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Rubisco
Rubisco
Enlafotosntesisribulosa1,5bisfosfatocarboxilasa/oxigenasa(Rubisco)catalizala
frecuenciaquelimitalavelocidaddeCO2fixationpasoenelciclodeCalvin.Estohaceque
laRubiscotantoelguardindelaentradadecarbonoenlabiosferayunobjetivoparala
mejorafuncionalparamejorarlafotosntesisyelcrecimientodelasplantas.Gravarel
rendimientocatalticodeRubiscoessumuyconservadasqumicacataltica,compleja.En
consecuencia,losesfuerzostradicionalesparamejorarlacatlisisRubiscoelusode"ensayo
yerror"prolongadaenfoquesdeingenieradeprotenashantenidounxitolimitado.Aqu
sedemuestralaversatilidaddealtorendimientodirigido(laboratorio)laevolucinde
protenasparamejorarlaspropiedadesdecarboxilacindeunRubisconofotosintticade
lasarqueasMethanococcoidesBurtonii.Elusodelatransformacindecloroplastosenla
plantamodelodeNicotianatabacum(tabaco)confirmamoslasformasmejoradas
deM.BurtoniiRubiscoaumentlafotosntesisyelcrecimientoenrelacinconlos
controlesdeproduccindetabacodetiposilvestreM.BurtoniiRubisco.Nuestroshallazgos
indicancontinuaronevolucindirigidadearqueasRubiscoofrecenuevasposibilidadespara
mejorarlafotosntesisdelahojaycrecimientodelasplantas.
Introduccin
MejorarelrendimientodelasemisionesdeCO2delaenzimaRubiscoFijacintieneel
potencialdemejorarsignificativamentelaeficienciafotosintticayproducir1.Las
estrategiasparalograresteobjetivosuponenilamodificacindelabioqumicayla
ultraestructuradeloscloroplastosdelashojasdeconcentrarCO2alrededordeRubisco,o
mejorardirectamentelacatlisisensRubiscomediantecruzamientogenticoo
modificacintransgnica2.Aunqueambosenfoquesseenfrentanadesafostcnicos
significativos,lassugerenciasdequeRubiscoenplantasyaestoperandoaocercade
ptimafisiolgicaplanteaincertidumbreencuantoalniveldemejoraposible3,4.Algopasa
poraltoenestospequeosconjuntodedatosdeanlisisesquelaplantaRubisconoesel
pinculodelaevolucincomoelRubiscosuperioresdealgunasalgasrojastienenel
potencialparabeneficiaraC3productividadPlantahastaenun30%2.Pordesgracia,en
sustitucindelaplantaRubiscoconalgasrojasRubiscopareceinsostenibledebidoala
chaperonaincompatibilidadesqueimpidenelmontajedealgasRubiscogrande(L)y
pequea(S)subunidadesfuncionalesenL8S8complejoshexadecamerenloscloroplastos
delashojas5.Enlosltimosaossehanproducidoavancessignificativosenla
comprensindelaschaperonasauxiliarescomplejasyespecializadasparalabiognesisde
lascianobacteriasylaplantaL8S8Rubisco6,7,8,9,sinembargohomlogosparamuchas
deestaschaperonasenalgasrojasnosonfcilmenteidentificables.
Apesardecincodcadasdeinvestigacin,unaamplificacindramticaenlapotenciade
clculoymsde25estructurasderayosXparadiferentesisoformasRubisco10seguimos
siendoincapacesdemejorarlaRubiscocatlisispordiseoracional11,12,13.Esta
limitacinhaconducidoaldesarrollodelasindicaciones(invitrodelaprotenaevolucino
laboratorio)EnfoquesadaptadosparaseleccionarmutantesRubiscoconmejoradela
funcin12.Engeneral,laevolucindeprotenasdirigidaimplicalaidentificacinde
protenasconpropiedadesdeseadasapartirdeunabibliotecademutantesquecomprende
unadiversidadgenticasuficiente14.Losavancesenlastecnologasdelaevolucinde
protenasdirigidashanestimuladosuxitoenlaidentificacindemutacionesquemejorano
alteran,lacatlisisy/olasolubilidaddeunagranvariedaddeenzimas14,15,16.Un
beneficioclavedelaevolucindirigidaesquepuederevelarnuevassolucionesde
acondicionamientofsicoqueseraprobablequedeotramanerapasaransinexplorar
durantelaevolucinnaturalde14,17.
LaevolucindirigidadeRubiscohautilizadoprincipalmentesistemasdebajorendimiento
fotosintticodeseleccin(porejemplocapsulatusRhodobacter)odealtorendimiento
dependeRubiscoE.colisistemasdeseleccin(RDE)quevarandramticamenteen
eficiencia12,18,19.ComnalossistemasdeseleccinRDEeslaexpresinectpicade
fosforribuloquinasa(PRK)cuyoproducto,elsustrato5carbonodeRubiscoribulosa1,5
bisphospahte(RuBP),esfortuitamentetxicosparalasbacterias.UnMM1
refinadaPRKseleccinRDEsehaadaptadogenticamenteparautilizarun'PRKRubisco
shunt'paracerrarunabrechaArupturaintroducidaenlagluclisis(figura1a.
20,21).La
bajafrecuenciadefalsospositivosobtenidosutilizandoelMM1PRKsistemaRDE
contrastaconlaineficienciasorprendentedeotrossistemasRDE22,23.Comoresultado,la
MM1PRKsistemaRDEhaidentificadomutacionesqueinfluyennegativamenteenel
CO2/O2especificidad(SC/O)deLbacteriana2RubiscodeRhodospirillumrubrum,as
comomutacionesquemejoransignificativamenteelconjunto(solubilidad)deL
cianobacterias8S8Rubiscoy,enuncaso,marginalmentemejoradatodoslosparmetros
catalticos12,24.Msrecientemente,elMM1PRKRDEidentific
unSynechocystisPCC6803L8S8Rubiscomutanteconmejorasde3vecesenlaeficiencia
decarboxilacinquemejoraronlastasasdefotosntesisde>50%cuandosevuelvea
integrarseenlaaltaconcentracindeCO2compartimentocarboxisomadentrodela
cianobacteria11.Porelcontrario,espocoprobablequeestasmejoraspodranserde
beneficioenhojasdeplantascomolaaltaconcentracindeCO2nivelesnecesariospara
explicarlabajadeCO2deafinidadylamalaSC/SdelascianobacteriasRubisconose
cumplenporloscloroplastos25.
Figura1:SeleccindemejorasenlacatlisisMBRusandoRubisco
dependienteE.coli(RDE).
( Un ) esquemtico simplificado del sistema de seleccin RDE que utiliza un
gluclisis / gluconeognesis interrumpi gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa
eliminacin ( brechaA ) cepa de E. coli (MM1). La expresin ectpica de
-
ElpapelnofotosintticadelosantiguosL2/Lde10isoformasRubiscoenarqueasimplica
queprobablementehansidosometidosalaspresionesdeseleccinalternativosparaRubisco
fotosintticadurantelaevolucin.Porejemplo,Rubiscodearqueastieneunaaltaafinidad
porRuBPyaltatermoestabilidadperobajastasasdecarboxilacin(kgatoC)ySC/
O26 27 28.EstedistintivocatalticasurgedelpapelbiolgicoalternativodearqueasRubisco
, ,
enlavadelaspentosasbisfosfatoenelquefuncionaparametabolizarlaRuBPproducido
duranteelmetabolismonuclesido29.Apesardesufuncinnofotosinttica,arqueas
Rubiscotodavapuedeapoyarlafotosntesisyelcrecimientodelasplantas.Porejemplo,
elMethanococcoidesBurtoniiL10Rubisco(MBR)esaltamenteexpresadoenlos
cloroplastosdelashojasysemuestraparaapoyarelcrecimientohastalamadurezfrtilde
tabacobajolaaltaconcentracindeCO2nivelesnecesariosparadarcabidaalabajakgatoCy
SC/SdeMBR26.
Laspropiedadescarboxilasasignificativamentemspobresyfuncinalternativadela
Rubiscoenarqueassugierenqueestaformadelaenzimasehaadaptadoalaspresiones
evolutivasalternativasencomparacinconlaRubiscoenlosorganismosfotosintticos.Esta
preguntasilaspropiedadesdecarboxilacindelarqueasL10Rubiscopodranserms
susceptiblesdemejorahacialosrequeridosparaelpotencialfotosintticomejorada.Para
abordarestacuestinseutilizelMM1PRKsistemaRDE(Fig.1a)paraseleccionar
mutantesMBRevolucionadoconmejorasenlaspropiedadescatalticasqueserequieren
paramejorarC3fotosntesisPlanta5,30.EstaspropiedadesincluyenelaumentodekcatC,la
eficienciadecarboxilacin(kgatoCdivididoporKC21%deO2,laKmparaelCO2enambientes,
O2)ySC/S.Usandogenomadelcloroplasto(plastoma)transformacin
introducimosMBRgeneseneltabacoparademostrarxitodelatraduccindepropiedades
mejoradasMBRseleccionadosenE.colialoscloroplastosdelashojas.Lafotosntesis
mejoradayelcrecimientodelasplantastransformadasproduciendomutantesmejorados
MBRenrelacinconelcontroldelneasdeproduccinnomutadaMBRproporciona
nuevospruebadeconceptoenlautilidaddelamejoradeRubiscocatlisisporevolucin
dirigidaenE.coliparamejorarelCO2tasaassimilationenhojas.
resultados
LaevolucindirigidadeM.BurtoniiRubisco(MBR)
enE.coli
ElnativoMBIILgenquecodificaM.BurtoniiRubiscosetraduceeficientemente
enE.coliyseensamblaenabundantementeexpresado(>6%(w/w)delaprotenasoluble
declulas)comofuncionalL2Rubisco(MBR)26.EnpresenciadeRuBPsustrato(oligando
fosfatodeazcarestructuralmentecomparable)elL2unidadesseensamblanenunL
estable10complejoMBR.LasmutacionesalazarseintrodujeronenMBIILusandoPCR
propensaerror(conunpromediode2mutacionesporkb)ylosgenesmutantesseligen
unlacdelvectorinduciblepTrcHisB20.
TresMBIILbibliotecas(comprendiendocadauno~180kvariantes)setransformaronen
MM1PRKclulas(Fig.1a)ysecultivarona23Ccomosehadescrito20.Laseleccin
inicialsellevacabobajoaltaRubiscoinducir(0,5mMdeIPTG)ybajocondicionesde
induccindePRK(0.05%(w/v)dearabinosa)enelairesuplementadasconCO2,5%(v/
v)2.Despusde916das80coloniasquemuestranelcrecimientomejoradoenrelacin
conMM1PRKseidentificaronproduccindetiposalvajeMBR(quecomplementael
cuadro1).ElplsmidoquecontienelaRubiscodecadacoloniasesecuencisustituciones
reveladorasen78delos474aminocidos(Tabla1complementario).CadaMBIILmutante
seclondenuevoenpTrcHisByvolveratransformarseenMM1PRKclulasRDEypor
separadocultivabajomayorseleccinactividadRubisco(esdecir,enmediosquecontienen
0,1%(w/v)dearabinosaparaelevarlaexpresindePRK;laFig.1b).Elcrecimientode
coloniassepuntuenrelacinconMM1PRKclulasqueexpresandetiposalvajeMBR
quenopodancrecerenunmedioquecontiene0,1%(w/v)dearabinosa(Fig.
1b).SieteMBIIseencontrarongenesmutantesLparatransmitirunaventajaselectiva
distintaaMM1PRKE.colicrecimiento(Fig.1c).
LossietedetiposalvajeymutantepTrcMBIILgenesseexpresanenXL1Blue
deE.coliysincoexpresindePRK.EstodiocomoresultadosloenL2seforman
oligmerosMBRcomolasclulasnohicieronningnRuBPqueserequiereparala
formacindeL10MBRcomplejos26.Elcontenidocelularylaspropiedadescatalticasde
cadaL2semidienzimaMBR(Fig.2a).LastasasmximasdeCO2fixation(kgatoC)a25
Csedeterminaronenambientes,O2niveles(~252MO2)yconunpHde7,2,debidoal
bajopHfavorecidoporcatlisisMBR26.EnestascondicionesMBRmutanteasla#1
(MBRK332E),#10A(MBRE138V)y#63(MBRT421A)mostraronsignificativas40%a
90%mejorasenlakcatCy10%a25%deincrementoenloscorrespondientesSOC/(Fig.
2a).LacuantificacindelaexpresindeMBRenE.colipor14CCABPdeuninyla
confirmacinmedianteSDSPAGE(Fig.2b)mostrquelamayoradelasmutaciones
tuvieronpocoefectosobreelniveldeexpresinMBR.ElmutanteMBRT421A(#63)
mostrunmodesto,perosignificativo,aumentoenlaexpresin,mientrasquelas
mutacionesenelMBRmutantes#14,#23y#45laproduccindeMBRobstaculizadade
formasignificativa(Fig.2b).
Figura2:AnlisisdemutantesdeMBRconlamejoradelacatlisis.
( Un ) propiedades catalticas (mxima tasa de RuBP-carboxilacin, k ;gato
C
pH 7,2, y su nivel de expresin relativa en bruto E . coli lisado soluble. Los valores
mostrados son la media ( DE) de los ensayos realizados en tres preparaciones de
clulas o, por S , cuatro repeticiones tcnica de preparaciones de enzimas
C/S
LaexpresindelamejoradeMBRenloscloroplastosde
tabaco
ElgenotipodeltabacocmtrLsehaadaptadogenticamenteparalaingenieradeRubisco
mediantelatransformacindecloroplastos31.EnelplastomadecmcloroplastosTRLeltipo
salvajerbcLgenhasidoreemplazadoconunsinttico,codnversinmodificadade
laR.rubrumbacterianarbcgenH(cmrbcM)quecodificaparalaFormaIIL2Rubiscoen
lugardetabacoL8S8Rubisco(Fig.3a).ElaumentodeO2sensibilidad
deR.rubrumL2RubiscoreducetantoSC/Oylaeficienciadecarboxilacinenambientes,
O2(kgatoC/KC21%O2)por~7vecesenrelacinconeltabacoL8S8Rubisco(Tabla1).Estas
propiedadescatalticasmspobrescomoresultadolacmgenotipotrLquerequierealta
concentracindeCO2paraelcrecimientoenelsuelo31.ComosemuestraporAlonsoet
al.,(2009)laspropiedadescatalticasdeMBR(tantoenL2yL10complejos)sonanms
impedidoqueR.rubrumL2Rubisco,especialmenteconelaumentodepHalcalino.Apesar
deestaalteracin,sustitucintransplastmicasdelcmrbcgenMencmtrLconladetipo
salvajeMBIIgenLgenerlaL10genotipotabacoMBRproducirTobMBIILquepodran
sobrevivirbajoniveleselevadosdeCO2(2,5%v/v)enelsuelo26.LosTobMBIILlneas
tomaronmsde300dasparaalcanzarlamadurezfrtilencomparacincon~30daspara
eltabacodetiposalvajey~32dasparacmtrLenlasmismascondicionesdecrecimiento.
Figura3:TransformacinyexpresindelaMBRmutadoenzimasenlashojasde
tabaco.
Las variables mb R genes que codifican tipo salvaje y mutante MBR se integraron
cm
cuantificacin de Rubisco contenido del sitio activo en las hojas jvenes dosel
superior comparables de cada genotipo durante la primera (~ 20 cm de altura,
barras de colores) y tarda (~ 60 cm de altura, barras negras) de crecimiento
exponencial.
Tabla1:medicionesdecatlisisRubisco.
mesa de tamao completo
ParaprobarsilasenzimasMBRevolucionadotraducidasalamejoradelafotosntesis
tabacoyelcrecimiento,sintticosmbsehicierongenesRqueincorporaronelusode
codonesdelatabacorbcLgen(Fig.3a).Adems,lasecuenciadeMSLIYEDLVMBRN
terminalnativosereemplazconlasecuenciadeMSPQTETKASVGFdeltabacoL
subunidadquesesometeaunaseriedemodificacionesposttraduccionalesque
tentativamenteproporcionanproteccindelaproteolisis13.TresmbRgenesquecodifican
tiposalvajeMBR,MBRK332EyMBRE138Vfueronclonadosenelplsmidoplastoma
transformarpLEV4ytransformadoencmtrLdeja31.Laslneasdetabacotransplastmicas
queproducenL10MBRseidentificaronmediantePAGEnativo(Fig.3b).Almenosdos
lneasindependientesparacadaunodelosTobMBR,tobMbRE138VyTobMbRK332Egenotiposse
propagandeformacontinuaenunmedioquecontieneespectinomicinahastahomoplasmic
(esdecir,yanoproducirL2R.rubrumRubisco)antesdecultivarlaT0plantashastala
madurezenelsueloenairecomplementadocon2,5%[v/v]CO2.
SloL10MBRsedetectenhojas(Fig.3b),debidoalaproduccincontinuadeRuBP
bajoiluminacinylarelativaestabilidaddelcomplejodecamricos26.Mientrasqueel
T0TobMBRE138VyTobMBRK332EplantascrecieronsustancialmentemsrpidoquetobMBR,se
detectpocadiferenciaenelL10contenidoMBRenhojasdeldoselsuperiorcomparables
delmenor(~21cmdealto)T0plantas(Fig.3c).Cuandoenel~60cmdealtura,36
vecesmayoresnivelesdeL10MBRsemidieroneneldoselsuperiorderecienteaparicin
dejaconcantidadessignificativamentemayoresdetectadasenlosquecrecenmsrpido,de
aspectosaludable,tobMbRE138VytobMbRK332ET0plantas(Fig.3c).Enambasetapasde
desarrollo,losnivelesdehojaMBRfuerongeneralmente34vecesmsbajosquelosde
L2yL8S8contenidoenelRubiscocmtrLyloscontrolesdetabacodetiposalvajequecrece
junto.
LaslimitacionesenelestadoestacionariombnivelesdeARNmRencadagenotipo
contribuyeronaladeficienciaenelMBR(Fig.1complementario).Comoseindicaenla
figura.3a,tantounmonocistronicmbRyA(5070%menosabundantes)discistronicmbR
aadUnatranscripcinserealizaronencadaT0TobMBRgenotipo.Enlashojasjvenes
superioresdeT0plantasen~21cmdealturatotalmbabundanciadeARNmdeIera3070%
msbajaenlaabundanciadelosRBCnivelesdemRNAenLdetiposalvaje
(complementarioFig.1).Comosehavistoanteriormenteenlosgenotiposdetabaco
modificadasRubiscoconpotencialreducidafotosinttica8,26,30,32,estosnivelesde
mRNAreducidossecorrelacionanconlaviabilidaddelaalteracindelamsdelgada,de
tamaomspequeo,plidohojasverdesdecadagenotipotransplastmica(verabajo).
ElMBRevolucionadohanmejoradolaactividad
carboxilasa
LaspropiedadescatalticasdeladetiposalvajeymutantesL10isoformasMBRproducido
enlosT0progeniesemidieronapH8(elpHaproximadodelaestromadel
cloroplasto,Tabla1).MientrasqueelSc/ovalorescoincidanconlosmedidosparael
L2enzimasproducidasenE.coli(Fig.2b),loskgatoCtasasfueroninferioresalosmedidosa
pH7,2,debidoalamayoractividaddeMBRabajopH26.Sinembargo,inclusoapH8
tantokgatoCylaseficienciasdecarboxilacin(kgatoC/KC21%O2)delasenzimasMBRE138Vy
MBRK332Eeranentre2y3,4vecesmayorqueMBR,conunacompaante~aumentodel
15%enelSC/SparalaenzimaMBRE138V(Tabla1).Esimportantedestacarqueestas
mejorasenCO2deafinidad,especificidadyfijacinvelocidadllegaronsingastosalaalta
afinidadnaturaldeMBRparaRuBP(esdecir.UnabajaKmRuBP,Tabla1).
LamejoradelacatlisisMBRmejoralafotosntesisyel
crecimientodeltabaco
LamejoradelcrecimientoyfenotipomssaludabledelaTobMbRK332EyTobMbRE138Vgenotipos
enrelacinconlostobMBRlneasfueevidenteenelT1progenie.Enlosensayosde
germinacindecultivodetejidosdetodoelT1progeniesurgicomocotiledonesverdesen
losmediosdecomunicacinespectinomicinadespusde1semanaconfirmandotodoseran
transplastmicas(Fig.4).Despusde5semanas,eraevidentequeserequierelaadicinde
sacarosaalmediodecultivodetejidosparaelgerminadoTobMBRyTobMbRE138Vlneaspara
sobrevivirbajoelevada(v2,5%v/)CO2(Fig.4).Encontraste,lostobMbRK332Eplantas
sobrevivieronaaltaCO2sinsuplementacinsacarosaycrecieronmsrpidamenteentodas
lascondicionesdecultivodetejidosensayados.
Figura4:ElT1TobMBRE138VyTobMBRK332Eprogeniemostrunamejoraenelcrecimiento
encultivodetejidos.
Comparacin del crecimiento de cada Tob genotipo tras el crecimiento 1 y 5
MBR
1
espectinomicina y los diversos niveles de sacarosa. Las plantas se cultivaron en
aire + 2% (v / v) de CO y 25 a 100 mu mol photons.m .s iluminacin.
2
-2 -1
ComosemuestraporAlonsoetal.,(2009),aireenriquecidocon(v/v)CO>2%2se
necesitabaparacadalneadetabacoproducirMBRgeneradoparacrecerhastalamadurez
frtilenelsuelo.EnconsonanciaconlacatlisismejoradadeltrasplantadoMBRE138Vy
enzimasMBRK332E(Tabla1),lostobMbRE138VyTobMbRK332Egenotiposapoyaronms
rpidoshojafotosintticadeCO2tasasdeasimilacinenrelacinconlostobMBRlneas
(Fig.5A).ParacompensarlosnivelesinferioresdelahojaMBRylaspropiedades
catalticasmspobresdelaL10MBRenrelacinconeltabacoL8S8Rubisco(Fig.
3cyTabla1),lasmedicionesdeCOfotosintticos2assimilationbajasentodoelMBR
transformaronhojasserealizaronen1%(v/v)O2.Inclusoenestasbajasconcentraciones
deO2presiones,lafotosntesissemantuvolimitadoporMBRactividadentodoelrangode
lahojaintercelulardeCO2presiones(Ci)aprueba(Fig.5a)conlamsaltatasade
asimilacinde2,4moldeCO2fixed.m2.s1medidoenTobMbRK332Edejabajoelintercambio
degasesdelahojaCmsaltaide2000barCO2(Fig.4b).Comoestatasaesmsde10
vecesmslentoqueel2630moldeCO2fixed.m2.s1tasasmedidasenaltaconcentracin
deCO2crecidotiposalvajedeja33TOBMbRK332Ecrecieron~5vecesmslentaqueladetipo
salvajebajoaltoCO2(Fig.5b,c).
Figura5:ElMBRmutadoamejorarlafotosntesisdelahojadetabacoycrecimiento
delasplantasenrelacinconlaproduccindetabacodetiposalvajeMBR.
LaubicacinestructuraldelaE138Vymutaciones
K332EenelMBR
ElanlisisfilogenticodeMBRrevelaquecompartehomologadesecuenciamsestrecha
conR.rubrumFormaIIRubiscoqueotrosRubiscoarqueas(SupplementalFig.
2)26.EstosalineamientosmostraronqueelE138yK332enelMBRsealineanconA134y
E331enR.rubrumRubiscoyR134yE324enelT.kodakorensisarqueasL10Rubisco(Fig.
6a).ComosemuestraenlaFig.
6b,A134enelR.rubrumL2estructuracristalinaes
solventeexpuestaysituadadistilalsitioactivo.EncontrasteR134enelT.kodakarensisL10
deestructuraesunodelosdiezaminocidosqueformanunaredaltamenteinicaentre
dmerosadyacentes(esdecir,encadaL2L2interfaz)27.
Figura6:AnlisisestructuraldelacatlisismejorademutacionesenelMBR.
( Un ) Alineacin de MBR, R. rubrum ( Rr ) y T. kodakorensis ( Tk secuencias de la
subunidad grande) Rubisco colindantes los sitios de mutacin E138 y K332 en
MBR. Slo se muestran los aminocidos que difieren de MBR. Estructura
secundaria de informacin es relativa a la de Tk L Rubisco 27 . ( B ) Localizacin
10
estn sombreadas de color rojo y verde, sitio activo unido RuBP o CABP en
amarillo. En el Tk estructura R134 est situado en el L -L de interfaz
2 2
EntantoR.rubrumyT.kodakorensisRubisco,laE331yE324correspondienteresiduosse
encuentrancercadelabisagradelaestructuraconservadabucleflexible6delaCterminal
/barril(Fig.6b).Unglutamatoenestaposicinenelgiro6estaltamenteconservada
entrefotosintticaL8S8isoformasRubisco(porejemploE336enplantascomoeltabaco,el
E339enalgasrojascomoGriffithsiamonilis)yseencuentraenlascercanasdelacataltica
deresiduosK334estrictamenteconservada(tabaconumeracinRubisco)cuyainteraccin
conlaRuBPyelsustratogaseosodelacadenalateralsondeterminantescrticosdela
eficienciacataltica(esdecir,kgatoCySC/S)10.Latasaderotacincatalticaaumentodela
eficienciaylacarboxilacindeMBRK332E(Tabla1)implicanunglutamatoenesta
posicinenelgiro6sepuedenbeneficiardeRubiscolacatlisisenlosorganismos
fotosintticos,peronosuponenningnbeneficioparaelpapelnophotosynthticdearqueas
Rubisco.
Discusin
lnosdemuestrandeformanicaelpotencialdeevolucindirigidausandolaseleccin
RDEparaentregarconxitolasformasmseficientesdelano
fotosintticaM.BurtoniiarqueasRubisco(MBR).LasmejorasderivadasdeCO2fixation
velocidad,CO2affinityyespecificidadparaelCO2delasenzimasmutantesMBRE138V
yMBRK332EevolucionadotraducidosaapoyaratasasmsrpidasdeCO2asimilaciny
elcrecimientoeneltabacoenrelacinconlosTobdecontrolMBRproduccindetiposalvaje
genotipoMBR.Estehallazgoproporcionalaprimerapruebadeconceptoquedirigela
evolucindelanofotosintticaRubiscoenE.colipuedeentregarmutantesconmejorasen
todoslosparmetroscatalticosnecesariosparaestimularlafotosntesisenloscloroplastos
delashojas.Estocontrastaconelxitoanteriorenlaevolucindemutantesmejorados
catalticasdecianobacteriasRubiscoque,obienmostrarslomarginal(<5%)mejora
generaldelacatlisis24ounamejorasignificativa(>50%)enlaeficienciadecarboxilacin
quevinieronaexpensasdeunaumentoparalelonodeseadoseninhibidoradelaeficiencia
deoxigenacin11.UnretoadicionalconcianobacteriasL8S8Rubiscoessupotencial
biognesislimitadaenloscloroplastosdetabaco(~10%detiposalvaje34)encomparacin
conelMBRL10queseproduceen~2550%deltabacodetiposalvajeRubisco(Fig.
3c).LaaltasolubilidadyelxitoglobalconlaevolucindelacatlisisMBRinspira
esfuerzocontinuadoevolucionandoalolargodelastrayectoriasevolutivaspropiedadesque
mejorananmssupotencialfotosinttico.
ExploracindelespaciodesecuenciasRubiscohaciamutacionesquemejoransueficiencia
enlasplantasdecultivoesundesafopermanente13.Nuestracontinuaincapacidaddespus
de50aosdepredecirracionalmentequcambiosdesecuenciapuedenmejorarlafuncin
Rubiscodiriginuestraatencinhaciaelpotencialdeevolucindirigidaparaexplorar
Rubiscosecuenciaespacioparalamejoradelacatlisis.Unrequisitocomndelosestudios
deevolucindirigidadexitoeslaidentificacindeunpuntodepartidaadecuadoparael
sistemademutagnesisyseleccinapropiada14,17,35.Lafacilidadconlaquelas
actividadescarboxilasadeMBRsepodranmejorarporcambiosdeaminocidos
individuales(Tabla1)probablementesederivadelmismoquetienelaespecializacin
sometidoaunpapelmetablicoalternativadurantesuevolucinnofotosinttica29.Esto
implicaquearqueasRubiscopuedeocuparunaposicinalternativaparafotosinttica
Rubiscodentrodelpanoramadelaevolucindeladiversidaddelespaciodesecuenciasen
relacinconlacatlisis.Enconsonanciaconesto,arqueascatlisisRubiscoesnormalmente
distintaconrespectoalocontemporneo(fotosntesis)Rubisco26.ArqueasRubiscopuede
sostenerfuncionalidadatemperaturasextremas,enlasquetermotolerantescrecerarqueas,y
muestranlaafinidadaumentadaparaRuBPnecesariaparametabolizarlosnivelesfinitos
realizadasduranteelmetabolismodenucletidos29.Lacompensacindeestas
caractersticasbeneficiosas,arqueasRubiscomuestranunabajakgatoCySC/S26.Mejorar
nuestracomprensinfundamentaldelascaractersticasestructuralesquedeterminanesta
cinticanoconvencionalesrequiereunestudiomsexhaustivodelaestructuradearqueas
Rubisco,cataltica,yladiversidaddesecuencias.
Losmritosdelaprotenaevolucindirigidaseilustranporlosmuchosejemplosdexito
alterarlasolubilidaddeprotenas,mejoradelacatlisis,inclusopermitiendopromiscua
funcincataltica12,14,15,17.Estosresultadossuelenrequerirmltiplesrondasde
mutagnesisygraduales.ParaMBR,sehizounintentoparaseleccionarmutantesde
segundageneracinconactividadmejoradautilizandounabibliotecacombinadadeepPCR
mutadombgenesquecodificanRMBR,MBRE138VyMBRK332E.Nohaymutantes
MBRsedetectaronquepermitilasupervivenciaRDEMM1PRKbajoaltainduccinPRK
(esdecir,0,2%w/varabinosa).Losobjetivosfuturossonexaminarlaviabilidaddela
capturadelaepistasisdelespectrodelaprimerageneracinMBIIgenesmutantesL(Tabla
Suplementaria1)utilizandounenfoquebarajadoparaidentificartrayectoriasadaptativas
quemejorananmsMBRcatlisis.Elxitosinembargodependedelpotencialepistatic
positivoparalaevolucindelaactividaddelacarboxilasadeMBRylacapacidaddeevitar
oeludirmutacionesbeneficiosasquepuedanproducirefectosdesestabilizadoressobrela
estructurayfuncin.Talesincertidumbressoncomunesalosestudiosdelaevolucinde
protenasdirigidas.Pronsticodelamedidaenquelasmutaciones(atravsdeinteracciones
decidoaminodistanciadirectaolarga)influyenenlastrayectoriasevolutivasartificiales
siguesiendoimpredecible36.
Unobstculoimportanteeslarelativamentebajafidelidaddelaseleccinylaproduccin
delMM1PRKsistemadeseleccin20.Lafrecuenciadexitoenaplicacionesdeevolucin
dirigidadependedelaseleccindelabibliotecarendimientoylasensibilidaddelsistemade
seleccinparadetectarunrasgodeseado14,15.Ladependenciayelrendimientodelas
cepasdeRDEexistentessufrendealtasfrecuenciasdefalsospositivosquesurgen
tpicamenteatravsdemutacionesdeescapePRKtransposnasociada11,12.Aunquees
relativamenteinmunealosfalsospositivos,laMM1PRKrendimientoseleccinRDEseve
impedidaporelrequisitodebajatemperaturadecrecimiento(25C),faltadeeficaciadela
transformacin,yredujolaviabilidadcelularcomoresultadode
ladiferenciaAmutacin20.LamejoradelafidelidaddelaseleccindelossistemasRDE
tanto,esfundamentalparalaevolucinulteriorMBR,yotrasisoformasRubisco,con
mejorespropiedadesfotosintticas.UnasolucinpodraserladeatarPRKconunaprotena
deresistenciaalosantibiticosenunacepadeRDEevitandoaslaseleccinde"PRK
silenciado"falsospositivosyaquetalesmutacionestambinrenuncienresistenciaalos
antibiticos.
LaevolucindeadaptacindearqueasRubiscoinvitrohaciaunoqueesmseficienteque
laplantadecultivoL8S8enzimasessindudaunretoalargoplazosignificativa,mucho
tiempo.AdiferenciadeL8S8Rubiscodelasplantasylasalgas,losrequisitosde
plegamientoyensamblajedearqueasRubisco,comoMBR,secumplenenE.coli(Fig.
1c)26,27,29.EstapropiedadrefuerzalaidoneidaddearchaealRubiscoparaidentificar
mutantesquemejoranlacatlisisutilizandocepasRDE,yaquerestringelaseleccinde
mutacionesquepotencianlasolubilidad,unresultadoquehadominadolosestudiosde
evolucindirigidaconcianobacteriasL8S8Rubisco11,12,22.Lasusceptibilidaddearqueas
RubiscoparalaspruebasdemutacinenE.coliyahademostradosertilparademostrar
cmolaincorporacindesecuenciadeRubiscoespinacasenT.kodakarensisL10Rubisco
puedemejorarkgatoC27.LamejoradelacatlisisdearqueasRubiscopordiseoracionalo
evolucindirigidaounacombinacindeambos,portanto,planteavasfuturoviablellevara
cabo,especialmenteteniendoencuentanuestraconclusindequeestosbeneficiosse
puedentraducirdirectamentealamejoradelafotosntesisdelashojas.
Comoseindicaenlafigura.
6,lassecuenciasprimariasdearqueasRubiscosonmuy
diversosysusestructurasdeoligmeroscomoL2oL10aparecevariable.Sibienelanlisis
deespectrometrademasasinfiereunamaduraL10estructuracuaternariadeMBR26nose
sabesiformaunaestructuratoroidalcomparableaT.kodakarensisarqueasRubisco(PDB:
1GEH),enparticular,yaqueslocompartenel36%dehomologadeaminocidosyMBR
contieneunanoveladeinsercinde11aminocidosensudominioC26.Losesfuerzosen
cursosecentranenlaresolucindelasestructurascristalinastantoparaL2yL10MBRpara
entendermejorladiversidadestructuralentrearqueasRubisco,ascomoayudarainterpretar
cmolasmutaciones,comoE138VyK332E,funcionalmenteimpartencambiosenla
catlisis.
Materialesymtodos
Laevolucin,expresinypurificacindeMBRenE.coli
ElMBIILgendePhuembiiL26seclonenpTrcHisBusandoNcoI/HindIIIyelplsmido
resultantepTrcMbRutilizcomomoldeparamutaraleatoriamenteelMBIILporPCR
propensaaerrores(epPCR)comosedescribe20.LosproductosdePCRseclonaronen
pTrcHisByladiversidaddelaMBIIbibliotecaLmutantecalculadoutilizandopedel
AA37.LabibliotecasetransformenlaRubiscodependienteE.coli(RDE)cepa
MM1PRKycrecidobajodiferentescondicionesselectivasdeacuerdoconla20.Los
mutantesMBIILgenesdelascoloniasdecrecimientomsrpidoseclonaronenel
plsmidodeexpresindelaubiquitinamarcadacon6xhistidinePhueycadaMBRafinidad
isoformapurificadaporcromatografadeafinidaddemetalinmovilizado(IMAC)comose
describe26.
transformacindeplastomadeltabacoyelcrecimiento
Ungensinttico,mbR,quecodificalaM.BurtoniiRubiscoconysinmutacionesde
codificacinE138VosustitucionesK332EfuesintetizadoporGenScript.Elusode
codonesdembRsecorrespondaconeltabacorbcgenLysesustituyelasecuencianativa
Nterminaldecodificacin(MSLIYEDLV)conladelRubiscogrande(L)subunidadtabaco
nativo(MSPQTETKASVGF).Los1.418pbmbfragmentosdegenesRseclonaronenNheI
/SalcortpLEV432paraproducirlatransformacindeplsmidosplastomapLEVmbR,
pLEVmbRK332EypLEVmbRE138VytransformadosendiezcmTRLhojaspor
bombardeobiolstico31.Independentlneastransformadaspositivamentelaproduccinde
L10MBRseidentificaronporPAGEnodesnaturalizante(PAGEnativa)26ydoslneas
independientesparacadagenotipoMBRsehicieroncrecerhastalamadurezenelsueloen
unacmaradecrecimientoconelairesuplementadocon2,5%(v/v)CO230.Lasfloresde
lasfrtilesT0plantasfueronfertilizadasconpolendetiposalvajeylasemillagerminadaen
cultivodetejidosenmediosdemedidarelativadepredictibilidadsuplementadascon0%a
3%(w/v)desacarosa30.ElgerminadoT1progeniesetransfiricuidadosamentealsueloy
elintercambiodegasdelahojaylabioqumicacelulardecercadehojastotalmente
expandidasenposicionescomparableseneldoselsuperioranalizadacuandolasplantaseran
de2025cmdealtura.
LosanlisisdeADN,protenasyPAGE
ADNgenmicodelahojatotalfueaisladoutilizandoelDNeasyKitycebadoresPlant
MiniLSHyLSE(Fig.3a)utilizadosparaamplificarporPCRylasecuenciadelaregin
deplastomatransformadoencadagenotipodetabacocomosedescribe32.Serealizla
preparacin,lacuantificacin(contraBSA)deprotenadehojasolubleyanlisisporSDS
PAGE,PAGEnativayanlisisdeinmunotransferenciacomosehadescrito38.
contenidodeRubiscoycatlisis
LastasasdeRubisco14CO2defijacinserealizaronutilizandoextractosdeprotenas
solublesaisladosdebacteriasodeprotenadelahojaen50mMHEPESNaOH(pH7,2o
8,0)quecontienetampndeextraccincomosehadescrito30.Seutilizextractode
protena(20l)parainiciarlaactividaden0,5mldeensayosrealizadosen7mlvialesde
centelleodeseptotope38.Cadamuestrasemidiporduplicadoendiversas
concentracionesdeNaH14CO3(067mM)yO2(0,2,y5%(v/v))paracalcularlatasa
mximadecarboxilacin(VC)ylaconstantesdeMichaelis(Km)paraelCO2(KC)y
O2(KS)38.Latasaderotacincarboxilacin(kgatoC)secalculdividiendoVCporlos
sitiosactivosdecontenidoRubiscocuantificadospor[14C]2CABPunin30.Rubisco
CO2/O2especificidad(SC/S)ylaKmparaRuBPsecuantificaroncomoseha
descrito38utilizandoMBRpurificapartirdeE.coliporcromatografadeafinidadcon
metalinmovilizado26olashojasdetabacomedianteintercambioinico30.
Anlisisdelcrecimientoylafotosntesis
Todaslasplantassecultivarona25Cenunacmaradecrecimientotalcomose
describe30envirtudde20050molquanta.m2.s1enairequecontiene2,5%(v/v)
CO2.Unavezaproximadamente21cmdealturalastasasdefotosntesisdelahoja(A)en
la5hojadecubiertasuperiorsemidieronusandoun6400LIsistemadeintercambiode
gasesXT(LICOR)adiferentesatmosfricasdeCO2presionesparciales(Cuna;502000
ppm)aunahojatempladaconstantede25Cy1,000molquanta.m2.s1.El"ACi"
mediciones(Ci,dehojaintercelulardeCO2niveles)serealizaronaconcentracionesbajas
deO2presionesparciales(1%(v/v)deO2enN2)paraobtenermedidasadecuadasdeA.