VISIN MODERNA DE LA

HEMOSTASIA: NUEVO MODELO

DE COAGULACIN

CURSO DE FORMACIN CONTINUADA A

DISTANCIA 2011-2012

TALLER DEL LABORATORIO CLNICO

N 2
I.S.S.N.- 1988-7469
Ttulo: Taller del Laboratorio Clnico
Editor: Asociacin Espaola de Biopatologa Mdica
Maquetacin: AEBM
Fecha de Distribucin: diciembre de 2011
 Visin moderna de la hemostasia: nuevo
modelo de coagulacin

Eva Menndez Alonso.- Residente de Bioqumica Clnica, Shaila

Rubio Arias.- Residente de Anlisis Clnicos, M Teresa Snchez
Calvin.- FEA de Anlisis Clnicos. Hospital Universitario 12 de
Octubre. Madrid.

1. INTRODUCCIN

La hemostasia permite que la sangre circule libremente por los vasos sanguneos

y cuando existe una lesin, inicia una serie de mecanismos fisiolgicos que conducen

a la formacin del trombo hemosttico, a reparar el dao y finalmente disolver el

cogulo representando el cese fisiolgico de la hemorragia.

El sistema de coagulacin junto a los mecanismos de retroalimentacin asegura la

eficacia hemosttica, mientras que el sistema fibrinoltico acta como regulador del

sistema de la coagulacin, eliminando la fibrina no necesaria para la hemostasia.

La hemostasia siempre depende del equilibrio entre ambos sistemas, este

equilibrio es perfecto en las personas sanas. Si hay un dficit de los factores de

coagulacin o si el potencial fibrinoltico sobrepasa el de coagulacin, se producir

una hemorragia. Al contrario, si el potencial de coagulacin sobrepasa al fibrinoltico

o se produce una disminucin de los factores de inhibicin de la coagulacin se

producir una trombosis.

Las superficies celulares, plaquetas, clulas endoteliales, fibroblastos y monocitos

principalmente, juegan un papel muy importante dentro de la coagulacin sangunea.

Desempean dos acciones bsicas en la hemostasia. Por una parte proporcionan los

factores esenciales que normalmente no estn presentes en el plasma y por otra

584
proveen una superficie para el ensamblaje de los complejos enzima-cofactor y su

interaccin con los sustratos para formar el cogulo de fibrina.

El sistema de la hemostasia se divide en dos mecanismos de respuesta

principales: la hemostasia primaria, donde se lleva a cabo fundamentalmente la

interaccin entre el endotelio y la plaqueta; y la hemostasia secundaria o coagulacin

donde participan los factores de coagulacin que interaccionan sobre una superficie

cataltica para formar una red de fibrina y posteriormente formar el cogulo

sanguneo (1).

2. HEMOSTASIA PRIMARIA

Tiene lugar a los pocos segundos de producirse una lesin vascular. La

interaccin de las plaquetas y la pared vascular juegan un papel esencial para

detener la salida de la sangre en capilares, arteriolas pequeas y vnulas.

Las plaquetas son participantes esenciales en el proceso de la hemostasia

primaria. Son pequeas clulas discoides anucleadas, procedentes de la

fragmentacin del megacariocito. A pesar de carecer de ncleo, estas clulas

contienen muchos componentes estructurales, metablicos y de sealizacin propios

de las clulas nucleadas. Incluso debido a su participacin en diversos procesos

fisiolgicos y su accesibilidad, han servido como modelo de estudio en biologa

molecular.

Las plaquetas, que normalmente circulan en forma inactiva, se adhieren a la

pared del vaso daado, segregando el contenido de sus grnulos e interaccionando

con otras plaquetas, formando la base del tapn hemosttico. Por otro lado, las

plaquetas participan en la activacin del sistema de la coagulacin proporcionando la

superficie sobre la cual se van a ensamblar los complejos que intervienen en esta

fase (2).
585
 La formacin del tapn hemosttico se produce por una serie de mecanismos:

Adhesin de la plaqueta al subendotelio vascular daado (interviene el factor

Von Willebrand)

Agregacin plaquetaria primaria al activarse el receptor glucoproteico IIb/IIIa

y permitir as la unin de las plaquetas

Liberacin de compuestos intraplaquetarios que provocan agregacin

secundaria de nuevas plaquetas al tapn hemosttico

Consolidacin y retraccin del cogulo

Formacin del tapn hemosttico definitivo con la formacin del polmero de

fibrina

Detencin de la hemorragia (1)

3. COAGULACIN O HEMOSTASIA SECUNDARIA

En esta fase se produce la interaccin entre s de las protenas plasmticas o

factores de coagulacin que se activan en una serie compleja de reacciones que

culminarn con la formacin del cogulo de fibrina.

La fibrina formar una malla definitiva que reforzar al tapn hemosttico inicial,

formndose un cogulo o trombo definitivo.

Intervienen en el proceso varias protenas procoagulantes (factores de

coagulacin) y protenas anticoagulantes (las ms importantes son antitrombina III,

protena C y protena S) que regulan y controlan el proceso de coagulacin evitando

una coagulacin generalizada.

Aunque la descripcin del mecanismo de la coagulacin se divide en diferentes

fases, todas ellas guardan relacin entre si. Las plaquetas activadas van a acelerar

el proceso de la coagulacin y a su vez los productos de la coagulacin van a inducir

la activacin de las plaquetas.

586
3.1 FACTORES DE COAGULACIN

Los factores plasmticos de la coagulacin son protenas procoagulantes (su

nomenclatura es internacional). Se denominan utilizando nmeros romanos,

asignados en el orden en el que fueron descubiertos (no existe factor VI).

A algunos factores plasmticos no se les ha asignado un nmero romano, como

son la precalicrena, calicrena, y el quiningeno de alto peso molecular (CAPM). Los

fosfolpidos plaquetarios no estn incluidos en esta clasificacin.

Todas las protenas y componentes celulares involucrados en el proceso de

coagulacin circulan en plasma de forma inactiva en condiciones fisiolgicas

normales. Durante el proceso de la coagulacin sern activados y entonces se

representan con el sufijo a despus del nmero romano. Se pueden englobar en

dos grandes grupos:

Factores dependientes de vitamina K

La sntesis de los factores de la coagulacin se realiza, principalmente, en el

hgado y en el endotelio vascular. Requieren vitamina K para su correcta

funcionalidad, aqu se incluyen los factores II, VII, IX y X, as como las dos

principales protenas reguladoras de la coagulacin protena C y protena S. Todos

ellos contienen de 10 a 12 residuos de glutamina, que son carboxilados a cido

carboxiglutmico por una carboxilasa que precisa como cofactor a la vitamina K.

Este paso es importante para la unin del in calcio y necesarios para la

interaccin de estas protenas con las membranas plaquetarias (fosfolpidos

plaquetarios).

Los factores no carboxilados se conocen como P.I.V.K.A. (Protein Induced by

Vitamin K Absence) que no son funcionales y poseen actividad anticoagulantes

por un mecanismo competitivo sobre los factores carboxilados.

587
 Cofactores

Se dividen en dos grupos:

Procofactores plasmticos: incluyen a los factores V, VIII y quiningeno. El FV

circula en plasma como una protena monomrica y el FVIII circula junto con

el factor de von Willebrand (FvW) que al activarse, se disociarn por

protelisis.

Procofactores celulares: incluyen al factor tisular (FT) y la trombomodulina

(TM). El FT es el nico factor que no se encuentra normalmente en la

circulacin sangunea, es una protena especfica presente sobre la membrana

plasmtica de clulas como monocitos o clulas endoteliales. El FT se activa

nicamente al entrar en contacto con el FVII, momento en el que se inicia la

coagulacin plasmtica. La TM se expresa sobre las clulas del endotelio

vascular, participa como anticoagulante activando a la protena C (1)

4. FIBRINOLISIS

El sistema fibrinoltico consiste en la conversin de una proenzima, el

plasmingeno, en su forma activa, la plasmina, la cual es capaz de degradar la

fibrina y, as, eliminar el cogulo previamente formado. La transformacin del

plasmingeno en plasmina se produce mediante la accin proteoltica de dos

enzimas: activador tisular del plasmingeno (tPA) y activador del plasmingeno tipo

urocinasa (uPA).

La plasmina degrada la fibrina del cogulo y la transforma en productos de

degradacin del fibringeno (PDF) que contienen residuos de lisina y arginina en

posicin carboxiterminal. Estos residuos constituyen los sitios de unin para el tPA y

el plasmingeno, y son por tanto responsables de amplificar enormemente la

cascada de la fibrinolisis. A esta tendencia profibrinoltica se opone una actividad

588
antifibrinoltica, de tal modo que slo un adecuado equilibrio entre ambas fuerzas

dar lugar a un correcto funcionamiento del sistema fibrinoltico.

La inhibicin de la fibrinolisis se produce a diferentes niveles. Por una parte, estn

los inhibidores de los activadores del plasmingeno: el principal inhibidor de la

fibrinolisis in vivo es el inhibidor del activador del plasmingeno tipo 1 o PAI-1, que

se sintetiza en el endotelio vascular y tambin en el hgado. Otros inhibidores son el

PAI-2, fundamentalmente de origen placentario y el PAI-3, con una menor actividad

antifibrinoltica.

Se ha descrito tambin otro mecanismo que regula negativamente la activacin

del plasmingeno, se trata de la va del inhibidor de la fibrinolisis activable por

trombina (TAFI). Los residuos de los aminocidos bsicos exhibidos en la superficie

de la fibrina parcialmente degradada sirven de anclaje al plasmingeno y al tPA.

Cuando el plasmingeno y el tPA coinciden en la superficie del cogulo de fibrina, se

produce la conversin del plasmingeno a plasmina. A este nivel el TAFI, una vez

activado por la trombina (TAFIa), es capaz de eliminar los residuos de lisina y

arginina de la superficie de la fibrina, impidiendo la formacin de plasmina y, por lo

tanto, limitando la cascada de la fibrinolisis.

A otro nivel se puede regular la actividad proteoltica de la plasmina por la accin

de la 2-antiplasmina, su principal inhibidor fisiolgico, y, en menor medida, por la

2-macroglobulina y el TAFIa.

stos son, bsicamente, los factores implicados en la fibrinolisis, de tal modo que

una correcta hemostasia depende del balance de fuerzas entre todas estas

tendencias opuestas. Hay que resaltar que se trata de un equilibrio dinmico y

adaptable a diferentes situaciones tanto fisiolgicas como patolgicas. (3)

589
5. MODELOS DE COAGULACIN

Distintos modelos de la coagulacin in vivo se han descrito desde finales del siglo

XIX. Las primeras descripciones estuvieron relacionadas con individuos que

desarrollaban trombosis, se demostr que la formacin del cogulo de fibrina se

genera a partir de su precursor el fibringeno mediante una conversin enzimtica

mediada por la enzima trombina que a su vez provena de la protrombina.

En los siguientes aos se realizaron mltiples investigaciones hasta conocer el

factor responsable del inicio del proceso de coagulacin.

En el ao 1904 Morawitz describi por primera vez un esquema de la coagulacin

sangunea. Afirm que los tejidos vasculares liberaban una tromboplastina tisular tras

la lesin vascular, necesaria para el inicio del proceso de coagulacin y propuso

cuatro componentes esenciales para la coagulacin: protrombina, fibringeno, calcio

y tromboplastina. Descubri tambin la presencia de antitrombinas en la circulacin

que modulan la trombocinasa, mejor conocida como factor tisular (FT). En el

trascurso de los aos se fueron descubriendo los factores de la coagulacin.

Ya en los aos 60 dos grupos de investigacin por separado, propusieron un

modelo de coagulacin que incorporaba una complejas reacciones, donde la

activacin secuencial de los factores de coagulacin, daban como resultado la

generacin de una enzima llamada trombina. En este modelo las vas de coagulacin

se dividieron en dos sistemas: sistema extrnseco y sistema intrnseco. Le dieron una

mayor importancia a la va intrnseca como iniciadora de la coagulacin a travs del

factor XII. Ambas vas convergan en una va comn y eran capaces de activar al

factor X, el cual unindose con el cofactor V activado, generaban la trombina.

Este modelo denominado Cascada de y de gran utilidad en el laboratorio, para

Coagulacin, es razonablemente bueno explicar la activacin in vitro de la

590
coagulacin a travs del tiempo de que corresponden a las vas extrnsecas

protrombina (TP) y tiempo de e intrnsecas respectivamente.

tromboplastina parcial activado (TTPa)

Figura 1. Cascada de la coagulacin

Sin embargo en base a los descubrimientos de los ltimos aos este modelo es

inadecuado para explicar las vas fisiolgicas de la hemostasis in vivo al no considerar

la interaccin del sistema con las clulas que participan en la coagulacin.

Es evidente que la hemostasia no es posible sin la participacin de las plaquetas, y

por otra parte el FT es una protena que est presente en la membrana de diversas

clulas esenciales en la coagulacin. Adems diferentes clulas expresan protenas

procoagulantes, anticoagulantes y receptores para diversos componentes de la

hemostasia, lo que ha supuesto un paradigma para explicar las reacciones que

tienen lugar durante el proceso hemosttico. (4)

El modelo clsico de la cascada de la coagulacin es por tanto inconsistente con

el comportamiento clnico de la disfuncin de la hemostasia. Se comprob que

ambas vas no operan de forma independiente y que los dficit de factores de la va

intrnseca que prolongan el TTPA no conllevan el mismo riesgo hemorrgico:

591
deficiencias de factor XII no cursan con hemorragia y las de XI puede cursar con

hemorragia leve, mientras que las deficiencias de factores VIII y IX (hemofilia A y B

respectivamente) conllevan hemorragias graves. Otra observacin clave fue el hecho

de que el complejo FT/VII no slo activa el factor X, sino tambin el factor IX (4).

Varios grupos han explicado procesos fundamentales que rompen la estructura

del modelo clsico de la coagulacin:

- La interaccin FT/VIIa activa no solamente al factor X sino tambin al IX,

llegndose a la conclusin de que la va extrnseca sera la de mayor relevancia

fisiopatolgica in vivo.

- El evento disparador de la hemostasia in vivo es la formacin del complejo

FT/FVIIa.

- La trombina activa directamente al factor XI en una superficie cargada.

De todo ello se ha concluido que es poco probable que el modelo tradicional

funcione en condiciones fisiolgicas, por lo que Hoffman y otros investigadores han

propuesto una alternativa denominada Modelo Celular de la Coagulacin (5).

6. MODELO CELULAR DE LA COAGULACIN

El modelo celular de la coagulacin se explica en 3 diferentes etapas.

6.1. INICIACIN

El FT es el principal iniciador de la coagulacin in vivo que acta como receptor

para el factor VII. Se expresa en numerosos tipos de clulas y est presente en

monocitos circulantes y clulas endoteliales en respuesta a procesos inflamatorios.

Las clulas estn localizadas fuera del endotelio, lo que previene la iniciacin de la

coagulacin cuando el flujo es normal y el endotelio est intacto. Es necesario que se

produzca una lesin que rompa la barrera que separa al FT y al factor VII.

592
 Cuando se produce una lesin en la pared vascular, las clulas subendoteliales

que contienen FT entran en contacto con el plasma y se inicia el proceso de

generacin de trombina al unirse al factor VII creando el complejo FT/VIIa. ste

complejo a su vez activa ms VII, y tambin acta sobre el factor IX y X.

El factor Xa se combina en la superficie celular con el Va para producir pequeas

cantidades de trombina, que jugarn un papel importante en la activacin de las

plaquetas y del factor VIII en la siguiente fase (4).

6.2. AMPLIFICACIN

En esta fase la clula fundamental es la plaqueta. stas se adhieren a la matriz

subendotelial, siendo activadas en lugares donde se ha expuesto el FT. Las pequeas

cantidades de trombina generadas en la fase anterior junto con el calcio sanguneo y

los fosfolpidos plaquetarios, amplifican la seal procoagulante inicial activando a los

factores V, VIII y XI que se ensamblan en la superficie plaquetar para promover

posteriores reacciones en la siguiente fase.

Esta fase se acaba cuando el factor Va y el VIIIa se unen a la membrana celular

de una plaqueta activada para poder formar dos complejos que iniciarn la fase

siguiente (6).

6.3. PROPAGACIN

Los complejos iniciadores de la propagacin son la tenasa (VIIIa/IXa, Ca2+ y

fosfolpidos) y el complejo protrombinasa (Va/Xa, Ca2+ y fosfolpidos). El complejo

tenasa cataliza la conversin del factor Xa, mientras que el complejo protrombinasa

cataliza, a nivel de la superficie plaquetar, la conversin de protrombina en grandes

cantidades de trombina, lo que se conoce como explosin de trombina necesaria

para la formacin de un cogulo estable de fibrina.

593
 La trombina generada, activar al factor XIII o factor estabilizador de fibrina y a

un inhibidor fibrinoltico (TAFI) necesarios para la formacin de un cogulo de fibrina

resistente a la lisis (4).

La trombina es la enzima principal de la coagulacin, la velocidad y el pico

mximo de produccin de trombina son factores muy importantes para que todas

sus funciones se lleven a cabo.

Las principales funciones de la trombina son: activacin de las plaquetas, del

cofactor V y VIII, del factor XI y XIII, activacin de la va del inhibidor de la

fibrinolisis por trombina (TAFI), es la enzima responsable de la transformacin del

fibringeno a fibrina, interviene en la unin al receptor PAR-4 en la superficie de las

plaquetas y participa en los procesos de inflamacin y cicatrizacin de heridas (7).

Figura 2. Nuevo Modelo celular de la hemostasia (3)

En resumen, segn el modelo celular de la hemostasia, la coagulacin fisiolgica

depende del contacto del FT subendotelial en el lugar de la lesin con el factor VIIa y

del ensamblaje de las reacciones de coagulacin a nivel de superficie celular

plaquetar, lo que favorece la formacin de trombina a nivel local y la generacin de

594
un cogulo estable de fibrina. Este modelo contempla una va nica y la focalizacin

del proceso en las superficies celulares (4).

7. CONTROL DE LA COAGULACIN

Existen varios mecanismos que regulan la coagulacin para prevenir un exceso de

formacin de trombina y la posible oclusin del flujo sanguneo. Existe una expresin

de antitrombina III y del inhibidor de la va del factor tisular (TFPI) que inhiben al

factor Xa que no est unido a las clulas que liberan TF o las plaquetas activadas.

Por otra parte la trombina se autorregula al unirse a la trombomodulina y as activar

a la protena C que va a impedir la generacin de nuevas molculas de trombina al

escindir irreversiblemente el factor Va y el VIIIa. Esta protena requiere de un

cofactor la protena S que va a actuar aumentando su afinidad por la membrana

celular unas 10 veces. La protena C inhibir al factor Va en un endotelio no daado,

pero no lo bloquear si se encuentra sobre una plaqueta activada. El complejo

protena C-protena S tambin inactiva a un importante inhibidor de la fibrinolisis, el

inhibidor del activador del plasmingeno. La fibrinolisis es esencial para disolver el

cogulo formado por los mecanismos hemostticos (6).

8. MTODOS DE DIAGNSTICO (8)

8.1. CONDICIONES PREANALTICAS

Para la determinacin del estudio hemosttico lo primero que necesitamos es una

correcta obtencin de la muestra. Son necesarios tubos con citrato sdico como

anticoagulante. Estos tubos contienen una concentracin de citrato sdico de 130

mM, que con la sangre se quedar en una concentracin final de 13mM, para ello se

deben extraer 9 partes de sangre y una de citrato sdico. Para la hematolgica

bsica se debe utilizar un tubo con cido etilen diamino tetractico (EDTA) como

595
anticoagulante.

8.2. EXPLORACIN DE LA HEMOSTASIA PRIMARIA

Tiempo de sangra: es el periodo de tiempo desde que se realiza una pequea

incisin en la piel y el momento en que finaliza el sangrado. Es la nica prueba que

permite medir in vivo la reaccin plaqueta-endotelio y demuestra la capacidad

hemosttica de las plaquetas. Se usa la tcnica de Ivy que consiste en practicar una

incisin en la cara anterior de antebrazo mediante una hoja especial de 1 cm de

longitud y 1 mm de profundidad.

El tiempo de hemorragia normal es entre 3 minutos y 30 segundos, y 8 minutos y

30 segundos. Las causas de prolongacin del tiempo de sangra son las alteraciones

en la pared vascular, trombocitopenias, defectos en la agregacin o adhesin

plaquetar.

Funcin plaquetaria: para su evaluacin estudiaremos el PFA-100, agregometra y el

estudio de las glucoprotenas de membrana.

Para evaluar el PFA-100 (9) se utiliza sangre total citratada. No es tan especfica

como el Ivy pero es ms rpida y menos dolorosa para el paciente adems de evitar

los posibles errores producidos por problemas cutneos del paciente.

Se realiza una simulacin in vitro del tiempo de hemorragia. Reproduce un flujo

constante de sangre que atraviesa una membrana porosa de colgeno y epinefrina o

colgeno y ADP. El paso por la membrana produce la activacin de las plaquetas y su

agregacin. El aparato registra el tiempo de obturacin del flujo. El tiempo de

obturacin est aumentado en pacientes con trombocitopenia, enfermedad de Von

Willebrand y en pacientes que toman medicacin que altera la funcin plaquetar.

596
 Otro estudio es la agregometra que se realiza cuando el tiempo de oclusin en

PFA-100 esta alterado. Utiliza el mtodo turbidimtrico de Born, que consiste en

medir la trasmitancia del plasma del paciente cuando se produce la agregacin

plaquetar. Obtenemos el porcentaje de agregacin plaquetaria frente a un panel de

agentes agregantes: ADP, colgeno, ristocetina, adrenalina, cido araquidnico,

trombina, endoperxidos cclicos y un ionforo de calcio. La respuesta de las

plaquetas a los diferentes agentes agregantes se divide en cuatro fases sucesivas: el

cambio de forma, la agregacin, la movilizacin y la liberacin del contenido de los

grnulos. Por ello, podemos estudiar donde se produce el fallo en el funcionamiento

plaquetario.

El ltimo estudio para la determinacin de la funcin plaquetar es la

determinacin de las glucoprotenas de membrana que se puede estudiar por dos

tcnicas diferentes:

1- Tcnica electrofortica en gel de policrilamida donde se detecta y caracteriza la

glucoprotena. Esta tcnica no permite detectar las propiedades antignicas de las

protenas ni su interaccin con otras protenas.

2- Tcnica inmunolgica: citometra de flujo, permite medir diferentes subgrupos

dentro de la poblacin plaquetaria estudiada, es capaz de detectar cambios

conformacionales en las glucoprotenas (ejemplo: complejo IIb-IIIa) y diferenciar las

plaquetas activadas de las que estn en reposo.

Exploracin de la cintica plaquetaria: se realiza un marcaje a las plaquetas con un

radionclido y se mide la radioactividad ligada a las plaquetas circulantes. Nos

permite cuantificar la supervivencia plaquetar, la tasa de renovacin plaquetaria y los

lugares de destruccin perifrica en el paciente (habitualmente el bazo).

597
Exploracin de la adhesividad: se realiza la tcnica de Baumgartner que estudia la

interaccin entre las plaquetas y el subendotelio en condiciones de flujo definidas.

Reproduce la circulacin sangunea y permite emular los parmetros reolgicos de

flujo y coeficiente de cizallamiento. Nos permite observar trastornos hemorrgicos

congnitos (por defectos en la unin del Factor von Willebrand al subendotelio y al

GPIb).

Nuevos mtodos de estudio de la funcin celular global de las plaquetas:

transcriptmica y protemica(10). Se sabe que las plaquetas poseen varios mRNA.

Existen principalmente dos tcnicas transcriptmicas para el estudio de los

transcriptos, que son los microarrays y la SAGE (anlisis seriado de expresin gnica)

(11). Las tcnicas protemicas nos proporcionaran conocimientos del contenido

proteico plaquetar y de su importancia en las alteraciones de la funcin plaquetar o

su respuesta a frmacos antitrombticos.

8.3. PRUEBAS DE ESTUDIO DE DITESIS HEMORRGICA

Tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa): el plasma citratado en presencia

de tromboplastina parcial o cefalina y cloruro clcico se coagula a una velocidad

dependiente de la concentracin de todos los factores (excepto VII y XIII). Se inicia

la reaccin aadiendo al plasma una sustancia cargada negativamente (slice, caoln

o cido elgico). Esta prueba presenta un error sistemtico cuando no se cumple la

proporcin 9:1 de sangre: citrato y nos da un valor de TTPa alargado. La relacin

(TTPa / TTPa control) > 1,5 se correlaciona con dficit de factores y el riesgo de

hemorragia. Podemos detectar hemofilias tipo A y B e inhibidores de la coagulacin

(anticoagulante lpico). Se usa para el control del tratamiento con heparina.

598
Tiempo de protrombina o de Quick (TP): el plasma citratado en presencia de

tromboplastina y cloruro clcico se coagula a una velocidad dependiente de la

actividad de protrombina, de los factores V, VII, X y el fibringeno. Evala la va

extrnseca. Se usa para el control del tratamiento crnico con cumarnicos. Detecta

anomalas de factores y se correlaciona el riesgo de hemorragia junto con TTPa.

Los resultados se expresan en la unidad: ndice normalizado internacional (INR)

es la razn del tiempo de coagulacin del paciente respecto al control elevado a un

valor llamado ISI (ndice de sensibilidad internacional) que es propio de cada

tromboplastina.

Tiempo de trombina (TT): tiempo que tarda en coagular un plasma citratado al

aadir una baja concentracin de trombina. Valora la capacidad de polimerizar del

fibringeno. Se prolonga en niveles muy bajos de fibringeno o niveles altos de

productos de degradacin del fibringeno o de la fibrina.

Tiempo de reptilasa: tiempo que tarda en coagular un plasma citratado al que se

aade reptilasa (reptilasa es una enzima proteoltica extrada del veneno de la

serpiente Bothrops atrox que acta como el fibringeno). Se alarga en hepatopatas,

disfibrinogenemias e hipofibrinogenemia. Es insensible a la heparina (se usa esta

tcnica cuando queremos comprobar si un plasma contiene heparina).

Concentracin de fibringeno: se usa el mtodo Von Clauss (12) que utiliza plasma

citratado diluido en el que se aade un exceso de trombina. Mide el tiempo de

transformacin del fibringeno a fibrina. Siendo la concentracin de fibringeno

proporcional al tiempo medido por el analizador, extrapolndose el resultado del

paciente a la correspondiente curva de calibracin realizada en el ensayo.

599
Dosificacin de la actividad de los factores:

Factores II, V, VII y X: Dependiendo de qu factor quieras medir se usa plasma

citratado con exceso de los otros factores y se inicia la coagulacin con

tromboplastina y calcio. El tiempo de coagulacin es proporcional a la concentracin

del factor.

Factores VIII, IX, XI y XII: igual que el anterior pero se inicia la coagulacin con

cefalina y calcio.

Factor XIII: se debe activar el factor XIII con trombina y valorar la actividad

trasglutaminasa sobre un sustrato o con un sustrato cromognico.

Factor von Willebrand (FvW): puede realizarse por medio de una determinacin por

aglutinacin donde se aade ristocetina para inducir o mimetizar el cambio que se

produce en el factor von Willebrand cuando se ha unido al colgeno. Se induce la

agregacin plaquetaria. Se determina por tcnicas de ELISA, electroinmunoensayo.

Determinacin de dmero D: el dmero D es un producto de degradacin de la fibrina.

Su exceso nos indica estados de hiperactivacin de la coagulacin como coagulacin

intravascular diseminada (CID). Tambin nos orienta a posible tromboembolismo e

hiperfibrinolisis. Se detecta por mtodos cuantitativos (ELISA o tcnicas

turbidimtricas) o semicuantitativos (aglutinacin por partculas de ltex o

inmunofiltracin).

2-antiplasmina: es el principal inhibidor de la plasmina (13). Es una glucoprotena.

Se incuba el plasma citratado con exceso de plasmina. Luego se aade un sustrato

cromognico que mide la cantidad de plasmina residual, est ser inversamente

proporcional a la capacidad antiplasmnica del plasma, debida prcticamente en su

totalidad a la 2-antiplasmina.

600
8.4. DETECCIN DE INHIBIDORES

El alargamiento de las pruebas bsicas de coagulacin o la deteccin de niveles

bajos de un factor no siempre son debidas a un dficit o defecto, sino que puede ser

consecuencia de la presencia de un inhibidor.

Deteccin de anticoagulante lpico (AL): son autoanticuerpos dirigidos contra

complejos protena-fosfolpidos que impiden la correcta unin de los factores de

coagulacin a las superficies fosfolipdicas. Se asocian a una tendencia trombtica.

Resultados: se produce alargamiento de la TTPa, o el tiempo de protrombina.

Para diagnosticar un paciente con AL deben cumplirse los siguientes criterios:

prolongacin de al menos una prueba de coagulacin que necesite fosfolpidos,

confirmacin de que la alteracin se debe a un inhibidor y no a un defecto de

factores, evidencia de que la actividad inhibitoria depende de los fosfolpidos y

evidencia de que el inhibidor no va dirigido contra factores de coagulacin.

Se determina por dos test: Test de Exner, mide el tiempo de coagulacin de un

plasma mezclado en diferentes proporciones con un plasma control, con caoln y

cloruro clcico. Es sensible a heparina y a los inhibidores especficos contra factores

de coagulacin. Al ser positivo descartaremos los inhibidores especficos contra

factores de coagulacin, y el Test de Russell, se coagula un plasma con veneno de la

serpiente de Russell, que activa el factor X en presencia de pequeas cantidades de

fosfolpidos. Tambin es sensible a la heparina.

Deteccin de anticuerpos antifosfolpidos: son anticuerpos contra los fosfolpidos

(14). Los pacientes presentan episodios trombticos, abortos recurrentes o

trombocitopenia. Se determinan con tcnicas ELISA utilizando como antgeno la

cardiolipina o la fosfatidilserina.

601
Deteccin de inhibidores contra los factores de la coagulacin: se detectan

inhibidores contra los factores de la va intrnseca, los ms frecuentes son

anticuerpos IgG anti-FcVIII. Se utiliza el test descrito por Ewing y Kasper, en el que

se valora el TTPa de una mezcla del plasma normal y del paciente, incubados juntos

durante dos horas a temperatura ambiente de 37C. En presencia de un inhibidor, el

TTPa posterior a la incubacin es prolongado en comparacin con los controles sin

inhibidor.

8.5. PRUEBAS PARA VALORAR LA TENDENCIA TROMBTICA

Cuando a un paciente se le relaciona con una patologa trombtica se debe hacer

un estudio bsico de trombofilia, es decir, antitrombina, protena C, protena S,

resistencia a la protena C activada, anticoagulante lpico, factor VIII, homocistena,

anticuerpos antifosfolpidos, la mutacin factor V Leiden y la mutacin G20210A del

gen de la protrombina.

Antitrombina: principal inhibidor fisiolgico de las sernproteasas. Su cuantificacin

funcionalmente se basa en la inhibicin de la antitrombina por trombina o factor Xa.

Se incuba el plasma citratado problema con un exceso de trombina o de factor Xa en

presencia de heparina que acelera la inhibicin. A continuacin se aade un sustrato

cromognico, con el que se valora la enzima residual, que es inversamente

proporcional a la cantidad de antitrombina presente en el plasma.

Si en la cuantificacin funcional se obtiene niveles bajos de antitrombina se hace

la determinacin antignica. Se realiza por mtodos de inmunodifusin radial,

electroinmunoensayo o ELISA. Si es un defecto de sntesis (los niveles detectados

por la cuantificacin funcional y la determinacin antignica son los mismos) y si es

una protena disfuncional (son mayores los niveles obtenidos por la determinacin

602
antignica que por la cuantificacin funcional).

Protena C: es una glucoprotena vitamina K dependiente con accin anticoagulante.

Se puede hacer su determinacin funcional midiendo la protena C activada sobre un

sustrato. Se puede utilizar el complejo trombina-trombomodulina o veneno de

serpiente para activar a la protena C. La deteccin se realiza aadiendo un sustrato

cromognico o su sustrato natural (factor Va y VIIIa). El primero es un mtodo

colorimtrico y el segundo una tcnica coagulativa en la que se valora el

alargamiento del tiempo de coagulacin por la protena C activa.

Protena S: es un cofactor no enzimtico para la actividad de la protena C activada

sobre los factores Va y VIIIa. En el plasma va unida en un 60% a C4b binding

protein (C4bBP) (15). El C4bBP es una glicoprotena de alto peso molecular del

complemento, formada por 7 subunidades idnticas y una subunidad . Las

subunidades se unen a C4b y la unidad se une a la protena S (PS). Para evaluar

su concentracin hay que conocer la concentracin total, la libre y su funcionalidad.

La determinacin de protena S libre se realiza eliminando los complejos C4bBP-PS

mediante precipitacin con polietilenglicol. Luego se mide con una tcnica ELISA. La

determinacin protena S total se realiza por tcnicas ELISA o de

electroinmunoensayo. Por ltimo, para la determinacin funcional se mide el

alargamiento del TTPa o de protrombina en el que el plasma citratado del enfermo

se ha diluido en plasma deficiente en protena S y al que se aade factor V y

protena C activada. El alargamiento del tiempo de coagulacin es proporcional a la

concentracin de protena S.

Hay tres tipos de defectos: Tipo I (niveles bajos de PS total, libre y funcional),

tipo II (niveles normales de PS total y libre y disminucin de la PS funcional) este

603
tipo es poco frecuente y posteriormente se ha comprobado que muchos de los

pacientes de este grupo realmente tenan el factor V Leiden mutado, y el tipo III

(niveles normales de PS total, bajos de PS libre y funcional).

Mutacin factor V Leiden: cuando existe una mutacin en el nucletido 1691G>A en

el gen del factor V, se produce un cambio de una arginina por una glutamina. Lo que

da lugar a una mayor resistencia a la degradacin del factor V por la protena C

activada, lo que est asociado a trombofilia. Se analiza el ADN mediante

amplificacin por PCR del fragmento genmico que contiene el nucletido y se hace

una digestin con una enzima de restriccin.

Mutacin 20210G>A del gen de la protrombina: La mutacin se da en el fragmento

genmico del gen de la protrombina. Se produce un cambio en la zona 3 (no

codificante), en el nucletido 20210G>A. Se detecta por amplificacin de la zona y

posterior digestin con una enzima de restriccin. La presencia de la mutacin se

asocia a niveles ms elevados de factor II, y a un incremento del riesgo trombtico.

Mutacin Jak2: JAK2 (16) es una protena con funcin tirosinquinasa implicada en la

traduccin de seal de los receptores de mltiples citoquinas. Se ha descrito una

mutacin en dominio pseudotirosinkinasa de esta protena que confiere un estatus de

activacin permanente a esta protena, lo que ocurre es que no puede ser inhibida

por sus inhibidores. Esta mutacin se sita en el aminocido 617 y se produce un

cambio de valina por fenilanina. La presencia de esta mutacin se ha descrito en la

trombocitosis esencial con una sensibilidad del 65% y una especificidad del 100%.

Se analiza por High Resolution Melting (HRM), este mtodo se basa en un anlisis de

PCR a tiempo real para identificar las variaciones en las secuencias de cidos

nucleicos, utilizando las curvas de la temperatura de melting (disociacin del ADN).

604
9. TRASTORNOS DE LA HEMOSTASIA

El diagnstico de la hemostasia exige la realizacin de una historia clnica, una

exploracin fsica y un estudio complementario de laboratorio.

9.1. TRASTORNOS DE LA HEMOSTASIA PRIMARIA (17)

Trombocitopenia: se define como valores de plaquetas totales inferiores a

150000/l. Por debajo de 50000/l se dan hemorragias espontneas y por debajo de

10000/l pueden resultar mortales. La trombocitopenia es resultado de uno o varios

de los siguientes procesos: disminucin de su produccin por la mdula sea,

secuestro, por lo general en un bazo crecido, o mayor destruccin de las plaquetas.

En primer lugar hay que descartar la posible presencia de una

"Pseudotrombocitopenia", sobre todo en pacientes sin una causa manifiesta de

trombocitopenia. Es un error in vitro causado por la aglutinacin de las plaquetas

mediada por los anticuerpos anti-EDTA. Se debe comprobar el resultado y observar

si se ha producido un cogulo en la muestra por incorrecta homogeneizacin del

anticoagulante con la sangre recin obtenida. Descartar la existencia de agregados

plaquetarios con la observacin de un frotis de sangre perifrica al microscopio

ptico. Y por ltimo diagnosticar la psedotrombopenia con la realizacin del

recuento plaquetario en sangre recogida en un tubo con citrato de sodio.

Los sntomas de los pacientes con trombocitopenia son pequeos sangrados de

vnulas pequeas o capilares en lugar de vasos grandes. La piel de estas personas

muestra muchas manchas purpreas pequeas, de las que deriva el nombre de

prpura trombocitopnica. La prpura trombocitopnica es un trastorno adquirido

que desencadena la destruccin de plaquetas mediada por factores inmunitarios y

tambin se produce la inhibicin de la liberacin de plaquetas a partir del

605
megacariocito.

Trombocitopenia hereditaria, puede darse de forma aislada o como parte de otro

sndrome. Es una enfermedad hereditaria autosmica dominante, autosmica

recesiva o ligada a X. En la actualidad se sabe que muchas formas de

trombocitopenia autosmica dominante estn relacionadas con mutaciones en el gen

de la cadena pesada de miosina no muscular MYH9.

Trombocitosis: casi siempre se debe a una deficiencia de hierro, inflamacin,

cncer o infeccin (trombosis reactiva), o un proceso mieloproliferativo subyacente

(trombocitemia idioptica o policitemia verdadera)

Trombopatas: dentro del grupo de trombopatas vamos a comentar la enfermedad

de Von Willebrand, enfermedad de Bernard-Soulier y la enfermedad de Glanzman.

Enfermedad de Von Willebrand: es el trastorno hemorrgico hereditario ms

frecuente (18). El factor de von Willebrand desempea dos funciones: como

principal molcula de adhesin que fija la plaqueta al subendotelio expuesto y como

protena fijadora para el factor VIII, lo cual trae consigo una prolongacin importante

de la vida media del factor VIII en la circulacin sangunea. La enfermedad de von

Willebrand se ha clasificado en tres tipos principales (1, 2 y 3) y cuatro subtipos del

tipo 2 (2A, 2B, 2M y 2N).

El tipo 1 es el ms frecuente. Los pacientes presentan, sobre todo, hemorragias en

mucosas, equimosis excesiva y epistaxis. A menudo, la enfermedad de von

Willebrand leve tipo 1 se manifiesta inicialmente durante las extracciones dentales o

con la amigdalectoma. Muchos factores influyen tanto en las concentraciones de

FvW como en los sntomas de hemorragia, se sabe que influyen el grupo sanguneo

del paciente, su estado hormonal tiroideo, la raza, el estrs y el ejercicio.

606
 Los pacientes con enfermedad de von Willebrand tipo 2 tienen defectos

funcionales en el FvW.

La enfermedad de von Willebrand adquirida es un raro trastorno que se observa

en pacientes con gammapatas monoclonales, mieloma mltiple y macroglobulinemia

de Waldenstrm. Se sospecha en pacientes con sntomas recientes de hemorragia

grave en mucosas, sobre todo en individuos de edad avanzada.

Enfermedad de Bernard-Soulier: Enfermedad con herencia autosmica recesiva que

se manifiesta por hemorragias desde la infancia. Existe un dficit del receptor

plaquetario GpIb-IX-V.

Enfermedad de Glanzman: Enfermedad hereditaria autosmica recesiva,

caracterizada por un dficit del receptor de plaquetas GpIIb-IIIa.

9.2. TRASTORNOS DE LA COAGULACIN

Trombosis venosa: Es el resultado de la formacin de un cogulo obstructivo en

las venas. Ocurre principalmente en las venas profundas de la pierna, desde donde

algunas fracciones del cogulo a menudo embolizan hacia los pulmones. Los

sntomas de trombosis venosa no son especficos y requiere estudios por imgen. El

tratamiento con anticoagulantes debe ser rpido y adecuado. Los factores de riesgo

para la trombosis, estn relacionados con la inmovilizacin o con la

hipercoagulabilidad.

Trombofilia hereditaria: Estos pacientes tienen una tendencia genticamente

determinada al tromboembolismo venoso. Su primer episodio de trombosis suele

aparecer alrededor de los 25-30 aos. No son recomendables los anticonceptivos

orales que contienen estrgenos y se considerar la profilaxis anticoagulante

despus del parto en mujeres con trombofilia hereditaria.

607
Hemofilias: La hemofilia es una enfermedad hemorrgica recesiva ligada a

cromosoma X producida por mutaciones en el gen F8 (hemofilia A o hemofilia clsica

-> dficit factor VIII) o el gen F9 (hemofilia B -> dficit factor IX). Afecta a 1:10.000

varones, las mujeres son portadoras de la enfermedad. Clnicamente la hemofilia A y

la hemofilia B son indistinguibles. El fenotipo de la enfermedad se correlaciona con la

actividad residual del factor VIII o el IX y se clasifica como grave (<1%), moderada

(1 a 5%) o leve (6 a 30%). En las formas grave y moderada, la enfermedad se

caracteriza por episodios hemorrgicos en articulaciones, partes blandas y msculos

despus de un traumatismo menor o incluso en forma espontnea. Los pacientes con

enfermedad leve experimentan hemorragias poco frecuentes que por lo general son

consecutivas a traumatismos. Entre aquellos con actividad residual de factor VIII o

IX de ms de 25% del valor normal, la enfermedad se descubre nicamente por la

hemorragia que se presenta posterior a un traumatismo importante o durante las

pruebas de laboratorio que por lo general se realizan antes de una intervencin

quirrgica.

Las pruebas globales de la coagulacin muestran slo una prolongacin aislada

del anlisis de TTPa. Los pacientes con hemofilia tienen tiempos de sangrado y

recuentos plaquetarios normales. El diagnstico se establece despus de la

determinacin especfica de la actividad coagulante de factor VIII o factor IX.

Coagulacin intravascular diseminada (CID): es un sndrome caracterizado por

la formacin incontrolada de fibrina intravascular en respuesta a la exposicin de la

sangre a concentraciones patolgicas de fosfolpidos de los tejidos que da lugar a un

consumo de factores de coagulacin y plaquetas con una hiperfibrinlisis secundaria.

Se produce un depsito de fibrina en zonas de microcirculacin que ocluyen los

608
vasos en la microcirculacin y puede derivar a un fallo multiorgnico. Las causas ms

frecuentes son la sepsis bacteriana, trastornos malignos como tumores slidos,

leucemia promieloctica aguda y causas obsttricas.

La prpura fulminante es una forma grave de coagulacin intravascular

diseminada debida a trombosis de zonas extensas de la piel.

Los anlisis de laboratorio deben incluir pruebas de coagulacin (TTPa, TP y TT),

marcadores de productos de la degradacin de la fibrina (dmero D), recuentos

plaquetarios y eritrocticos y anlisis del frotis sanguneo al microscopio ptico, con la

observacin de esquistocitos (fragmentos de eritrocitos).

Dficit de vitamina K: el dficit de la vitamina K se ha relacionado con las

deficiencias combinadas de todas las protenas dependientes de vitamina K, incluidas

las protenas procoagulantes protrombina, VII, IX y X, y los anticoagulantes protena

C y protena S (19). La vitamina K es una vitamina liposoluble y es el cofactor para

la carboxilacin del carbono gamma de los residuos de cido glutmico en los

factores dependientes de vitamina K. El dficit de vitamina K en un paciente produce

episodios hemorrgicos leves a graves.

609
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