Food Enzymes 11042013 HT

11/04/13 Untitled Document
II. GENERALIDADES SOBRE ENZIMAS
PROF. DR. MARIO SAPAG-HAGAR

PROF. DR. HERMANN SCHMIDT-HEBBEL
1. LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES BIOLGICOS.
1.1. Definiciones y Unidades de actividad (3, 5, 6).
Las enzimas son biocatalizadores complejos de gran especificidad y eficiencia, producidos por las
clulas de organismos vivos, que aumentan la velocidad de las reacciones biolgicas a travs de vas
bien definidas y cuya actividad est sujeta a regulacin. Las sustancias sobre las que actan las
enzimas, transformndolas, se denominan substratos.
La actividad de las enzimas se expresa generalmente por la, velocidad de la reaccin catalizada, a
travs de las siguientes UNIDADES:
UNIDAD INTERNACIONAL DE ACTIVIDAD ENZIMTICA: Es la cantidad de enzima que cataliza la

transformacin de 1 micromol de substrato por minuto, bajo condiciones bien definidas (condiciones
estndar). Esta es la expresin bsica de la velocidad de la reaccin. Se ha sugerido que la
temperatura debe ser, en lo posible, de 30C y que las otras condiciones, tales como pH y
concentraciones de substratos, debieran ser las ptimas para la actividad enzimtica.
KATAL (smbolo: kat): Es la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de 1 mol de substrato
por segundo. Esta unidad ha sido introducida recientemente por la Unin Internacional de Bioqumica 1
kat = 6 x unidades internacionales.
La Unidad Anson se ocupa cuando se usa hemoglobina como substrato: 1 Unidad Anson = aquella
cantidad de enzima que, bajo las condiciones del test, libera 1 mmol (1 milimol = mol) de
aminocidos positivos al reactivo de Folin por minuto, calculados como tirosina. La miliunidad Anson
corresponde a 1 mol (= mol) de tirosina.
(El R. de Folin - Ciocalteu para fenoles contiene tungstato y molibdato de sodio, sulfato de litio, HC1,
y bromo y da color violeta con los aminocidos fenlicos) (36,76).
ACTIVIDAD ESPECFICA: Es el nmero de unidades de enzima por mg de protena. Es una medida

muy utilizada para expresar la actividad de preparaciones enzimticas.
ACTIVIDAD MOLECULAR (nmero de recambio): Es el nmero de molculas de substrato,

transformadas, por minuto, por una molcula de enzima. Se calcula dividiendo la velocidad mxima de
la enzima por el peso molecular; es una caracterstica de las enzimas individuales y no refleja la
pureza de la preparacin.
Si la enzima respectiva contiene un grupo prosttico, una coenzima o un centro cataltico (vanse
stos ms adelante), cuya concentracin sea medible, la actividad enzimtica puede expresarse
tambin por el nmero de molculas de substrato, transformadas por minuto, por cada centro cataltico
(10).
1.2. Estructura de las enzimas.
Son protenas cuyo peso molecular cubre un amplio rango. Por ej., La ribonucleasa, que hidroliza los
cidos ribonucleicos, tiene un PM de 13.700 daltons y est constituida por una sola cadena
polipeptdica de 124 aminocidos. En cambio, la aldolasa, una enzima implicada en el metabolismo de
mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/parte02/01.html 1/3
la glucosa, est constituida por 4 subunidades de 40.000 daltons cada una.
1.3 Cofactores y Coenzimas (4-9).
Existen enzimas cuya funcin cataltica se debe exclusivamente a su naturaleza proteica, pero hay
otras en que sus propiedades catalticas, aunque relacionadas con su naturaleza proteica, dependen
para su actividad ptima de la presencia de una estructura no proteica y termoestable llamada
cofactor. Los cofactores pueden ser simples iones inorgnicos
o sustancias orgnicas ms o menos complejas.
Cuando los cofactores orgnicos estn fuertemente unidos a la protena enzimtica (por enlace
covalente) y son especficos para esa enzima, se denominan grupos prostticos (p. ej., el grupo de la
hemoglobina). Si los cofactores orgnicos estn ms dbilmente unidos (interaccin no covalente) a la
protena y por ello no se asocian a ella permanentemente (generalmente se unen slo en el curso de la
reaccin), se denominan coenzimas. La mayora de estas coenzimas derivan de las vitaminas,
especialmente las del complejo B. Muchas dishidrogenasas requieren la coenzima nicotinamida-
adenina-dinucletido (NAD+) o su derivado de fosfato (NADP+), las cuales provienen de la niacina. El
cido pantotnico es un componente esencial de la coenzima A, la cual funciona como un
transportador transitorio de grupos acilo en el metabolismo. La biotina es un transportador de en
las enzimas que catalizan ciertas reacciones de carboxilacin y decarboxilacin. El cido
tetrahidroflico, una forma reducida de la vitamina, el cido flico, participa en las reacciones de
transferencia de grupos de un tomo. La vitamina B12, en su forma de coenzima, funciona en la
transferencia de grupos alquilo de ciertas reacciones enzimticas.
En el lenguaje corriente de la enzimologa, el componente proteico se denomina apoenzima y el

complejo completo de protena y cofactor se llama holoenzima. Generalmente la apoenzima es inactiva
como catalizador. Algunas enzimas requieren dos o tres cofactores distintos y corrientemente uno de
ellos es un ion metlico.
1.4. Substratos de Enzimas.
Constituyen las sustancias que son transformadas especficamente por las enzimas.
Se usan para medir la actividad cataltica de las enzimas y, secundariamente, tambin para determinar
el carcter especifico de una accin enzimtica.
Para que una sustancia sea apropiada como substrato de una enzima debe reunir los siguientes
requisitos:
a) Que experimente una transformacin bien definida por la accin cataltica de la enzima;
b) Que sea especfica para la enzima respectiva o el grupo muy restringido de enzimas. Ej.: el almidn
para las alfa- y beta- amilasas;
c) Que segn las condiciones del ensayo, previamente fijadas, no sufra una descomposicin
espontnea o produzca otras reacciones no catalizadas por la enzima;
d) Que la transformacin del substrato que es catalizada por la enzima. Sea fcilmente medible.
Ejemplos son los siguientes:
- formacin estequiomtrica de un producto coloreado;

- una modificacin definida en la absorcin al ultravioleta (ej.: NADH;
- liberacin de un cido o de un lcali que sean medibles por titulacin (ej.: liberacin de carboxilos en
la pectina por la pectino-estearasa);
- si no se dan estas posibilidades, por acoplamiento con otras reacciones qumicas o enzimticas,
llamadas reacciones indicadoras (por ej.: la reaccin qumica (de fosfatasa en leche), del fenol liberado
con la dibromoquinon-clorimida para dar indofenol, de color azul).
Otro ejemplo de una segunda reaccin enzimtica acoplada es la transformacin especfica de la

glucosa por la glucosa-oxidasa en D-glucono-delta-lactona y perxido de hidrgeno. Este ltimo es
desdoblado por adicin de peroxidasa con liberacin de oxgeno, reconocible por un reactivo
cromgeno, que acta como donador de hidrgeno, como la orto-toluidina o la paraanisidina;
midindose, finalmente, la intensidad de la coloracin resultante.
Los substratos enzimticos pueden tener dos orgenes:
- Substratos naturales de las respectivas enzimas, como por ej., El almidn (para amilasas) o el etanol
(para la alcohol dehidrogenasa);
- Derivados de substratos naturales, obtenidos por sntesis con una estructura qumica tal que an son
reconocidos y transformados por la respectiva enzima con formacin de productos, ya sea coloreados
o fcilmente medibles por otro mecanismo. Ejemplos son: 4-nitroanilidas de aminocidos, para
proteasas, y
- nitrofenil-derivados de azcares, para glucosidasas.
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2. PROPIEDADES GENERALES DE LAS ENZIMAS
Ya hemos mencionado que las enzimas, por ser protenas, tienen pesos moleculares altos. Esto hace
difcil su caracterizacin por mtodos fsicos o qumicos.
2.1. Efecto de la temperatura sobre las enzimas (3,6).
Puesto que la estructura proteica es la que determina la actividad enzimtica, cualquier causa que
perturbe esta estructura puede llevar a una prdida de actividad. Aunque el rango general de
temperaturas adecuadas para las reacciones enzimticas es muy estrecho, los cambios ligeros suelen
tener una considerable influencia. La temperatura ptima para la mayora de las reacciones
enzimticas est, con pocas excepciones, entre 30C y 40C, en que la actividad es mxima. Al
aumentar la temperatura, la velocidad de reaccin aumenta y, para casi todas las enzimas, un
incremento de 10C duplica e incluso triplica la velocidad de reaccin. Por otro lado, sin embargo,
ese mismo aumento de temperatura acelera tambin la inactivacin de la enzima por desnaturalizacin
trmica. Para muchas enzimas la regin de inactivacin trmica extensiva est muy prxima de la
temperatura ptima.
Las enzimas muestran, a menudo, una marcada fragilidad trmica. Cuando se calientan a
temperaturas superiores a los 50C la mayora de las enzimas, pero no todas, se denaturan, y unas
pocas muestran desnaturalizacin cuando se enfran aproximadamente a 5C. A temperaturas bajas,
aunque la actividad enzimtica procede muy lentamente, ella no se detiene del todo, hecho que debe
tenerse en cuenta en la industria congeladora de alimentos. A menos que se inactiven previamente las
enzimas objetables, la mayora de los alimentos congelados experimentan un considerable deterioro
despus de un almacenamiento prolongado, porque a temperaturas tan bajas como -18C algunas
reacciones enzimticas siguen teniendo lugar. Habitualmente la desnaturalizacin a alta temperatura
es irreversible, debido a que se rompen las fuerzas dbiles de enlace al aumentar la vibracin trmica
de los tomos componentes, fenmeno que daa la estructura tridimensional.
Es importante sealar que una misma enzima, aislada de tejidos diferentes, puede tener diferente
capacidad de resistencia a la desnaturalizacin suave por el calor, hecho que es til con fines de
identificacin o de diagnstico.
Otras aplicaciones de la desnaturalizacin por el calor son la esterilizacin de alimentos e

instrumentos y la pasteurizacin de la leche; ambos procesos dependen de la destruccin rpida por
calor de las enzimas esenciales de los microorganismos contaminantes.
La mayora de las enzimas son, pues, muy termolbiles y habitualmente es suficiente aplicar una
temperatura de 40 a 80C por 2 a 5 minutos, a fin de destruir su actividad.
Es este hecho de inactivacin completa de las enzimas el que se utiliza ampliamente en la industria
alimentara. En la mayor parte de los casos de preservacin de alimentos, es deseable que no haya
continuacin alguna de actividad enzimtica.
Si ello ocurriera se podra producir, por ejemplo, un cambio en el color de la clorifila o de los
carotenoides, o producirse el pardeamiento de varios alimentos; podra alterarse el sabor de los
hidratos de carbono, o producirse la rancidez de las grasas. Tambin la persistencia de actividad
enzimtica podra provocar cambios en el aroma o en el valor nutritivo de las protenas (o de las
vitaminas) y, finalmente, la presencia de enzimas pectinolticas puede producir un cambio total en la
textura de los alimentos.
El tratamiento con calor es, sin duda, un mtodo adecuado para la destruccin de microorganismos
que alteran los alimentos (esterilizacin por calor y pasteurizacin). De esta manera un procesamiento
trmico adecuado puede lograr simultneamente la preservacin microbiolgica y la estabilizacin de
los alimentos. A veces la actividad residual de una enzima (no necesariamente objetable) se usa como
prueba de la suficiencia de un proceso de tratamiento con calor.
As, la ausencia de actividad fosfatsica de la leche es un buen indicador de si la leche ha sido

pasteurizada adecuadamente, ya que esta enzima se inactiva completamente por la dosis de
tratamiento trmico necesaria para destruir agentes patgenos.
Las enzimas difieren ampliamente en su resistencia a la inactivacin trmica. Las peroxidasas

vegetales son particularmente estables (120C por unos minutos no son suficientes para destruirlas
del todo). La velocidad de inactivacin trmica depende tambin del pH, fuerza inica y del estado
fsico de la enzima en el material alimentario: si la enzima est igualmente bien distribuida por todo el
producto o adsorbida sobre partculas slidas (como ocurre con las enzimas pectinolticas y las
fenolasas, las cuales estn adsorbidas en la pulpa de varios jugos de frutas).
Existen situaciones en la tecnologa de alimentos en las que algunas enzimas, a pesar de haber sido
inactivadas, se "regeneran" y su actividad se renueva despus de cierto tiempo. Este tipo de
regeneracin enzimtica ha sido observada en los casos de peroxidasas (leche, verduras); catalasa
(verduras); lipasa (productos de la leche) y enzimas pectinolticas (jugos ctricos). La regeneracin
seria el resultado de una reorganizacin, al menos parcial, de la molcula proteica, restablecindose
las estructuras de los sitios activos que haban sido alterados por la desnaturalizacin.
La reversin de la desnaturalizacin es un proceso lento, pero durante el almacenamiento prolongado

de los alimentos procesados habra tiempo suficiente para la regeneracin, detectable, de algunas
enzimas. De esta manera, la estabilidad de los alimentos con respecto al dao de stos por las
enzimas es una funcin tanto de la "profundidad" de la inactivacin trmica como del tiempo y
condiciones de almacenamiento.
2.2. Efecto de las radiaciones (3).
Las enzimas se afectan tambin por irradiacin con ondas electromagnticas. La inactivacin por luz
ultravioleta se debera a la fotolisis de grupos disulfuro y aromticos de los aminocidos que
constituyen las protenas. La inactivacin de la pepsina se atribuye a la oxidacin del grupo fenlico de
la tirosina. Estos efectos sobre las enzimas son de escaso rendimiento, por lo que la luz ultravioleta no
es de aplicacin prctica, desde este punto de vista, en la tecnologa alimentara.
En cambio, la irradiacin de los alimentos con radiaciones ionizantes (radiaciones beta, gamma, etc.)
es de considerable importancia en el procesamiento de alimentos y ya est en uso en escala
comercial. Uno de los mayores problemas en este campo es el hecho de que la destruccin de las
enzimas requiere de dosis de radiacin mucho ms elevadas que para la destruccin de los
microorganismos. En algunos casos es ms prctico utilizar en forma combinada calor e irradiacin
para inactivar enzimas.
La actividad lipoxidsica puede reducirse al 67% de su valor inicial por irradiacin a pH7 con 9x rad.
Existe una prdida adicional postradiacin. Si la enzima se irradia y luego se calienta, el efecto de
ambos tratamientos es sinergstico. Si la enzima se calienta primero y luego se irradia, el efecto es
meramente aditivo.
2.3. Efecto de la humedad (3,4).
En los alimentos, al igual que en cualquier sistema biolgico, el agua es uno de los componentes ms
importantes.
Por ser un solvente, el agua sirve para poner en contacto a las diversas molculas que interactan.
Adems, la reactividad de muchas sustancias depende de la disociacin inica y de la configuracin
molecular y, por lo tanto, de la hidratacin. El agua es a menudo uno de los reactantes o uno de los
productos de la reaccin.
Hoy se sabe que la influencia del agua sobre la reactivacin del sistema no est relacionada slo con
el contenido real de agua, sino tambin con el estado de las molculas de agua.
La disponibilidad de agua es una funcin tanto del contenido como del estado y se expresa
adecuadamente por el concepto denominado "actividad del agua" ( ) que equivale a la relacin entre la
presin de vapor de agua sobre el sistema (p) y la presin de vapor del agua pura (Po) a la misma
temperatura:
Si los alimentos fueran simples mezclas de agua con sustancias inertes que no interactan de ninguna
manera con las molculas de agua, la actividad del agua seria siempre 1, cualquiera sea el contenido
de agua.
Los alimentos son sistemas en los cuales parte del agua est fuertemente absorbida sobre la
superficie de sustancias polimricas (protenas, carbohidratos macromoleculares). Esto queda
claramente establecido por el hecho que la presin de vapor del agua sobre un alimento con un
contenido de humedad bajo o intermedio es considerablemente menor que el que predice la Ley de
Raoult. Esto se conoce como "agua ligada". En estos casos; la actividad del agua es inferior al valor
que le correspondera por su concentracin. Una de las razones para este efecto es el hecho que el
"agua libre" est parcialmente atrapada en la estructura porosa del alimento y, por lo tanto, est sujeta
a la accin depresora de los capilares sobre la presin de vapor. A niveles ms altos del contenido de
humedad el sistema se comporta en realidad como una solucin acuosa. De hecho la concentracin
molar de los solutos es habitualmente tan baja que la actividad del agua pronto alcanza valores
cercanos a la unidad.
La disponibilidad de agua, medida como actividad del agua, tiene una fuerte influencia sobre la
velocidad de las reacciones por enzimas, es decir, la actividad enzimtica aumenta al aumentar el
contenido de "agua libre" y ello ocurre no slo en las reacciones hidrolticas, en las que el agua es uno
de los reactantes obvios, sino tambin en las reacciones no-hidrolticas.
La velocidad de las reacciones enzimticas se ve fuertemente influida por la naturaleza y concentracin

de los solventes.
En la prctica es de gran importancia el efecto de la cantidad de humedad de los alimentos sobre la

velocidad de la reaccin enzimtica. Incluso en los alimentos denominados desecados la accin
enzimtica procede a una velocidad medible.
A niveles muy bajos de humedad, la actividad enzimtica puede ser afectada cualitativamente. Es el
caso de la -amilasa que a una humedad del 20 %o (o 4% de "agua libre") produce principalmente
glucosa y maltosa a partir de almidn. A niveles ms elevados de humedad se forman tambin otros
oligosacridos. Quizs lo que ocurre es que a niveles muy bajos de "agua libre", la rigidez del medio
impide la difusin de la enzima o del substrato, limitndose as la hidrlisis a aquellas porciones del
substrato que estn en contacto inmediato con la enzima.
En los cereales y harinas almacenados es posible detectar, fcilmente, actividad lipoltica y

proteoltica. A niveles de humedad superiores a 15% esta actividad es debida, generalmente, a las
enzimas de los hongos que crecen en el cereal y que pueden participar tambin en las reacciones
hidrolticas, desarrollndose amargor o rancidez por la accin enzimtica sobre la fraccin proteoltica
o lipdica durante el almacenamiento.
Los mtodos modernos de liofilizacin de carnes y verduras han introducido problemas similares a
estas industrias. La actividad enzimtica se determina generalmente en estos casos por mtodos
autolticos, ya que la velocidad de la reaccin enzimtica es baja. Por ejemplo, en el msculo de cerdo
liofilizado se usa la desaparicin del glicgeno muscular como un ndice de actividad enzimtica a
diferentes niveles de humedad.
2.4. Efecto del pH y del estado inico (3,6).
La actividad enzimtica guarda tambin relacin con el estado inico de la molcula y, especialmente,
de la parte proteica, puesto que las cadenas polipeptdicas contienen grupos que pueden ionizarse
(principalmente grupos carboxilos y aminos de los aminocidos constituyentes) en un grado que
depende del pH existente. Como ocurre con las protenas, las enzimas poseen un punto isoelctrico al
cual su carga libre neta es cero. El pH del punto isoelctrico, como regla, no es igual al pH al cual se
observa actividad mxima. El pH ptimo de las enzimas varia ampliamente; la pepsina, que existe en
el medio cido del estmago, tiene un pH ptimo de alrededor de 1,5, mientras que la arginasa tiene
un pH ptimo de 9,7. Sin embargo, la gran mayora de las enzimas tienen un ptimo entre pH 4 y 8.
Algunas enzimas muestran una amplia tolerancia a los cambios del pH, pero otras trabajan bien slo
en un rango estrecho. Cualquier enzima que se someta a valores extremos de pH, se desnaturaliza.
Esta sensibilidad de las enzimas a la alteracin del pH es una de las razones por la que la regulacin
del pH del organismo es controlada celosamente y explica por qu las desviaciones de la normalidad
pueden implicar graves consecuencias.
Muchas enzimas existen en el organismo a un pH ms bien alejado de su valor ptimo. Esto se debe,
en parte, a la diferencia del medio ambiente "in vivo" con respecto al "in vitro". Esto recalca tambin
que el control, del pH puede representar un importante medio para regular la actividad enzimtica.
Las protenas sufren cambios en su solubilidad, presin osmtica y viscosidad a diferentes valores de
pH. Es probable que el cambio en la actividad enzimtica, al variar los valores de pH, se deba a los
cambios en la ionizacin ya sea de la enzima, del substrato o del complejo enzima-substrato.
A1 determinar la velocidad de reaccin de una enzima y para cierta concentracin de substrato, a

diferentes valores de pH, se observa que la curva resultante tiene forma de campana. Se le denomina
curva de pH: actividad. Esta curva no caracteriza, necesariamente, a una enzima, puesto que el pH
ptimo puede variar para diferentes substratos, ni tampoco son similares las curvas de pH: actividad
para dos enzimas que hidrolizan el mismo enlace en un substrato. Por ejemplo, las
pectinometilesterasas hidrolizan especficamente los enlaces ster de polimetilgalacturonatos. La
pectinometilesterasa obtenida de un hongo tiene un pH ptimo de 5,0; la de frjoles tiene su ptima
actividad a pH cercano a 8,5.
Estas diferencias sobre los pH ptimos de enzimas que actan sobre substratos similares es de la
mayor importancia en el procesamiento de alimentos. Una enzima tiene que tener buena actividad
proteoltica a un pH de 4,5 a fin de ser una enzima a prueba de congelacin, o a niveles de pH
superiores a 5,5 para ser un buen ablandador de carne. Para la mayora de las aplicaciones prcticas,
el pH del alimento no puede ser ajustado como para adecuarlo al pH ptimo de una enzima
determinada. La enzima debe escogerse en base a su actividad al pH natural del alimento. Existen
algunas excepciones notables en que es factible y prctico el ajuste del pH. Para la produccin de
glucosa, la pasta de almidn se ajusta a un pH entre 5 y 7 para la hidrlisis ptima por la alfa-amilasa
bacteriana. En cambio, el pH se ajusta entre 4 y 6 para la ptima sacarificacin por la amilasa de
hongos o de cereales.
La velocidad de inactivacin de las enzimas vara para los diferentes valores de pH y, por lo tanto, un
alza en la temperatura puede cambiar el pH ptimo. As, en la industria de cereales el aumento de
temperatura hace variar el pH ptimo de la beta-amilasa hacia valores ms altos de pH. Puede
aplicarse una variacin intencional del pH para destruir especficamente una enzima como, por
ejemplo, la inactivacin diferencial de alfa-amilasa y proteasas en preparaciones enzimticas de
hongos.
Es necesario recalcar, sin embargo, que el trmino "pH ptimo" no tiene una significacin fsico-
qumica bien definida. Es mejor, en general, referirse a un rango de pH favorable para una reaccin
dada. Este rango depende no slo de la naturaleza de la enzima particular, sino tambin del substrato
y de la concentracin de ste, de la estabilidad de la enzima, de la temperatura y de la extensin del
periodo de reaccin.
2.5. Sitio activo y especificidad enzimtica (5,8).
Algunas enzimas tienen una especificidad prcticamente absoluta para un determinado substrato y no
atacarn ni siquiera a molculas muy relacionadas. Por ejemplo, la enzima aspartasa cataliza la
adicin reversible de amoniaco. Al doble enlace del cido fumrico, pero a ningn otro cido no
saturado.. La aspartasa tambin presenta una rgida estereoespecificidad y especificidad geomtrica;
por eso no desamina D-aspartato ni adiciona amonaco al maleato, que es el ismero geomtrico-cis
del fumarato. Otro ejemplo de especificidad absoluta es el de la maltasa verdadera, que slo desdobla
al azcar maltosa. En el otro extremo estn las enzimas que tienen una especificidad relativamente
amplia y actan sobre muchos compuestos que presentan una caracterstica comn. Por ejemplo, la
fosfatasa de rin cataliza la hidrlisis de muchos steres diferentes del cido fosfrico, pero a
velocidades variables. Otro ejemplo lo constituyen las lipasas, que pueden romper la unin entre el
cido y el alcohol en el lpido, en tanto sta sea una unin ster (desdoblan igual etilbutirato que un
triglicrido).
Del estudio de la especificidad de las enzimas por el substrato surgi la idea de que existe una
relacin complementaria tipo llave-cerradura entre la molcula de substrato y un rea especfica sobre
la superficie de la molcula de la enzima, denominada el sitio activo o sitio cataltico, al cual se une la
molcula del substrato, mientras experimenta la reaccin cataltica.
Dos caractersticas estructurales determinan la especificidad de una enzima por su substrato: a) el

substrato debe poseer el enlace qumico especfico o unin, que puede ser atacado por la enzima, y b)
el substrato debe tener habitualmente algn otro grupo funcional, un grupo de unin, que se une a la
enzima y ubica en posicin a la molcula de substrato de modo que el enlace susceptible se disponga
apropiadamente en relacin al sitio activo de la enzima.
2.6. Isoenzimas (6,9).
Los isoenzimas constituyen formas moleculares mltiples de una misma enzima que catalizan
fundamentalmente la misma reaccin, pero difieren en sus propiedades qumicas, fsicas, estructurales
o inmunoqumicas; Se originan estas diferencias en su biosntesis, debido a causas genticas. Su
diferencia radica en la estructura primaria de su protena, ocurriendo como dmeros o tetrmeros,
compuestos ya por subunidades idnticas o no.
Muchas enzimas existen en la misma especie o tejido y aun dentro de la misma clula. A menudo
limitadas a un rgano, pueden pertenecer, sin embargo, tambin a organismos diferentes (enzimas
isodinmicas).
Uno de los ejemplos ms conocidos de isoenzimas es el de la dehidrogenasa lctica que est

presente en los tejidos animales en 5 formas, separables por electroforesis. Estas 5 isoenzimas estn
constituidas por la combinacin de dos clases diferentes de cadenas polipeptdicas, de un peso
molecular de 33.500 cada una: Las cadenas "M" (de msculo) y "H" (de heart, corazn).
Para identificar y diferenciar isoenzimas se usan mtodos cromatogrficos (en columna);

electroforticos (en papel o gel); inhibidores qumicos (ditio-treitol) o los respectivos antisueros contra
isoenzimas. Estos ltimos representan anticuerpos inhibidores obtenidos por va inmunolgica (de
sueros ovinos o caprinos) que actan generalmente por precipitacin en la solucin reactiva, al ser
insoluble el complejo enzima - antisuero.
La identificacin y diferenciacin de isoenzimas tiene aplicacin en el diagnstico de ciertas

enfermedades para poder localizarlas en un determinado rgano como, por ejemplo, en el infarto
cardiaco, mediante las isoenzimas de la creatin-fosfokinasa (CPK).
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3. MECANISMO DE LA CATALISIS ENZIMTICA (5,8).
3.1. La energa de activacin y los efectos de los catalizadores.
Una reaccin qumica tal como A P tiene lugar debido a que un cierto nmero de las molculas A,
en un momento determinado, poseen ms energa que el resto de la poblacin, suficiente para
alcanzar un estado "activado", en el cual puede formarse o romperse un enlace qumico, para formar el
producto P. Se denomina energa libre de activacin a la cantidad de energa en caloras que se
requiere para llevar todas las molculas de un mol de una sustancia, a una temperatura dada, al
estado reactivo. Por estado de transicin se entiende el estado, rico en energa, de las molculas
reaccionantes en el tope o cumbre de la barrera de activacin, sobrepasada la cual, se produce la
reaccin.
La velocidad de una reaccin qumica es proporcional a la concentracin de las molculas en estado

de transicin. La velocidad de una reaccin qumica puede acelerarse, subiendo la temperatura (la cual
aumenta el movimiento trmico y la energa, aumentando as el nmero de molculas en est estado
de transicin) o mediante un catalizador, el cual acta haciendo bajar la energa de activacin. Los
catalizadores, como las enzimas, se combinan con los reactantes y producen un estado de transicin
que tiene menos energa libre que el estado de transicin de la reaccin no catalizada: Ellos no alteran
los equilibrios de reaccin. Una vez formados los productos de la reaccin, el catalizador libre es
nuevamente regenerado.
3.2. El mecanismo de la accin enzimtica.
No se conoce bien an el mecanismo preciso de la catlisis para ninguna enzima. Sin embargo, se
sabe que los cidos y bases (es decir, dadores y aceptores de protones, respectivamente) son
catalizadores muy verstiles, que pueden aumentar las velocidades de muchos tipos de reacciones
orgnicas, tales como la hidrlisis de steres y de compuestos fosforilados, la adicin de agua a
grupos carbonilos, as como la eliminacin de agua de los alcoholes para producir compuestos no
saturados. Se puede extrapolar esto a las enzimas, las que contienen grupos dadores de protones (
, carboxilos, sulfhidrilos) as como grupos aceptores de protones ( y carboxilatos -COO).
Tambin los grupos nucleoflicos son catalizadores eficaces. Se trata de grupos funcionales ricos en
electrones que pueden donar un par de electrones al ncleo de algn otro tomo. Grupos nucleoflicos
tpicos son los grupos hidroxilo, sulfhidrilo e imidazol, que se sabe estn tambin presentes en las
protenas. Es as que en diferentes enzimas son ciertos grupos funcionales de los aminocidos
integrantes de su molcula proteica los que participan como centro activo en el proceso cataltico,
como sucede con el grupo epsilon-amino de la lisina (base de la determinacin de la llamada "lisina
aprovechable") (11), el grupo sulfhidrlico de la cistena, el de la cerina y el resto imidazlico de
la histidina.
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4. REGULACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA (6,8).
4.1. Mecanismos reguladores.
Existen varios:
a) Variaciones por accin de masas.
Es el mecanismo regulador ms primitivo y mediante l la velocidad de la reaccin puede variarse,

alterando la concentracin del substrato, del producto (si la reaccin es lo suficientemente reversible
como para que la concentracin del producto afecte significativamente la reaccin opuesta) o de
cualquiera de los cofactores que intervienen estequiomtricamente en la reaccin.
b) Variacin de la actividad especfica de la enzima por activacin o inhibicin.
Se ha hecho evidente que las enzimas estn sujetas a la regulacin de su capacidad cataltica, ya sea
en direccin positiva o negativa, o en ambas, mediante molculas pequeas que han sido
denominadas efectores o moduladores. Este tipo de sustancias incluye substratos, productos,
metabolitos posteriores a una va metablica, precursores de una ruta metablica e incluso metabolitos
que participan en una va metablica aparentemente no relacionada.
En la mayora de los sistemas multienzimticos, es decir, aquellos en que intervienen

secuencialmente varias enzimas y en que el producto de una es el substrato de la siguiente, la primera
enzima de la secuencia funciona como reguladora de la velocidad de todo el sistema y se denomina
enzima reguladora o enzima alostrica. Habitualmente esta enzima es inhibida por el producto final de
la secuencia, de tal modo que cuando se produce acumulacin del producto final por sobre cierta
concentracin crtica, ste inhibe a la primera enzima de la secuencia (enzima reguladora),
interrumpiendo o cerrando as ese segmento del metabolismo. Este tipo de inhibicin se conoce como
inhibicin por producto final o retroinhibicin (inhibicin "feedback"). Las enzimas reguladoras o
alostricas estn formadas por dos a ms subunidades, las que tienen sitios de unin no slo para su
substrato normal, sino tambin para el metabolito regulador, el cual se denomina efector o modulador
alostrico. El sitio de unin para el modulador se denomina sitio alostrico y es altamente especifico
para ese metabolito. Cuando el sitio alostrico est desocupado, la enzima funciona con su velocidad
cataltica normal; en cambio, si est ocupado por el metabolito regulador, la enzima sufre una
modificacin en su conformacin a una forma menos activa o ms activa, dependiendo de s el
modulador es inhibidor o estimulador.
La inhibicin de la actividad enzimtica por molculas especificas y por iones es importante porque
sirve como mecanismo de control mayoritario en los sistemas biolgicos. Tambin muchos frmacos y
agentes txicos actan inhibiendo a las enzimas. Es ms, la inhibicin enzimtica puede suministrar
una idea acerca del mecanismo de la accin enzimtica.
La inhibicin enzimtica puede ser reversible o irreversible. En la inhibicin irreversible, el inhibidor

queda covalentemente unido a la enzima o ligado tan fuertemente, que su disociacin de la enzima es
lenta; produciendo una modificacin permanente de algn grupo funcional del sitio activo de la enzima.
Ejemplos de los inhibidores irreversibles son las sales de metales pesados y el yodoacetato que se
fijan en los esenciales grupos sulfhidrlicos de enzimas y, por otra parte, el di-isopropil-fluorofosfato
(uno de los potentes gases txicos del sistema nervioso) que inhibe a la enzima acetilcolinoesterasa al
unirse a una serina fundamental del sitio activo, bloquendolo.
La inhibicin reversible, en cambio, se caracteriza por un rpido equilibrio entre el inhibidor y la enzima.
Ejemplos lo constituyen la inhibicin competitiva y la no competitiva.
Los inhibidores competitivos son aquellos cuya accin puede ser revertida aumentando la
concentracin de substrato. Habitualmente tienen una estructuran con l, por unirse al sitio activo. Un
ejemplo es el malonato, que se asemeja al succinato y por ello inhibe e la succinato-deshidrogenase.
El inhibidor no competitivo no se une al sitio del substrato, sino a un grupo de la enzima, que es
esencial para su funcin. La inhibicin no competitiva no puede ser revertida por el substrato. Un
ejemplo lo constituye la inhibicin de algunas enzimas que contienen Fe, por el cianuro, el cual se
combina reversiblemente con el tomo de Fe, dando una forma inactiva.
c) Variacin de la concentracin de la enzima.
Hoy se reconoce que uno de los principales mecanismos reguladores se basa en la alteracin de la
cantidad absoluta de enzima en la clula. La concentracin de la enzima es la resultante entre las
velocidades que llevan a su sntesis y a su degradacin. Se denomina induccin al aumento de la
concentracin de la enzima por aumento en su sntesis y represin a su disminucin por disminuir la
sntesis. La sntesis de protenas, y por lo tanto de las enzimas, est regulada primordialmente a nivel
de la transcripcin del DNA, para dar RNA mensajero. La transcripcin de un gen o de un grupo
coordinado de genes (lo que se llama un opern) puede reprimirse al unirse una sustancia represora a
un gen operador que forma parte del opern.
Puede des-reprimirse (o sea, producir induccin) por la presencia de ciertos metabolitos reguladores
(molculas inductoras), que puede ser un substrato de la enzima codificada por el gen reprimido.
Este tipo de mecanismos reguladores que implica alteracin en la velocidad de sntesis de una enzima
conlleva una apreciable cantidad de tiempo (desde una hora hasta varios das).
4.2 Importancia de la induccin y represin enzimticas para mejorar la calidad de los

alimentos: Los biorreguladores (12).
Actualmente es posible mejorar la calidad nutritiva y las caractersticas fsicas de las cosechas de
alimentos mediante el uso de biorreguladores, los cuales permiten manipular la expresin gentica de
las plantas individuales. El uso de biorreguladores en los frutos ctricos des-reprime genes especficos
de los frutos, induciendo la produccin de cantidades adicionales de componentes que aumentan su
color, sabor, aroma y calidad nutricional (provitamina A). Hay varias clases de biorreguladores que
inducen la formacin de carotenoides (carotenos, licopeno), cuando se aplican en bajas
concentraciones a la superficie del fruto ctrico maduro. Entre ellos estn los derivados de las
chalconas de la trietilamina y de la dietilnonilamina.
Importancia de los biorreguladores.
a) La induccin de la sntesis de carotenoides puede lograrse, en teora, en cualquier especie que

porte los genes que codifican para las enzimas que sintetizan dichos carotenoides (todas las frutas
ctricas, damascos, duraznos, tomates, zanahorias). Esta universalidad de efecto sugiere que los
biorreguladores actan a travs de una va comn. La des-represin de un gen especifico, pues, puede
revertir los efectos de aquellas sustancias qumicas que se sabe reprimen los genes que codifican la
formacin de carotenoides en Ficomices.
El nico proceso ligeramente comparable es el del uso del etileno para promover la maduracin de
frutas ctricas y tomates; Sin embargo, el etileno es un estimulador amplio, que acelera toda la
actividad metablica en la fruta no madura (77). Los biorreguladores, en cambio, estimulan slo vas
metablicas especificas en frutas completamente maduras.
b) Podra ser posible encontrar otros biorreguladores para aumentar el contenido de un determinado
aminocido en el maz o aumentar la concentracin de protenas en el arroz, etc.
c) Los biorreguladores pueden aportar una nueva arma para aprender ms acerca de los mecanismos
que controlan los genes. Su futuro es muy promisorio, como lo demuestran los recientes trabajos de
Yokoyama y su grupo en el laboratorio del Depto. de Agricultura en California (12). Ellos han
identificado, adems de los biorreguladores ya mencionados, otros que aumentan el aroma, como, por
ejemplo, uno que induce 3,5 veces el contenido en citral de los limones maduros, un constituyente de
la esencia que contribuye en forma importante al aroma del limn.
III. CLASIFICACIN DE LAS ENZIMAS CLASIFICACIN GENERAL.
Actualmente, mas de mil enzimas han sido aisladas y clasificadas de acuerdo con el substrato
especfico sobre el cual actan.
Entre las numerosas clasificaciones, algunas se basan en las reacciones que catalizan las enzimas,
otras en el substrato sobre el que actan e incluso muchas enzimas se designan con nombres triviales
de origen histrico.
La comisin de Enzimas de la Unin Internacional de Bioqumica introdujo en 1964, para uniformar la

nomenclatura, la siguiente clasificacin sistemtica, en la cual se consideran 6 grupos principales de
enzimas de acuerdo al tipo reaccin implicada:
1. Oxidorreductasas:
Catalizan una amplia variedad de reacciones de xido-reduccin, empleando coenzimas, tales como
NAD+ y NADP+, como aceptor de hidrgeno. Este grupo incluye las enzimas denominadas
comnmente como deshidrogenasas, reductasas, oxidasas, oxigenasas, hidroxilasas y catalasas.
2. Transferasas:
Catalizan varios tipos de transferencia de grupos de una molcula a. otra (transferencia de grupos
amino, carboxilo, carbonilo, metilo, glicosilo, acilo, o fosforilo). Ej.: aminotransferasas (transaminasas).
3. Hidrolasas:
Catalizan reacciones que implican la ruptura hidroltica de enlaces qumicos, tales como C=O, C-N, C-
C. Sus nombres comunes se forman aadiendo el sufijo -asa al nombre de substrato. Ejs.: lipasas,
peptidasas, amilasa, maltasa, pectinoesterasa, fosfatasa, ureasa. Tambin pertenecen a este grupo la
pepsina, tripsina y quimotripsina.
4. Liasas:
Tambin catalizan la ruptura de enlaces (C-C, C-S y algunos C-N, excluyendo enlaces peptdicos),
pero no por hidrlisis. Ejs.: decarboxilasas, citrato-liasa, deshidratasas y aldolasas.
5. Isomerasas:
Transforman sus substratos de una forma isomrica en otra. Ejs.: Epimerasas, racemasas y mutaras.
6. Ligaras:
Catalizan la formacin de enlace entre C y O, S, N y otros tomos. Generalmente, la energa requerida

para la formacin de enlace deriva de la hidrlisis del ATP. Las sintetasas y carboxilasas estn en este
grupo.
CLASIFICACIN DE LAS ENZIMAS DE LOS ALIMENTOS
Braverman (4) distingue dos importantes grupos de enzimas de los alimentos: las Hidrolasas y las
Desmolasas o Enzimas Oxidantes (3, 14).
1. LAS HIDROLASAS comprenden las:
1.1. ESTERASAS, entre las cuales son de importancia en los alimentos:

a) Lipasas, que hidrolizan los steres de cidos grasos;

b) Fosfatasas, que hidrolizan los steres fosfricos de muchos compuestos orgnicos, como, por
ejemplo, glicerofosfatos, almidones fosforilados:
c) Clorofilasas. En la industria alimentara debe tratarse de retener el color verde de la clorofila, en el
caso de los vegetales deshidratados o en conservas. Por ello puede protegerse el color natural
(retencin de clorofila de hasta 60%) por los siguientes tratamientos:
- Pretratamiento por inmersin (ej., Arvejas), a temperatura ambiente, en solucin de bicarbonato de

sodio al 2% por espacio de 30 a 40 min.
- Escaldado en solucin de hidrxido de calcio 0,005 M.
- Procesamiento en salmuera, que lleva adicionada hidrxido de magnesio (0,020-0,025 M.) .
El pH en estos casos se eleva a 8 en el primer tiempo y se mantiene durante el escaldado y la

esterilizacin posterior.
d) Pectino-esterara, enzima importante en la industria de derivados de frutas (vanse stas) .
1.2 CARBOHIDRASAS, que se clasifican en:
a) Hexosidasas, entre las que interesan la invertasa y la lactasa; y

b) Poliasas, que comprenden las amilasas, las celulasas y la poligalacturinasa o pectinasa, que acta
sobre el cido pctico o poligalacturnico, dando molculas de cido galacturnico, carentes de poder
gelificante; de importancia en la elaboracin de zumos y nctares de frutas.
1.3 PROTEASAS, que se clasifican en:
a) Proteinasas, endoenzimas que rompen las uniones peptdicas: -CO-NH de las protenas, algunas de
las cuales son muy resistentes al ataque de la enzima proteoltica, en su estado nativo; por el calor u
otros agentes se puede abrir la molcula proteica, de modo que entonces las uniones peptdicas
pueden ser atacadas por estas enzimas;
b) Peptidasas, que rompen las uniones de los pptidos hasta la liberacin final de molculas de
aminocidos;
c) Catepsinas, a cuya accin en el msculo proteico se deben los procesos autolticos en la
maduracin de la carne. El tejido vivo tiene un pH desfavorable para la accin de estas enzimas, pero a
la muerte del animal baja el pH al acumularse cido lctico por degradacin del glicgeno. Al alcanzar
un pH 4,5 se hace ptimo para la liberacin y accin de la enzima, apareciendo los respectivos
cambios en la textura y dems caracteres de la carne, y
d) Renina, Quimosina o Fermento Lab, que se encuentra en el cuarto estmago del ternero
alimentado slo con leche materna y que causa la coagulacin de la leche (Vase en "Aplicacin de
enzimas en la Industria Lechera") .
2. DESMOLASAS O ENZIMAS OXIDANTES.
Entre ellas son de inters en alimentos:
2.1 Oxidasas, que comprenden:
a) Las Oxidasas Frricas:

Catalasa, responsable de la prdida de color y olor de vegetales congelados, y
Peroxidasa, que se encuentra en verduras y frutas ctricas. Su estudio es de gran inters en la
industria de alimentos por ser una de las enzimas ms estables al calor y requerir mayor tiempo de
inactivacin, con el agravante de que en ciertas condiciones puede regenerar su actividad con el
tiempo;
b) A las Oxidasas Cpricas pertenecen la poli fenol-oxidasa, tirosinasa, catecolasa, relacionadas con
el Pardeamiento Enzimtico (vase ste) y la ascrbico-oxidasa.
2.2 Dehidrogenasas.
Entre stas se encuentran las enzimas siguientes:
Xantino-oxidasa, que es una flavoprotena con molibdeno y cataliza la oxidacin de xantina y

aldehdos como el frmico, actuando como aceptor de H el azul de metileno, al transformarse en su
leuco-derivado; en esto se basa su aplicacin analtica en el control trmico de la leche y en la
deteccin de leche de vaca en leche humana, pues esta ltima no contiene esta enzima;
Lipoxidasa, que cataliza la oxidacin de cidos grasos poliinsaturados y secundariamente tambin al

caroteno de frutas y verduras deshidratadas, a travs de los perxidos formados.
V. ENZIMAS EN TECNOLOGA DE ALIMENTOS
Como es sabido, todo alimento constituye un complejo sistema biolgico, cuyas clulas se encuentran
en equilibrio por accin de las enzimas que encierran. En este contexto, los tejidos provenientes de un
organismo animal o vegetal, que despus de su muerte por matanza, cosecha o preparacin llegan a
convertirse en alimentos, contienen todo el conjunto de enzimas que necesitan para su metabolismo,
tanto anablico como catablico y que persisten despus de la destruccin de los tejidos.
1. LOCALIZACIN DE ALGUNAS ENZIMAS EN LOS ALIMENTOS.
Es importante conocer la distribucin que tienen algunas enzimas en los alimentos. Ellas pueden
encontrarse repartidas en diversa forma, como sucede, p. ej., en la fosfatasa de la leche adsorbida por
sus glbulos grasos o bien, disueltas en el alimento como es el caso de las lipasas en grasas y
aceites. Por otra parte, las encontramos adsorbidas en las partculas slidas como es el caso de las
enzimas pectolticas y las fenolasas, que se encuentran adsorbidas en la pulpa; cuando se procede a
filtrar, el grado de actividad enzimtica disminuye notablemente.
En el trigo, las amilasas estn ubicadas en el germen, no encontrndoselas ni en la capa de aleurona

ni en el salvado. Por otra parte, la actividad proteoltica del higo se encuentra en el ltex que est slo
en la porcin conocida como receptculo del higo y no en el rea de las semillas (22).
Las catepsinas estn localizadas en el lisosoma de las clulas.
2. INHIBICIN DE ENZIMAS DE LOS ALIMENTOS.
Las enzimas pueden inactivarse por el calor, aditivos o componentes naturales de los alimentos.
2.1. Inactivacin por calor.
La precoccin, escaldado o blanching es el mtodo ms conocido y empleado por la industria

alimentara para la inactivacin de las enzimas, de modo que las reacciones enzimticas que inducen
los cambios indeseables, no ocurren durante las siguientes etapas de los procesos. Este mtodo
consiste en exponer durante un tiempo breve, la materia prima cruda a altas temperaturas por corto
tiempo - 3 a 10 minutos - como mximo en el caso de las frutas y se realiza aplicando vapor o por
ebullicin. La aplicacin de vapor tiene la ventaja sobre el agua de que reduce la prdida de las
sustancias solubles en ella como las vitaminas y sales hidrosolubles.
2.2. Inhibicin por aditivos (no permitidos).
Algunos estn prohibidos precisamente por su accin sobre enzimas importantes:
-Acido frmico: por su poder complejante que inhibe enzimas que contienen Fe+++.
-Acidos monocloro- y monobromoactico: por su accin tiolopriva en el sentido de bloquear los grupos
sulfhidrlicos de las enzimas.
-Acido brico: inactiva descarboxilasas, fuera de acumularse en la grasa del organismo.
-Base de amonio cuaternario: que activan la citocromo-oxidasa y enzimas digestivas.
-Acido nordihidro-guayartico: (NDHA-antioxidante), inhibe las catalanas, peroxidasas, alcohol-
dehidrogenasa, fuera de tener una accin alergizante.
2.3. Inhibicin de enzimas por componentes de alimentos:
-Factor antitrptico, que se encuentra en el poroto de soya, clara de huevo (ovomucoide) y zumo de
papa cruda.
-Solanina o solanidina (aglucn) de la papa, que inhibe la colino-esterasa; lo que tiene relacin con el
control de la conduccin de los impulsos nerviosos (23).
3. ENZIMAS DE ALIMENTOS QUE DESTRUYEN NUTRIENTES.
-Lipoxidasa, destruye los carotenos y la vitamina A de frutas y hortalizas, al actuar sobre los dobles
enlaces de compuestos insaturados.
-Tiaminasa, destruye la tiamina y se la encuentra en mariscos (ostras) y algunos peces crudos.
4. REGENERACIN ENZIMTICA.
En la tecnologa alimentara moderna se deben tener presentes los cambios que pueden ocurrir en los
procesos tecnolgicos. As, cuando las enzimas se han inactivado, algunas pueden regenerarse, como
es el caso de la peroxidasa, de la fosfatasa y otras. El mtodo de High-temperature-Short-time (HTST)
como lo dice su nombre, es la aplicacin de calor (a alta temperatura), pero por corto tiempo; antes se
usaban 115C por tiempo prolongado, hoy se usan 125C por corto tiempo. Con ello puede suceder
que la enzima no se inactive en su totalidad, no sufre el despliegue total de su estructura proteica
helicoidal y as recupera parcialmente su estructura nativa despus de las 24 horas de elaborado el
producto. Con esto regenera su actividad, en parte, lo suficiente como para que durante el almacenaje
resulten efectos dainos en los alimentos conservados, produciendo mal olor y sabor.
Pero la regeneracin de la actividad no est limitada a la desnaturalizacin por calor de la enzima-

protena. Algunas, como la alfa-amilasa obtenida del Bacillus subtilis, pueden denaturarse por adicin
de la urea a la solucin de enzima. Alrededor del 80% de su actividad original se regenera colocando la
solucin en tampn de pH 8,5. Si se elimina el resto de urea por dilisis, se regenera slo el 40% de la
actividad. La regeneracin ha sido explicada por algunos autores (24, 25, 26, 27) como la capacidad de
la enzima de recuperar su estructura terciaria, por recombinacin de las uniones H.
5. ACCIN TIL O DETERIORO EJERCIDOS POR LAS ENZIMAS EN LOS ALIMENTOS.
5.1. Las enzimas pueden ejercer, segn las circunstancias del caso, una accin deseada o no
deseada, desde el punto de vista de la tecnologa de alimentos. Segn Reed (3, 28), la diferencia entre
un efecto beneficioso o desfavorable sobre los alimentos que pueden resultar de estas acciones
enzimticas puede ser, a veces, sutil, dependiendo de la intensidad de la reaccin enzimtica; as
sucede en el pardeamiento y reblandecimiento de frutas, como tambin en la disminucin de su fibra
por celulasas durante su maduracin.
5.2. Efectos beneficiosos de la accin enzimtica.
Entre stos pueden mencionarse las complejas reacciones enzimticas que determinan la rigidez
cadavrica y la posterior maduracin de la carne y productos derivados con las respectivas
modificaciones de las caractersticas de su tejido muscular (57). Por otra parte, la preparacin de la
malta o cebada germinada, - primer paso de la elaboracin de la cerveza, se basa en la accin de las
amilasas y proteasas propias del cereal en germinacin. La elaboracin de la masa del pan por accin
de las enzimas del cereal y de la levadura y la maduracin de la crema, de los quesos y de las frutas,
son otros tantos ejemplos de procesos que serian imposibles sin la valiosa intervencin de enzimas.
A la qumica de los estimulantes de tipo cafenico se le ha llamado tambin la qumica enzimtica, ya

que en una u otra forma son enzimas las que intervienen en la elaboracin del t negro
(polifenoloxidasas y otras), la separacin previa de las semillas de caf de sus frutos (enzimas
pectinolticas) y la compleja fermentacin previa de las semillas de cacao para desarrollar su sabor y
aroma agradables (41).
Por otra parte, tambin en la tecnologa de la preparacin de diferentes especias, como la pimienta
negra, la mostaza, el rbano y la vainilla, el desarrollo de sus caractersticas de sabor y aroma se debe
a tiles reacciones enzimticas (33); al igual que el aroma de muchas frutas se debe a enzimas que lo
generan a partir de sus precursores (vase industria de derivados de frutas y hortalizas).
5.3. Efectos no deseados o deterioros producidos en alimentos por accin enzimtica.
Entre estos efectos deben mencionarse los fenmenos de pardeamiento de los alimentos, los cuales
se manifiestan por la aparicin de manchas oscuras en el tejido animal o vegetal y pueden tener dos
causas bien diferentes, distinguindose entr el pardeamiento qumico o no enzimtico y el
enzimtico.
5.4. Pardeamiento qumico o no enzimtico.
Alimentos ricos en protenas' y azcares experimentan la llamada "Reaccin de Maillard" (32), quien
encontr, ya en 1912, que aminocidos simples reaccionan en caliente con ciertos azcares para
formar compuestos obscuros semejantes a la melanina. Se ha definido esta reaccin como "la
reaccin de los grupos aminocidos, pptidos o protenas con los grupos hidroxil-glucosidicos de los
azcares". La reaccin es favorecida por la humedad, la temperatura, algunos metales, como hierro y
cobre, y el pH.
Entre las diversas reacciones intermedias tenemos la formacin de glicosilamina que es incolora, luego
una isomerizacin conocida como reordenamiento de Amadori y posteriormente la llamada
degradacin de Strecker, con prdida de una molcula de y formacin de hidroximetil-furfural.
Este fenmeno es deseable en algunos productos, como cerveza, corteza del pan, caf, pero en otros
alimentos no es conveniente, ya que involucra aparte del cambio de color, cambios en el sabor, olor y
en la disminucin del valor nutritivo, ya que estn comprometidos algunos aminocidos esenciales
como la lisina (32). Este pardeamiento se puede evitar mediante bajas temperaturas, bajo pH,
descomponiendo la mitad de glucosa que puede estar presente, y el mtodo ms usado, que es
bloquear el grupo -CO mediante el sulfito de sodio (29).
continua >>
5.5. Pardeamiento enzimtico (36, 37).
Aunque el resultado final de este fenmeno de pardeamiento conduce tambin a polmeros obscuros
del tipo de la melanina, semejantes a los que se forman en el pardeamiento no enzimtico, el
mecanismo de la formacin es bien diferente.
El cambio de color en frutas, verduras y tubrculos se observa cuando ellos sufren dao mecnico o
fisiolgico: cuando se mondan, cortan o golpean. Se debe a la presencia en los tejidos vegetales de
enzimas del tipo polifenoloxidasas, cuya protena contiene cobre, que cataliza la oxidacin de
compuestos fenlicos a quinonas. Estas prosiguen su oxidacin por el del aire sobre el tejido en
corte reciente, para formar pigmentos obscuros, melanoides, por polimerizacin.
Los substratos responsables son de tipo orto-fenlico y entre ellos se mencionan: cido clorognico-
tirosina-catecol-cido cafeico-cido glico-hidroquinonas, antocianos-flavonoides.
Las enzimas responsables son: la tirosinasa, la catecolasa, lacassa, la ascrbico-oxidasa y las

polifenol-oxidasas.
Los compuestos de la reaccin no son txicos, pero la preocupacin de los tecnlogos es el aspecto,
color y presentacin de frutas y verduras, que indudablemente tienen gran importancia comercial y
culinaria.
Para que se produzca este pardeamiento es necesario, por lo tanto, la presencia de los tres
componentes: enzima, substrato ms el oxgeno. Como nada se puede hacer o muy poco con el
substrato oxidable, los mtodos hoy en uso tienden a inhibir la enzima o a eliminar el oxgeno y
algunas veces se combinan ambos mtodos.
a) Inactivacin de la enzima mediante calor. Tiene la ventaja de que no se aplica aditivo alguno,
pero presenta el inconveniente de que la aplicacin de calor en frutas frescas produce cambios en la
textura, dando sabor y aspecto a cocido.
Para evitar estos inconvenientes se regula el tiempo de calentamiento, acortndolo justo al mnimo
capaz de inactivar la enzima por un escaldado inmediato. Se puede controlar la inhibicin enzimtica
por la prueba del catecol. La inhibicin es lenta a 75, pero se hace rpida a 85C.
b) Inactivacin de la enzima mediante inhibidores qumicos:
Anhdrido sulfuroso: Es uno de los ms efectivos y econmicos inhibidores qumicos hoy usados en
la industria alimentara, aunque su olor y sabor desagradables pueden comunicarse al alimento cuando
se emplea en grandes cantidades. Su uso no es aconsejable en alimentos ricos en tiamina y vitamina
C, pues las destruye. En el caso de la tiamina, el es capaz de romper el anillo tiazlico de la
vitamina, separando el anillo de pirimidina, con lo que pierde su carcter vitamnico.
La polifenoloxidasa es muy sensible al , pero la reaccin debe realizarse antes que se formen las
quinonas por oxidacin del substrato, pues stas oxidan al , por lo que pierde entonces su
propiedad de inhibir la enzima.
Acidos: Bajo un pH 2,5 cesa la actividad enzimtica, que es ptima entre 5 y 7. Aunque luego se
vuelva al pH original de la fruta, la enzima no se recupera, impidindose as el pardeamiento. Entre los
cidos ms usados est el mlico, que se agrega al prensar la fruta: caso de la manzana, de la cual
es uno de sus componentes naturales (30); tambin se usa, pero en menor proporcin, el cido ctrico.
Acido ascrbico: Este cido es el ms recomendado para evitar o minimizar el pardeamiento

enzimtico, por su carcter vitamnico inofensivo. El cido ascrbico por s mismo no es un inhibidor de
la enzima: acta sobre el substrato, de modo que puede adicionarse despus de haberse formado las
quinonas; Tiene la propiedad de oxidarse a cido dehi-hidroascrbico, reduciendo la quinona a fenol
(35).
Esto lo hace el cido ascrbico hasta que se haya transformado totalmente en dehidroascrbico que
ya no puede reducir las quinonas, de manera que stas continan, entonces, su oxidacin hasta la
formacin de melanoides. El cido dehidroascrbico an puede ser perjudicial al formar, en la
esterilizacin posterior, melanoides con los aminocidos presentes; por eso la adicin de cido
ascrbico no es eficaz en cerezas, ciruelas y frutillas. Sin embargo, si se agrega a otras frutas exceso
de cido ascrbico para inactivas totalmente la enzima, se logra prevenir el pardeamiento en forma
efectiva y permanente.
Productos especialmente propensos a empardecer por oxidacin qumica, cmo manzanas, peras,
duraznos, damascos, ciruelas y pltanos entre las frutas, y papas, esprragos, zanahorias entre las
hortalizas, deben mantenerse, inmediatamente despus de cortadas o peladas, en agua adicionada de
0,1-0,2 % de cido ascrbico y de 0,2% de cido ctrico.
Adems, para evitar alteraciones de color por oxidacin qumica en las conservas enlatadas, es
conveniente agregar por cada litro de liquido de relleno 0,5-1 g de cido ascrbico (y 0,25-0,50 g de
cido ctrico, segn lo admita el producto en cuanto al sabor). Para mantener el color de conservas de
championes y otros hongos es conveniente una adicin de 0,15-0,20 g por litro y para el choucroute
se agrega a la salmuera 1-2 g/kg de cido ascrbico, poco antes del envase.
Otros inhibidores qumicos: Entre las sales propuestas para controlar el pardeamiento la ms usada
es NaCl, cuya accin impide la actividad de la polifenol-oxidasa frente al cido clorognico. Una
sumersin en solucin acuosa diluida de NaCl (0,3%) se usa mucho cuando se quiere evitar por corto
tiempo el obscurecimiento de frutas peladas, como rodajas de manzanas, antes de ser sometidas al
procesamiento; Su contenido en cido ascrbico s mantiene, entonces, constante durante varias
horas.
Se aplica el bloqueo de los hidrxilos fenlicos por adicin de complejantes con el cobre de la enzima,
como el cido ctrico (0,2%) y boratos
(0,2% + 0,01% ). Tambin la cistena y otros dadores de SH se unen a los fenoles, dando
complejos incoloros, previa reduccin de las quinonas.
El uso de jugos de pia o de limn para evitar el pardeamiento en preparaciones caseras, se basa en
el contenido de compuestos sulfhidrlicos del primero y en cidos ctrico y ascrbico del segundo.
c) Eliminacin del oxgeno: La exclusin o limitacin de la influencia del del aire al trabajar y
envasar rpidamente el material y en caso necesario con ayuda del vaco o en atmsfera inerte
representan medidas satisfactorias para mantener ciertas frutas al estado lo ms natural posible,
especialmente en lo que se refiere a textura y sabor. Para frutas destinadas a la congelacin, se usa
tambin azcar y jarabe para cubrir la superficie, retardando as la entrada del oxigeno atmosfrico.
5.6. Fuera de estos fenmenos de pardeamiento enzimtico existen tambin otras reacciones
enzimticas que pueden conducir a un deterioro en los alimentos. Durante el procesamiento de
productos tanto animales (matanza) como- vegetales (frutas, hortalizas, molienda de cereales), la
destruccin de los tejidos por accin generalmente mecnica, puede liberar enzimas de sus
estructuras tisulares. Las consiguientes transformaciones metablicas no controladas pueden conducir
entonces, a veces, a reacciones enzimticas que van en desmedro de la calidad del alimento. Es as
que la ya mencionada lipoxidasa puede dar origen a productos de oxidacin de sabor rancio o amargo
en derivados de cereales y destruir los carotenos (55). Tambin una excesiva proteolisis enzimtica
puede conducir a un deterioro del tejido, como sucede en la putrefaccin de productos crneos y
marinos.
Por otra parte, el reblandecimiento exagerado o la prdida de consistencia de frutas y hortalizas que
han sobrepasado su estado de madurez tienen su origen en una pectinolisis no controlada por
pectinasas. En el fruto fresco e intacto estas enzimas se encuentran separadas de su substrato, las
pectinas; Pero al producirse la ruptura celular en el fruto alterado se genera entonces su reaccin de
deterioro (28).
VIII. DESCRIPCIN DE TCNICAS DE ANLISIS DE ENZIMAS EN ALIMENTOS
1. APLICACIONES ANALTICAS DE LAS ENZIMAS.
Los mtodos analticos enzimticos juegan hoy da un rol muy importante en el anlisis de alimentos.
Ellos permiten la rpida y segura determinacin de numerosos compuestos de los alimentos en el
laboratorio, incluyendo problemas analticos que son extremadamente difciles, si no imposibles, para
ser determinados por mtodos convencionales. Los requerimientos bsicos para el xito y seguridad
en los ensayos enzimticos estn en los reactivos y condiciones de trabajo.
Desde el punto de vista analtico, la valoracin de la actividad enzimtica en los alimentos puede
aplicarse para diferentes fines:
a) Como indicador del estado higinico y de conservacin de un alimento al determinar la actividad d

alguna enzima producida por microorganismos, por ej., la prueba de la reductasa y catalasa en leche y
jugos;
b) para controlar tratamientos tecnolgicos en alimentos que han sido sometidos a altas o bajas
temperaturas, como en el caso de la fosfatasa, peroxidasa y aldehdo-reductasa, que se usan para el
control de pasteurizacin y esterilizacin de leche y de la prueba de la ureasa residual en soya, para
demostrar la destruccin total de sus componentes antibiolgicos. En el proceso de "blanching,
blanqueado o escaldado", el test de peroxidasa es fundamental.
Medidas continuas de actividades enzimticas durante el tratamiento, el almacenamiento y en los

procesos enzimticos de maduracin pueden suministrar importantes informaciones sobre fenmenos
biodinmicos que ocurren en los alimentos;
c) para determinar mediante enzimas puras algunos componentes de alimentos, a veces difciles de
valorar por mtodos exclusivamente qumicos.
Ejemplos son la determinacin de glucosa en la miel por su oxidacin especifica mediante la glucosa-
oxidasa y la determinacin de cidos orgnicos como el lctico y el mlico con enzimas especficas:
la lactato- y la malato-dehidrogenasa.
Tambin se han elaborado tcnicas de anlisis enzimticos para la determinacin analtica especifica
de cido ctrico, cido glutmico, cido pirvico, cido glucnico y glucono-delta-lactona, colesterol,
sorbitol y diferentes glcidos en alimentos (58);
d) para determinar la naturaleza y concentracin de sustancias extraas en los alimentos, como

antispticos, antibiticos, pesticidas u otros txicos.
2. DETERMINACIN DE ACTIVIDAD DE PEROXIDASA Y DE SU

REGENERACIN.
a) La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidacin de ciertos compuestos dadores de

hidrgeno, como fenoles (guayacol, pirogalol) y aminas aromticas (o-fenilendiamina) por medio de
perxidos ( ). El substrato oxidable ms usado es el guayacol, que es oxidado a un complejo
coloreado de tetraguayacol en presencia de peroxidasa:
La velocidad de formacin del color rojo ladrillo puede ser utilizada como medida de la actividad
enzimtica por lecturas espectrofotomtricas de las absorbancias en relacin con el tiempo.
La peroxidasa presenta como grupo prosttico un grupo Hem, cuyo tomo central de hierro forma
complejos con diferentes compuestos, como los cianuros y la hidroxilamina, inhibindose su actividad
enzimtica.
La actividad enzimtica depende del vegetal (los rbanos picantes son especialmente activos), del
substrato oxidable que se emplea como reactivo y del pH y temperatura a que se trabaja.
Como la mayora de las enzimas, la peroxidasa puede ser inactivada por el calor, siendo una de las
que precisa mayor temperatura y ms tiempo para su inactivacin. Posee, adems, la propiedad
peculiar de la regeneracin enzimtica. Este fenmeno consiste en que al inactivarla por medio del
calor recupera parcialmente su actividad despus de un cierto tiempo. Esto ha sido explicado,
aduciendo que la fraccin proteica de la enzima sufre una desnaturalizacin slo parcial, con prdida
de su estructura terciaria, si el calor se aplica un tiempo muy corto, producindose luego una reversin
de la protena a su estado normal por recombinacin de sus grupos hidrgenos o sulfhidrlicos.
Este efecto del calor sobre la actividad peroxidsica es muy, importante en la industria de alimentos y
la regeneracin enzimtica de la peroxidasa puede causar serios problemas en los caracteres
organolpticos. Se ha demostrado en el laboratorio que esta actividad enzimtica puede detenerse
totalmente, si el calentamiento es suficientemente largo, de manera que sobre 30" la regeneracin es
muy dbil generalmente.
La investigacin de la peroxidasa ha sido usada para evaluar la eficiencia del escaldado o blanqueo de
verduras y tambin en el control de pasteurizacin de la leche. As, a la temperatura de pasteurizacin,
la lactoperoxidasa se inactiva, pero se regenera; en cambio, si la leche es sobrecalentada (ms de 80-
85C) la peroxidasa pierde su actividad en forma definitiva.
b) Procedimiento: Colocar 0,1 ml de guayacol liquido junto con 0,2 ml de al 0,9% y 4,7 ml de
agua en un tubo de ensayo (a). Dentro de un tubo del espectrofotmetro colocar 1 ml de jugo de
expresin de nabo, filtrado y diluido (1 + 199) y 4 ml de agua (b). Agregar la mezcla de guayacol y
agua oxigenada (a) al tubo del espectrofotmetro y tomar el tiempo con cronmetro. Vaciar
rpidamente la mezcla al tubo vaco y luego nuevamente al tubo del espectrofotmetro. Colocar el tubo
en el espectrofotmetro, previamente estandarizado con agua a 470 nm. Anotar las lecturas de
absorbancia a 470 nm cada 20 segundos hasta obtener 4 5 puntos. Graficar las lecturas de
absorbancia contra los tiempos para obtener as la graduacin de la reaccin.
c) Regeneracin: Colocar alrededor de 4 ml del jugo diluido (1 + 199) en tres diferentes tubos de
ensayo. Colocarlos en un bao hirviente (o calentado al vapor) y sacar el primer tubo despus, de 30
segundos, el 20 despus de 1 minuto y el 39 despus de 2 minutos. Enfriarlos rpidamente en un bao
de agua y determinar de inmediato la actividad peroxidsica, como Se ha descrito anteriormente.
Despus de 1 hora repetir la determinacin de la actividad en los tres tubos calentados.
2.1. DETERMINACIN DE PEROXIDASA EN VEGETALES (59, 60, 61, 62).
Fundamento del mtodo:
El mtodo se basa en la oxidacin del guayacol (incoloro) a tetraguayacol (rojo ladrillo). El substrato es
el guayacol-perxido de hidrgeno y la reaccin es catalizada por la enzima peroxidasa.
Obtencin del extracto crudo (de arvejas, porotitos verdes)
Se homogeneiza la muestra (60 a 150 g) en un omni-mixer a velocidad mxima por espacio de 3

minutos, manteniendo la temperatura a 0C en bao de hielo. El extracto se obtiene en tampn de
citrato 0,6 M a pH 4,5 (3 ml por g de tejido) y ms o menos 1 g de carbonato de calcio.
La centrifugacin se hace en una centrfuga tipo Sorvall a 0C y a velocidad de 12.000 rpm durante 10
minutos. Algunos autores saturan la muestra con , usando un tubo de vidrio corriente. Se filtra el
extracto a travs de algodn, descartando los primeros 10 a 20 ml del filtrado.
Reactivos:
a) Nitrgeno (de cilindro).

b) Citrato tampn (pH 4,5) preparado de la siguiente forma:
-Disolver 126 g de cido ctrico en ms o menos 800 ml de agua dest.

-Agregar suficiente sol. de NaOH para llevar el pH a 4,5 (solucin 7,5 N de NaOH). Enrasar a 1.000 ml;
la concentracin del citrato es de 0,6 M.
-Agregar unos ml de tolueno como preservativo, agitar y usarlo diluido con parte igual de agua dest.
Guardar en refrigerador para retardar el desarrollo de hongos.
c) Solucin de guayacol 0,5% en alcohol de 50%.

d) Agua oxigenada al 0,085% 0,05 N (diluir a un litro con agua dest., 2,83 ml de agua oxigenada de
30%). Guardar en refrigerador, preferiblemente en frasco obscuro, y renovarla semanal o
mensualmente, dependiendo de la frecuencia de su uso.
Procedimiento:
En un tubo de ensayo que contiene 20 ml de agua dest., agregar 2 ml del extracto enzimtico. Agregar
1 ml del reactivo de guayacol, dejndolo escurrir por las paredes del tubo, para formar una capa
intermedia.
Se agrega 1 ml de la sol. de agua oxigenada al 0,085%, del mismo modo que el reactivo anterior.
Se tapa el tubo, se invierte rpidamente 2 3 veces para mezclar bien y se coloca en la forma ms
rpida en el tubo del colormetro Klett-Summerson, leyendo a 420 nm. Previamente el aparato debe
ajustarse a 0 con agua dest. a la misma longitud de onda. La medicin peridica de la intensidad de
color desarrollado se hace por triplicado.
La reaccin es lineal en el tiempo hasta los 15 min., considerndose el mejor tiempo los 5 minutos.
La actividad de peroxidasa se expresa como unidades KLETT/mg de protena por 5 minutos de

reaccin.
Determinacin de protena:
Si se trata de extracto opaco, se recomienda la determinacin por el mtodo turbidimtrico (70).

Pueden aplicarse tambin otros mtodos de valoracin de protenas.
La enzima ms usada para evaluar el grado de escaldado es la peroxidasa. Las principales razones
para este uso son las siguientes:
-su presencia en cantidad considerable en prcticamente todos los alimentos que requieren del
proceso de escaldado;
-su estabilidad al calor;
-su actividad puede ser fcilmente evaluada tambin por mtodos simples y rpidos, como su
extraccin semicuantitativa que es una simplificacin del mtodo cuantitativo anteriormente sealado,
en que se detecta visualmente el color a los 3,5 minutos de reaccin. Para ello se miden:
1 ml de sol. de guayacol;
1 ml de sol. de agua oxigenada;
0,1 ml de extracto enzimtico, y
21,9 ml de agua.
Se incuba a 25C y se va observando el desarrollo o no de color rojo, medible a 460 nm (61, 62).
2.2. En forma semejante se procede a la determinacin de la LACTOPEROXIDASA para el control de

la pasteurizacin, sobrecalentamiento o esterilizacin de leche: a 3 ml de leche se agregan 3 ml de
solucin de guayacol al 1 %, en alcohol de 50% y 3 gotas de agua oxigenada. Dentro de 5 minutos se
produce color rojo o salmn en leche cruda o pasteurizada a baja temperatura, siendo su lmite trmico
de 75 a 82C.
2.3. DETERMINACIN DE PEROXIDASA EN ALIMENTOS QUE LA CONTIENEN EN PEQUEAS

CANTIDADES (por ejemplo, en maz dulce) (75).
Fundamento:
Este mtodo de valoracin de la enzima peroxidasa se basa en medir el color desarrollado al

reaccionar la enzima sobre la o-fenilendiamina, en presencia de perxido de hidrgeno, leyndose la
absorbancia a 430 nm.
Reactivos:
a) Solucin tampn de pH 6,5 (fosfato-citrato).

Se prepara mezclando 14,2 partes de fosfato disdico 0,2 M y 5,8 partes de cido ctrico 0,1 M.
b) Orto-fenilendiamina al 1 % (en alcohol al 95%; se debe preparar fresca cada 4 horas).
c) Agua oxigenada al 0,3%.
d) Solucin saturada de bisulfito de sodio.
Procedimiento:
Se pesan aproximadamente 4 g de material fresco y se lleva a 250 ml con tampn fosfato-citrato (a) de
pH 6,5 y se somete a homogeneizacin en mezcladora elctrica por 3 minutos; 10 ml de este extracto

se llevan a 250 ml con el mismo tampn.
Una alcuota de 25 ml de la muestra homogeneizada y diluida se transfiere a una botella centrfuga de

250 ml. Por otra parte, 25 ml de alcuota de cada muestra se usan para preparar los blancos. Debe
mezclarse bien antes de tomar las alcuotas, pues parte de la enzima se localiza en las partculas
slidas que tienden a sedimentar. Las muestras se mantienen en bao a t constante de 25C por
30 min.
A continuacin, a la muestra problema se le agrega 1 ml de solucin de o-fenilendiamina al 1 % y 1 ml

de al 0,3%, dejndose la mezcla reaccionar por 5 minutos. A este tiempo debe detenerse la
reaccin agregando 2 ml de la solucin saturada de bisulfito de sodio.
A los blancos se les agrega la fenilendiamina, luego el bisulfito y, por ltimo, el agua oxigenada. La
enzima es inhibida por el bisulfito de modo que ella est inactivada cuando se agrega el perxido de
hidrgeno.
Cuando se trata de productos ricos en almidn, es aconsejable precipitarlo, agregando para ello 25 ml
de alcohol de 95%; se agita mientras se agrega el alcohol para lograr una buena floculacin.
Las muestras se centrifugan a 3.000 rpm por 5 minutos. El supernadante se presenta como una
solucin clara y se transfiere a un tubo del colormetro.
Se lee la absorbancia a 430 nm. El colormetro se lleva a 100% de transmitancia con el

correspondiente blanco de cada muestra.
Si se pesan 4 g de material fresco y se obtiene una lectura de 0,5, el resultado se calcula de acuerdo
a la siguiente frmula:
Cuando se toman cantidades mayores y se hacen diluciones menores, los valores de U/g se pueden
calcular de la misma manera.
2.4. DETERMINACIN DE PEROXIDASA EN VEGETALES CONGELADOS (68).
Reactivos estables:
a) Solucin tampn de fosfato-oxalato 0,1 M, pH 6,0: Disolver 14,2 g de (o 26,81 g de

+7 ) y 12,6 g de +2 en agua y calentar; enfriar, ajustar el pH a 6,0 con
hidrxido de sodio 1 N y diluir a 1 litro.
b) Solucin de cido oxlico 1 M: Disolver 126 g de cido oxlico en agua y diluir a 1 litro.
c) Solucin de cloruro de sodio al 2%: Disolver 20 g de NaCl en agua y diluir a 1 litro. Enfriar a 0C y
mantenerlo a esa temperatura.
Reactivos relativamente inestables:
d) Solucin de agua oxigenada 0,1 N: Diluir 0,58 ml de agua oxigenada al 30% a 100 ml con agua.
Estandarizarla yodomtricamente como sigue: a 25 ml de agua oxigenada 0,1 N agregar 10 ml de
cido sulfrico 4 N, 6 ml de KI 1 N y 3 gotas de molibdato de amonio 1 N. Titular con solucin de
tiosulfato de sodio 0,1 N, usando almidn como indicador. Esta solucin debe mantenerse en
refrigeracin cuando no se use. Debe prepararse semanalmente.
e) Solucin de indo-fenol 0,001 N: Disolver 200 mg de 2,6-diclorofenol-indofenol o 175 mg de su sal

sdica, en agua y diluir a 1 litro. Estandarizarla contra tiosulfato de sodio 0,01 N titulando el yodo
liberado con 50 ml del colorante despus de adicionar 10 ml de KI 1 N y 10 m1 de H2SO4 4 N.
Mantener en refrigeracin y prepararla cada semana.
f) Solucin de cido ascrbico 0,05 M: Disolver 880 mg de 1-cido ascrbico en tampn (a) 0,1 M y
diluir a 100 ml. Prepararla fresca todos los das.
Preparacin del extracto enzimtico:
Homogeneizar 50 g de material fresco o congelado en una mezcladora a alta velocidad con 200 ml de
la solucin de cloruro de sodio al 2%, fra. Eliminar las partculas mayores, por filtracin, a travs de
gasa. Usar esta solucin dentro de 30 minutos.
Procedimiento:
En un vaso de 400 ml colocar: 75 ml de tampn (a), 50 ml del colorante (e), 5 ml de cido ascrbico (f)
y suficiente cantidad de agua (para alcanzar un total de 250 ml despus de adicionar el extracto en
ensayo y agua oxigenada). Calentar a una temperatura de ms o menos 25C o enfriar en caso de
bajarla a la misma temperatura.
Colocar el vaso en un agitador magntico y agitar por 30 segundos, a una velocidad tal de impedir la
penetracin de aire. Agregar a continuacin 1-3 ml del extracto enzimtico problema (equivalente a 0,2-
0,4 g de tejido) y rpidamente agregar 5 ml de . Poner en funcin el cronmetro inmediatamente
despus de agregar el agua oxigenada. Continuar mezclando a medida que se agrega el agua
oxigenada y hasta que se retire la primera alicuota.
Dentro de los 15-30 segundos despus de agregar el agua oxigenada, medir 25 ml de la mezcla
reaccionante con una pipeta de flujo rpido de tal manera de poder expulsar el contenido en 5
segundos y hacerlos caer en 5 m1 de la solucin de cido oxlico (b) colocados en un Erlenmeyer de
125 ml. Tomar 4-5 muestras consecutivas a 1 minuto de intervalo y vaciar en otros matraces de 125 ml
que contiene cada uno 5 ml de cido oxlico (b).
Registrar el tiempo de reaccin que corresponde al tiempo que deplore en vaciarse la pipeta. Titular el
cido ascrbico residual con la solucin de indo-fenol y calcular la reaccin de primer orden. Ajustar la
actividad enzimtica de modo que la constante sea de la magnitud de 5-20 x y expresar la
actividad de peroxidasa Kf como de tejido usado.
Los puntos finales deben ser rosados claramente visibles y permanecer por espacio de 1 minuto.
Todas las titulaciones deben asemejarse a la primera en su limite. Agregar el indo-fenol en forma
rpida al comienzo y posteriormente en forma ms lenta.
ta y tb son tiempos iniciales y finales de dos titulaciones bajo las condiciones estipuladas.
Bajo condiciones ptimas el valor de la titulacin inicial es de 35-40 ml de colorante y los valores
disminuyen a 20-25 m1 en 5 minutos.
Este es el mtodo de clculo que se aplica en la determinacin de catalasa, pero tambin puede
tomarse la recta (slope of plot) del logaritmo de los ml de colorante versus tiempo. Dividir el promedio
del valor de para los diversos intervalos de tiempo (0-1, 1-2, 2-3 minutos) por el peso del tejido
vegetal, correspondiendo al vol. de extracto en la mezcla de reaccin.
3. DETERMINACIN DE CATALASA EN VEGETALES.
Reactivos relativamente estables:
a) Solucin fosfato tampn 0,1 M, pH 6,95 0,15: Disolver 15,22 g de

en agua y diluir a 1 litro.
b) Acido sulfrico con molibdato 2N: Agregar 55 ml de a ms o menos 800 ml de agua, enfriar
y agregar 0,1 g de molibdato de amonio finamente molido .
c) Solucin de tiosulfato de sodio (ms o menos 0,01N) en solucin de yoduro de potasio al 10%:
Disolver 100 g de KI, 2,50 g de y ms o menos 1 g de carbonato de sodio en 500 ml
de agua; diluir a 1 litro (no es necesario estandarizar).
d) Solucin de yodo 0,01 N: Disolver 1,27 g de yodo y 2 g de yoduro de potasio: en 10 ml de agua y
diluir a 1 litro: Se estandariza contra una solucin de tiosulfato de sodio. Evitar exponerla a la luz
excesiva, aun cuando est en la bureta.
Reactivos relativamente inestables:
e) Perxido de hidrgeno 0,1 N: Diluir 0,58 ml de agua oxigenada al 30% a, .100 ml con agua fra.
Guardar en refrigerador o bao, de hielo cuando, no est en uso. Preparar diariamente.
f) Solucin de glucosa al 20% en solucin tampn: Disolver 20 g de glucosa en 100 ml de fosfato 0,1 M
(a). Guardar en refrigerador y prepararla semanalmente.
g) Indicador de almidn: Suspender 1 g de almidn en 100 ml de agua fra, agitar y calentar a
ebullicin. Preparar cada dos semanas.
Preparacin de las muestras (extractos):
Para evitar contaminacin con metales pesados, manejar las muestras slo con esptulas de cero
inoxidable.
a) Vegetales congelados o frescos: 50 g del producto se homogeneizan a alta velocidad por 3 minutos
con ms o menos
1 g de carbonato de calcio y suficiente agua como para completar 200 ml. Eliminar las partculas,
filtrando por gasa. Usar el filtrado dentro de 30 minutos.
b) Vegetales secos: Rehidratar 5 g de la muestra y proceder a la extraccin como en a).
Determinacin:
a) Demostrar presencia o ausencia de catalasa: A 10 ml de extracto (o menos, dependiendo de la

actividad) agregar agua hasta un volumen de 43 ml y 5 ml de la solucin de glucosa (f). Mezclar y
agregar 2 ml de 0,1 N. Inmediatamente despus de agregar el agua oxigenada, mezclar
rpidamente; de inmediato sacar una alcuota (que va a corresponder al tiempo cero) con una pipeta de
succin rpida y vaciar en un Erlenmeyer de 125 ml que contiene 10 ml de molibdato (b).
Empezar a contar el tiempo cero desde que se sac la alcuota de tiempo cero. Sacar 10 ml de la
alcuota a los 5 y 10 minutos (La temperatura de la mezcla de reaccin debe permanecer a menos de
20C).
A cada tiempo, dentro de 1 hora, agregar a cada matraz 5 ml de tiosulfato-yoduro (c) y mezclar. Dejar
en reposo 3 a 5 minutos; en seguida titular el exceso de tiosulfato con solucin de yodo 0,01 N,
usando 10 gotas de almidn como indicador.
Correr un blanco de la misma manera, excepto agregar agua en lugar del agua oxigenada y no sacar
alcuotas a los 5 y 10 minutos.
La diferencia entre los valores del blanco y los obtenidos en presencia de agua oxigenada corresponde
a la solucin de yodo, equivalente al agua oxigenada presente en los respectivos tiempos. El valor del
tiempo cero deber ser 0,5 a 2,0 ml de sol. de yodo; diferencias entre el blanco y el tiempo cero sern
entre 3,0-4,5 ml de sol. de yodo 0,01 N.
3.1. Determinacin de catalasa en solucin.
Las condiciones del test son:
1 ml de 0,06 M en tampn de fosfato, 0,05 M de pH 7,0 se mezcla con 2 ml de catalasa o del

extracto problema (1,25 m g/ml) disuelto en tampn de fosfato 0,05 M de pH 7,0 a 25C y se mide
E240/min, haciendo la lectura cada segundo durante los primeros 70 segundos de la reaccin. Una
unidad de catalasa corresponde a la cantidad de enzima que bajo las condiciones del ensayo
transforma 1 mol de substrato por minuto.
3.2. Determinacin de catalasa en leche.
La determinacin de presencia de catalasa junto con la reductasa sirve para conocer el estado de
conservacin de la leche, pues con el nmero de grmenes aumentan tambin las catalasas y
reductasas que ellos producen.
En un catalasmetro apropiado que permite medir el volumen de oxgeno que se desprende, se colocan
10 ml de leche y 5 ml de agua oxigenada (3%). Se lleva durante 2 horas a 37C y se mide el volumen
gaseoso que s desprende, expresando el resultado en ml de O2%. En el catalasmetro de Roeder se
usan 5 ml de leche mas 1 ml de agua oxigenada al 1,670 (obtenida por mezcla de 10 ml de
30% o con 140 ml de agua), adicionada de dibromotimol, indicador de pH cuyo viraje se reconoce por
la coloracin que toma la mezcla (reaccin alcalina: azul-verdoso; cida: verde-oliva a amarillo). Aqu el
volumen se mide despus de 30 a 37C. La leche normal cruda desprende hasta 30 ml de %, la
pasteurizada hasta 6 ml y la leche cocida o esterilizada no presenta desprendimiento. Las leches
enfermas, sucias o calostrales desprenden hasta 10 15 veces mas que una leche normal.
4. DETERMINACIN DE REDUCTASA EN LA LECHE.
En la leche debe hacerse distincin entre la Reductasa generada por los microorganismos presentes y
cuya actividad aumenta a medida que stos aumentan, por lo que sirve para controlar el estado
higinico y de conserva-in de la leche y la aldehdo-reductasa componente de la leche, cuya actividad
se utiliza para controlar el tratamiento trmico (pasteurizacin, esterilizacin) a que se ha sometido la
leche.
4.1. PRUEBA DE LA REDUCTASA.
En un tubo de ensayo, grande y estril, se vierten aspticamente 20 ml de leche (dentro de las 4 horas
siguientes a la extraccin de la muestra) y 1 ml de solucin de azul de metileno, obtenida por mezcla
de 5 ml de su solucin alcohlica saturada con 195 ml de agua. Se tapa el tubo y se calienta 5 a
37C, luego se invierte varias veces para asegurar la distribucin uniforme de la crema y se incuba a
37-38C en posicin vertical, invirtiendo cada media hora y protegido de la luz solar o elctrica. Se
mide el tiempo desde que se inicia la incubacin hasta que por lo menos los 4/5 de la leche se han
descolorado. La leche cruda y la pasteurizada deben resistir mas de 5 horas sin descolorarse y la
destinada a la pasteurizacin, por lo menos 3 horas.
Segn otra tcnica, se colocan en un tubo con tapa atornillada (en las Pruebas de reductasa todo el
material usado debe ser estril) 10 ml de leche y 1 ml de una solucin de 1 tableta con 8,8 mg de
tiocianato de azul de metileno en 200 m1 de agua destilada estril. El tubo, llevado a 36C, se tapa y
se invierte 3 veces. Si despus de 30 minutos de incubacin a 36C la mezcla sigue azul, se sigue 1,
2 o ms horas hasta que 4/5 del volumen estn descolorados.
4.2. PRUEBA DE LA RESAZURINA.
Representa una modificacin de la prueba de la reductasa, en que s substituye el azul de metileno

por la resazurina, colorante derivado d la oxazina. En un tubo esterilizado se mezclan 10 ml de la
leche con 1 ml de la solucin colorante al 0,2 por mil en agua destilada estril. Despus de mantener
la mezcla durante 10 a 37C se compara el color resultante con una escala cuyos colores tienen
los siguientes valores comparativos:
N I, de color azul; Calificacin: muy buena = Reductasa: 5 horas o ms.

N II. de color azul-violeta; Calific.: buena = Reductasa: 2 a 5 horas.
N III, de color rojo-violeta; Calific.: suficiente = Reductasa: 20 a 2 horas.
N IV, de color rojo; Calificacin: insuficiente = Reductasa hasta 20 .
N V, incoloras Calificacin: mala = Reductasa: hasta 20 .
Tambin se pueden leer los colores en un Comparador de Lovibond.
4.3. PRUEBA DE LA ALDEHDO-REDUCTASA.
La enzima causante es la xantino-o-aldehdo-dehidrogenasa, que cataliza la oxidacin de xantina y de

diversos aldehdos a cido rico y los respectivos cidos carbnicos; se trata de una flavoprotena con
molibdeno. La reaccin se basa en que la dehidrogenasa, en presencia de HCHO, descolora el azul de
metileno como aceptor de . 10 ml de leche se adicionan de 1 ml del reactivo constituido por una
mezcla de 5 ml de solucin alcohlica saturada (2%) de azul de metileno (exento de zinc), 5 ml de
solucin de formalina al 40% y 190 ml de agua destilada. Se agita y se lleva a 55C, sin agitar ms,
midiendo el tiempo en que se produce la descoloracin. La leche cruda se descolora en menos de 7,
la pasteurizada entre 7 y 20 (la stassanizada en ms de 12), y la cocida en ms de 30. Estas
cifras pueden ofrecer variaciones, teniendo la interpretacin de esta prueba slo valor en conjunto con
las dems. Esta enzima se encuentra slo en la leche de vaca, de manera que permite reconocer su
adicin a la leche humana (41).
5. DETERMINACIN DE FOSFATASA EN LA LECHE.
a) El mtodo ms usado se basa en la hidrlisis del disodio-fenilfosfato por accin de la fosfatasa de

la leche con liberacin de fenol, el cual s reconoce al hacerlo reaccionar con la
dibromoquinon-clorimida, dando indofenol de color azul:
Reactivos necesarios: Solucin tampn de brax: 28,427 g de brax crist. (p.an.) se disuelven en 900
ml de agua, se agregan 3,27 g de NaOH y se completa 1 litro con agua (pH 9,6).
Reactivo BQC: 40 mg de 2,6-dibromo-quinona-4-clorimida (Merck: para determinar fosfatasa en leche)

se disuelven en 10 ml de etanol.
Substrato tampn (de preparacin reciente): 0,5 g fenilfosfato sal disdica, dihidrato (Merck: para
determinar fosfatasa en leche) se disuelven en 5 ml de agua, se agregan 100 ml del tampn de brax y
se completa 1 litro con agua, debiendo tener un pH de 9,6 (azul a la timoltaleina). [Si s desea
comprobar la ausencia de fenol libre, la solucin del fenilfosfato en los 5 ml de agua se agita con 0,5
m1 de tampn de brax y luego con 4 gotas de reactivo BQC. Si en 10 resulta color azul, se extrae
ste con 2 ml de butanol y se usa l liquido inferior, ahora decolorado, agregando los 100 ml de brax
y completando el litro con agua.
Tcnica: 10 ml de substrato tampn se adicionan de 1 ml de leche, bien homogeneizada por inversin

repetida, pues los glbulos grasos adsorben mucha fosfatasa. Se agita y se incuba a 41 C (37-45
C) durante 10 (Scharer indica 38-40C durante 1 hora); luego se hierve (o se calienta a 80C
durante 5), se enfra, se agregan 5-10 gotas de reactivo BQC y se deja reposar por lo menos 5.
Debe hacerse simultneamente una prueba en blanco con leche calentada a 80C durante 5' para
inactivar la fosfatasa. Pruebas en blanco sin leche o sin substrato tampn deben resultar tambin
negativas.
Como la cantidad de fenol liberado es proporcional a la actividad fosfatsica y, por lo tanto, a la

intensidad del color azul, se le puede dar tambin una apreciacin cuantitativa (68), midiendo su
extincin a 660 nm y haciendo la lectura en una curva de calibracin que confronta los mcg de fenol
con las extinciones obtenidas. E1 limite trmico es de 72-73C, de manera que una leche
stassanizada da generalmente resultado negativo. Segn Scharer, una leche correctamente
pasteurizada no debe desprender ms de 15 mcg de fenol por ml.
En la mantequilla se incuba 1 g con 10 ml del substrato y en el queso se trabaja con el macerado de 1

g en 10 ml del substrato, despus de ajustar el pH a 9,6.
b) Otra tcnica (49) usa como reactivo el disodio-p-nitrofenilfosfato, que es hidrolizado por la fosfatasa
a p-nitrofenol, de color amarillo. 5 ml de un substrato tampn (con 0,15 g de 4-nitrofenilo-fosfato, sal
disdica, disuelta en un tampn con 3,5 g de anhidro y 1,5 g de por litro de agua) se
mezclan con 1 ml de leche y se calienta a 37C por 30 min. El color resultante se puede comparar
con los discos de colores estndares de un comparador de Lovibond, graduados en g de p-nitrofenol
por ml de leche. La leche pasteurizada da 0 o trazas de g hasta 10 m g, si se incuba 90 min. ms.
6. DETERMINACIN DE POLIFENOLOXIDASA (peras y manzanas)

(35, 63).
Fundamento:
Se basa el mtodo en medir espectrofotomtricamente, a intervalos de 1 minuto, el aumento de

absorbancia de una mezcla de la solucin enzimtica con cido clorognico como substrato. Al
graficar la absorbancia contra el tiempo, los resultados se expresan en aumento de absorbancia por
minuto y por g de protena.
Reactivos:
1. Cloruro de potasio 0,3 M.

2. Solucin tampn pH 5,2: 23,3 ml de solucin de cido ctrico 0,1 M (19,21 g en 1 litro) ms 26,7 ml
de sol. de fosfato disdico 0,2 M (53,65 g de + 71,7 g de + 12 en 1
litro) ms agua destilada c.s.p. 100 ml.
3. Solucin de cido clorognico 3,33 x M en solucin tampn,
4. Solucin de enzima: para extraer la enzima se pesan 70 g de manzana o pera mantenidas, por lo
menos dos horas antes en congelador a 0C; luego se mondan y trozan. Se homogeneiza en
mezcladora elctrica con KCl 0,3 M a 4C, que acta como liquido de extraccin. La mezcla se
centrifuga por 30 min. a 10.000 rpm en centrifuga refrigerada a 0C. El sobrenadante se filtra al vaco
y luego se enrasa a 200 ml con la sol. KCl.
Procedimiento:
En un matraz de 125 ml se colocan 25 ml de la solucin tampn y 10 ml de la solucin de cido

clorognico. Se mezcla suavemente y se mantiene por 10 minutos en un termostato a 30C. Luego
se adicionan 5 ml de la solucin enzimtica ajustada a 0,1 mg/ml de protena; se agita suavemente
unos segundos y se vuelve a llevar al bao de agua, a 30C (sin agitacin posterior). A intervalos de 1
minuto o 30 segundos se lee el aumento de absorbancia a longitud de onda de 390 nm. Como blanco
se usa una mezcla igual a la anterior, pero hervida por 10 minutos, reconstituyendo su volumen original
con agua.
Clculos:
La actividad enzimtica se mide al espectrofotmetro en % de transmitancia (% T), el cual se expresa

en absorbancia (A), aplicando la siguiente frmula:
A = 2 - log T
Para expresar la actividad enzimtica se grafican las absorbancias por minuto y por g de protena
contra el tiempo (cada minuto) y se usa la pendiente inicial de la curva obtenida (porcin recta).
6.1. DETERMINACIN DE PROTENAS.
En un tubo del fotocolormetro Klett-Summerson se colocan 5 ml de la solucin enzimtica

sobrenadante, se agregan 5 ml de cido tricloroactico al 6% y se mide la extincin a 515 nm, usando
un filtro verde N 54. Se usa como blanco una mezcla de 5 ml de agua ms 5 ml de cido
tricloroactico al 6 . Los valores obtenidos se pueden comparar con los de una solucin tipo de
seroalbmina de concentracin igual a 2 mg/ml. E1 extracto enzimtico original puede tener una
concentracin en protenas mayor que 0,1 mg por ml; para poder ajustarla despus a esta cifra se
diluye con cloruro de potasio 0,3 M.
6.2. DETERMINACIN DE SUBSTRATOS POLIFENLICOS.
En la industria de alimentos se puede presentar el problema de efectuar una adecuada seleccin de

variedades de frutas que presentan en menor grado el fenmeno del pardeamiento enzimtico, sea por
su menor contenido en substratos fenlicos, sea por su menor actividad enzimtica (36).
Los estudios de substratos se pueden efectuar por las siguientes determinaciones:
a) Pardeamiento actual, que indica las posibilidades del substrato natural en condiciones ptimas de
actividad enzimtica. En este caso, se mide la densidad ptica del color pardo que se produce al
oxidar el tejido vegetal, en este caso manzanas o peras, con aire, a pH adecuado y con adicin de
sulfato de cobre, para permitir una actividad ptima de la enzima. Se usa como blanco otra muestra,
que en lugar de llevar cobre, contiene tiourea, que al unirse al cobre de la enzima inhibe el
pardeamiento. Los resultados se expresan en Unidades por 100 g de fruta, en que 1 Unidad
corresponde a una diferencia de 0,1 de densidad ptica.
b) Pardeamiento potencial, que mide una disponibilidad total de actividad enzimtica, en presencia
de exceso de substrato. La determinacin se hace en forma semejante a la anterior, con la diferencia
que se agregan 20 mg de catecol como substrato fenlico adicional. Los resultados se expresan en las
mismas unidades que en el pardeamiento actual.
c) Determinacin directa de cido clorognico y de fenoles totales como substratos; se aplica una
reaccin colorimtrica que se obtiene haciendo actuar el cido clorognico con cido actico y nitrito
de sodio. Los fenoles totales se extraen con alcohol diluido y se miden con un reactivo general de
fenoles, segn Folin a base de cido tngstico o molibdico (36).
Estudios realizados entre las principales variedades de manzanas chilenas, permiten deducir que la
var. Winesap es la ms aconsejable para su industrializacin, por su bajo pardeamiento actual y
potencial. En peras se demostr que la variedad ms recomendable es la Winter Bartlett, por su menor
actividad enzimtica.
Al usar el anhdrido sulfuroso como agente de antipardeamiento (vase ste) hay que asegurarse que
el haya penetrado hasta el interior de la fruta, sobre todo cuando sta es posteriormente
disgregada o si se trata de frutas que contengan mucho en sus tejidos, como sera el caso de las
manzanas, para evitar que se produzca el pardeamiento interno. Para verificar el grado de penetracin
del al interior de las frutas se usa la llamada prueba del catecol, que consiste en cortar en cruz la
fruta o trozo de fruta que se ha sometido a la accin del , y luego agregarle en la superficie una
solucin de pirocatecol al 1 %. Si la enzima no ha sido totalmente inactivada se produce la oxidacin
del catecol y el consiguiente obscurecimiento de la fruta en la porcin que tenga enzima activa. Al
emplear solucin de cido sulfuroso, la aplicacin del test de catecol comprueba que la penetracin es
casi completa a los 20, a -5C, mientras que con la sumersin en bisulfito demora cerca de 24
horas, a la misma temperatura.
7. DETERMINACIN DE ACTIVIDAD DE PECTINO-ESTERASA (P. E.)
Fundamento:
Como esta enzima hidroliza los grupos metoxilos de la molcula de pectina, se puede medir la
liberacin de los grupos carboxilos, por titulacin potenciomtrica con lcali.
Obtencin del extracto homogeneizado:
Se pesan 175 g del material (cebolla, naranja, pulpa y cscara) y se le agrega 5 g de cloruro de sodio,
homogeneizando en una juguera elctrica. El cloruro de sodio sirve para activar la enzima y ayuda a su
extraccin.
Reactivos:
Solucin de pectina al 1 % o (como substrato) disuelta en cloruro de sodio 0,2 M.
Solucin de hidrxido de sodio 0,01 N.
Procedimiento:
Se miden 2 ml de jugo de limn o 5 ml de zumo de papa (rallada y filtrada).
Si se trata de cebolla se tomarn 1 parte del homogeneizado y 1 parte de agua; en el caso de la

naranja se tomarn 1 parte del extracto crudo y 2 partes de agua. Se agita por 4 minutos, dejando en
reposo por un momento y posteriormente se toman alcuotas para efectuar la reaccin en la forma
siguiente:
10 ml de la solucin de extracto se agregan a 50 ml de pectina al 1 %, colocando la mezcla en bao

de agua a 30C. Se ajusta el pH a 7,5 con NaOH 0,01 N. Cada 5 minutos se ajusta el pH, lo que se
hace por un espacia de 30 minutos, anotando en cada intervalo la cantidad acumulativa de lcali
gastado. Las curvas se obtienen graficando los ml gastados de lcali versus tiempo.
Conviene trabajar en duplicado y calcular el promedio. El blanco, preparado con la solucin enzimtica
calentada a bao de agua hirviente por 5 minutos, no debe presentar gasto de hidrxido de sodio, o
bien, su valor debe ser restado del consumo total.
Clculos:
Segn la frmula de Kertesz (56), se multiplica el gasto total de ml de NaOH 0,1 N por el factor 3,1 y
se divide por los ml aplicados de la solucin de enzima. Este valor representa los mg de grupos
metoxilos separados por 1 ml de solucin de enzima en 30 minutos, o bien Unidades de pectino-
esterasa por ml de solucin enzimtica.
8. DETERMINACIN DE ACTIVIDAD DE ENZIMAS PROTEOLTICAS.
Al presente existen varios mtodos para la determinacin de proteasas (papana). Cada uno tiene
caractersticas ventajosas y desventajosas frente a los otros y se usan de acuerdo a los
requerimientos particulares de la determinacin.
Mtodo de Balls y Hoover (66), conocido como el mtodo de coagulacin de la leche, es, sin duda,
uno de los mtodos mas expeditos para determinar actividad enzimtica de una proteinasa. Se toma
como indice de actividad proteoltica, el tiempo necesario para que una cantidad conocida de enzima
coagule un determinado volumen de solucin de leche. La actividad se expresa en trminos de
unidades de leche coagulada por g de preparado enzimtico. La unidad de leche coagulada se la define
coma la cantidad en peso de un preparado enzimtico necesario para coagular 5 ml de solucin de
leche estndar por minuto, cuando la temperatura es de 40C y el pH 6. La principal desventaja de
este mtodo radica en el hecho de no medir la proteolisis total, es decir, la hidrlisis de un substrato
de protena, pero, por el contrario, mide la actividad de la coagulacin de la leche. Afortunadamente,
sin embargo, la coagulacin de la leche parece ser una propiedad caracterstica de los componentes
proteolticos de este grupo de enzimas y puede ser usada con seguridad en la medicin proteoltica.
Segn algunos autores, las preparaciones es necesario activarlas antes con o bien con exceso de
cianuro.
Mtodo Srensen, conocido como titulacin formlica. Por este mtodo se mide directamente la
hidrlisis de una protena-substrato realizada por una cantidad conocida de enzima. Cuando las
uniones peptdicas se rompen, se liberan grupos -COOH y . Para hacer posible la titulacin de los
grupos carboxilos, los grupos bsicos se bloquean con el aldehdo frmico. Los substratos usuales
son la casena o la gelatina (11).
Mtodo de Anson o Mtodo de la Hemoglobina: Es quizs el mtodo ms actualizado para estimar

protelisis. El substrato que es la hemoglobina desnaturalizada, se digiere bajo condiciones
estndares. La protena no digerida se precipita con cido tricloroactico. La cantidad de protena no
precipitada se valora con reactivo fenlico. La ventaja de la hemoglobina como substrato sobre la
gelatina y casena, es su reproducibilidad, porque diferentes lotes de hemoglobina son digeridos a la
misma velocidad por una proteinasa dada (54). Al aplicarse este mtodo para determinar papainasa se
requiere la presencia de un agente reductor, como cianuro, pues de otro modo la hemoglobina inactiva
parte o toda la papana por oxidacin.
8.1. DETERMINACIN DE RENINA.
Fundamento:
El mtodo se basa en hacer actuar 0,2 ml de una solucin de renina (1 : 500) sobre 5 ml de leche
descremada, que contiene 3 M; mezclar e incubar a 37C, determinndose el tiempo en que
demora en aparecer el primer cogulo.
8.2. DETERMINACIN DE PAPANA (53).
Fundamento:
El mtodo se basa en medir el aminocido tirosina que se libera por la accin de la enzima sobre las
protenas, usando el reactivo de Folin.
Reactivos:
- Solucin de cianuro de sodio 2,0 141 (activador de la enzima).

- Substrato-hemoglobina (Anson): 20 mg/ml de hemoglobina se disuelven en solucin tampn de borato
0,1 M, de pH 7,5.
- Acido tricloroactico 0,3 M.
- Solucin de NaOH 0,4 N.
- Reactivo del fenol segn Folin-Ciocalteu (36,76), dilucin: 1 + 2.
Preparacin de extracto enzimtico:
El producto pesado y molido se extrae con solucin tampn de borato 0,1 M de pH 7,5. Luego se
centrifuga separndose el sobrenadante que se usar en la determinacin.
Procedimiento:
En primer lugar, debe activarse la enzima, para lo cual se toma una alicuota del extracto enzimtico
problema y se le agrega 0,25 ml de cianuro sdico 2,0 M, mantenindose la mezcla a 25C por 3
minutos.
A 5 ml de solucin de hemoglobina se le agrega 1 ml del extracto activado y se mantiene a 35,5C

por 10 minutos; para agregar luego 10,0 ml de cido tricloroactico 0,3 1\1 y centrifugar. Del
sobrenadante se toman 5 ml, se agregan 10,0 ml de NaOH 0,5 N y 3 ml del reactivo de Folin (dilucin
1 + 2); se lee la absorbancia a 750 nm.
9. DETERMINACIN DE ACTIVIDAD DE AMILASA.
La necesidad de determinar la actividad de enzimas amilolticas en productos como harina, malta y

otros, ha hecho desarrollar varios mtodos analticos que miden, ya sea cambios fsicos o
transformaciones qumicas, producidos por las enzimas sobre substratos seleccionados. Entre estos
mtodos se cuenta el de Lintner, el de la maltosa y el SKB (Sandstedt, Kneen, Blish) (64).
Mtodo de Lintner: Mide principalmente la actividad de la beta-amilasa de malta o de jarabes y se

basa en producir maltosa por un infuso de malta, haciendo actuar una solucin de enzima en solucin
tampn, bajo condiciones estndares de tiempo y temperatura. Los grados de Lintner se calculan a
partir del poder reductor o contenido de maltosa del almidn convertido, determinado ya sea por el
ferricianuro o por la solucin de Fehling (41). Los grados de Lintner, multiplicados por el factor 4, dan el
equivalente en maltosa.
Mtodo de la Maltosa: Se basa en suspender 10 g de harina en 46 ml de solucin tampn de pH 4,5-

4,8 e incubar por 1 hora a 30C. Esto permite que la enzima presente en la harina acte sobre el
almidn y lo convierte en maltosa, la que se determina por el mtodo del ferricianuro. El valor de
maltosa se define como los mg de maltosa producidos por 10 g de harina bajo las condiciones ya
sealadas.
La maltosa puede tambin determinarse por el mtodo de Munson y Walker, usando la reaccin de
Fehling I, 11, o bien por titulacin yodomtrica de Cu no, reducido a (41).
Mtodo de Sandstedt, Kneen y Blish (64): Mide la dextrinizacin de un preparado de alfa-amilasa en

trminos de tiempo de digestin, requerido para producir un cambio de color que refleja la completa
dextrinizacin del almidn. La modificacin al mtodo original consiste en medir la dextrinizacin en
presencia de exceso de beta-amilasa para eliminar los efectos variables de beta-amilasa presente en el
extracto de malta:
Los resultados se expresan en unidades arbitrarias SKB y representa el nmero de g de almidn

soluble que bajo la accin de exceso de beta-amilasa son dextrinizados por 1 g de malta en 1 hora a
30C. El punto final se compara con una solucin de yodo-dextrina de color rojo pardo.
9.1. DETERMINACIN DE ALFA- O DE BETA-AMILASA (COMO TALES) (65).
Fundamento:
Los grupos reductores liberados del almidn se miden por su propiedad de reducir el cido 3,5-
dinitrosalicilico.
Reactivos:
Enzima: Diluir una suspensin cristalina 1: 500 (o el extracto problema), determinar la concentracin
proteica
mg/ml = x 0,81. Para trabajar, diluir 1 microgramo/ml.
Substrato: Solucin al 1% de almidn en fosfato de sodio 0,02 M de pH 6,9 con NaCl 0,006 M (para
alfa-amilasa) y solucin al 1 % de almidn en acetato de sodio 0,016 M, de pH 4,8 (para beta-amilasa).
Reactivo de color: 1 g de cido dinitrosaliclico se disuelve en 20 ml de NaOH2N y 50 ml de agua, se

agregan 30 g de sal de Seignette (tartrato de Na y K) y se diluye a 100 ml, protegindola del .
Procedimiento:
0,5 ml de solucin de la enzima o del extracto problema se mezclan con 0,5 ml de substrato. Se
incluye un blanco con 0,5 ml de agua en reemplazo de la enzima o extracto problema. Se incuba a
25C por 3 minutos, s agrega 1 ml de reactivo de color, se calienta en agua hirviendo por 5 minutos
y luego se enfra. Se agregan 10 ml de agua y se lee a 540 nm (filtro verde) contra el blanco.
Se establece una curva con maltosa (0,3-3,0 m moles) para convertir las lecturas colorimtricas a
unidades de actividad enzimtica, o sea, que libera un micromol de azcar reductor, calculado como
maltosa por minuto y a 25C bajo las condiciones del ensayo.
10. DETERMINACIN DE CELULASA (53).
Fundamento:
Un complejo de enzimas designado como celulasas, hidroliza las uniones beta-glucosdicas 1,4 de la
celulosa, liberando glucosa, que es valorable.
Reactivos:
- Substrato: celulosa microcristalina; 5,2 mg de celulosa/ml en solucin tampn de pH 4,8.

- Solucin tampn de acetato de sodio 0,1 M, de pH 4,8.
- Solucin de cido 3,5-dinitro-saliclico 0,04 M disuelto en NaOH 0,4 N.
- Solucin de almidn 100 mg/ml.
Preparacin del extracto enzimtico problema:
Se pesa una cantidad del producto en estudio, y se homogeneiza con solucin tampn de pH 4,8. Se
filtra o centrifuga usando el sobrenadante como extracto enzimtico.
Procedimiento:
Se toman 24,0 ml de la suspensin de celulosa y se calientan a 30C. Luego se agrega 1 m1 del

extracto enzimtico, tambin a 30C y se mantiene por espacio de 2 horas bajo agitacin, a la
misma temperatura. Luego s procede a centrifugar y se miden 2 m1 del lquido sobrenadante. Se
agregan 0,1 ml de la solucin de almidn y 2 ml de la solucin del cido 3,5 dinitrosalicilico,
manteniendo la mezcla a 100C por 5 minutos (viraje del amarillo al pardo rojizo).
Despus de completar un volumen de 20 ml con agua destilada se mide la absorbancia a 490 nm.
Si no se dispone de cido 3,5 dinitro-salicilico se puede determinar tambin la actividad de celulasa de

la siguiente manera:
A 200 mg de celulosa microcristalina se agregan 4 ml de solucin tampn de acetato 0,05 M, de pH

5,0 y 1 ml de la solucin problema. Se incuba bajo agitacin por 2 horas a 37C. Se centrifuga o filtra
y se determina la glucosa liberada por los mtodos convencionales (65).
Unidad enzimtica:
1 Unidad enzimtica corresponde a la cantidad de enzima que bajo las condiciones del ensayo, libera
1 microequivalente de grupos reductores por minuto (calculado como glucosa).
11. DETERMINACIN DE INVERTASA O SACARASA.
Fundamento:
El mtodo se basa en determinar los mg de azcar invertido a partir de la reaccin que sufre la
sacarosa disuelta en tampn acetato y mantenida a 20C, por adicin de una solucin de sacarasa o
suspensin de levadura a la misma temperatura y posterior determinacin del azcar invertido de
acuerdo al mtodo del cido dinitrosalicilico, el de Munson y Walker o por yodometra (41).
Reactivos:
Colocar 43 ml de acetato de sodio N y 57 ml de cido actico N en un matraz de 1 litro, enterando

volumen con agua bidestilada. Disolver 6,5 g de sacarosa en 96 ml de esta solucin tampn, y agregar
gotas de tolueno. La solucin contendr 6,5% de sacarosa y el pH ser de 4,5. En medio ambiente la
solucin dura 3 das.
Procedimiento:
5 ml de solucin de sacarosa al 6,5% en tampn acetato se dejan incubar a 20C. Agregar luego 1
ml de solucin de sacarasa o de la muestra problema, mantenida tambin a 20C, tratando de que se
mezclen rpidamente.
Dejar en bao de agua por 5 minutos, luego agregar 5 ml de NaOH 0,1 N. Mezclar y determinar el
azcar invertido en 1 ml por mtodos convencionales.
Las unidades de sacarasa se expresan directamente en trminos de mg de azcar formado en 5

minutos, a 20C y a pH 4,5.
Los mg de azcar invertido multiplicados por 11 darn las unidades de sacarasa por 1 ml de solucin
de enzima. Si el valor obtenido es ms de 1 o menos de 0,5 mg de azcar invertido por ml, el anlisis
debe repetirse, con una dilucin mayor o menor de la solucin de sacarosa; o aumentando o acortando
el tiempo de digestin. La reaccin se detiene, agregando al final de los 5 minutos el NaOH.
11.1. DETERMINACIN DE INVERTASA EN CERVEZA (PARA EL CONTROL DE SU

PASTEURIZACIN).
A dos porciones de 20 ml cada una y de las cuales una ha sido hervida se agregan 20 ml de solucin
de sacarosa al 20,0. Despus de dejarlas 24 horas a la temperatura ambiente se clarifican con 0,5 ml
de subacetato de plomo, se completan con agua a 50 ml, se agitan fuertemente y se filtran. Si las dos
muestras presentan una diferencia marcada en su desviacin polarimtrica, se trata de cerveza no
pasteurizada; en cambio, si la desviacin es aproximadamente igual, la cerveza ha sido calentada a
ms de 58C, limite trmico de la reaccin.
12. DETERMINACIN DE LACTASA (beta-galactosidasa) (65).
Fundamento:
La enzima lactasa es capaz de hidrolizar la lactosa, dando glucosa y galactosa.
Reactivos:
- Solucin tampn de fosfato de sodio 0,1 M, de pH 7,0.

- Substrato de lactosa al 1,0% en agua.
- Acido perclrico al 4,2%.
Preparacin de la muestra:
Una cantidad pesada se trata con solucin de fosfato de pH 7,0. Se filtra y se usan alcuotas del
sobrenadante.
Procedimiento:
A 4 ml de substrato se agregan 0,9 ml de solucin tampn y 0,1 ml del extracto problema en un bao
de agua a 37C a tiempo cero. Despus de 15 minutos se detiene la reaccin con 1 ml de cido
perclrico. Se valora la glucosa liberada por uno de sus mtodos especficos (como ser por la glucosa-
oxidasa) simultneamente con un estndar de glucosa al 1%, en solucin tampn.
Unidad enzimtica:
1 U es equivalente a 1 micromol de lactosa hidrolizada por minuto a 25C.
13. DETERMINACIN DE GLUCOSA-OXIDASA (53).
Fundamento:
Esta enzima acta especficamente sobre la glucosa, dando como producto cido glucnico y agua
oxigenada. En presencia de la dupla peroxidasa y o-dianisidina se determina la absorbancia producida
por la reaccin.
Reactivos:
- Solucin tampn de fosfato 0,125 M de pH 7,0.

- Reactivo cromgeno: Clorhidrato de o-dianisidina al 1 % en agua.
- Solucin de peroxidasa de 60 U/ml: 2 mg/ml en agua destilada.
- Substrato: solucin de glucosa 0,1 M disuelta en agua bidestilada, permitiendo llegar al equilibrio de
rotacin.
Una cantidad pesada y bien homogeneizada de la muestra problema se extrae con solucin tampn de
pH 7,0, se filtra o centrifuga, separando el sobrenadante, que corresponde al extracto enzimtico.
Procedimiento:
En primer lugar, se agrega 0,1 ml de solucin de o-dianisidina a 12 ml de la solucin fosfato de pH 7,0.

Se miden 2,48 ml de sta mezcla y se agrega 0,01 ml de la solucin de peroxidasa, manteniendo la
mezcla final a 25C. A continuacin se agrega 0,1 ml de la solucin problema, tambin a la misma
temperatura.
Se mide la absorbancia a 436 nm por 2 a 4 minutos.
Unidad enzimtica:
1 U de actividad enzimtica de glucosa-oxidasa corresponde a la cantidad de enzima que bajo las

condiciones de ensayo, transforma 1 micromol de substrato por minuto. .
14. DETERMINACIN ENZIMTICA DE GLUCOSA MEDIANTE GLUCOSA-

OXIDASA (glucosa-dehidrogenasa).
Como ejemplo tpico de los anlisis enzimticos que se aplican actualmente para la valoracin
especifica de ciertos componentes en productos alimenticios, damos a continuacin la tcnica
descrita por Temperli y colab. (67) para determinar la glucosa en mieles y bebidas.
El mtodo se basa en la siguiente reaccin enzimtica: -D-Glucsa + NAD D-glucono-lactona +

, catalizada por la glucosa-dehidrogenasa; por adicin simultnea de mutarotasa se aumenta la
velocidad de la reaccin. Se determina finalmente la cantidad del formado, la cual es
proporcional a la concentracin de glucosa. La lectura se hace fotomtricamente a una longitud de
onda de 340 366 nm.
Este mtodo es apropiado para la determinacin de glucosa en diversos jugos y nctares de fruta
(naranja, durazno, tomate) y de verduras (zanahoria), como tambin en vinos y mieles. Dada la
especificidad de la glucosadehidrogenasa frente a la glucosa, no reacciona con la fructosa, ni la
sacarosa.
La determinacin puede hacerse directamente en el producto diluido. As los jugos pueden diluirse, por
ejemplo, al 1:100; los nctares, al 1:200; los vinos, al 1:20, y la miel, al 1:2.500; tomando despus 0,2
ml para el anlisis.
Para la realizacin ms rpida y cmoda de esta tcnica, los autores mencionados recurren al juego
de Reactivos Merckotest: "Gluc-DH, UV", destinado originalmente al anlisis clnico y que contiene
todos los reactivos necesarios para la determinacin.
Para aplicar el "mtodo de referencia con el Gluc-DH" se disuelve previamente la mezcla de enzimas
(contenida en el frasco 4 del juego de Reactivos) en la solucin tampn de fosfato 0,12 mol/l, de pH 7,6
(contenida en el frasco 2) dejando unos 15 minutos con agitacin ocasional, hasta disolucin completa
(si el tampn se ha vuelto turbio, debe filtrarse antes de su uso). Por otra parte, la solucin del
coenzima NAD 0,22 mol/l se obtiene disolviendo el contenido del frasco 3 por adicin de 0,9 ml de
agua bidestilada (la solucin se conserva por 6 meses al refrigerador).
En el caso del anlisis de bebidas y mieles (ya diluidas), las cubetas, de 1 cm de espesor, se llenan
segn el siguiente esquema:
- Blanco Anlisis
Muestra + agua (Vol. final: 1,0 ml) 1,0 ml agua 1,0 ml dilucin
Solucin de enzima en tampn (Merckotest
2,0 2,0
Gluc-DH)
Mezclar y despus de 1 minuto leer
Agregar solucin NAD (coenzima) 0,02 ml 0,02 ml
Mezclar de inmediato y despus de 7
minutos exactos, leer las nuevas
extinciones:
La cubeta de referencia contiene agua destilada.
La diferencia de las extinciones (" "), corregida por los valores del blanco, la cual es proporcional a la
cantidad resultante de NADH2 y tambin a la concentracin de glucosa, se obtiene segn la frmula
Para calcular la concentracin de glucosa, el valor debe multiplicarse solamente todava por un
factor que depende de la longitud de onda aplicada. Se llega as a la siguiente frmula final, tomando
en cuenta un volumen total de 3,02 ml y un volumen de la muestra diluida de 1,0 ml: g glucosa =
nm 164,73 F en que "F" es el factor de dilucin de la muestra.
(Si la medida se efecta a 340 nm, se multiplica nm por 87,40).
Al realizar anlisis en serie, los autores (67) recomiendan trabajar con 3 cubetas,, dedicando una a la
referencia con agua destilada y midiendo las extinciones de los blancos, debidas a los reactivos:
y slo una vez para cada serie.
Ensayos hechos con glucosa pura demostraron una curva de calibracin, lineal y con buenas pruebas
de recuperacin, al agregar cantidades conocidas de glucosa a diversos jugos, vino y miel.
En comparacin con la determinacin de glucosa en diversos jugos de uva por cromatografa liquida de
alta presin (HPLC) se obtuvieron valores concordantes, teniendo el mtodo enzimtico aun mayor
sensibilidad.
15. DETERMINACIN DE LIPASA (53).
Fundamento:
Como la enzima es capaz de hidrolizar los triglicridos a di- y mono-glicridos y cidos grasos libres,
el mtodo para determinar actividad de lipasa en alimentos se basa en la valoracin del cido actico
liberado.
Reactivos:
-Substrato: triacetina 0,31 M, pH 6,2.

-Hidrxido de sodio 0,05 N.
Una cantidad de muestra se trata con agua bidestilada a 30C en una mezcladora elctrica Waring
Blendor, se centrifuga o filtra y el sobrenadante constituye el extracto enzimtico.
Procedimiento:
En un matraz Erlenmeyer se colocan 48,0 ml del substrato triacetina y se agrega una alcuota del
extracto enzimtico; ambos deben estar previamente a 30C, manteniendo a esta temperatura la
mezcla final durante 30 minutos.
El cido liberado se titula con NaOH 0,05 N, ajustando el pH a 6,2 con ayuda de un potencimetro.
Unidad enzimtica:
Una U corresponde a la cantidad de enzima que bajo las condiciones de ensayo libera 1 micromol de
cido actico/min.
16. DETERMINACIN DE LIPOXIDASA (65).
La lipoxidasa cataliza especficamente la oxidacin de los grupos metilenos de cidos grasos

insaturados como linoleico, linolnico y araquidnico y sus steres, a los respectivos perxidos. Tanto
el mtodo espectrofotomtrico desarrollado por Holman y Burr como el mtodo de Bergstrom (55) se
basan en medir el aumento de absorcin a la luz UV, a 284 nm cuando la lipoxidasa acta sobre estos
cidos grasos. El aumento del peak s relaciona con la cantidad de perxido formado, siendo
proporcional al tiempo y a la concentracin de enzima.
Fundamento:
Se basa en medir la absorbancia que se produce por la oxidacin del linoleato, a 234 nm.
Reactivos:
Substrato: Disolver 0,1 ml de cido linoleico en 60 ml de etanol al 65%. Diluir a 100 ml con agua
destilada bajo suave agitacin hasta obtener una buena dispersin. A1 momento de usar el substrato,
ste debe diluirse con 5 vol. de tampn de borato 0,2 M, de pH 9,0.
Generalmente el material a ensayar (principalmente poroto de soya y semillas de garbanzos) debe

lavarse previamente con ter de petrleo y manteniendo las muestras en botellas cerradas en el
refrigerador. Una cantidad de muestra pesada se homogeneiza con solucin tampn de borato, de pH
9,0. Luego se centrifuga o filtra, usndose para la determinacin el lquido transparente.
Procedimiento:
En una cubeta se colocan 2,0 ml de substrato y se procede a oxigenar durante unos pocos minutos. A
continuacin, a tiempo 0, se agrega. 1 ml de la solucin enzimtica y a un minuto de intervalo se
registra la absorbancia a 234 nm.
S grafica la absorbancia versus tiempo, debindose obtener una lnea recta; se calculan los cambios
de absorbancia por minuto.
Unidad enzimtica:
1 U es el aumento de absorbancia de 0,001 por minuto bajo las condiciones especificas de ensayo a
25C.
16.1. DETERMINACIN DE ACTIVIDAD DE LIPOXIDASA EN HARINA DE SOYA (69).
Fundamento:
El mtodo se basa en determinar la lipoxidasa por adicin de un aceite vegetal y en valorar los
perxidos formados por yodometra.
Procedimiento:
100 g de aceite fresco de semillas de algodn se colocan en un matraz de doble pared, entre la cual
se hace circular agua para mantener la temperatura a 20C.
Se agrega exactamente 0,5 g de harina de soya, suspendida en 50 ml de agua destilada. S agita la

mezcla durante 20 minutos con agitador y se centrifuga, agregando previamente un poco de sal para
facilitar la separacin de las fases de agua y aceite en forma clara. Logrado esto, se pesan 5 g de
aceite lmpido, se colocan en un vaso y se agregan 50 ml de una mezcla de cloroformo y acido actico
(40 + 60). Luego se agrega 1 ml de solucin acuosa saturada de yoduro de potasio, se mezcla bien y
se deja en reposo por 5 minutos. Ahora se agregan 100 ml de agua destilada para detener la reaccin
y se titula el yodo liberado con tiosulfato de sodio 0,1 N, usando almidn como indicador.
A la vez se corre un blanco, usando 0,5 g de harina de soya, calentada a 100C. Se resta el gasto de
la titulacin del blanco de aqul de la titulacin de la muestra con la enzima activa. El aceite de semilla
de algodn da generalmente un blanco de 0,2 a 0,8 m1 de tiosulfato 0,1 N, y el valor de la lipoxidasa
es generalmente de 4 a 5 ml de tiosulfato 0,1 N.
17. DETERMINACIN DE UREASA (53).
Fundamento:
Como la reaccin que cataliza esta enzima sobre la urea es la liberacin de amoniaco, la
determinacin se basa en la cuantificacin de ste, bajo las condiciones de ensayo.
Reactivos:
-Substrato: solucin de urea 0,17 M en agua bidestilada, a 30C (pH 6,1).

-HC1 0,1 N.
Preparacin del extracto problema:
El material a ensayar (poroto de soya) se muele, y se extrae la enzima con agua destilada a
temperatura de 30C. Se filtra o centrifuga, usndose el sobrenadante para la determinacin de la
actividad enzimtica.
Procedimiento:
Se colocan 50 ml del substrato en un matraz Erlenmeyer y a continuacin se agrega una alcuota del
extracto en estudio, manteniendo la mezcla a 30C por espacio de 10 minutos.
Se valora el amonaco liberado con HC1 0,1 N, ajustando el pH a 6,1 con ayuda de un potencimetro.
Unidad enzimtica:
1 U corresponde a la cantidad de enzima que bajo las condiciones de ensayo disocia 1 micromol de
urea por minuto.
UNIDADES ESPECFICAS PARA ALGUNAS ENZIMAS USADAS EN ALIMENTOS (43, 53).
Alfa-amilasa (bacteriana, pancretica) y Beta-amilasa:
1 Unidad = cantidad de enzima que, bajo las condiciones del test, libera un microequivalente de grupos
reductores (de los enlaces glucosdicos) por minuto (calculado como maltosa).
Alfa-amilasa (de vegetales):
1 Unidad (SKB) = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test desdobla a 30C 1 g de
amilodextrina en 1 hora, de modo que por adicin de yodo se obtenga igualdad de coloracin con
un color estndar.
Amiloglucosidasa y Celulasa:
1 Unidad = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test libera 1 microequivalente de grupos
reductores por minuto (calculado como glucosa).
Celulasa:
1 Unidad = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test y a 35C hace bajar la viscosidad de
carboximetil-celulosa de 400 a 300 cp en 1 hora.
Glucosa-oxidasa:
1 Unidad = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test cataliza la transformacin de 1 m mol
de substrato por minuto.
1 Unidad = la cantidad de enzima que bajo las condiciones del test a 30C, a pH 5,9 y con exceso de
catalasa produce la captacin de 100 mm de sobre el substrato de glucosa.
Invertasa:
1 Unidad = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test y a 20C hidroliza el 77% de la
sacarosa aplicada.
Catalasa (fngica, bacteriana, animal):
1 Unidad (Baker) = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test y a 25C desdobla 266 mg
de perxido de hidrgeno por minuto.
Lactasa (fngica):
1 Unidad = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test libera por minuto 1 micromol de o-
nitrofenol a partir de o-nitrofenol-beta-D-galactsido.
Lipasa (pancretica, fngica):
1 Unidad = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test libera a partir del substrato 1
microequivalente (micromol) de cido por minuto.
Pectinasa (bacteriana):
1 Unidad = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test y a 30C produce en un substrato
de pectina de Citrus un aumento de extincin de = 0,01 por minuto a 235 nm.
Proteasas:
En general, se usa la Unidad Anson (vase Pg. 13) con hemoglobina como substrato. Adems:
a) Vegetal (papana, bromelina, ficina): 1 Unidad NF (National Formulary) = cantidad de enzima

que, bajo las condiciones del test y a 40C libera 1 m g de tirosina por hora, a partir de un substrato
de casena.
b) Fngica: 1 Unidad HUT = cantidad de enzima que bajo las condiciones del ensayo y a 40C libera
1 m g de tirosina por ml y minuto a partir de substrato de hemoglobina.
c) Bacteriana: 1 Unidad (PC) = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test y a 37C libera
1 m g de tirosina por minuto a partir de casena.

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11/04/13 Untitled Document

II. GENERALIDADES SOBRE ENZIMAS

PROF. DR. MARIO SAPAG-HAGAR

1. LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES BIOLGICOS.

1.1. Definiciones y Unidades de actividad (3, 5, 6).

UNIDAD INTERNACIONAL DE ACTIVIDAD ENZIMTICA: Es la cantidad de enzima que cataliza la

ACTIVIDAD ESPECFICA: Es el nmero de unidades de enzima por mg de protena. Es una medida

ACTIVIDAD MOLECULAR (nmero de recambio): Es el nmero de molculas de substrato,

1.2. Estructura de las enzimas.

la glucosa, est constituida por 4 subunidades de 40.000 daltons cada una.

1.3 Cofactores y Coenzimas (4-9).

En el lenguaje corriente de la enzimologa, el componente proteico se denomina apoenzima y el

1.4. Substratos de Enzimas.

- formacin estequiomtrica de un producto coloreado;

Otro ejemplo de una segunda reaccin enzimtica acoplada es la transformacin especfica de la

Los substratos enzimticos pueden tener dos orgenes:

2. PROPIEDADES GENERALES DE LAS ENZIMAS

2.1. Efecto de la temperatura sobre las enzimas (3,6).

Otras aplicaciones de la desnaturalizacin por el calor son la esterilizacin de alimentos e

As, la ausencia de actividad fosfatsica de la leche es un buen indicador de si la leche ha sido

Las enzimas difieren ampliamente en su resistencia a la inactivacin trmica. Las peroxidasas

La reversin de la desnaturalizacin es un proceso lento, pero durante el almacenamiento prolongado

2.2. Efecto de las radiaciones (3).

2.3. Efecto de la humedad (3,4).

La velocidad de las reacciones enzimticas se ve fuertemente influida por la naturaleza y concentracin

En la prctica es de gran importancia el efecto de la cantidad de humedad de los alimentos sobre la

En los cereales y harinas almacenados es posible detectar, fcilmente, actividad lipoltica y

diferentes niveles de humedad.

2.4. Efecto del pH y del estado inico (3,6).

A1 determinar la velocidad de reaccin de una enzima y para cierta concentracin de substrato, a

2.5. Sitio activo y especificidad enzimtica (5,8).

Dos caractersticas estructurales determinan la especificidad de una enzima por su substrato: a) el

2.6. Isoenzimas (6,9).

Uno de los ejemplos ms conocidos de isoenzimas es el de la dehidrogenasa lctica que est

Para identificar y diferenciar isoenzimas se usan mtodos cromatogrficos (en columna);

La identificacin y diferenciacin de isoenzimas tiene aplicacin en el diagnstico de ciertas

3. MECANISMO DE LA CATALISIS ENZIMTICA (5,8).

3.1. La energa de activacin y los efectos de los catalizadores.

La velocidad de una reaccin qumica es proporcional a la concentracin de las molculas en estado

3.2. El mecanismo de la accin enzimtica.

4. REGULACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA (6,8).

4.1. Mecanismos reguladores.

a) Variaciones por accin de masas.

Es el mecanismo regulador ms primitivo y mediante l la velocidad de la reaccin puede variarse,

b) Variacin de la actividad especfica de la enzima por activacin o inhibicin.

En la mayora de los sistemas multienzimticos, es decir, aquellos en que intervienen

La inhibicin enzimtica puede ser reversible o irreversible. En la inhibicin irreversible, el inhibidor

c) Variacin de la concentracin de la enzima.

4.2 Importancia de la induccin y represin enzimticas para mejorar la calidad de los

Importancia de los biorreguladores.

a) La induccin de la sntesis de carotenoides puede lograrse, en teora, en cualquier especie que

III. CLASIFICACIN DE LAS ENZIMAS CLASIFICACIN GENERAL.

La comisin de Enzimas de la Unin Internacional de Bioqumica introdujo en 1964, para uniformar la

Catalizan la formacin de enlace entre C y O, S, N y otros tomos. Generalmente, la energa requerida

CLASIFICACIN DE LAS ENZIMAS DE LOS ALIMENTOS

1. LAS HIDROLASAS comprenden las:

1.1. ESTERASAS, entre las cuales son de importancia en los alimentos:

a) Lipasas, que hidrolizan los steres de cidos grasos;

- Pretratamiento por inmersin (ej., Arvejas), a temperatura ambiente, en solucin de bicarbonato de

El pH en estos casos se eleva a 8 en el primer tiempo y se mantiene durante el escaldado y la

d) Pectino-esterara, enzima importante en la industria de derivados de frutas (vanse stas) .

1.2 CARBOHIDRASAS, que se clasifican en:

a) Hexosidasas, entre las que interesan la invertasa y la lactasa; y

1.3 PROTEASAS, que se clasifican en: