CRECIMIENTO Y CINÉTICA MICROBIANA

Cuantificación del crecimiento

Profesor: Dr. Fernando Salazar

fernando.salazar@ucv.cl
Anexo 4221

INGENIERÍA DE ALIMENTOS
MICRO ALI323-2019
CRECIMIENTO MICROBIANO

Es el aumento ordenado de todos los componentes químicos que

llevan a un incremento de los constituyentes y estructuras
celulares, a la división celular y al crecimiento de la población
Como resultado del metabolismo bacteriano, el microorganismo crece y se multiplica.
En organismos unicelulares la multiplicación implica el aumento del número de células
mas que el tamaño de la celular.
Se puede expresar también como función del incremento de la masa celular.
Estas, se reproducen normalmente por fisión binaria.
El primer paso es la duplicación del ADN.
Posteriormente, la membrana citoplasmática y la pared celular se invaginan, separando
en dos regiones el ADN cromosómico. Finalmente, las paredes en crecimiento se unen
formando dos células individuales, cada una de las cuales es esencialmente idéntica a
la célula parental. La mayoría de las bacterias se divide cada 20 minutos (tiempo de
gestación). El bacilo de Koch (Mycobacterium tuberculosis) constituye una excepción,
ya que se divide cada 24 hrs.
CRECIMIENTO MICROBIANO
División celular: fisión binaria

Gemación
levaduras
 CRECIMIENTO MICROBIANO

CÓMO CRECEN LOS MICROORGANISMOS?

En el laboratorio, organismos estudiados como cultivos puros crecidos con

abundancia de nutrientes a muy altas densidades (condiciones ideales):

•Cultivo discontinuo (batch)

•Cultivo continuo o quimiostato

En la naturaleza, los microorganismos usualmente existen en biofilms - grupos de

diferentes microorganismos organizados en capas sobre una superficie (viva o inerte)
– Quimiostaxis- exopolisacaridos (agua, enzimas, nutrientes)..

flotantes

Fijas e
inmóvil
CRECIMIENTO MICROBIANO

CULTIVO EN LOTE (BATCH O DISCONTINUO)

Es el crecimiento de microorganismos en un
volumen fijo de nutrientes que continuamente es
alterado hasta su agotamiento por el crecimiento.
Se realiza sin intercambio de materia con los
alrededores (sistema cerrado).
Este sistema ofrece como principal característica su
simpleza, tanto desde el punto de vista de equipo
necesario como de su operación.
Al mismo tiempo, esta modalidad de cultivo presenta
limitaciones, como la falta de control sobre diversos
parámetros del cultivo y el hecho que las células se
desarrollan en un estado fisiológico poco definido y
cambiante hasta agotar completamente los sustratos
del medio.

Microorganismo + Nutrientes (medio de cultivo)

CRECIMIENTO MICROBIANO

CULTIVO CONTINUO

Es un sistema de flujo de volumen constante al que se le agrega continuamente medio

y del cual sale un dispositivo que permite la eliminación constante del medio
excedente. Puesto que un sistema de este tipo se encuentra en equilibrio, el número
de células y su estado nutritivo permanecen también constantes, considerándose
entonces que el sistema se encuentra en un estado estable. El dispositivo más
frecuente para cultivo continuo es el llamado quimiostato.
CRECIMIENTO MICROBIANO

QUIMIOSTATO
Es el dispositivo más comúnmente
usado para cultivo continuo.
Permite el control de la densidad de la
población y de la tasa de crecimiento del
cultivo.
Consiste básicamente en un tanque
agitado que opera con dos elementos de
control: la tasa de flujo y la
concentración de un nutriente limitante
tal como la fuente carbonada o
nitrogenada.
Los demás nutrientes en el medio se
encuentran en exceso y junto al
nutriente esencial determinado como
factor limitante son aportados al tanque
continuamente desde un reservorio, al
mismo tiempo que se saca del recipiente
el exceso de organismos y de medio.
CRECIMIENTO MICROBIANO

Crecimiento
Es importante distinguir entre el crecimiento individual de células y el crecimiento de
poblaciones de células:
Crecimiento individual: Es el incremento en el tamaño y peso y es usualmente un
preludio a la división celular
Crecimiento poblacional: Es el incremento en el número de células como una
consecuencia del crecimiento y división celular.

Tasa de crecimiento (velocidad de crecimiento)

Es el cambio del número de células o masa por unidad de tiempo (VC = Dn/Dt)

Generación (n):
Es el número de divisiones celulares o generaciones que ocurren en un
determinado tiempo en un cultivo microbiano.

Tiempo de generación (Tiempo de duplicación, td)

Tiempo que tarda una población en duplicarse. Se puede definir también como la
cantidad de tiempo requerida para completar un ciclo de división. (td=t/n)
 CRECIMIENTO MICROBIANO

Tiempo de generación o duplicación

• Los tiempos de generación o

duplicación, varían ampliamente
dependiendo de la especie
bacteriana.

• El más corto conocido es de

alrededor de 6 min/generación.

• Otras bacterias requieren horas, dias,

semanas.

td=g
CRECIMIENTO MICROBIANO
Número de células vs tiempo de
generación o duplicación

Tiempo Tiempo de generación

(h) (td, min)
30 60
0 1 1
1 4 2
2 16 4
3 64 8
t 60 min t 60 min
td   30 min td   60 min
4 256 16 n 2 n 1

5 1024 32 td 
t 120 min
 30 min td 
t 120 min
 60 min
n 4 n 2
6 4096 64
7 16384 128
8 65536 256
 CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Fases del crecimiento

X2
X1

Log X I Lag
II Aceleración
III Exponencial
IV Desaceleración
X2 V Estacionaria
X0
VI Declive
I II III IV V VI
t0 t1 t2 t3 t4

Tiempo (h)
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Fase Lag, de latencia o de inducción.

Es la expresión de un período de adaptación de las células al substrato del medio de
cultivo para iniciar el crecimiento, no hay división celular, cuando la fase de adaptación
termina se inicia el crecimiento y aumenta la velocidad especifica de división. Su
presencia y su extensión depende de:
Inóculo
 Estado fisiológico
 Fase de crecimiento
 Tamaño
 Tipo de microorganismos

Composición del medio en el que se inocula

 Condiciones fisicoquímicas del medio

Fase Lag aparente: con inóculos pequeños

CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Fase Lag, de latencia o de inducción

Cinética
(dX/dt) = 0
X = Concentración de células
X = X0
t = Tiempo
X0 = Biomasa inicial

Incidencia Industrial
Costo del tiempo de fermentación
Tamaño del fermentador
Riesgo de contaminación
 CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Fase exponencial (Fase de aceleración)

• Velocidad específica o tasa de crecimiento exponencial alcanza un máximo y
permanece constante.

• La concentración de las células aumenta exponencialmente.

• La composición y fisiología de las células permanecen invariables

• Comienza la formación de productos asociados al metabolismo primario: etanol, ácido

láctico.

• Pare de las celulas comienzan a dividirse.

(dX/dt) = µX
X = Biomasa microbiana
µ = Constante especifica del crecimiento microbiano en h-1.
T = Tiempo en horas (h).
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Fase exponencial

 El cultivo esta en estado autocatalítico

 Es un período relativamente corto
N° inicial y final
 Se cumple que:
de células
N = N0 * 2n n= Log N – Log No
 Cinética de crecimiento Log 2
Se caracteriza por ser una fase de crecimiento constante
(dX/dt) = µX

X = Biomasa microbiana
µ = Constante especifica del crecimiento microbiano en h-1.
t = Tiempo en horas (h). (t = td = tiempo de duplicación)
n = n° de generaciones
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Fase estacionaria

• Antes existe uma fase de desaceleración de la

división celular por agotamiento del medio de
cultivo

• La concentración de células alcanza su máximo

nivel.

• Vel de crecimiento = Vel de muerte

• El crecimiento celular se detiene pero conserva

buena actividad metabólica.
(dX/dt) = 0
• Acumulación de productos del metabolismo
(acidos, alcohol, etc.)
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Constante especifica de la velocidad de crecimiento microbiano

 La constante especifica de la velocidad de crecimiento microbiano (µ) se utiliza

para caracterizar el comportamiento de una población microbiana.

 Su valor depende de las condiciones ambientales en que se encuentra el

microorganismo.

 Existe una gran dependencia de la fuente de carbono y energía tanto en calidad

como en cantidad.
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Fase de declinación o retardo

• Autólisis de las celulas por acción de las propias enzimas de la célula, agotamiento
de sustrato, acumulación de un inihibidor, otras causas ajenas al crecimiento.
• Existe división celular por consumo de materia orgánica liberada por las propias
células.
• Vel de crecimiento < Vel de muerte

Cinética:
(dx/dt) = µ(Xm – X)

Xm = Concentración de biomasa máxima

CRECIMIENTO MICROBIANO

Efecto de la concentración de nutrientes

La concentración de nutrientes puede afectar tanto a la velocidad de crecimiento

como al rendimiento del crecimiento de un microorganismo. A concentraciones muy
bajas de nutrientes, la velocidad de crecimiento se reduce, mientras que a niveles
moderados y altos de nutrientes llega a ser máxima.
CRECIMIENTO MICROBIANO

Nutrientes (S) Número de células (N)

LOG N
P
S

Producto (P)
CRECIMIENTO MICROBIANO

1 2 3 4
CRECIMIENTO MICROBIANO

VELOCIDAD DE CRECIMIENTO Y TIEMPO DE DUPLICACIÓN

DE ALGUNOS MICROORGANISMOS

Microorganismos µmax g (h)

Td (h)

Bacillus subtilis 1.70 0.4

Escherichia coli 2.30 0.3
Candida tropicalis 0.70 1.0
Saccharomyces cerevisiae 0.35 2.0
Aspergillus sp. 0.53 1.30
MEDIDA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
MEDIDA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Se mide por cambios sucesivos en el número de células o por el peso de la masa de

las células. Existen varios métodos para contar las células o estimar la masa de éstas.

A) Recuento de células

1) Conteo de células al microscopio

Se emplea un dispositivo graduado con 25

cuadrados cuyo volumen y área es conocido.
Ej.: Cámara de Petroff-Hausser, cámara de
Neubauer, hemocitómetro

Limitaciones: - Es muy tedioso, no es práctico

para un gran número de muestras
- No es muy sensible, se necesitan al menos 106
bact/ml para que sean observadas al
microscopio
- No distinguen células vivas de muertas
MEDIDA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

2) Conteo de células viables

Una célula viable es definida como aquélla que es capaz de dividirse y formar
una colonia en el medio de cultivo. El conteo en placas es el método más
utilizado. Pueden ser:
Diseminación en placa (siembra en placa por extensión).-
Se asume que cada colonia surgió de una simple célula, contando el número
de colonias uno puede calcular el número de células viables en la muestra.
Método de vaciado en placa.-
 MEDIDA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

B) Medida de la masa celular

En muchos estudios es necesario determinar el peso de las células más que el

número.

1) Peso seco
Se determina el peso seco o peso húmedo de una alícuota de la población
separada por centrifugación. El peso seco es por lo general el 20-25 % del
peso húmedo.

2) Turbidimetría

A través de un colorímetro o espectrofotómetro midiendo la turbidez en

unidades de absorbancia. Debe prepararse curva estándar para cada
organismo estudiado.
MEDIDA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Turbidimetría

Se basa em la dispersión de un rayo luminoso debido a las partículas em suspensión.

Se establece una relación entre la DO y la concentración celular ( g/L)

DO = E I X

DO: densidad óptica

E: coeficiente de turbidez (L/g.cm)
I: ancho de la cuveta o célula de medición (cm)
X: concentración de biomasa (g/L)
MEDIDA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Otras: aplicables para mo filamentosos

Determinación de proteínas (no diferencia cell vivas de muertas).

Determinación de DNA (alto costo)

Determinación de NADH (sofisticada)

Medida de la actividad enzimática (poco reproductible)

Consumo de sustrato (estimación)

 TÉCNICAS DE MUESTREO PARA EL
CONTROL MICROBIOLÓGICO

TOMA DE MUESTRAS

El muestreo de alimentos destinados al análisis microbiológico

es la operación que consiste en separar un numero determinado
de muestras de un lote, remesa, partida, etc, con el fin de
obtener unos resultados analíticos fiables. La muestra tiene que
ser representativa del total.

NÚMERO DE MUESTRAS

Para que el muestreo tenga utilidad estadística, se debe realizar sobre un numero
apreciable de unidades de un lote o cualquier otra porción.
Se suele sugerir que el numero de muestras se corresponda con la raíz cuadrada del
numero total de unidades del lote, y también que teniendo en cuanta el volumen del lote
se tome el 1% del total cuando es grande y el 10% cuando el lote es pequeño.
Esto es cuando el lote procede de una industria cuyo control se desconoce, si los
productos están sometidos a un control regular, es suficiente analizar 5-10 muestras de
cada lote.
TÉCNICAS DE MUESTREO PARA EL
CONTROL MICROBIOLÓGICO

MÉTODO DE MUESTREO ALEATORIO

Este método consiste en separar del lote un numero de muestras calculado

previamente utilizando la tabla de números al azar.
 TÉCNICAS DE MUESTREO PARA EL
CONTROL MICROBIOLÓGICO

MATERIAL UTILIZADO PARA EL MUESTREO

Envases para la toma de muestras

Envases de vidrio de boca ancha esterilizables

Envases de plástico esterilizables
Bolsas de plástico esterilizables
Envases metálicos

Instrumentos para la apertura de envases

Tijeras estériles
Pinzas estériles
Cuchillos estériles
Sondas estériles
Taladros estériles
Cucharas estériles
Espátulas estériles
Sierras, etc
 TÉCNICAS DE MUESTREO PARA EL
CONTROL MICROBIOLÓGICO
CONDICIONES GENERALES PARA EL MUESTREO:

● La persona destinada al muestreo debe conocer perfectamente su finalidad e

importancia y deberá estar debidamente autorizada para ejercer su labor.
● A ser posible las unidades de muestra se tomaran en sus envases originales en los que
se enviaran al laboratorio.
● En ocasiones las muestras que se deben recoger son únicas, sobretodo cuando se trata
de alimentos sospechosos de toxiinfección alimentaria.
● Cuando los envases son muy grandes y difíciles de trasportar se toman asépticamente
muestras representativas y se pasan a envases estériles mas pequeños.
● Los alimentos a granel se muestrean tomando porciones de distintas zonas con material
estéril y pasándolas asépticamente a envases esterilizados.
● Si el producto a muestrear tiene salida por un conducto se desechan las primeras
porciones antes de tomar la muestra.
● Si son productos líquidos, se agitaran en su envase y se pasaran asépticamente a
recipientes estériles.
● Para productos sólidos, se tomaran las muestras en varias zonas con sacabocados,
taladros, sierras y se introducirán asépticamente en recipientes estériles.
● Es conveniente anotar la temperatura de almacenamiento del producto e incluso su
propia temperatura.
 TÉCNICAS DE MUESTREO PARA EL
CONTROL MICROBIOLÓGICO
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA SU ENVÍO AL LABORATORIO

Una vez tomadas las muestras, se empaquetan de forma adecuada y se etiquetan

correctamente, la etiqueta ira numerada y adecuadamente identificada para que concuerde
con el informe de muestreo que debe acompañar siempre a la muestra representativa. El
informe recopilara todos los datos que puedan ser de interés para el microbiólogo.

- Nombre de quien toma las muestras

- Nombre y dirección de la persona empresa etc. donde se han tomado las muestras.
- Fecha lugar y hora.
- Clase de alimentos
- Nombre del fabricante, importador, etc.
- Razón por la que se toma el muestreo
- Número, tamaño y marca de las unidades que forman el lote.
- Forma de trasporte. Punto de origen y lugar de destino.
- Temperatura del producto en el momento del muestreo
- Temperatura ambiental de almacenado
- Forma de transporte y condiciones del envío de las muestras al laboratorio
 TÉCNICAS DE MUESTREO PARA EL
CONTROL MICROBIOLÓGICO
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS.

Esta operación exige unas reglas de manipulación aséptica muy estrictas, así como la
utilización de material y diluyentes estériles, para evitar la contaminación exterior del
alimento. Se utilizan campanas o cámaras de flujo laminar adecuadas para la toma de
muestras, que suponen una gran ayuda para evitar el riesgo de cualquier contaminación
 TÉCNICAS DE MUESTREO PARA EL
CONTROL MICROBIOLÓGICO
TRITURACIÓN Y HOMOGENEIZACIÓN DE ALIMENTOS

Jarra: Consiste en un envase de vidrio o acero provisto de una hélice.

Vástago: Provisto de una hélice en su extremo, que se introduce en la mezcla que se va a triturar.
Necesita un envase de vidrio o acero que se adapte especialmente al vástago.
Triturador de paletas (Stomacher), que actúa golpeando rítmicamente la mezcla de alimento y
diluyente que ha sido introducida previamente en una bolsa de plástico estéril.
 TÉCNICAS DE MUESTREO PARA EL
CONTROL MICROBIOLÓGICO

TRITURACIÓN Y HOMOGENEIZACIÓN DE ALIMENTOS

Muestras sólidas Muestras líquidas

Solución madre: Solución madre:

1/10 de alimento 1/10 de alimento
en Diluyente en Diluyente

10 ml

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

10 ml

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

TÉCNICAS DE MUESTREO PARA EL
CONTROL MICROBIOLÓGICO

TRITURACIÓN Y HOMOGENEIZACIÓN DE ALIMENTOS

Diluyente Agua de triptona

(Tryptone Water: TW)
Triptona 10 g
Cloruro sódico 5g
Agua destilada 1.000 ml

Solución Tinger 1/4

Cloruro sódico 9g
Cloruro cálcico anhidro 0,42g
Hidrogeno Carbonato sódico 0,20g
Agua destilada 1.000 ml

BPW Agua de peptona tamponada

Peptona 10 g
Cloruro sódico 5g
Fosfato disódico 9g
Fosfato potásico 1,5g
Agua destilada 1.000 ml
 TÉCNICAS DE MUESTREO PARA EL
CONTROL MICROBIOLÓGICO.

CRITERIOS GENERALES DE MUESTREO

• La muestra seleccionada para el análisis

debe ser representativa del lote entero del
alimento y lo suficientemente grande para
poder llevar acabo todas las
determinaciones.

• La técnica de análisis sea ejecutada con

estricto apego a la metodología establecida.

• Comparación con normas o estándares de

calidad
TÉCNICAS DE MUESTREO PARA EL
CONTROL MICROBIOLÓGICO.

CRITERIOS GENERALES DE MUESTREO

Para realizar un muestreo en forma práctica se utiliza el "Sentido Común".

La experiencia de los procesos de fabricación permite que el muestreo pueda
resolverse al tanteo.

– Ejemplo 1: tomando muestras al principio y al final de la jornada

– Ejemplo 2: tomando como muestra el último producto de cada serie

(como se hace con algunos alimentos precocidos y congelados).
 TÉCNICAS DE MUESTREO PARA EL
CONTROL MICROBIOLÓGICO.

CRITERIOS GENERALES DE MUESTREO

• Todo el material que se use debe esterilizarse

y envolverse.

• Al colectar la muestra hay que evitar

contaminación del ambiente (polvo, tierra,
agua, saliva).

• Rotular o etiquetar.

• Consignar información que pueda afectar la

prueba o el significado del resultado. Por
ejemplo la presencia de algún conservador,
olor, color, condiciones de conservación,
temperatura.
 TÉCNICAS DE MUESTREO PARA EL
CONTROL MICROBIOLÓGICO.

CRITERIOS GENERALES DE MUESTREO

• Para muestras sólidas se recomienda un peso de

100 gramos. Si se encuentra a granel o en
recipientes o piezas grandes habrá que retirar
porciones de diferentes puntos para integrar una
muestra representativa. O bien manejar varias
muestras independientes de áreas que se
considere pueden tener mayor riesgo.

• En productos como carne y pescado deben

tomarse muestras de la superficie y profundas
(minimizando la contaminación de la superficie).

• En alimentos congelados se pueden usar

sacabocados para tener muestras sin descongelar.
 TÉCNICAS DE MUESTREO PARA EL
CONTROL MICROBIOLÓGICO.

CRITERIOS GENERALES DE MUESTREO

• Transportar muestras de alimentos perecederos bajo

refrigeración (2-8°C) o en congelación si son alimentos
congelados. Evitar agua de deshielo que pueda contaminar
el alimento.

• Reducir el tiempo comprendido entre recolección y entrega

de la muestra.

• Muestras líquidas deben encontrarse homogéneas,

emplearse de 100 a 500 ml.

• Obtención de muestras superficiales mediante

transferencia de pedazos con la ayuda de bisturí y pinzas,
uso de isopos inertes estériles humedecidos en solución
diluyente estéril.
TÉCNICAS DE MUESTREO PARA EL
CONTROL MICROBIOLÓGICO.

TÉCNICAS DE MANEJO DE MUESTRAS

Dilución para conteo de microorganismos viables

• Si es muestra líquida congelada, es necesario
fundirla y homogeneizarla. No es recomendable
que el producto llene totalmente el recipiente
para evitar escurrimientos y contaminación.
• Para muestras sólidas se pesan 10 gramos y se
diluyen en 90 ml de solución diluyente, se licúa o
se puede usar un mortero estéril. Se considera
como la primera dilución. Para las diluciones
sucesivas se usan pipetas diferentes inoculando
simultáneamente a las cajas petri.
• El volumen que se transfiera nunca será menor
del 10% de la capacidad total de la pipeta, por
ejemplo para 0.1 ml no se usa una pipeta de más
de 1 ml.