Manipulación genética del metabolismo central del carbono de Escherichia coli para una

producción eficiente de ácido fumarico.

Esquema

El ácido fumarico es uno de los principales productos químicos de 12 biomasa. En este

estudio, informamos de la manipulación del metabolismo central del carbono de E. coli con
el objetivo de disminuir los subproductos y mejorar la producción de ácido fumarico. El
sistema de glucosa fosfotransferasa dependiente de PEP se reemplazó por un sistema de
translocación de galactosa para minimizar el consumo de fosfoenolpiriuvato. La vía
anaplerótica de ingeniería (fosfoenolpiriuvato carboxilasa) se empleó para redistribuir el flujo
de carbono desde la glucólisis hasta el ciclo de Krebs. La deleción de la malato
deshidrogenasa y la sobreexpresión de la acetil-CoA sintasa podrían disminuir los
subproductos del ácido málico y el ácido acético. Las estrategias combinadas llevaron a un
rendimiento de ácido fumarico de hasta 1,53 g/g de peso de células secas, un aumento del
50 % en comparación con la cepa parental. El resultado demostró que estas modificaciones
genéticas fueron estrategias efectivas para mejorar la producción de ácido fumarico y la
cepa de ingeniería puede servir a una plataforma de fábrica de células microbianas para la
producción eficiente de ácido fumarico u otros ácidos dicarboxílicos.

Introducción

El ácido fumárico, un ácido carboxílico de cuatro carbono con un doble enlace y dos grupos
carboxílicos, es un intermediario del ácido tricarboxílico (TCA) (Gu et al., 2013). También es
un producto químico de plataforma y ampliamente utilizado como precursor de numerosos
productos, incluidos productos farmacéuticos, productos químicos finos y polímeros
biodegradables (Zhou et al., 2014). Actualmente, el ácido fumarico se produce por
isomerización química del anhídrido maleico, obtenido del benzeno o la oxidación del
butano (Roa Engel et al., 2008). Sin embargo, el proceso de síntesis química se enfrentó a
una serie de problemas, incluidos los limitados recursos petroleros, el aumento de los
precios del petróleo y la contaminación ambiental. Para mitigar las preocupaciones
ambientales, los ingenieros metabólicos y los microbiólogos industriales han tratado de
diseñar una ruta biosintética alternativa para ocultar de manera eficiente las poblaciones de
piensos renovables al ácido fumarico a través de organismos modificados genéticamente (Li
et al., 2014, Liu et al., 2017b, Zhang et al., 2015b).

La producción de ácido fumarico por fermentación se llevó a cabo principalmente con

Rhizopus oryzae o Rhizopus arrhizus (Liu et al., 2017c, Xu et al., 2012). Según el informe
anterior, se obtuvieron 45,31 g/L y 37,52 g/L de ácido fumarico a partir de la xilosa y la
glucosa, respectivamente, utilizando una nueva cepa seleccionada Rhizopus arrhizus RH
7-13-9# inmovilizada en una red (Liu et al., 2017a, Liu et al., 2015). En otro wok, se utilizó
Rhizopus oryzae ATCC 20344 como cepa, después de la optimización de las condiciones
de cultivo de semillas, se formaron grupos miceliales uniformemente dispersos con un
diámetro de ∼1 mm, lo que llevó a un alto rendimiento de ácido fumarico de 50,2 g/L de
glucosa en frascos de batido (Z Sin embargo, el proceso de fermentación fúngica
filamentosa fue difícil de ampliar para las aplicaciones industriales, debido a las dificultades
para controlar la morfología celular y a las limitaciones de transferencia de oxígeno durante
la producción a gran escala (Xu et al., 2013a, Xu et al., 2017, Xu et al., 2012). Con las
ventajas de una buena información genómica anotada, herramientas genéticas fáciles,
bajos requisitos de nutrientes y una rápida tasa de crecimiento, Escherichia coli se ha
convertido en una cepa huésped prominente para la producción de ácido fumarico (Cao et
al., 2011).

La mejora de la utilización del sustrato y la eliminación de la formación de subproductos

fueron dos de las estrategias más utilizadas para desarrollar la producción química de base
biológica. Estudiada con el anterior

Han demostrado varias estrategias útiles para mejorar la producción de ácido fumarico en la
bobina E. (Chong et al., 2014, Xu y Koffas, 2010, Xu et al., 2011). Por ejemplo, la piruvato
carboxilasa (PYC) o la fosfoenolpiriuvato carboxilasa (PPC) en la bobina E. se
sobreexpresaron para mejorar los precursores de la OAA (ácido oxaloacético) a través de la
vía glicolítica (Gao et al., 2018, Hu et al., La reductasa del ácido fumarico (FrdABCD) y la
fumarasa (FumABC) se interrumpieron para reducir la conversión del ácido fumarico en los
subproductos ácido málico y ácido succínico (Zhang et al., 2015c). Además, la lactato
deshidrogenasa (LDH) y piruvato formate-lyasa (PFL) como vías de competencia de
piruvato para la formación de ácido láctico también se eliminaron para disminuir el
desperdicio de la fuente de carbono (Salleh et al., 2015). Además, con el fin de regular los
niveles de oxidación y reducción por los cofactores, las relaciones NAD+/NADH y
NADP+/NADPH también se mejoraron para mejorar la biosíntesis del ácido fumárico
(Siedler et al., 2011, Zhanga et al., 2009). En este estudio, intentamos mejorar aún más la
producción de ácido fumarico aumentando la tasa de absorción de sustrato y minimizando
la pérdida de carbono al prevenir la formación de ácido málico y ácido acético de
subproducto. El sistema de transporte de glucosa nativa también se reemplazó para
minimizar la pérdida de precursores de fosfoenolpiruvato (PEP).

En E. coli, varios sistemas podrían transportar azúcar al consumo de PEP en el

acoplamiento del citoplasma. El sistema de fosfotransferasa específica de la glucosa
dependiente de PEP (PTSG) fue el sistema más eficiente para el transporte de glucosa, que
podría actuar como el principal punto regulador en el control del flujo y la distribución del
carbono en el metabolismo central del carbono (Liang et al., 2015). Pero el PEP también fue
el precursor directo en la OAA y la síntesis de ácido fumarico y participó directamente en las
reacciones generadoras de energía. Planteamos la hipótesis de que la modificación del
sistema de transporte de glucosa afectaría a la acumulación de ácido fumarico. Mientras
tanto, los datos experimentales anteriores mostraron que el ácido málico y el ácido acético
eran los principales subproductos en la producción de ácido fumarico utilizando E. coli. Por
lo tanto, en un estudio anterior, la cepa E. coli ABCDIA con vía del ácido fumarico se diseñó
aún más eliminando la fumarato reductasa (frdABCD), la fumarasa (fumABC), el regulador
de la respuesta de unión al ADN (arcA), el represor de isociratalyasa (iclR) Esta cepa de
deleción se utilizó como cepa huésped para investigar si la interrupción del sistema de
transporte de glucosa y la modificación de las vías de los subproductos mejorarían aún más
la producción de ácido fumarico. En resumen, mejoramos significativamente tanto la
productividad como el rendimiento del ácido fumarico con estas estrategias combinadas. El
trabajo informado debería ser útil para construir una plataforma sostenible para la
producción de ácido carboxílico C4 (Fig. 1).

Fragmentos de sección
Cepas, plásmidos y medio

Las cepas y plásmidos utilizados en este estudio se enumeraron en la Tabla 1. La cepa

productora de ácido fumarico E. coli ABCDIA se utilizó como cepa original (Zhang et al.,
2017). El gen que codifica PPC y la acetil-CoA sinetasa (ACS) se amplificaron a partir del
ADN genómico de E. coli K12. El plásmido pETDUet-1 se utilizó como vector de expresión.
Para los cultivos de rutina durante la construcción de plásmidos y el cultivo de la
deformación, el caldo de Luria-Bertani (LB) o la placa de agar LB (1,5% w/v, agar) se
empleó para cultivar células durante la cepa

Efecto de la eliminación del gen ptsG en la producción de ácido fumarico

PTSG, el sistema de fosfotransferasa de azúcar dependiente de fosfoenolpiruvato, es el

principal sistema de translocación de azúcar a través de la membrana celular, lo que facilita
la absorción de glucosa con el consumo concomitante del sustrato de alta energía
fosfoenolpiriuvato (PEP). Para minimizar el consumo de PEP, el sistema PTSG nativo de E.
coli (codificado por el gen ptsG) fue reemplazado por la permeasa de galactosa (codificada
por el gen galp) y la glucoquinasa (codificada por el gen glk), que podría restaurar la
absorción de glucosa sin el consumo de PEP, como resultado

Culminación

En este estudio, se construyó una cepa de E. coli diseñada metabólicamente para investigar
si la ingeniería del gen ptsG, mdh, acs disminuiría los subproductos y mejoraría la
producción de ácido fumarico en E. coli. Los resultados mostraron que la producción de
ácido fumarico aumentó en gran medida por la ingeniería del sistema de absorción de
glucosa y la manipulación de la vía de precursores y subproductos, lo que significaba que
estas estrategias modificadas fueron beneficiosas para el proceso de producción de ácido
fumarico. Las estrategias reportadas