Una revisin de las bacterias acido lcticas bacteriocinognicas utilizadas como cultivos bioprotectores en la carne fresca producida en Argentina

Resumen
Varias bacterias acido lcticas (BAL) asociadas a productos crnicos son importantes productores de bacteriocina natural. Las bacteriocinas son sustancias proteinceas antagnicas que son importantes en el control del deterioro (putrefaccin) y microorganismos patgenos. El uso de BAL como cultivos bioprotectores para extender la vida til de la carne fresca puede mejorar la estabilidad y seguridad microbiolgica en la conservacin de la carne comercial. El Lactobacillus curvatus CRL705 utilizado como cultivo de proteccin de la carne fresca es eficaz en la inhibicin de Listeria innocua y Brochothrix thermosphacta, as como las BAL nativas contaminantes, reteniendo su efecto inhibitorio a bajas temperaturas y con un efecto insignificante en el pH de la carne. Adems de los obstculos representados por la baja temperatura y envasado al vaco, el uso de clulas vivas de Lb. curvatus CRL705 parece ms factible desde un punto de vista econmico - y sin restricciones legales - en comparacin con la adicin de bacteriocinas purificadas. En este artculo, se discute una descripcin de las bacteriocinas transmitidas por la carne y su aplicacin en la carne para prolongar la vida til.

1. Introduccin
Los consumidores pueden estar ms preocupados por la seguridad en los alimentos que en otros productos, incluidos los medicamentos (Prendergast, 1997). La conciencia sobre las consecuencias de la Escherichia coli O157:H7, patgeno transmitidos por la carne, se ha incrementado en la opinin pblica en general, haciendo a ste organismo un nombre familiar en el siglo XXI (Ransom, Belk, Sofos, Parada de ida, Scanga, Ransom et al., 2003). Sin duda la mayor amenaza para la seguridad alimentaria es la aparicin de nuevos patgenos. El papel reciente de Listeria monocytogenes, E. coli O157:H7, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica y Vibrio parahemolyticus como microorganismos transmitidos por alimentos se ha relacionado con el aumento de brotes, en comparacin a los patgenos alimentarios tradicionales (Iglesia, 2004; Elmi, 2004; Mead et al. 2005, Moore et al, 2005). Los cambios en la cadena alimentaria continuarn creando oportunidades para el surgimiento de nuevas enfermedades y la reaparicin de enfermedades antiguas. Dado que los patgenos no reconocen las fronteras nacionales, la rapidez con la que los microorganismos individuales pueden circunnavegar el globo propagando infecciones, hace del control de las enfermedades transmisibles un enorme desafo para los gobiernos, as como para los sistemas de atencin primaria y de salud. La fabricacin de una gama cada vez mayor de nuevos productos crnicos como alimentos funcionales y la inclusin de ingredientes considerados beneficiosos para la salud (Fernandez-Gines, Fernandez-Lopez, Sayas-Barbera & Perez-Alvarez, 2005) tambin pueden representar peligros adicionales con respecto a la seguridad. Adicionalmente, la presencia en los productos crnicos de aditivos qumicos y residuos agroqumicos y medicamentos veterinarios tambin es percibida por los consumidores como un riesgo para la salud. Incluso cuando el nivel de estos residuos rara vez excede los lmites reglamentarios en productos crnicos (Tarrant, 1998), el uso de antibiticos en la produccin animal intensiva plantea el riesgo adicional de la resistencia bacteriana, lo cual constituye un peligro microbiolgico en lugar de un residuo estrictamente qumico.

Sobre estas bases, se precisa la necesidad de soluciones relativas a la calidad higinica de los alimentos. Los consumidores cada vez ms exigen alimentos que estn libres de patgenos, con un procesamiento mnimo y menos conservantes y aditivos, pero con una calidad sensorial intacta. Como una respuesta a estas demandas en conflicto, las tendencias actuales en la industria de alimentos incluyen la investigacin de los inhibidores alternativos para garantizar la seguridad alimentaria. La biopreservacin ha ganado mayor atencin como medio de control natural de la vida til y seguridad de los productos crnicos. La aplicacin de cultivos bioprotectores para garantizar la calidad higinica es una herramienta prometedora aunque, como ha sealado Holzapfel, Geisen y Schillinger (1995), debe ser considerado slo como una medida adicional a las buenas prcticas de manufactura, procesamiento, almacenamiento y distribucin. Algunos microorganismos comnmente asociados con las carnes han demostrado ser antagonistas con respecto a las bacterias patgenas y al deterioro. Las bacterias cido lcticas (BAL) tienen un gran potencial para su uso en biopreservacin, ya que son seguros para el consumo humano (estado GRAS) y son la microflora prevalente durante el almacenamiento en muchos alimentos. En el presente trabajo, se discute el uso de antagonistas de microorganismos para inhibir y/o inactivar agentes patgenos y flora de deterioro en la carne, con especial referencia a cepas de BAL formadoras de bacteriocina. Adems, se analiza un concepto nuevo de cultivo bacteriano que se utilizar en la extensin de la vida til de la carne fresca, en donde las caractersticas bioconservantes y biotecnolgicas completan los criterios esenciales para productos crnicos ms sanos.

2. Microbiologa de la carne fresca

Las poblaciones microbianas caractersticas que se desarrollan en la carne y productos crnicos son el resultado del efecto de las condiciones ambientales prevalecientes en el crecimiento de tipo de microbios inicialmente presentes en la materia prima o introducida por contaminacin cruzada. Los factores intrnsecos y extrnsecos que regulan el crecimiento microbiano determinarn el tipo y el nmero de bacterias presentes en la carne. Los factores intrnsecos son predominantemente qumicos (concentracin y disponibilidad de nutrientes, pH, potencial redox, capacidad amortiguadora, aw, estructura de la carne), mientras que los extrnsecos se relacionan con las condiciones de almacenamiento y procesamiento. Este ltimo, cuyos parmetros principales son la temperatura y oxgeno disponible, se utilizan muchas veces para extender la vida til de productos crnicos. La higiene durante el sacrificio y el faenado de las canales, junto con el enfriamiento rpido y adecuado es de gran importancia para la calidad y seguridad de la carne. La carne es un excelente sustrato para el crecimiento bacteriano, por lo que, si los mtodos de restriccin no se utilizan, se deteriora fcilmente. Las bajas temperaturas utilizadas durante el enfriamiento de la canal constituyen la primera barrera para que los microbios se desarrollen. Adems, la microbiologa de las canales de carne est muy supeditada a las condiciones en la que los animales fueron criados, transportados, sacrificados y procesados. Las condiciones en el sacrificio, la diseminacin de la contaminacin durante el mismo, y el tiempo-temperatura de almacenamiento son factores importantes que determinan la calidad microbiolgica de la carne (Barkocy-Gallagher et al, 2003; Chang, Mills, y cuchillas, 2003; Fegan, Vanderlinde, Higgs, y Desmarchelier, 2004; Fike Y Spire, 2006; Ghfir et al, 2005; Looper et al, 2006). Se han reportado diferencias regionales y estacionales en la prevalencia de patgenos en el cuero del ganado durante la recoleccin en plantas comerciales de procesamiento de carne bovina, datos ocultos reflejan la prevalencia regional y los datos de las canales indican diferencias en las prcticas de sacrificio (Rivera-Betancourt et al. 2004). Sin embargo, Barkocy-Gallagher et al. (2003) reportaron que la prevalencia de patgenos estacin-dependientes fue mayor en cueros que en heces y que los recuentos microbianos disminuyeron durante el proceso y durante la aplicacin de intervenciones antimicrobianas. La amplia distribucin de productos crnicos en el comercio nacional e internacional conllev a que las enfermedades transmitidas por alimentos se propaguen a travs del consumo de carne. Durante los aos 70, el establecimiento de criterios microbiolgicos para la carne refrigerada o congelada, as como normas de higiene en los mataderos y durante la inspeccin sanitaria de animales vivos, fueron de gran

importancia para que los procesadores de carne mejoren la higiene (Nottingham, 1982). Recientemente, las tecnologas de intervencin para reducir los agentes patgenos en la carne, que han recibido considerable atencin, han demostrado ser eficaces. Luego del rendimiento de la canal, la microbiota comprende una mezcla de mesfilos y psicrfilos, los cuales son gradualmente seleccionados durante la refrigeracin. En estas condiciones, el crecimiento mesfilo ya no se produce y se desarrollar una microbiota psicrotrfica. Como la mayora de los patgenos son mesfilos, la carne obtenida en buenas condiciones de higiene no se esperara que represente riesgos sanitarios. Las estrategias de descontaminacin de las carcasas usando soluciones desinfectantes, tales como cidos orgnicos, fosfato trisdico o el ozono (Castillo, Santa Luca, Mercado, y Acuff, de 2001; Dubal et al, 2004; Ransom et al, 2003) se han aplicado con xito para la reduccin de patgenos en las canales de carne bovina, especialmente cuando se combina con tratamientos de pre-enfriamiento. Al considerar la microbiologa de la carne, debemos distinguir entre las enfermedades de los animales (ntrax, brucelosis, cisticercosis, triquinosis, tuberculosis, fiebre aftosa), que pueden ser detectados antes o despus de la inspeccin, y las infecciones que provoquen intoxicacin alimentaria en los seres humanos, que podran estar presentes en animales portadores asintomticos o llegar al producto de otras fuentes. Las salmonelas son tpicos patgenos intestinales de importancia en salud pblica. Los altos niveles de Salmonella en la carne pueden surgir de las prcticas de produccin animal en la fase de cra, as como de la contaminacin cruzada despus del sacrificio o en el matadero o en el comercio al por menor (Beach, Murano, y Acuff, 2002; Frost, O'Boyle y Samuel, 1988). A pesar que los serotipos de Salmonella relacionados a la intoxicacin por alimentos no suponen un riesgo sanitario para los animales, presentan dificultades para el mantenimiento de la higiene en la medida que el procesador de carne no tenga indicacin de su presencia. Este problema puede agravarse por el estrs y el hambre durante el transporte y manipulacin, los cuales causan agotamiento fsico que tendr un impacto en la funcin del sistema inmunolgico, incidencia de enfermedad y, finalmente, en la calidad de la canal (Fike y Spire, 2006). La prevalencia de Salmonella en canales de carne bovina en las diferentes etapas de la produccin de carne bovina, as como en los recortes, fue reportada de estar en el rango de 3-12% (Barkocy-Gallagher et al, 2003; Ghfir et al, 2005; McEvoy, Doherty, Sheridan, Blair, y McDowell, 2003) mientras que una deteccin de menor impacto (00,2% de las canales de carne bovina) se obtuvo en una encuesta nacional reciente en Australia (Phillips, Jordania, Morris, Jenson, y Sumner, 2006). Cuando se investig la presencia de Salmonella en mataderos de cerdos, la incidencia de contaminacin mostr una alta variabilidad con un promedio de 1,7% a 12% para las canales de cerdo, y se haba reportado una alta incidencia en las muestras ambientales (Hald, Wingstrand, Swanenburg, von Altrock, y Thorberg, 2003; Pala y Sevilla, 2004; Rodrguez, Pangloli, Richards, el monte, y Draughon, 2006). Algunos tejidos (ganglios linfticos y amgdalas) tambin participaron en la propagacin de Salmonella en mataderos de cerdos, lo cual indica un mayor riesgo de contaminacin de la carne porcina (Vieira Pinto, Temudo, y Martins, 2005). La intoxicaciones alimentarias por estafilococos estn ampliamente distribuidas; siendo la contaminacin de la carne asociada generalmente con alimentos de alta manipulacin manual. El agente etiolgico ms frecuente es el Staphylococcus aureus y su enterotoxinas termo-estables relacionadas (Balaban y Rasooly, 2000). Los estudios realizados en cerdos y bovinos sacrificados mostraron que S. aureus fue la bacteria patgena ms frecuentemente detectada en los mataderos y salas de procesamiento. Aunque la calidad microbiolgica de la carne depende en gran medida de la higiene de los lugares de beneficio, las operaciones de faenado y lneas de procesamiento, donde las manos de los trabajadores y el medio ambiente de los lugares asociados con el proceso de evisceracin son las principales fuentes (Desmarchelier, Higgs, Mills, Sullivan, y Vanderlinde, 1999; pizarra, Jacoby, y Plaatjies, 2006). Adems, la presencia de estafilococos en bioaerosoles de los mataderos de carne roja, as como la mastitis bovina en vacas lecheras tambin pueden constituir un riesgo de contaminacin por patgenos transmitidos por alimentos (Pitkala, Haveri, Pyorala, Myllys, y Honkanen Buzalski, 2004; pizarra, Lues, Venter, y compra, 2006). Las canales de cerdo son a menudo una fuente importante de contaminacin con S. aureus principalmente debido a los pasos secuenciales de sacrificio, que implican escaldado, depilado, pulido, corte, lavado, refrigeracin y los sistemas de cadena de fro para el transporte y comercializacin (Carr, Thompson, Miller, Ramsey, y Kaster, 1998; Pala y Sevilla de 2004; Spescha, Stephan, y Zweifel, 2006). El abuso de tiempo y temperatura de un alimento contaminado con estafilococos enterotoxignicos puede

resultar en la formacin de enterotoxina. La presencia de S. aureus enterotoxignicos en los alimentos de origen animal es muy variable, oscilando entre el 6% a 90% (Blaiotta et al, 2004;. Holeckova et al, 2002;. Manfre-da, Mioni, y De Cesare, 2005). La determinacin de la presencia de enterotoxinas estafiloccicas por medio de tcnicas moleculares mejora la posibilidad de rastrear las fuentes de cepas enterotoxignicas y el establecimiento de estrategias preventivas (Blaiotta et al., 2004). La E. coli enterohemorrgica productora de toxina shiga (STEC) ha emergido como un patgeno de transmisin alimentaria con ms significancia que otros bien conocidos debido a las graves consecuencias para los humanos, su baja dosis de infeccin, su inusual tolerancia al cido y su aparente asociacin especial pero inexplicable con rumiantes utilizados para la alimentacin (Tarrant, 1998). Este patgeno puede causar graves complicaciones en los seres humanos tales como la colitis hemorrgica y sndrome urmico hemoltico (Griffin y Tauxe, 1991). La prevalencia incrementada de E. coli O157:H7 en los alimentos puede estar asociada con la consolidacin de la industria de la carne en pocas pero ms grandes unidades de produccin y de procesamiento. Pases como Francia, Reino Unido, Estados Unidos, Canad, Japn, Australia y Argentina han evaluado las carcasas de carne y/o productos crnicos para la presencia de E. coli O157, confirmando que el ganado bovino es el principal reservorio de STEC patgenos para los seres humanos. La eavuacin mundial de heces bovinas revel amplios rangos de tasas de prevalencia de STEC O157 (0.2-27.8%) con una alta incidencia de sndrome urmico hemoltico (Andral, Aspan, Perelle e Fach, 2004;. Blanco et al, 2004; Gleeson, Duncan, Kamanzi, Charlebois, y Farber, 2005; Hussein y Bollinger, 2005; Omisakin, MacRae,Ogden y Strachan, 2003). En particular, la carne de novillos de las principales zonas productora de carne de Argentina ha sido reportada de ser reservorio de cepas de STEC, sin embargo, su importancia como agentes de enfermedades humanas an no se ha establecido (Meichtri et al., 2004). Los cueros y heces de los animales en los establecimientos de beneficio han demostrado ser los principales reservorios de este patgeno (Tutenel, Pierard, van Hoof, y De Zutter, 2003). Las tecnologas de intervencin para la reduccin de E. coli O157:H7 en las carcasas crnicas, cortes y recortes han demostrado ser eficaces en el empaquetado de carnes/industria de procesamiento (Marshall, Niebuhr, Acuff, Santa Luca, y Dickson, 2005;. Ransom et al, 2003), aunque las malas prcticas de manejo en las plantas procesadoras a menudo han dado lugar a carne y productos crnicos contaminados (Cagney et al. 2004). L. monocytogenes ha contribuido a aumentar la preocupacin sobre la seguridad alimentaria por ms de dos dcadas, especialmente con respecto a los productos listos para el consumo. La listeriosis es un patgeno de salud pblica significativo debido a su gravedad clnica y a las altas tasas de mortalidad, los brotes alrededor del mundo de origen alimentario en el que los productos crnicos fueron implicados han estado tomando lugar durante las ltimas dos dcadas (Mead et al, 2005;. Okutani, Okada, Yamamoto, y Igimi, 2004; Vaillant et al, 2005). Debido a su carcter ubicuo, L. monocytogenes puede crecer a temperaturas de entre 1 y 45 C, a pH 4.6-9.6, en presencia de altas concentraciones de sal, y puede sobrevivir adherida a los equipos de procesamiento por la formacin de biofilm, lo que podra ser una fuente potencial contaminacin (Autio et al., 1999). Varios investigadores han reportado mayor incidencia de Listeria spp. en carne molida mas que en canales o piezas de carne deshuesada. Su prevalencia, debido principalmente a la contaminacin cruzada, se ha incrementado de la granja a las plantas de procesamiento (Lin et al, 2006;. Thevenot, Dernburg, y Vernozy-Rozand, 2006). El ambiente de los establecimientos de beneficio (tablas de cortar, cuchillos y equipo) constituye la principal fuente productos crnicos contaminados con Listeria. La contaminacin de Listeria por contacto humano (manos y vestimenta de los beneficiadores), probablemente representa una parte de la contaminacin ambiental (Marzoca, Marucci, Sica, y Alvarez, 2004; Peccio, Autio, Korkeala, Rosmini, y Trevisani, 2003). Altos valores promedio de Listeria spp. y L. monocytogenes (73% y 75%, respectivamente) se han registrado en carne congelada (Hassan, Purwati, Radu, Rahim, y Rusul, 2001). Aunque se han desarrollado muchas estrategias de manejo de riesgos para el control de L. monocytogenes en los alimentos (Chen, Ross, Scott, y Gombas, 2003; y Fravalo Salvat, 2004; ILSI Research Foundation; Risk Science Institute, 2005), los datos sugieren que este patgeno no puede ser eliminado completamente del ambiente de procesamiento y de los productos alimenticios.

Especies dentro del gnero Campylobacter y Yersinia tambin han emergido como agentes patgenos de inters de salud pblica humana (Centers for Disease Control and Prevention, www.cdc.gov, 2002;. Moore et al, 2005). Campylobacter es la causa ms comn de enfermedades humanas transmitidas por los alimentos en los Estados Unidos, esto ha sido relacionado con su alto grado de virulencia y su amplia presencia en los alimentos de origen animal. Campylobacter se ha aislado de carne en la venta al por menor, lo que indica que la carne puede ser un vehculo potencial para la transmisin de este patgeno para humanos (Kramer, Frost, Bolton, y Wareing, 2000). C. jejuni se puede transferir a partir de pieles a la carne durante el beneficiado y faenado de las carcasas (Inglis, Kalischuk, Busz, y Kastelic, 2005). Incluso despus de la alta prevalencia inicial de la carcasa, el enfriamiento demostr ser un punto crtico de control eficaz para eliminar a Camplylobacter de la superficie de la canal (Pearce et al, 2003; Pezzotti et al, 2003). Una alta prevalencia de resistencia a los antimicrobianos se observ con frecuencia en las cepas de Campylobacter, siendo C. coli generalmente ms resistente que C. jejuni (Pezzotti et al. 2003). Por otra parte, Yersinia enterocolitica es frecuentemente asociada con cerdos y productos porcinos y puede transmitirse a los humanos a travs del consumo de carnes procesadas frescas, poco cocinadas o contaminadas. La prevalencia de Y. enterocolitica en piaras de cerdos ha sido reportada de estar entre el 40% y 65%, siendo importantes reservorios las amgdalas y la cavidad oral (Bhaduri, Wesley, y George W. Bush, 2005; Gurtler, Alter, Kasimir, Linnebur, y er Fehlhab, 2005). Otros patgenos que afectan la salud humana que pueden estar presentes pero permanecer indetectables en los animales sacrificados implican clostridios estreptococos, y corinebacteria. Entre estos, Clostridium perfringes es la principal causa de intoxicaciones alimentarias bacterias en los pases donde el consumo de carne y aves es alta. Las carnes de animales pueden estar sometidas a un nmero de enfermedades clostridiales y estas bacterias pueden estar presentes en sus carcasas. Las cepas enterotoxignicas de tipo A portadoras de un gen cromosomal cpe, necesario para la intoxicacin por alimentos, han sido fuertemente asociados con los brotes de intoxicacin alimentaria (Wen y McClane, 2004). En un estudio realizado en Inglaterra y Gales, el consumo de carnes rojas fue implicado en brotes infecciosos intestinales en el que C. perfringes fue el organismo mayormente reportado. Una disminucin en el nmero de casos vinculados a los alimentos que contengan carne roja est de acuerdo con la constante disminucin en el consumo de carnes rojas debido a la crisis de la EEB (Smerdon, Adak, O'Brien, Gillespie y Reacher, 2001). Despus del beneficio y el faenado de las canales, el crecimiento de bacterias depender de las condiciones de almacenamiento. Durante el almacenamiento, los factores ambientales como la temperatura, atmsfera gaseosaa y el pH de la carne seleccionarn ciertas bacterias para el crecimiento. El almacenamiento en fro de la carne reducir el crecimiento de bacterias, siendo slo 10% de las bacterias presentes inicialmente capaces de crecer a temperaturas de refrigeracin. La restriccin de oxgeno utilizando el vaco o atmsferas modificadas reduce drsticamente la presencia de Pseudomonas, mientras que la flora bacteriana ser seleccionada gradualmenta hacia los organismos tolerantes a CO2. Bajo estas condiciones, los microorganismos dominantes son Brochothrix thermosphacta, bacterias acidolcticas (BAL), principalmente Lactobacillus, Leuconostoc y Carnobacterium (Fontana, Cocconcelli, y Vignolo, 2006; Jones, 2004). Se ha reportado la presencia de Enterococcus en la carne, carcasas porcinas y de aves o carne fresca, indicando contaminacin fecal durante el beneficio. Tanto los papeles beneficiosos y perjudiciales en los alimentos se han atribuido a Enterococcus. Juegan un papel importante en el desarrollo del sabor en los quesos tradicionales y embutidos y, como probiticos, puede proporcionar importantes beneficios a la salud. Como organismos perjudiciales, han sido implicados en brotes de enfermedades transmitidas por alimentos a travs de su resistencia a antibiticos y factores de virulencia. La prevalencia de estreptococos y enterococos aislados de la cadena de produccin de instalaciones porcinas, ha sido ampliamente reportada (Houben, 2003; Rizzotti et al, 2005; Sapkota, Ojo, Roberts, y Schwab, 2006).

3. Estabilidad en almacenamiento y el efecto obstculo (Hurdle effect) en la carne fresca

La seguridad y la estabilidad microbiana, as como la calidad nutricional y sensorial de la carne y productos crnicos se basa en la aplicacin de la combinacin de factores de conservacin u obstculo. Estos factores se introdujeron empricamente en los alimentos tradicionales, mientras que para los nuevos productos alimenticios, los obstculos fueron seleccionados inteligentemente y aplicados deliberadamente (Leist-ner, 2000). La tecnologa de obstculos, derivados de la comprensin del efecto obstculo (Leistner, 1997), se refiere a la combinacin deliberada de las tcnicas de conservacin actuales (temperatura, aw, Eh, preservantes) y nuevas (empaque en gases, bacteriocinas) con el fin de establecer una serie de factores conservantes ms selectivos (obstculos) que los microorganismos de deterioro y patgenos no sean capaces de superar. La carne es un excelente sustrato para el crecimiento bacteriano, que requiere de mtodos restrictivos para evitar la contaminacin. Los factores extrnsecos, a menudo controladas para prolongar la vida til de la carne, se refieren principalmente a las condiciones de almacenamiento y condiciones de almacenamiento y pueden ser consideradas como un conjunto de obstculos aplicados para su estabilizacin. La refrigeracin postmortem de las canales de ganado son principalmente empleadas para garantizar la seguridad alimentaria y maximizar la vida til, con menos nfasis en el mantenimiento de la terneza y el color en el producto final. La temperatura baja reduce la tasa de reacciones bioqumicas y el crecimiento microbiano. Debido a que la temperatura es el factor ms importante que afecta a la microbiota de la carne, la refrigeracin de las canales ser el primer obstculo que las bacterias del deterioro tienen que superar durante el acondicionamiento de la carne. El proceso de enfriamiento luego del beneficio tiene un fuerte impacto en la calidad y palatabilidad de la carne as como sobre la tasa de aparicin de deterioro. La tasa de enfriamiento afecta solo a la microbiota bacteriana de la carne; la terneza puede ser perjudicada por el rpido enfriamiento de los msculos antes del rigor mortis. Debido a que los requisitos de calidad de las diferentes caractersticas estan a menudo en conflicto, las condiciones ptimas de enfiramiento deben ser un compromiso (Savell, Mueller, y Baird, 2005). Otro de los factores extrnsecos que es un importante obstculo selectivo que ocurre naturlamente es el CO2, que se acumula como consecuencia del crecimiento de las bacterias aerbicas. La vida til puede ser extendida por el envasado al vaco en materiales plsticos de baja permeabilidad al oxgeno. Esta caracterstica efectivamente impide la sustitucin de oxgeno consumido por la respiracin aerbica bacteriana y los tejidos y da lugar a la acumulacin de CO2. La carne almacenada en estas condiciones limita el crecimiento de Pseudomonas, B. thermosphacta y enterobacterias, siendo las BAL los microorganismos predominantes. Despus de la muerte de los animales, el glucgeno muscular se convierte en cido lctico a travs de la gliclisis y, si las reservas de glucgeno son altas, se logra un pH final de 5,4-5,6. A este pH el crecimiento de muchas bacterias de importancia en el deterioro puede ser parcial o totalmente inhibido. El valor del pH final alcanzado por la carne durante el acondicionamiento tambin se puede considerar como un obstculo para el crecimiento bacteriano. El efecto inhibidor del cido lctico en gram-negativos psicrfilos en la carne parece estar relacionado con la reduccin del pH a temperaturas de refrigeracin. Sin embargo, algunas especies de Pseudomonas son esencialmente afectadas por el pH de la carne normal y otros obstculos, tales como el envasado al vaco, se deben aplicar con el fin de inhibir su crecimiento. El antagonismo microbiano tambin se explota mediante la modificacin de las condiciones ambientales para lograr una competicin controlada y favorecer el crecimiento de organismos especficos, especialmente de BAL, de manera que se produce una secuencia predecible de bacterias. Las bacterias interactan entre s y con el medio ambiente, cada especie incrementa su biomasa a una velocidad que depende de las caractersticas fsicas y qumicas del medio ambiente. Sin embargo, el crecimiento, la muerte o la supervivencia de las bacterias asociadas a la carne, no se rige slo por estos factores. En la carne fresca refrigerada, la competencia por un crecimiento limitado a un sustrato, como glucosa y oxgeno, se produce la interaccin entre las especies (Gill, 1976). La prevalencia de algunas especies ser determinado por su nivel inicial relativo, afinidad por los sustratos, disponibilidad de sustrato, la tasa de crecimiento relativo de las especies que compiten en diferentes temperaturas, y la produccin de metabolitos antimicrobianos. Las BAL pueden producir una gran variedad de antagonistas metabolitos

primarios y secundarios que incluyen cidos orgnicos, diacetil, CO2 y bacteriocinas, que son pptidos producidos por los ribosomas activos contra los patgenos alimentarios tales como L. monocytogenes, Clostridium y otras bacterias presentes en el deterioro tales como B. Thermosphacta

4. Cultivos Bioprotectores 4.1. Bioproteccin: definicin

La conservacin de los alimentos utilizando su microflora natural y controlada y/o sus metabolitos antimicrobianos ha sido denominado bioproteccin o biopreservacin para diferenciarlo de la preservacin artificial (qumica) (Stiles, 1996). Los cultivos antagnicos aadidos a los alimentos para inhibir patgenos y/o extender la vida til sin cambiar significativamente las propiedades sensoriales son llamados cultivos protectivos (Lucke, 2000). El objetivo principal de la bioconservacin es la extensin de la vida de almacenamiento, as como la mejora de la seguridad alimentaria. Las BAL tienen un gran potencial para su uso en la biopreservacin, ya que son seguros para el consumo y, durante el almacenamiento, dominan naturalmente la microbiota de muchos alimentos. Las BAL son generalmente reconocidas como seguras (GRAS), debido a su asociacin con los fermentaciones alimentarias y su larga tradicin como las bacterias de calidad alimentaria. Adems, los pptidos antimicrobianos producidos por BAL puede romperse con facilidad por las proteasas digestivas, por lo que no producirn alteracin de la microbiota intestinal. Las BAL pueden ejercer un efecto inhibitorio o bioprotector contra otros microorganismos como resultado de la competencia por nutrientes y/o de la produccin de bacteriocinas u otros componentes antagonistas tales como los cidos orgnicos, perxido de hidrgeno y enzimas. Se puede distinguir entre cultivos iniciadores y cultivos de proteccin en los que la actividad metablica (produccin de cido, hidrlisis de protenas) y la accin antimicrobiana constituyen el objetivo principal, respectivamente. Los procesadores de alimentos se enfrentan a un reto importante con los consumidores, los cuales exigen alimentos seguros con una larga vida til, pero tambin expresando su preferencia por productos mnimamente procesados, menos severamente daados por el calor y congelacin y sin conservantes qumicos. Por lo tanto, las bacteriocinas aparecen como una opcin atractiva para proporcionar por lo menos parte de la solucin.

4.2. Antimicrobianos pptidos producidos por BAL transmitidos por la carne

La capacidad de conservacin de las BAL en los alimentos se atribuye a la produccin de metabolitos antimicrobianos como cidos orgnicos y bacteriocinas. La produccin de cido como resultado del catabolismo de hidratos de carbono es una caracterstica comn entre BAL, aunque no todos las BAL pueden producir pptidos antimicrobianos durante el crecimiento. A partir que numerosas bacteriocinas han sido aislados en las ltimas tres dcadas, la produccin de estas sustancias antagnicas parece ser un fenotipo comn entre BAL. Varan en tamao desde pequeos (<3 kDa), muchos pptidos modificados postraduccin a protenas termolbiles grandes. Las bacteriocinas producidas por BAL son un grupo heterogneo de pptidos y protenas. El ltimo esquema de clasificacin revisado los divide en dos categoras principales: los lantibiticos que contienen lantionina (clase I) y las bacteriocinas que no contienen lantionina (clase II), mientras que las grandes; hidrolasas de murena termolbiles (anteriormente la clase III de bacteriocinas) constituyen un grupo separado llamado bacteriolisinas (Cotter, Hill, & Ross, 2005). A pesar del aumento espectacular del nmero de bacteriocinas descubiertas durante las dos ltimas dcadas, la caracterizacin bioqumica y gentica slo se ha llevado a cabo en algunos de ellos. La presente descripcin se centrar principalmente en las bacteriocinas producidas por BAL asociadas a la carne y productos crnicos. Las bacteriocinas lactococales son producidas por varias especies de Lactococcus lactis aislado de los productos lcteos, vegetales y productos crnicos (Guinane, Cotter, Hill, & Ross, 2005; Dos-mey, Ross,

Ryan, Meaney, y Hill, 2002). En condiciones favorables la nisina tiene un amplio espectro de inhibicin frente a microorganismos gram-positivos. Ha sido ampliamente caracterizado, la estructura precisa de su molcula y su mecanismo de accin (Cotter et al., 2005). A pesar que la nisina es el nico lantibiotico comercialmente explotado hasta la fecha, se estn realizando esfuerzos para desarrollar aplicaciones para otros lantibiticos. La lacticina 3147, un lantibiotico de dos pptidos producido por L. lactis subsp. lactis DPC3147 aislado de granos de kfir irlands, presenta un modo de accin bactericida contra el deterioro de los alimentos y las bacterias patgenas (Ryan, Rea, Hill, & Ross, 1996). La alta estabilidad al calor y la amplia gama de pH de la lacticina 3147, la hacen atractiva para su uso en la industria alimentaria. Aunque la mayora de las bacteriocinas lactococales fueron aisladas de productos lcteos y vegetales, varias cepas de L. lactis productoras de nisina fueron aisladas de embutidos fermentados, lo cual indica el uso potencial de lactococos en la fermentacin de la carne. Las cepas de L. lactis productoras de nisina de embutidos fermentados espaoles (Rodrguez et al., 1995) y de los embutidos fermentados tradicionales de Tailandia (Noonpakdee, Santivarangkna, Jumriangrit, Sonomoto, y Panyim, 2003) fueron eficaces en la inhibicin de BAL cercanamente relacionados, L. monocytogenes, C. perfringes, Bacillus cereus y S. aureus. Por otra parte, el Lactobacillus sakei L45 aislado de embutidos secos noruegos y Lb. sakei 148 del embutidos fermentados espaoles secretan lactocina S, un lantibiotico cuyo espectro de actividad moderada comprende BAL y Clostridium (Aymerich, Hugas, y Monfort, 1998). La abundancia de las cepas de BAL productoras de bacteriocinas lantibioticas evidencia la importancia de estas sustancias en los productos fermentados. Estas bacteriocinas estn presentes en diversos productos y entornos geogrficos. Las bacteriocinas de Clase II incluyen un grupo muy grande de pequeos pptidos (<10 kDa) estables al calor, las cuales - a diferencia de los lantibiticos - son bacteriocinas no modificadas. Se ha sugerido recientemente cuatro grupos diferentes (Cotter et al, 2005.): clase IIa que incluye bacteriocinas similares a la pediocina (tipo pediocina), la clase IIb que incluye bacteriocinas de dos pptidos, clase IIc que incluye bacteriocinas cclicas y la clase IId que incluye pptidos lineales simples no similares a la pediocina. La clase IIa de bacteriocinas tienen un estrecho espectro de actividad, pero muestran un alta actividad especfica contra L. monocytogenes. Las bacteriocinas tipo pediocina pueden ser consideradas como el subgrupo principal entre los pptidos no lantibioticos, no slo debido a su gran nmero, sino tambin debido a su significativa actividad biolgica y posibles aplicaciones. Los pptidos tipo pediocina contienen entre 37 y 48 residuos de aminocidos, que son involucrados en la regin N- terminal del patrn conservado caja pediocina. El dominio C-terminal es menos conservado y se piensa que determinan el espectro antimicrobiano no listerial. De acuerdo a las diferencias en el C-terminal, las bacteriocinas de clase IIa se pueden agrupar en tres subgrupos. Las bacteriocinas que se ajusten a estos grupos incluyen pediocina PA-1/AcH, sakacin P y enterocina A (subgrupo 1); leucocin A y mesentericina Y105 (subgrupo 2), y curvacina A y carnobacteriocina B2 (subgrupo 3) (Fimland, Johnsen, Dal-marido, y Nissen-Meyer, 2005). La Pediocina PA-1 es producida por Pediococcus acidilactici aislado de americanos y Pediococcus pentosaceous Z102 de embutidos espaoles. La sakacin A es producida por dos diferentes cepas de Lb. sakei (Lb706 y CTC494) y Lactobacillus curvatus LTH1174 aisladas de embutidos fermentados. La enterocina A es producida por Entrococcus faecium CTC492 aisladas de embutidos secos fermentados espaoles. Estas tres bacteriocinas son activos frente a otras BAL, L. monocytogenes y Clostridium (Aymerich et al., 1998). Adems, Lc. gelidum y Lc. mesenteroides aislado de carne empaquetada al vaco fro y almacenada en congealimento, secretan leucocina A y mesentericina Y105, respectivamente, las cuales son inhibidores contra BAL, L. monocytogenes y Enterococcus faecalis (Hechard y Sahl, 2002). Por otra parte, Carnobacterium piscicola LV17B aislada de carne envasada al vaco produce dos bacteriocinas, carnobacteriocina B1 y B2, que son muy eficaces contra L. monocytogenes y otras BAL (Quadri, veleros, Roy, Vederas, y Stiles, 1994). La Lc. mesenteroides L124 y Lb. curvatus L442 aisladas a partir de embutidos secos fermentados tambin muestran una fuerte actividad antilisterial (Mataragas, Metaxopoulos & Drosinos, 2002). Debido a su alto potencial antilisterial, estas BAL productoras de bacteriocinas son de considerable inters como cultivos bioconservante.

Las bacteriocinas de dos pptidos (clase IIb) requieren la actividad combinada de ambos pptidos para ejercer su actividad antimicrobiana. Cada pptido muestra muy baja actividad, cuando son evaluados individualmente, la mayora de estas bacteriocinas requieren una relacin pptido 1:1 para tener un efecto bactericida ptimo (Garneau, Martin, y Vederas, 2002). La lactococcina G y lactacina F producida por L. lactis y Lb. johnsonii, respectivamente, fueron aisladas y caracterizadas en la dcada de 1990. Estas bacteriocinas de origen lcteo son las primeras bacteriocinas reportadas de dos pptidos con un estrecho espectro de inhibicin contra otros lactobacilos, E. faecalis y Clostriduim. Los mejores sistemas caracterizados de dos pptidos son plantaricinas EF/JK y plantaricina S producida por Lb. plantarum C11 y LPCO10 respectivamente, de origen vegetal (Anderssen, Diep, Nes, Eijsink, y Nissen-Meyer, 1998;. Daz Jimnez et al, 1995). Por otra parte, la lactocina 705 secretada por Lb. curvatus CRL705 (antes Lb. Casei), aisladas de embutidos fermentados argentinos, es la primera bacteriocina reportada de dos pptidos de una cepa asociada a la carne. La lactocin 705 demostr ser antagnica hacia otros BAL y B. thermosphacta cuando se ensay en sistemas de carne (Castellano, Holzapfel, y Vignolo, 2004; Castellano y Vignolo, 2006). Las bacteriocinas de clase IIc comprenden algunos ejemplos de los pptidos ciclicos mientras que la clase IId incluye el resto de sustancias antimicrobianas aisladas. Las bacteriocinas de la clase I y II se encuentran entre los mejores pptidos antimicrobianos bioqumica y genticamente caracterizados y los ms probables a ser utilizados en aplicaciones de alimentos debido a su especifidad (Tabla 1).

5. Bioproteccin aplicarda a la carne fresca 5.1. Sistemas para la distribucin de carne al por menor
El envo de productos crnicos procedentes del hemisferio sur (productores de carne) a los pases consumidores del norte se inici a fines del siglo 19 despus de la aparicin de la refrigeracin. En ese momento, todos los productos crnicos se congelaban antes de su envo y se mantienian a 10 C o menos durante el transporte. El comercio de los cuartos de res de Argentina a Europa se inici en la dcada de 1930 beneficiado por los altos precios de los productos refrigerados, ya que estos cuartos bovinos se mantenian en 1 a 2 C, durante un viaje de 15 das. Ms adelante, en la dcada de 1950, un comercio similar se inici en Australia usando atmsferas controladas, en cubiertas a prueba de gas debido al largo viaje. La dcada de 1960 fue testigo del desarrollo del comercio de cortes de carne envasados al vaco, en donde se llev a cabo el deshuesado y el procesado al por menor antes de su envo. Hoy en da, el comercio de carne en todo el mundo se lleva a cabo en el envasado al vaco y atmsferas controladas. La evolucin del comercio de la carne fresca se basa en la baja temperatura y el envasado en atmsferas modificadoas como los obstculos ms importantes para la extensin de la vida til. El crecimiento de BAL en la carne se considera una ferementacin oculta ya que, debido al bajo contenido de hidratos de carbono y la fuerte capacidad tampn de la carne, estas bacterias no producen un cambio dramtico en las caractersticas sensoriales en comparacin a los cambios que tienen lugar en la fermentacin de la leche y vegetales. Dado que la carne fresca no es pasteurizada antes de la adicin de cultivos de laboratorio, el cultivo bioconservante debe competir con la microbiota natural presente en la carne. Es bien sabido que la microbiologa de las canales de carne es altamente dependiente de las condiciones en las que los animales fueron criados, sacrificados y procesados. La higiene durante el sacrificio y el faenado de las canales, junto con el enfriamiento rpido y adecuado es de gran importancia para evaluar la calidad y seguridad de la carne. Las tecnologas de intervencin para reducir la carga bacteriana en las carcasas crnicas y recortes han demostrado ser muy eficaces. Sin embargo, la refrigeracin es esencial para la preservacin adecuada de la carne, la temperatura es el factor extrinseco ms importante que influye en la vida de almacenamiento de carnes frescas. Cuando la carne fresca es envasada al vaco en pelculas plsticas de baja permeabilidad a los gases y se almacenan a bajas temperaturas, su vida til es mucho mayor. A pesar que las tecnologas de vaco y atmsferas modificadas han demostrado ser vulnerables desde un punto de vista de seguridad, la concentracin de CO2 en el paquete es crtico para la inhibicin microbiana

(Farber, 1991; Phillips, 1996). Para un efecto antimicrobiano mximo, la temperatura de conservacin de un producto envasado en atmsfera modificada (MAP) debe mantenerse lo ms bajo posible, ya que se produce una dramtica disminucin de la solubilidad del CO2 cuando se aumenta la temperatura. En estas condiciones, los organismos de descomposicin aerbicos, que suelen advertir a los consumidores contra el deterioro, se inhiben, a medida que el crecimiento de patgenos pueda ser permitido o incluso estimulado. En el pasado la mayor preocupacin estaba relacionada con patogenos anaerbicos, en especial los psicrotrofos, clostridios no protelticos. Sin embargo, los patgenos psicrotrofos emergentes como L. monocytogenes y las gram-negativas Y. enterocoltica y Aeromonas hydroophila pueden crecer en estas condiciones (Iglesia y Parsons, 1995; Farber, 1991). La vida til extendida de muchos productos MAP permite ms tiempo para que estos patgenos alcancen peligrosamente niveles altos en los alimentos. Un obstculo adicional para reducir el riesgo de L. monocytogenes sera el uso de cultivos iniciadores competitivos productores de bacteriocinas referidos como cultivos bioprotectores. Adems, las estrategias para superar la barrera presentada por la membrana externa de bacterias gram-negativas, como el uso de agentes quelantes mejorar la eficiencia de las bacteriocinas.

5.2. Lb. curvatus CRL705 como una cepa bacteriocinognica

Lb. curvatus CRL705 (previamente identificadas como L. casei CRL705) aislada de embutidos argentinos artesanales (Vignolo, Suriani, Holgado, y Oliver, 1993) produce lactocina 705 y lactocin AL705; una bacteriocina de dos pptidos (clase IIb) y una de tipo pediocina (IIa), respectivamente. La lactocina 705 es una bacteriocina cuya actividad depende de la accin complementaria de dos pptidos (lac705a y lac705b) de 33 residuos de aminocidos cada uno. Los genes estructurales de esta bacteriocina no lantibiotica asociada con un plsmido de aproximadamente 18.6 kb codifica los precursores de dos protenas, lactocin 705A y lactocin 705B (Cuozzo, Sesma, Palacios, R. Holgado, y Raya, 2000). La accin bactericida de esta bacteriocina de dos componentes se basa en la accin complementaria de dos pptidos que formarn complejos de poracin en la membrana citoplasmtica, con lo que disipa gradientes inicos, resultando en la inhibicin del crecimiento de microorganismos diana. Estos eventos estn fuertemente estimulados en presencia de glucosa y negativamente afectados por iones Ca2+; por lo tanto, estos componentes junto con otros parmetros de los alimentos pueden tener una influencia significativa sobre la actividad de bacteriocinas (Castellano, Raya, y Vignolo, 2003). Cuando se estudi los roles diferenciales de los dos pptidos de la lactocina 705 en la actividad antimicrobiana, se encontr una ptima relacin de pptidos lac705/ lac705 (Cuozzo, castellano-o, Sesma, Vignolo, y Raya, 2003). Utilizando la espectroscopia infrarroja de transfomada de Fourier, se demostr un mecanismo de accin en los lac705 el cual induce la deshidratacin de la regin bicapa interfacial, mientras que el pptido lac705 se inserta en la regin hidrofbica formando un oligmero transmembrana (Castellano, Vignolo, Far'as, Arrondo, y Che'n, 2007). La lactocin 705 result ser activa contra las BAL cercanamente relacinadas y B. thermosphacta, per a medida que el sobrenadante de Lb. curvatus CRL705 tambin inhibia la proliferacin de L. monocytogenes, se asumi a produccin de ms de una bacteriocina. De hecho, estudios genticos (datos no publicados), as como ensayos de caldo de carne y pasta (Castellano y Vignolo, 2006;. Castellano et al, 2004) demostraron la existencia de un segunda substancia inhibidora, una bacteriocina contra Listeria (lactocina AL705).

5.3. Inhibicin de Listeria y otras BAL en caldo y en un sistema de carne incubados a 4 y 8 C

La produccin de una bacteriocina en un medio de laboratorio no implica su eficacia en un sistema alimentario. Al evaluar un cultivo bacteriocinognico, hay que tener en cuenta el hecho de que la carne y productos crnicos son sistemas complejos con un nmero de factores que influyen en el crecimiento bacteriano y la produccin de metabolitos. Por lo tanto, la influencia de la composicin de los alimentos y

los parmetros tecnolgicos en el rendimiento de los cultivos bacteriocinognicos en biopre utilizados en la bioconservacin necesita ser probado. Para evaluar la actividad antimicrobiana de las cepas bacteriocinognicas de Lb. curvatus CRL705 en la carne fresca, se llevaron a cabo estudios previos en caldo MRS y en una mezcla de carne. La inoculacin de caldo MRS con L. monocytogenes (4x103 UFC ml1 ) y Lb. curvatus CRL705 (5x107 UFC ml-1) dio lugar a una rpida disminucin de la poblacin de clulas viables de Listeria cuando se incub a 20 C por 24 h (Fig. 1). Cuando Lb. curvatus CRL705 Bac (una variante negativa de la bacteriocina CRL705 con la misma tasa de crecimiento y produccin de cido como la cepa de tipo salvaje) fue utilizado, el crecimiento de L. monocytogenes no se vio afectado, llegando a casi la misma densidad celular como en la ausencia de la cepas bacteriocinogenicas, lo cual indica que la Lb. curvatus CRL705 productora de bacteriocina fue el responsable de la eliminacin de la Listeria. La actividad de la bacteriocina producida alcanz un valor mximo (1100 AU ml-1) a las 12 h, al mismo tiempo que el bajo nmero de clulas de Listeria observado en este momento (Vignolo, Cuozzo, Kairuz, Holgado, Y Oliver, 1996a). Una carne procesada fue elegido como un sistema modelo para estudiar el efecto sobre L. monocytogenes de la cepa bacteriocinognica Lb. curvatus CRL705, as como la bacteriocina producida contra Listeria, lactocina AL705. La eficacia de lactocina AL705 en el crecimiento de este patgeno en la carne procesada a 20 C dependa de las concentraciones de ambos, bacteriocina y bacterias. La inhibicin de L. monocytogenes en el mezcla de carne fue mayor con altos niveles de lactocina AL705 y pocos nmeros iniciales de celulas del patgeno (Vignolo, Fadda, Kairuz, Holgado, y Oliver, 1996b). Estos datos sealan la importancia de mantener altas los estndares de higiene durante el proceso de la carne junto a un saneamiento estricto. A partir de que las bacteriocinas no pueden ser consideradas como inhibidores por s mismos, estas actan sinrgicamente como un obstculo ms con otros mtodos de conservacin, en los cuales los efectos combinados de pH, temperatura y disponibilidad de oxgeno son estudiados en conjunto con el aadido de BAL bacteriocinognicas o sus bacteriocinas. Las carnes procesadas inoculadas con L. monocytogenes mostraron un rpido crecimiento del patgeno, aumento en el nmero de clulas viables de 3x103 a 8x107 UFC ml-1 en un plazo de 24 horas a 20 C. Sin embargo, en presencia de las cepas bacteriocinognicas, la viabilidad de Listeria se mantuvo ms o menos constante en 103 UFC ml-1 a lo largo de la incubacin (Fig. 2). Varios factores en el sistema de modelo de alimentos pueden interferir con la actividad de la bacteriocina; la lactocina AL705 puede ser inactivada por las proteasas endgenas de la carne y unirse a la carne o partculas de grasa. Cuando las carnes procesadas se autoclavaron antes de la inoculacin, se observ una reduccin de L. monocytogenes en alrededor de 2 log en la concentracin mxima de bacteriocina utilizada (16 800 AU ml-1) (Fig. 3). Este hecho puede explicarse por la inactivacin trmica de las proteasas presentes en carnes frescas, que producen una degradacin de las bacteriocinas y as poner en peligro su eficacia. Se produjeron cantidades suficientes de bacteriocinas por Lb. curvatus CRL705 para suprimir el crecimiento de L. monocytogenes en una carne procesada. Se demostr que el efecto listeriostatico era debido a la bacteriocina producida, ya que la carne procesada inoculada con la variante Bac no fue capaz de disminuir los conteos de Listeria en la misma medida que las cepas bacteriocinognicas lo hicieron. A partir de estos resultados, se puede suponer que Lb. curvatus CRL705 puede ser utilizada como cultivo bioconservante en la carne (Vignolo et al., 1996a, 1996b). Desde el punto de vista de aplicacin, el uso de cepas de BAL bacteriocinognicas como cultivos bioprotectores para la conservacin de la carne comercial sera ms factible ya que la nisina es actualmente la nica bacteriocina aprobada para su uso en alimentos. En consecuencia, se evalu el efecto de la cepa Lb. curvatus CRL705 productora de bacteriocinas sobre el control de Listeria innocua 7 y Lb. sakei CRL1424 en medio MRS y de la carne procesada durante el almacenamiento al vaco a temperatura de congelacin. La Lb. sakei CRL1424, aislada de carne fresca en mal estado envasada al vaco como especie deteriorativa dominante de la microbiota indgena, fue identificada por el ADNr 16S (Nmero de acceso AY323236) y se utiliz como un organismo de deterioro. La L. innocua 7 fue utilizada como un patgeno modelo debido a su similar tasa de crecimiento a temperaturas de refrigeracin y la sensibilidad a lactocina AL705 en comparacin con L. monocytogenes (Cuadro 2).

La actividad de las bacteriocinas se encontr que era similar contra ambas cepas de Listeria (300 AU ml-1) (Castellano et al., 2004). La Lb. sakei CRL1424 y L. innocua 7 se cultivaron al vaco en caldo MRS coinoculados con Lb. curvatus CRL705 productor de bacteriocinas a 8 y 4 C, causando inhibicin de crecimiento de ambas cepas durante 14 das de incubacin. A 8 C, se observ una disminucin en su poblacin en el momento en que se detectaron actividades antimicrobianas por primera vez en el sobrenadante. Los recuentos celulares de Lb. sakei CRL1424 se redujeron a niveles indetectables despus de 10 das de incubacin, mientras que L. innocua 7 se inhibi completamente despus de 4 das a 8 C. La actividad de lactocina 705 alcanz valores mximos (2130 AU ml-1) despus de 10 das en coincidencia con la inhibicin total de Lb. sakei CRL1424. Por otra parte, la lactocina AL705, una bacteriocina anti-Listeria producida tambin por Lb. curvatus CRL705, mostr que la actividad mxima (400 AU ml-1) despus de 8 das, posteriormente L. innocua 7 fue completamente inhibida (Fig. 4). Cuando se condujo el mismo experimento en caldo MRS a 4 C, se produjo una inhibicin completa de la cepa CRL1424 y L. innocua 7 despus de 14 y 8 das, respectivamente, en el momento en que la lactocina 705 alcanz un valor de actividad de 690 AU ml-1 y la bacteriocina anti-Listeria (AL705) tena una actividad de 90 AU ml-1 (Fig. 5). Estos datos confirman que las cepas bacteriocinognicas crecen rpidamente y producen una cantidad suficiente de bacteriocinas para inhibir las cepas de deterioro BAL y Listeria en caldo MRS, a 4 y 8 C (Castellano et al., 2004). El efecto de ambas sustancias antimicrobianas producidas por L. curvatus CRL705 en una carne procesada mostr ser menos pronunciado cuando se incub durante 21 das al vaco a 4 C (Fig. 6). Cuando se evalu con L. innocua, se produjo un aumento de su poblacin durante los primeros 4 das en coincidencia con una fase de latencia de la cepa bacteriocinognica y un retraso en la produccin de lactocina AL705, siendo este efecto listeriostatico despus de este tiempo. Por el contrario, Lb sakei CRL1424 disminuyo su poblacin en 1,65 log ciclos despus de 21 das de almacenamiento en las mismas condiciones, siendo este efecto paralelo a la produccin de lactocina 705 en la carne procesada durante este perodo. Sin embargo, en las actividades bacteriocina de la carne procesada mostraron valores ms bajos que en caldo MRS, esto se explica por el hecho de que los alimentos proteicos no estaran libres de los factores que interfieren, tales como grasa alta y contenido de slidos. Aunque el uso de BAL psicrotrofas bacteriocinognicas de origen crnico tiene un mayor potencial de sus bacteriocinas para inhibir los contaminantes y organismos patgenos en la carne, el efecto de la carne ambiental en la actividad tambin debe ser considerado. Adems, no se observ diferencia significativa en la reduccin del crecimiento de ambos, Lb. sakei y L. innocua, en co-cultivos con la cepa bacteriocinognica (CRL1424+CRL705 y Listeria 7+CRL705) cuando se compararon a los cultivos combinados (CRL1424 Listeria + 7 + CRL705). Este efecto puede explicarse por la accin selectiva de cada bacteriocina produ-cida por Lb. CRL705 curvatus, ya que pertenecen a clases diferentes y tienen diferentes organismos de destino. Ambas bacteriocinas, lactocina 705 y lactocina AL705, actuan hacia Lb. sakei CRl1424 o L. innocua 7 independientemente si son o no son producidos en cooperacin con los cocultivos de dos o tres cepas (Castel-lano et al., 2004).

5.4.

Control

de

Listeria,

Brochothrix

thermosphacta

BAL

indgenas en la carne fresca envasada al vaco almacenada a 2 C

Se inocularon discos de carne fresca bovina con una cultivo vivo de Lb. curvatus CRL705, as como lactocina 705 y lactocina AL705 y envasados al vaco almacenados a 2 C durante 36 das. Cuando el crecimiento de la microbiota psicrfila natural presente en la carne fue evaluada en ausencia y presencia de lactocina 705, se obtuvo un conteo final de celulas de 5x106 UFC cm-2 y 5x104 UFC cm-2 despus de 36 das, respectivamente, mostrando una reduccin de 2 log en la carne (Fig. 7a). Por otra parte, Lb. curvatus CRL705 utilizado como cultivo bioprotector y la lactocina 705 mostraron ser igualmente eficaces en la prevencin del crecimiento de L. innocua en los discos de carne durante todo el perodo de almacenamiento (Fig. 7b), mientras que B. thermosphacta experiment un reduccin del 1,5 log despus de la adicin de cualquiera de los cultivos protectores o lactocina 705 (fig. 7c). Un efecto similar

listeriostatico fue reportado por Katla et al. (2002) al comparar la actividad anti-Listeria de sakacina P y la cepa Lb. sakei productora de sakacina de embutidos de pollo. Adems, Hugas, Pages, Garriga, y Monfort (1998), trabajando en productos de carne fresca envasados al vaco, tambin encontr que Lb. sakei CTC494 y la bacteriocina producida, sakacin K, ejerce un efecto bacteriosttico sobre Listeria. Por otro lado, Jacobsen, Budde, y Koch (2003) demostraron que las clulas vivas de Lc. carnosum 4010 fueron ms efectivas que las leucocinas solo en la inhibicin del crecimiento de L. monocytogenes en productos crnicos cortados. En contraste, la adicin de E. faecium CTC492 a las salchichas y hamburguesas fermentadas no ejerci un efecto positivo contra Listeria en comparacin con los lotes tratados con enterocinas A y B, siendo este atribuido a una alta inhibicin de la cepa productora por temperaturas de refrigeracin y los ingredientes de embutidos (Aymerich et al., 2000). Adems, la poblacin de B. thermosphacta tambin se redujo por Lc. mesenteroides L124 y Lb. curvatus L442 o sus bacteriocinas aadidas a los productos crnicos cocidos-curados al vaco o MAP a 4 C. Por otra parte, el control de BAL indgenas en la carne proporciono una extensin de la vida til sin necesidad de comprometer la seguridad microbiolgica del producto. Se demostr que la microbiota psicrfil creci a una tasa ms alta en ausencia de bacteriocinas en comparacin con los discos de carne tratados con lactocina 705. Como parte del crecimiento natural de BAL fue suprimido, la adicin de un cultivo bioprotector seleccionado podra ser una forma efectiva de controlar los cambios organolpticos indeseables en carnes envasadas al vaco. Tambin se report que otras cepas bacteriocinognicas controlan la microbiota natural de BAL como L. lactis productora de lacticina 3147 en embustidos frescos de cerdo (Scannell, Ross, Colina, y Arendt, 2000) y Lb. sakei TH1 durante la produccin comercial de productos crnicos cocidos (Bredholt, Nesbakken, y Holck, 2001). La actividad antibacteriana se detect en los discos de la carne durante 36 das cuando se agreg Lb. curvatus CRL705, lactocina 705 o lactocina AL705 y se mantuvo estable durante todo el perodo de almacenamiento. La baja actividad de bacteriocinas se detect durante las primeras dos semanas en presencia de cultivos bioprotectores, posiblemente debido a su adaptacin al crecimiento en el sustrato de carne y las bajas temperaturas (Castellano y Vignolo, 2006).

5.5. Influencia del cultivo bioprotector sobre los cambios sensoriales en la carne
Las BAL son los principales organismos de putrefaccin/deterioro que se desarrollan en diversos tipos de carnes envasadas al vaco refrigeradas, las principales cepas pertenecen a Lactobacillus, Leuconostoc, Weisella y Carnobacterium. En estos productos, las BAL inducen cambios sensoriales tpicos, tales como acidificacin, gas, SH2 y formacin de una sustancia pegajosa, resultando en grandes prdidas econmicas en la industria. Sin embargo, el uso de determinadas cepas de BAL como cultivos bioprotectores para extender la vida til de carnes frescas envasadas al vaco y almacenadas en congelamiento implica el crecimiento y la produccin de cido de las cepas bacteriocinognicas en la carne. Los defectos organolpticos relacionados con la produccin de cido lctico seran percibidos por los consumidores como olor a cortado o a queso y/o sin gusto. Se compararon los valores finales de pH como resultado del crecimiento de Lb. curvatus CRL705 bacteriocinognicas en caldo MRS y carne cortada (Tabla 3). El MRS incubado a 4 y 8 C durante 14 das al vaco mostr reducciones de pH de 6,20 a 5,54 y 6,20 a 4,23, respectivamente. Sin embargo, los cambios de pH producidos por Lb. curvatus CRL705 en la carne cortada incubada a 4 C no fueron significativamente diferentes en comparacin con el control, siendo su disminucin total 0,37 unidades despus de 21 das de almacenamiento al vaco. Cuando el cultivo protector se inocul en los discos de carne envasados al vaco y almacenados a 2 C durante 36 das, el valor de pH de los discos de carne inoculados (5.48) fue significativamente diferente del control (5,50). Esta pequea disminucin del pH se puede atribuir a la capacidad tampn de la carne y la contribucin potencial de Lb. curvatus CRL705 en la ruptura de protenas de la carne (Sanz et al., 1999). Esta actividad proteolitica sera responsable de la generacin de compuestos bsicos que en parte neutralizan el cido producido y evitan una acidificacin excesiva de la carne. Adems de una acidificacin suave, un cultivo bioprotector que se utilizar para ampliar la vida til de la carne fresca tampoco deberia ser un productor que forma gas o exopolisacridos

para evitar as el abultamiento en los paquetes, debido a la acumulacin de gases y formacin de sustancias pegajosas en la superficie de la carne. Lb. curvatus CRL705 demostr ser capaz de crecer y producir bacteriocinas en carne fresca envasada al vaco almacenada a temperaturas de refrigeracin (2-8 C), con un mnimo efecto sobre las caractersticas sensoriales de la carne. Para cumplir con los requisitos industriales, un cultivo protector debe ser fcil de cultivar, fcil de aplicar a la carne y con un resultado fiable y reproducible. El cultivo tambin debe estar bien adaptado para crecer en el producto, sobrevivir a lo largo de su almacenamiento, competir con las altas cargas microbianas indgenas de la carne fresca, inhibir activavemente las bacterias patgenas y de deterioro, y no alterar las propiedades sensoriales de la carne, excepto bajo condiciones de exceso de temperatura. Ms an, el uso de cultivos bioprotectores en la carne fresca refrigerada envasada al vaco sera ms factible desde el punto de vista econmico - y sin restricciones legales - en comparacin con la adicin de bacteriocinas producidas.

6. Vencer la resistencia de Gram-negativas a bacteriocinas de BAL

Los mtodos para reducir sustancialmente o inhibir las bacterias gram-negativas por compuestos de calidad alimentaria son de considerable inters para la industria alimentaria, ya que existe preocupacion en la salud pblica y economa. En la proteccin de los alimentos, los organismos gram-negativos de deterioro y agentes patgenos son especialmente problemticas debido a su resistencia inherente a algunos agentes antimicrobianos que se aplican o estn presentes en alimentos tales como las bacteriocinas. Aunque los lantibiticos tienen un mayor espectro de inhibicin que los no lantibiticos, ninguna de las bacteriocinas producidas por BAL fueron efectivas en la muerte de bacterias gramnegativas. Esta incapacidad se debe a la membrana externa protectora que cubre la membrana citoplasmtica y la capa de peptidoglucano de las clulas. Esta membrana asimtrica contiene molculas de glicerofosfolpidos y lipopolisacridos (LPS) las cuales participan en el anclaje de los cationes bivalentes. El tratamiento con agentes quelantes de metales, tales como EDTA, generalmente resulta en la eliminacin por quelacin de cationes bivalentes con una consiguiente perturbacin de la membrana externa (Alakomi, Saarela, y Helander, 2003). El cido lctico y sus sales tambin son potentes agentes desintegradores de la membrana externa, como lo demuestra su capacidad para provocar una lieberacin de LPS. Estos permeabilizadores aumentan la susceptibilidad a las sustancias hidrofbicas, tales como las bacteriocinas, por lo que les permite penetrar la pared celular. En consecuencia, los permeabilizadores de calidad alimentario en combinacin con bacteriocinas seran efectivos como parte del concepto de obstculo en la inhibicin de las bacterias Gram-negativas. Se han examinado varios quelantes de calidad alimentaria (citrato, fosfato, EDTA, hexametafosfato) por su capacidad para superar la barrera de penetracin de Salmonella enterica y E. coli, volviendo a estas especies sensibles a los antibiticos hidrfobos. Se ha llevado a cabo la reduccin de dos cepas de E. coli luego del tratamiento con bacteriocinas de BAL y quelantes en medio TSB a 21 y 6 C (Belfiore, Castellano, y Vignolo, 2007). El tratamiento con EDTA (500 y 1000 milmetros) y lactato de sodio (800 mM) por s solos producen un efecto variable dependiendo de la cepa, siendo el lactato de Na inhibitorio en contra de E. coli NCTC12900 a ambas temperaturas ensayadas, mientras que el EDTA (1000 milmetros) llev a su inactivacin slo a 6 C. Cuando se analiz la adicin directa y diferida de bacteriocinas y quelantes, los primeros mostraron no ser tan eficaz como el ltimo. La adicin diferida del quelante y las bacteriocinas producidas por Lb. curvatus CRL705, lactocina 705/AL705, demostr tener un mayor efecto inhibidor sobre cepas de E. coli en comparacin con la combinacin de quelantes y nisina producida por L. lactis CRL1109 a 6 C (Tabla 4). Sin embargo, los tratamientos combinados fueron altamente dependientes de la sensibilidad de E. coli. Un efecto protector sobre cepas de E. coli se observ cuando se aadi lactato en combinacin con bacteriocinas, este efecto se explica por los iones Mn+2 y Mg+2 del medio de cultivo, que estaran ligados al agente quelante sin afectar la capa de LPS en la membrana externa de las clulas de E. coli. Resultados similares fueron reportados por Cutter y Siragusa (1995), quienes encontraron una disminucin en la inhibicin de E. coli y Salmonella typhimurium cuando se agreg Mg y Ca a los buffers que contenan nisina. Cuando se estudi la capacidad de los quelantes y nisina generados in situ para inhibir e inactivar

bacterias Gram-negativas, se encontr que E. coli era ms sensible que las salmonelas, pero las Pseudomonas mostraron mayor sensibilidad (Bozi-Aris y Adams, 1999). Por otra parte, el espectro de actividad de la nisina puede extenderse a una variedad de agentes patgenos, incluyendo bacterias gramnegativas, cuando se usa junto con las enzimas de calidad alimentaria, tales como la lisozima o el sistema lactoperoxidasa en combinacin con tratamientos fsicos (Elliot, McLay, Kennedy, y Simmonds, 2004; Nattress & Baker, 2003). Tambin se estudi la eficacia de la alta presin hidrosttica para inducir lesiones sub-letales a las clulas bacterianas vivas transmitidas por alimentos en combinacin con diferentes bacteriocinas (Aymerich, Jofre, Garriga, y Hugas, 2005).

7. Conclusiones
Hoy en da, los consumidores estn muy preocupados por la relacin entre la alimentacin y salud. El uso de aditivos alimentarios se considera como natural e inseguro. Sin embargo, los aditivos son necesarios para preservar los alimentos del deterioro y para mejorar las propiedades organolpticas. La demanda de una reduccin del uso de aditivos y procesamientos parece contradictoria para un mercado que pide alimentos ms seguros y sabrosos. Estas demandas del mercado colocan a la industria de alimentos bajo una presin de bsqueda de soluciones innovadoras. En particular, la carne y productos crnicos enfrentan el desafo de superar la falta de confianza de los consumidores que surgi durante la ltima dcada debido al brote de la EEB, as como a los brotes de enfermedades transmitidas por alimentos causadas por patgenos emergentes. Las nuevas ideas sobre el metabolismo de BAL ofrecen perspectivas para la aplicacin de una nueva generacin de cultivos funcionales. Se estn desarrollando nuevos cultivos BAL iniciadores con una funcionalidad industrial importante, sobre todo contribuyendo a la seguridad microbiana u ofreciendo una o ms ventajas sensoriales, tecnolgicas, nutricionales o salubres. El uso de BAL competitivas bacteriocinognicas como cultivos bioprotectora puede as proporcionar al menos una parte de la solucin. Sin embargo, la aplicacin de la tecnologa de bioconservacin de carnes y productos crnicos debe ser considerada slo como un obstculo adicional al proceso de fabricacin y las prcticas de distribucin. Los pronsticos son excelentes para todas las especies de carne y, en particular para la carne bovina y Argentina, como productor histrico de carne, tiene grandes oportunidades en el marco de un comercio mundial creciente y una poblacin cada vez mayor.