descarb
Gelatinasa + + + + - D
Indol
+ + (+) + + +
Utiliz de
citrato
d + + + - +
RM + (+) (+) (+) - +
VP d - + - - -
Crec . NACL
0%
+ - - - - +
Crec . NACL
3%
+ + + + + +
Crec . NACL
8%
- + + - d -
Crec . NACL
10%
- - + - - -
STRING
+ d + + + +
TEST
Crec.TCBS + + + + + +
d: 11-89% de cepas son positivas

TABLA 3. COMPORTAMIENTO DE, V. cholerae EN LAS PRUEBAS DE

IDENTIFICACION
PRUEBA REACCION
Aglutinación con antisueros 0-1 Ogawa e Inaba +
Motilidad +
Gas de glucosa +
Acido de glucosa -
Manitol +
Inositol +
Sacarosa -
Manosa +
Arabinosa +
Sulfuro de hidrogeno -
Prueba de filamentosidad -
oxidasa +

125
126
 RESULTADOS

1. ENRIQUECIMIENTO DE LA MUESTRA

2. AISLAMIENTO PRIMARIO : Desarrollo de colonias características en agar TCBS

MORFOLOGIA C-1 C-2

FORMA
TAMAÑO
COLOR
ELEVACION
CONSISTENCIA
ASPECTO
SACAROSA

3. OBSERVACION MICROSCOPICA DE Vibrios: Tinción Gram

C-1 C-2

127
 MORFOLOGIA C-1 C-2
FORMA
DISPOSICION

REACCION TINTORIAL

MOTILIDAD

4. CULTIVO PURO

COLONIA 1 COLONIA 2

5. IDENTIFICACION DE COLONIA

COLONIA 1

 Lisina descarbox. (LIA)  Arginina dihidrolasa  Ferm. de carbohidr. (TSI)

 V-P  Red. de nitrato

128
Tolerancia a la sal

 sin sal  NaCl 3%  NaCl 8%  NaCl 10%

COLONIA 2

 Lisina descarbox. (LIA)  Arginina dihidrolasa  Ferm. de carbohidr. (TSI)

 V-P  Red. de nitrato

Tolerancia a la sal

 sin sal  NaCl 3%  NaCl 8%  NaCl 10%

129
 Identificación C1 C2
LIA
Arginina dihidrolasa
TSI
VP
Red. nitratos
Sin sal
NaCl 3%
NaCl 8%
NaCl 10%

6. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

7. CONCLUSIONES

130
 CUESTIONARIO

1. ¿Cómo diferencia las distintas cepas de Vibrio, en medio TCBS? Explique

porque desarrolla Vibrio en medio TCBS.
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

2. ¿Explique el experimento que haría para determinar si Vibrio produce o no H2S.

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

3. ¿Las pruebas realizadas son suficientes para identificar las distintas especies de
Vibrio?. ¿Por qué?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

4. ¿Cuál sería el procedimiento a seguir en la identificación de Vibrio, para una

muestra de agua servida?
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______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

5. ¿Pueden desarrollar otras bacterias en medio TCBS? ¿Por qué?

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

6. ¿Cuál es la finalidad de sembrar la muestra en caldo peptonado, pH 8,5?

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______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

131
 PRACTICA 16

FAMILIA AEROMONADACEA

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DEL

GÉNERO: Aeromonas

El género aeromonas, comprende bacilos rectos de extremos redondeados o formas

próximas a cocoides; miden de 0,3 a 1 ,0 𝜇m de diámetro y 1,0 a 3,5 um de largo;
después de la división celular, se disponen, aislados o forman cortas cadenas.
Las células son Gram negativos, móviles mediante un flagelo, no forman esporas y no
son capsulados. Crecen en medios de cultivo ordinarios; no desarrollan en agar TCBS.
Son anaerobias facultativas, quimioorganótrofas con metabolismo respiratorio y
fermentativo; la temperatura óptima de crecimiento es de 22 a 28°C, muchas especies
crecen bién a 37°C. Fermentan los carbohidratos con producción de ácido pero no gas.
Son oxidasa y catalasa positivas, ureasa negativa, gelatinasa y DNAasa positivas,
reducen los nitratos son resistentes al agente vibriostático O/129(2, 4-diamino-6, 7-
diisopropilptheridina).
Se encuentran con frecuencia en el agua dulce y de albañal. Algunas especies son
patógenas de ranas, peces y humanos. Las infecciones humanas se caracterizan por
diarreas o bacteríemias.

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA
 Aislar Aeromonas en medio GSP de muestra de aguas servidas y heces humanas.
 Identificar por lo menos una especie de Aeromonas.

MATERIALES
1. Muestra:
 Aguas servidas, heces humanas con diagnóstico de gastroenteritis

2. Aislamiento:
 1 placa con agar GSP
 Asa bacteriológica,
 Tubos con ATS

3. Identificación:
 Batería de Gram
 Reactivo oxidasa
 Lámina y agua oxigenada
 1 tubo con medio LIA
 1 tubo con caldo arginina
 1 tubo con caldo peptona
 Reactivo de Kovac
 Tubo con caldo glucosa fosfato
 1 tubo con medio gelatina

132
 Tubos con caldo glucosa, maltosa, sacarosa
 1 tubo con caldo nitrato
 1 tubo con caldo úrea
 1tubo con caldo peptona con NaCl 3,5%

PROCEDIMIENTO
A. Obtención de la muestra de heces:
 La muestra de heces debe obtenerse antes de la administración de cualquier
antibiótico, y deben ser transportadas igual que Vibrio
 Las muestras de agua deben ser recogidas en frascos de boca ancha, con tapa de
rosca, estériles.

B. Aislamiento directo:
 Sembrar la muestra directamente por la técnica de estría en la superficie del agar
GSP
 Incubar las placas a 37 °C por 24 hrs.

C. Lectura:
 Observar el crecimiento de colonias características y seleccionarlas de acuerdo a la
tabla 1

D. Cultivo puro:
 Separar las colonias características en a ATS inclinado, iricubarlas a la misma
temperatura para obtener un cultivo puro.

4. Identificación:
 Morfología microscópica
 Prueba de oxidasa
 Prueba de catalasa
 Pruebas de IMViC
 Prueba de Lisina descarboxilasa
 Prueba de arginina dihidrolasa
 Prueba de gelatinasa
 Prueba de fermentación de carbohidratos: glucosa, maltosa, sacarosa
 Prueba de reducción de nitratos
 Prueba de tolerancia a la sal.

133
 TABLA 1. MORFOLOGIA D LAS COLONIAS DE AEROMONAS EN MEDIO GSP
COLONIAS BACTERIA
Grandes de 2 a 3mm de diámetro, violeta
Pseudomonas
azulada rodeada de zona violeta rojiza.
Casi siempre más pequeñas, de
Enterobacteriaceas y otras
crecimiento más lento a veces mucoides.
Grandes, de 2 a 3 mm, amarillas rodeadas
Aeromonas
de zona amarilla.

TABLA 2. PRUEBAS DE IDENTIFICACION DE ALGUNAS ESPECIES DE

AEROMONAS
PRUEBAS A.caviae A. hidrophila A. media A.sobria A.veronil
Indol + + d + +
RM + + + - +
VP - + - d +
CITRATO d - - - +
H2S - + - - -
UREASA - - - + +
L.descarboxilasa - d - + -
Arginina dehidrolasa + + + + +
Motilidad + + + + +
Gelatinasa + + - + +
Glucosa
 Acido - + - - +
 Gas - + - - -
Arabinosa + + + + +
Lactosa d d d d +
Maltosa + + + - -
Sacarosa + + + + +
Trehalosa + + + + +
Xilosa - - - - -
Oxidasa + + + - -
0%Nacl + + + + +
1%Nacl + + + + +
6%Nacl -
Pigmento marrón soluble - - + - -

134
 RESULTADOS
1. AISLAMIENTO PRIMARIO : Desarrollo de colonias características en agar GSP

MORFOLOGIA C-1
FORMA
TAMAÑO
COLOR
ELEVACION
CONSISTENCIA
ASPECTO

2. OBSERVACION MICROSCOPICA DE AEROMONAS. Tincion Gram

MORFOLOGIA C-1
FORMA
DISPOSICION
REACCION TINTORIAL

MOTILIDAD

3. CULTIVO PURO DE COLONIA N0……

COLONIA 1

135
4. IDENTIFICACION

Prueba de la catalasa: ____

IMViC

 Indol  RM  VP  citrato

 Hidr. De urea
(Ureasa)  Reducción de NO3  Gelatinasa

 LIA  TSI  Arginina dihidrol.

Fermentación de carbohidratos
 Glucosa  Maltosa  Sacarosa  Xilosa  Arabinosa

136
Tolerancia a la sal

 sin sal  NaCl 3%  NaCl 8%  NaCl 10%

IDENTIFICACION COLONIA 1
Indol
RM
VP
Citrato
Ureasa
Red. NO3
Gelatinasa
LIA
TSI
Arginina dihidrolasa
Ferm. glucosa
Ferm. maltosa
Ferm. Sacarosa
Ferm. Xilosa
Ferm. Arabinosa
NaCl 3%
NaCl 8%
NaCl 10%

5. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

6. CONCLUSIONES

137
 CUESTIONARIO

1. ¿A parte de la muestra utilizada en la práctica, de qué otras muestras puede

aislar Aeromonas?
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

2. ¿se puede aislar Aeromonas en los medios Agar Mc Conkey y Agar TCBS.
porque?
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

3. ¿Cuáles son las características mas saltantes para reconocer las bacterias del
genero Aeromonas?
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

138
 PRACTICA 17
FAMILIA: HALOBACTERIACEA
1. AISLAMIENTO PRIMARIO: En una placa con 10% de NaCl.

MORFOLOGIA C-1
FORMA
TAMAÑO
COLOR
ELEVACION
CONSISTENCIA
ASPECTO

2. OBSERVACION MICROSCOPICA

MORFOLOGIA C-1
FORMA
DISPOSICION
REACCION TINTORIAL

MOTILIDAD

3. CULTIVO PURO

COLONIA 1

139
4. IDENTIFICACION

Prueba de la catalasa: ____

IMViC

 Indol  RM  VP  Citrato

Fermentación de carbohidratos
 Glucosa  Lactosa  Manitol  Xilosa  Sacarosa

 Red. de NO3  SIM (H2S)  Hidr. De gelatina

 Hidrolisis de almidón

140
IDENTIFICACION COLONIA1
Indol
RM
VP
Citrato
Ferm. glucosa
Ferm. Lactose
Ferm. Manitol
Ferm. Xilosa
Ferm. Sacarosa
Red. de NO3
SIM (H2S)
Hidr. De gelatina
Hidrolisis de almidón

5. INTERPRETACION DE RESULTADOS

6. CONCLUSIION

141
OBSERVACIONES MICROSCOPICAS

142