Microbiologa General

Facultad de Ciencias Exactas UNLP

AISLAMIENTO Y TITULACIN DE BACTERIOFAGOS

1. Deteccin de bacterifagos de Bacillus cereus a partir de una muestra de tierra

Enriquecimiento de bacterifagos

a)
b)
c)
d)
e)

Agregar 10 g de la muestra en 90 ml de caldo nutritivo. Mezclar por agitacin.

Agregar 0.1 ml del cultivo de B. cereus en fase estacionaria temprana.
Incubar 24 hs a 32C con agitacin.
Tomar 5 ml del cultivo de enriquecimiento y centrifugar durante 10 minutos a 3600 rpm.
Filtrar aspticamente el sobrenadante (0,45 m dimetro de poro)

Con el filtrado (libre de bacterias) realizar las siguientes determinaciones:

Lisis de un cultivo fresco de B. cereus
a) Infeccin del cultivo bacteriano segn el siguiente protocolo
Tubo de lisis Tubo control
Caldo nutritivo estril
3 ml
3 ml
B.cereus
0,1 ml
0,1 ml
Filtrado (fago)
0,1 ml
Solucin fisiolgica
0,1 ml
b) Incubar ambos tubos a 32C con agitacin y observar peridicamente.

Prueba de la gota (Spot test)

Disponer de una placa de agar nutritivo.
Realizar diluciones seriadas 1/10 del filtrado en solucin fisiolgica hasta una dilucin 10-5.
Fundir y termostatizar a 50C un tubo de agar blando (4 ml). Agregar 500 l de un cultivo de B.
cereus. Mezclar por rotacin y volcar sobre la placa de agar nutritivo. Secar en flujo laminar
durante 30 min.
d) Rotular en la caja la posicin de cada dilucin. Colocar 10 l del filtrado y de cada dilucin
segn el esquema. Dejar sobre la mesada 15 min.

a)
b)
c)

100
10-5

10-1

10-4

10-2
10-3

e) Incubar a 32C, durante 16 hs.

f) Estimar la concentracin de fagos a partir de la observacin de placas de lisis

Microbiologa General
Facultad de Ciencias Exactas UNLP
2. Titulacin de fagos: Recuento de unidades formadoras de placas de lisis por ml
(UFP/ml) mediante la tcnica de la doble capa de agar
A partir de un lisado se determinar la concentracin de fagos
Tcnica de la doble capa
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)

Disponer de un cultivo de B. cereus en fase exponencial.

Disponer de 6 placas de Petri conteniendo agar nutritivo.
Realizar diluciones seriadas 1/10 del filtrado de fagos (lisado) en solucin fisiolgica.
Fundir y termostatizar a 45C, 6 tubos conteniendo agar blando (4 ml)
Agregar a cada tubo 0,1 ml del cultivo de B. cereus
Agregar a los tubos 0,1 ml de la dilucin correspondiente del lisado.
Homogeneizar en vortex y verter sobre las placas de agar nutritivo previamente rotuladas. Secar
e incubar a 32C, 16 hs.
h) Contar las placas de lisis (calvas) y calcular el ttulo de la suspensin original (UFP/ml)

Agar blando a
45C
Lisado (fago)
B. cereus
Dilucin del fago
Diluciones en

SF

Base de agar
nutritivo

Microbiologa General
Facultad de Ciencias Exactas UNLP
CUESTIONARIO
1- Qu es un virus? Y un bacterifago? Qu criterios han sido utilizados para su clasificacin?
En qu se basa la Clasificacin Baltimore?
2- Describa brevemente los ciclos lticos y lisognico de los bacterifagos.
3- La reproduccin de los virus animales se asemeja en cierta forma a la de los bacteriofagos, sin
embargo dependiendo del cido nucleico, los diferentes virus han desarrollado diferentes
estrategias de reproduccin. Describa qu tipo de estrategia desarrolla un virus +RNA
(picornavirus), y cul es la desarrollada por el Retrovirus del HIV (+RNA)?
4- Qu mtodos de recuento de virus conoce?
5- Describa el mtodo de recuento de fagos que utiliz en el TP. Cmo interpreta los resultados
del Spot test?
6- Cmo procedera para aislar virus bacterianos? y virus animales?
7- Analice un grafico de crecimiento en un escaln: UFP/ml versus tiempo. Defina el perodo de
latencia y mrquelo en la grfica. Cmo determinara experimentalmente el perodo de eclipse?
8- Cmo determinara en forma experimental la fraccin de bacterias sobrevivientes a una
infeccin fgica? Cmo la calculara en forma terica? Espera que sean coincidentes?
Justifique.
9- A partir de una muestra de agua de ro, usted realiza un aislamiento de fagos que infectan
Pseudomonas spp., siguiendo el protocolo que se realiz en el Trabajo Prctico. En un
experimento de crecimiento en un escaln, un stock del fago aislado fue ajustado a 1x109
UFP/ml y un volumen de 0,01 ml fue inoculado en 10 ml de un cultivo de Pseudomonas
aeruginosa en fase exponencial (1x107 UFC/ml). Cada 10 minutos y durante una hora, un
volumen del cultivo fue procesado para determinar el nmero de UFP/ml. La tabla muestra los
resultados obtenidos.
Tiempo*
(min)

Nmero de calvas en cada dilucin (valor promedio de 2 placas)

1x10

-2

1x10

-3

1x10

-4

-5

1x10

1x10

-6

1x10

-7

1x10

10

Incontable

247

34

20

Incontable

263

28

30

Incontable

Incontable

180

25

40

Incontable

Incontable

Incontable

311

35

50

Incontable

Incontable

Incontable

347

32

60

Incontable

Incontable

Incontable

368

40

11

-8

* Minutos luego de la infeccin de Pseudomonas con el fago (tiempo postinfeccin).

a) Realice el grfico de crecimiento en un escaln, y calcule los parmetros que definen
la curva. Explique cada uno de esos parmetros.
b) Cul fue la multiplicidad de infeccin utilizada en el experimento?
10- Un volumen de 8 ml de una cepa de Salmonella sensible al fago ST2 creciendo en caldo nutritivo
en fase log, DO600 = 0,4 (DO600 = 0,1 corresponde a 1 x 108 ufc/ml) se infecta con 8 ml de una
suspensin de fago T2 con un ttulo de 3 x 109 ufp/ml. La cepa posee, en las condiciones del
experimento, un tiempo de duplicacin de 30 min, entra en fase estacionaria cuando alcanza una
concentracin de 5 x 109 ufc/ml. El fago lisa en 40 min produciendo 40 fagos/bacteria infectada.

Microbiologa General
Facultad de Ciencias Exactas UNLP
a) Calcule la concentracin de bacterias sobrevivientes a la infeccin (B(0)/B(T) = e-mdi) a los 10
min y 50 min despus de infectar y la concentracin de fagos infectivos despus de 50 min
de incubacin en el experimento.
b) Grafique la curva de multiplicacin del fago y la curva de crecimiento bacteriano.

11- Se infecta un volumen de 1 ml de una cepa de E. coli sensible al fago T4 creciendo en caldo
nutritivo en fase exponencial con DO600 = 0,4 (DO600 = 0,1 corresponde a 1 x 108 ufc/ml) con 1,5 ml
de una suspensin de fago T4 con un ttulo de 6 x 107 ufp/ml. La cepa posee, en las condiciones del
experimento, un tiempo de duplicacin de 30 minutos, entra en fase estacionaria cuando alcanza
una concentracin de 5 x 109 ufc/ml. El fago lisa en 50 minutos produciendo 25 fagos/bacteria
infectada.
Calcular la concentracin de bacterias sobrevivientes a la infeccin a los 20 minutos, 50 min y 100
min despus de infectar y la concentracin de fagos infectivos despus de 100 minutos de
incubacin en el experimento.

12-Se dispone de un lisado de bacterifagos que son capaces de infectar E. coli y un cultivo
sensible. La concentracin del lisado es de 1.5 x109 UFP/ml y el cultivo bacteriano posee una
concentracin de 108 UFC/ml. Se toman 5 ml de caldo adicionado de Ca++ al cual se le agregan 300
l de cultivo bacteriano y 100 l del lisado de fagos. Se incuba 10 minutos a 32C con agitacin, se
realizan diluciones con diluyente helado y se plaquean en agar nutritivo obtenindose los siguientes
resultados:
DILUCION
N DE COLONIAS
10-2
ms de 1000
10-3
298/320
10-4
15/12
Compare el nmero de bacterias sobrevivientes obtenido en forma experimental con el que
esperara si lo calculara en forma terica. Si encuentra diferencias justifquelas.

13- Se mezclan volmenes iguales de una suspensin de fagos lticos de 5 x 108 UFP/ml y un cultivo
de E. coli sensible al fago de concentracin 2 x 109 UFC/ml. Sabiendo que el ciclo ltico del fago se
produce en 40 minutos produciendo 50 fagos/bacteria infectada y la bacteria se duplica en 30 minutos,
grafique la curva de multiplicacin del fago (UFP/ml vs t (min)). Cuntos ciclos de infeccin se
obtienen? Justifique.

14-Cuando se encontr que existen bacterias resistentes a los bacterifagos, se plantearon dos
hiptesis tpicas para estos problemas en las Ciencias Biolgicas: adaptacin versus seleccin. Si
hubiera una adaptacin de las bacterias a los virus, la aparicin de bacterias resistentes tendra
lugar solamente en contacto con los virus y sera inducida por stos. Por el contrario, la hiptesis de
la seleccin implica que la poblacin resistente es el resultado de la aparicin de mutantes
resistentes a travs de mutaciones espontneas para lo cual no sera necesaria la presencia del
virus.

Microbiologa General
Facultad de Ciencias Exactas UNLP
En 1952, Joshua y Ester Lederberg descubrieron que era posible hacer una rplica exacta de
una serie de colonias en una placa de Petri a travs de la utilizacin de un trozo de terciopelo
montado sobre un bloque de madera circular. Al presionar este bloque sobre una placa madre y
posteriormente efectuar improntas en placas con medio de cultivo estril, es posible obtener
rplicas de las colonias en la misma posicin que en la caja madre (Fig.1) Los Lederberg
incubaron una placa madre sembrada con alrededor de 107 E. coli Tons (cepa sensible al fago)
durante varias horas para permitir a las bacterias comenzar a desarrollar. Esta placa madre se
presion con el mango de terciopelo y se aplic en varias placas que contenan una gran
cantidad de fagos T1. Un esquema de la tcnica y los resultados al cabo de la incubacin se
muestra en la Fig. 2.
Cul de las dos hiptesis puede descartarse con estos resultados? Qu resultado hubiera
esperado si la otra hiptesis fuera vlida? Fundamente su respuesta.
Fig. 1

Fig. 2

https://educacion.biol.unlp.edu.ar/course/index.php?categoryid=52