ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGA

PRCTICA N 02
Recuento total de microorganismo
Mtodo de Breed
ASIGNATURA :

Microbiologa de los Alimentos I

DOCENTE :

Dra. Graciela Albino Cornejo

ALUMNO :

Rmulo Aycachi Inga

CICLO :

2007 - II

Lambayeque, 28 de enero de 2008.

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 PRCTICA N 02
RECUENTO MICROSCOPICO DIRECTO POR
EL METODO DE BREED
I. Introduccin:

Los recuentos microscpicos directos permiten determinar el nmero de clulas

microbianas, por observacin directa en el microscopio. Presentan una gran ventaja ya
que la muestra puede utilizarse tal cual, (si es lquida como leche o cultivos puros en
medio lquido), o puede prepararse una dilucin tal como se realiza para otros mtodos
de recuento.
Se basa en contar m.o. en una cantidad conocida de muestra utilizando frotis
coloreados, cmaras del tipo de las de contar glbulos, o las especialmente diseadas
para contar hongos en alimentos como la cmara de Howard.
Se determina el nmero TOTAL de clulas presentes (VIABLES Y NO VIABLES)
Ocasionalmente se pueden utilizar colorantes que indiquen diferentes estados
metablicos de las clulas. Por ejemplo en un recuento en cmara de un cultivo de
levaduras con azul de metileno, se pueden distinguir las clulas VIABLES (no absorben
el colorante, se vern transparentes) de las NO VIABLES (absorben el colorante y se
vern azules).
El mtodo de Breed es un mtodo de recuento directo bastante simple, fcil y eficaz a
pesar de ser un mtodo antiguo (1911). Este mtodo de Conteo Directo al Microscopio
(CMD) es usado mayoritariamente para el diagnostico microbiolgico de la leche y se
lo considera un mtodo rpido para estimar el grado de contaminacin bacteriano de la
leche pero que no est diseado para el conteo rutinario de la leche cruda ya que el
conteo en placa es ms preciso, ms prctico y ms barato que un conteo directo
ejecutado adecuadamente. Si el mtodo se contemplara como un mtodo para estimar la
calidad de la leche con propsito de pago, su uso sera limitado para pequeo nmero de
muestras con alto contenido bacteriano (2.3 x 106 ufc/mL) debido a la insensibilidad del
mtodo.
El mtodo de Breed tambin es usado para diagnstico de mastitis bovina (diagnstico
subclnico). En sta, el coloreado con azul de metileno nos permite ver adems
leucocitos y clulas somticas, tambin se pueden usar coloraciones por los mtodos de
LevowitzWeber o BroadhurstPaley que permiten observar especficamente clulas
somticas en leche.

II. Objetivos:

Hacer un recuento toral de microorganismos que hay en una muestra (leche).

Emitir juicio de valor sobre la calidad de la leche.

III. Materiales:

Microscopio calibrado
Lminas portaobjeto
Lmina patrn de Breed
Pipeta de Breed o asa en anillo calibrado
Colorante de Gram o Azul de metileno

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 Xilol
Papel Tis
Muestra: leche

IV. Procedimiento:

1. - Estandarizacin del Equipo:

Se coloca la lmina patrn que tiene una tabla macromtrica marcada, que
tiene divisiones de 0.1 a 0.01 m; con el objetivo de inmersin, proceder as:
Medir el campo en mm. hasta el tercer decimal.
Determinar el rea del campo en mm2; aplicando la frmula de
superficie del crculo:
Ao = r2

Clculo del factor microscpico:

Se mide con exactitud el rea del microscopio en mm2.
Luego se divide 100 entre el rea encontrada (X = 100 x Acampo).
Luego, para hallar el factor microscpico se multiplica este valor
hallado por 100 (FM = X x 100)
Se indica que los microscopios tiene un factor de microscopio de
300,000 a 600,000.

2. Preparacin de la Pelcula:
Se lava la lmina, desengrasndola. Una vez hecho se coloca sobre la lmina
patrn, en este caso al carecer de ella se coloca una lmina de cartn que
tenga una cuadrado de 1 cm2.
Enseguida colocar la muestra de leche previamente homogenizada (20
veces).
Con el asa calibrada se coloca 0.01 ml. de la muestra en la lmina. Esta se
extiende por toda el rea del cuadrado de la lmina patrn.
Luego debe hacerse el secado lento para evitar el resquebrajamiento de la
pelcula; en especial cuando la muestra se trata de leche.
En algunas muestras es necesario desengrasar la pelcula con Xilol.

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 Teir la pelcula por el Mtodo de Gram o tincin simple con azul de
metileno.

3. Examen Microscpico:
Contar en el microscopio los microorganismos por campo utilizando lente de
inmersin. Se cuenta a lo largo de toda la pelcula.
Se cuenta como mnimo 20 campos y un mximo 100 campos.
Cuando se cuentan los microorganismos se deben de contar como uno solo:
aquellas bacterias que estn solas, los agregados, los grupos, los cocos o
bacilos en cadenas.

4. Cmputo y clculo del microorganismo:

Cada alumno contar un mnimo de 20 campos.
Luego se sacar un promedio del nmero de microorganismos por campo y
se multiplica por el factor microscpico.
Luego, como la muestra usada fue de 0.01 mL, multiplicaremos el resultado
anterior obtenido por 100 para pasarlo a la misma unidad (mL).

RECUENTO = N X Factor X Recproco

MICROSCPICO DE promedio microscpico de la
MICROORGANISMOS de m.o por dilucin

4
 campo

V. Clculos y Resultados:

Clculo del promedio de microorganismos por campo:

# de # de
# de m.o # de m.o
campo campo
1. 9 11. 3
2. 2 12. 6
3. 4 13. 7
4. 9 14. 3
5. 8 15. 5
6. 9 16. 4
7. 5 17. 6
8. 6 18. 1
9. 3 19. 4
10. 5 20. 2

Promedio de m.o. por m.o.

=
campo N de campos

Promedio de m.o. por 101

campo = 20

Promedio de m.o. por

5.05
campo =

Clculo del rea del microscopio (100X)

- Al medir el rea del microscopio, primero se midi el dimetro del campo
visto con objetivo de inmersin (100X); se cont 17.5 lneas.
- Como cada lnea equivale a 10 m se pas a convertir las lneas a m:

17.5 x 10 m = 175 m

- Luego se pas este valor de m a mm dividindolo entre 1000:

1 mm
175 m x = 0.175 mm
1000 m

- Luego, con este valor podemos hallar el rea del crculo o en este caso, del
campo microscpico (Acampo = x r2), en este caso como tenemos el
dimetro y no el radio, lo nico que se hace es dividirlo entre 2.

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 Acampo = 3.1416 x (0.175 mm/2)2

Acampo = 3.1416 x (0.0875)2

Acampo = 3.1416 x 0.00765625 mm2

Acampo = 0.02405 mm2

Clculo del factor microscpico (FM)

- Luego, con el rea del campo (en mm2) hallado, podemos ahora hallar el
FM.
- Primero dividiremos 100 entre el campo hallado, este dato vendra a ser el
nmero de campos por frotis.

X = 100 0.02405 mm2

X = 4158 mm-2

- Luego, a este valor se lo multiplica por 100 para hallar el FM (el factor
microscpico debe estar entre 300,000 y 600,000.

FM = 4158 mm-2 x 100

FM = 415 800 mm-2

- Este factor hallado se realiz con el microscopio Motic N 1, cdigo

34223-03.
- La lmina patrn usada fue una lmina marca Zeiss de 5 + 100/100 mm.
- Luego, ya con estos datos se puede hallar el recuento de m.o. en muestra.

N promedio Recproco
N de m.o. en Factor
= de m.o por X X de la
muestra microscpico
campo dilucin

N de m.o. en
= 5.05 x 415 800 x 100
muestra

N de m.o. en
= 209979,000 m.o/mL
muestra

- Entonces el recuento de m.o. en la muestra de leche trada nos dio un total

de 209979,000 m.o/mL.

VI. Preguntas:

1) Buscar la Norma Tcnica peruana o internacional por el Mtodo de Breed para

leche.

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- La Norma Tcnica Peruana para el Mtodo de Bredd se puede conseguir con el sgte.
nombre: Leche Cruda: Numeracin de Clulas Somticas. Mtodo del
Microscopio; con cdigo NTP 202.173:1998, y tiene un costo de S/. 48.92. Esta
norma tcnica ser comprada en conjunto por los alumnos de prctica del curso en
los prximos das.

2) Con que otros colorantes se realiza tincin para el mtodo.

- Se puede utilizar un microscopio de fluorescencia, en el cual se utilizar un tipo de
colorante distinto (fluorenscentes) como el azul de anilina modificado.
- Las clulas viables se pueden diferenciar de las no viables, para eso se puede usar la
naranja de acridina (0,01%), este es el mtodo de recuento directo con naranja de
acridina (AODC).
- Tambin se pueden usar coloraciones por los mtodos de LevowitzWeber o
BroadhurstPaley que permiten observar especficamente clulas somticas en
leche.

3) Para que otros alimentos se realiza el mtodo.

- Se puede realizar para otros productos lcteos derivados y otros productos
alimenticios, siempre y cuando sean lquidos, como por ejemplo leches fermentadas
(leche acidfila), vino, sidra (para contar levaduras).

VII. Referencias:

- Autor desconocido (1982). Mastitis bovina con especial nfasis en la realidad

nacional (diagnstico). Monografas de Medicina Veterinaria, Vol. 4, N 2, obtenido
el 19 de enero de 2008 en
http://www.monografiasveterinaria.uchile.cl/CDA/mon_vet_simple/0,1420,SCID%2
53D7819%2526ISID%253D414%2526PRT%253D7798,00.html
- AVILA TELLEZ, S. (2005). Mastitis: Diagnostico, tratamiento y control. Obtenido
el 19 de enero de 2008 en
http://www.fmvz.unam.mx/biblivir/BvS1Lb/BvS1Pdf/Avila/cap8.pdf
- COTRINO, V. (2005). Mastitis bovina. Obtenido el 19 de enero de 2008 en
http://lmvltda.com/programas/ar21.html
- DAVILA F., Nuria y J. E., HERNANDEZ G. (2006) Mtodos de ensayos rpidos de
deteccin de microorganismos en la leche. Revista Electrnica de Veterinaria
REDVET, Vol. VII, N 07, obtenido el 19 de enero de 2008 en
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n070706/070603.pdf
- GUERRA RODRIGUEZ, V. (2005). La mastitis y sus pruebas diagnsticas.
Obtenido el 19 de enero de 2008 en
http://www.engornomix.com/la_mastitis_sus_pruebas_s_articulos_935_GDL.htm
- PRUEBAS BIOQUIMICAS. Obtenido el 19 de Enero de 2008 en
http://mail.fq.edu.uy/~microbio/MGral/practico/segundociclo.doc