Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica

Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C.,

Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C.
Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 40
MTODOS INMUNOQUMICOS
Darwins Castillo A. y Carolina Valenzuela B.

1. Introduccin
2. Inmunoanlisis
2.1.Inmunoanlisis con reactivos no marcados
2.1.1. Reaccin de precipitacin
2.1.1.1. Reaccin de precipitacin
en medio lquido
a) Precipitacin en tubo
b) Floculacin
c) Turbidimetra
d) Nefelometra
e) Precipitacin de complejos inmunes solubles
2.1.1.2. Reaccin de precipitacin
en gel
a) Inmunodifusin doble
b) Inmunodifusin radial
c) Inmunoelectroforesis
d) Inmunofijacin
e) Contrainmunoelectroforesis
f) Rocket inmunoelectroforesis
g) Inmunoelectroforesis cruzada o
bidimensional de Laurell
2.1.2. Reaccin de aglutinacin
a) Aglutinacin directa
b) Aglutinacin indirecta

c) Aglutinacin pasiva
2.1.3. Reaccin con participacin del
complemento
a) Fijacin del complemento
b) Actividad hemoltica del complemento
2.2. Inmunoanlisis con reactivos marcados
2.2.1. Inmunoanlisis fluorescente
a) Microscopa inmunofluorescente
b) Inmunoanlisis de fluorescencia
polarizada
c) Inmunoanlisis de fluorescencia
unida a enzima
d) Citometra de flujo
2.2.2. Enzimainmunoanlisis (EIA)
a) EIA homogneo
b) EIA heterogneo
c) Electroinmunotransferencia o
Western blot o Immunoblotting
2.2.3. Radioinmunoanlisis (RIA)
a) RIA en fase soluble
b) RIA en fase slida
c) Deteccin inmunorradiomtrica
para antgeno
2.2.4. Quimiluminiscencia
2.2.5. Bioluminiscencia

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RESUMEN
La base de los mtodos inmunoqumicos es la unin del antgeno y/o hapteno con el anticuerpo, es una reaccin especfica, de alta afinidad y reversible. Est definida por una constante
de equilibrio o de asociacin intrnseca (K) que es una medida de fuerza de la interaccin de la
reaccin para formar complejos estables.
Los anticuerpos son protenas relativamente estables, y sus reacciones con haptenos o
antgenos pueden ser estudiados en un amplio rango de condiciones. Las modificaciones en la
constante de asociacin inciden en las fuerzas que estabilizan los complejos antgeno-anticuerpo
(Ag-Ac). La reaccin es dependiente de algunos parmetros como: temperatura, pH y fuerza
inica del medio que deben considerarse al llevar a cabo un inmunoanlisis.
Los inmunoanlisis pueden ser divididos en mtodos que requieren de sistemas Ag-Ac no
marcados y marcados. La mayora de los inmunoanlisis no marcados se basan en reacciones
inmunes secundarias (precipitacin). Los inmunoanlisis marcados se basan en reacciones inmunes primarias (inmunoanlisis fluorescentes).
En el inmunoanlisis con reactivos no marcados, la interaccin de antgenos solubles
macromoleculares y anticuerpos especficos llevan a la formacin de complejos, que en una
relacin molar equivalente precipitan en solucin (precipitacin). Existe una reaccin anmala
llamada floculacin, en que la precipitacin se observa slo en un rango muy estrecho de la
proporcin Ag/Ac. La interaccin de antgenos particulados con sus anticuerpos especficos producen aglutinacin. La turbidimetra y nefelometra determina niveles de antgeno o de anticuerpo en baja concentracin, formando pequeos agregados que producen una turbidez que
puede ser medida por disminucin y dispersin de la luz incidente, respectivamente.
Los mtodos de precipitacin en gel detectan la presencia y/o concentracin de antgenos
y/o anticuerpos por la formacin de bandas, anillos o arcos de precipitado que corresponden a
complejos antgeno-anticuerpo en la zona de equivalencia (inmunodifusin doble,
inmunodifusin radial, inmunoelectroforesis, inmunofijacin, contrainmunoelectroforesis,
rocket inmunoelectroforesis e inmunoelectroforesis cruzada).
El inmunoanlisis con reactivos marcados se clasifica en homogneo o heterogneo y
puede ser de dos tipos competitivo y no competitivo. El inmunoanlisis fluorescente incluye la
microscopa inmunofluorescente que corresponde a la tradicional inmunofluorescencia (IF)
que es una tcnica inmunohistoqumica o inmunocitoqumica que permite la localizacin de
antgenos en clulas tejidos, y la deteccin y titulacin de anticuerpos especficos; el
inmunoanlisis de fluorescencia polarizada (FPIA) que es homogneo y competitivo; el
inmunoanlisis de fluorescencia unida a enzima (ELFIA) que es heterogneo y puede ser
competitivo o no competitivo; y la citometra de flujo que permite medir la cantidad de anticuerpo monoclonal fluorescente unido en cada clula que atraviesa un lser e identificarla segn
su tamao y granularidad de acuerdo a la forma que deflecta o dispersa la luz del lser.
El enzimainmunoanlisis (EIA) se basa en dos fenmenos biolgicos: reaccin
inmunolgica (unin Ag-Ac) y la amplificacin por reacciones qumicas (enzima que acta sobre el sustrato). Se dispone de EIA homogneo representado por el enzyme-multiplied
immunoassay technique (EMIT) que adems es competitivo y de EIA heterogneo, como el
"enzyme-linked inmunosorbent assay" (ELISA) y el "microparticle enzyme immunoassay"
(MEIA) que adems son no competitivos. La electroinmunotransferencia combina la
electroforesis en gel SDS-poliacrilaminada y el enzimainmunoanlisis. El radioinmunoanlisis
(RIA) utiliza antgeno o anticuerpo, generalmente marcados con istopos como 125I o, eventualmente, 131I y este inmunoanlisis puede llevarse a cabo en fase soluble o slida.
Finalmente existe el inmunoanlisis quimiluminiscente que utiliza la emisin de luz producida en ciertas reacciones qumicas de oxidacin, como por ejemplo, la oxidacin del luminol
y el inmunoanlisis bioluminiscente que se basa en un sistema natural la D-luciferina/luciferasa,
en que la luciferasa cataliza la oxidacin de la D-luciferina en presencia de ATP y Mg+2 a
oxiluciferina, con emisin de luz a 546 nm.

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1. INTRODUCCIN

como ultracentrifugacin, "quenching" fluorescentes, y otros. Pero, el mtodo que se utiliza

corrientemente es el equilibrio de dilisis.
En forma prctica, en el laboratorio se calcula
la constante de asociacin intrnseca promedio
(Ko) obtenida a travs de la ecuacin de Scatchard,
que se define por la concentracin de hapteno o
ligando libre requerida para ocupar la mitad de
los sitios activos o de unin de los anticuerpos.
De acuerdo a esta premisa, en la ecuacin 2:

La unin del antgeno (Ag) con el anticuerpo (Ac) es una reaccin fundamental en la metodologa inmunoqumica. En general, la mayora
de los antgenos son macromolculas, especialmente protenas con una estructura completamente
establecida en que regularmente no conocemos la
identidad, ni la conformacin del determinante
antgnico que reacciona con el anticuerpo, ni el
nmero por molcula de Ag. Para comprender la
reaccin Ag-Ac y evitar reacciones complicadas
con Ags macromoculares, en adelante se van a
considerar reacciones de Acs especficos con molculas de haptenos (Hp) simples.
La produccin de Acs contra Hp se obtiene
generalmente inmunizando animales con el Hp
unido covalentemente a una protena. La formacin de complejos especficos Hp-Ac puede ser
examinados en detalle con sistemas relativamente simples y los anticuerpos que reaccionan son
fcilmente aislados e identificados.
Como se ha sealado, la base de los mtodos
inmunoqumicos es la unin del antgeno y/o
hapteno con el anticuerpo. Esta reaccin se caracteriza por ser especfica, de alta afinidad y reversible. Est definida por una constante de equilibrio o de asociacin intrnseca (K) que es una
medida de la fuerza de interaccin de la reaccin
para formar un complejo estable.

[Hp Ac] = [Ac], por lo tanto,

1
Ko=
[Hp]

La unidad de Ko es el recproco de la concentracin, es decir, litro/moles.

Los anticuerpos son protenas relativamente
estables y sus reacciones con haptenos o antgenos
pueden ser estudiados en un amplio rango de
condiciones. Las modificaciones que se producen
en la constante de asociacin inciden en las fuerzas
que estabilizan los complejos Ag-Ac. Por lo tanto,
las caractersticas de la reaccin es dependiente
de varios parmetros como: temperatura, pH y
fuerza inica del medio. Por ejemplo, un aumento
de la temperatura puede afectar la interaccin del
anticuerpo con hapteno o antgeno que puede
disminuir o no la constante de asociacin y, por lo
tanto, modificar la afinidad. Sin embargo, la
prctica general es incubar la mezcla de
anticuerpos y antgenos a 37C o a temperatura
ambiente (aproximadamente 22 C).
La unin del hapteno p-aminobenzoato con
el anticuerpo anti-p-aminobenzoato disminuye
tanto con la reduccin de pH de 7 a 4, como con el
aumento de la concentracin de cloruro de sodio
(NaC1) desde 0,1 a 1 M. Sin embargo, idnticos
cambios no afectan a la unin del hapteno 2,4dinitroanilina (DNP) a su anticuerpo anti-DNP. La
explicacin se debera probablemente a que el
grupo COO- del benzoato interacta con un grupo
cargado positivamente del sitio de combinacin
de los anticuerpos y que en cambio, en el grupo
DNP las interacciones inicas no son importantes
para la unin con el sitio de su anticuerpo.

k
Hp + Ac

[Hp Ac]

(1)

k'

k
K=

[Hp Ac]
=

(2)

k'

[Hp] [Ac]

k : constante de asociacin
k': constante de disociacin

K representa la afinidad intrnseca de un sitio

activo representativo del anticuerpo por un hapteno
o ligando en trmino de concentracin en
equilibrio, que puede calcularse midiendo la
concentracin de hapteno o ligando libre.
Existen varios mtodos para distinguir
hapteno libre (Hp) de hapteno unido (Hp-Ac),

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2. INMUNOANLISIS

(Ag-Ac) con relacin variable de Ag o de Ac, que

frecuentemente llegan a ser insolubles y precipitan
en solucin. Esta se conoce como reaccin de
precipitacin que es dependiente de la relacin
molar Ag y Ac. La formacin de complejos de
haptenos o de pequeos antgenos univalente con
sus anticuerpos son solubles. La interaccin de
antgenos particulados, como microorganismo o
clulas con sus anticuerpos especficos producen
la reaccin de aglutinacin. En la tabla 40-1 se
muestran los mtodos de inmunoanlisis con
reactivos no marcados.

Los inmunoanlisis son actualmente

herramientas de amplio uso en los laboratorios
para medir diferentes analitos biolgicos, debido
a su facilidad de trabajo, como en la obtencin de
resultados sensibles y especficos.
Los inmunoanlisis pueden ser divididos en
mtodos que requieren de sistemas Ag-Ac no
marcados y marcados. La mayora de los
inmunoanlisis no marcados se basan en
reacciones inmunes secundarias, como por
ejemplo, precipitacin y aglutinacin. Se miden
por mtodos cuya base es la dispersin de la luz o
por recuento de partculas o clulas Los
inmunoanlisis marcados se basan en reacciones
inmunes primarias, como por ejemplo, inmunoanlisis fluorescente y enzimainmunoanlisis.

2.1.1. Reaccin de precipitacin

2.1.1.1. Reaccin de precipitacin en medio
lquido
a) Precipitacin en tubo. La precipitacin en tubo
es un procedimiento que no se usa corrientemente
en el laboratorio, pero que es necesario conocer
para apreciar las caractersticas generales de la
reaccin de anticuerpo con antgeno de alto peso
molecular en medio lquido. En forma prctica se

2.1. Inmunoanlisis con reactivos no marcados

La interaccin de antgenos solubles
macromoleculares (polivalentes) y anticuerpos
especficos llevan a la formacin de complejos

Tabla 40-1. Inmunoanlisis con reactivos no marcados

Reaccin de precipitacin
En medio lquido
Precipitacin en tubo
Floculacin
Turbidimetra
Nefelometra
Precipitacin de complejos inmunes solubles
En gel
Inmunodifusin doble
Inmunodifusin radial
Inmunoelectroforesis
Inmunofijacin
Contrainmunoelectroforesis
Rocket inmunoelectroforesis
Inmunoelectroforesis cruzada o bidimensional de Laurell
Reaccin de aglutinacin
Aglutinacin directa
Aglutinacin indirecta
Aglutinacin pasiva
Reaccin con participacin del complemento
Fijacin del complemento
Actividad hemoltica del complemento

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realiza en una batera de tubos que contienen un

volumen fijo de antisuero (concentracin fija de
anticuerpo) a los que se les aade diferentes
concentraciones de antgeno, midiendo la protena
total del precipitado formado y detectando el
excedente de Ac o de Ag en el sobrenadante.
Como se muestra en la figura 40-1, a una
concentracin definida de anticuerpos, la cantidad
de complejo Ag-Ac precipitado aumenta con la
cantidad de antgeno aadido hasta un valor
mximo, que sobrepasndolo lleva a una
disminucin progresiva de la precipitacin. Se
produce precipitacin de una cantidad mxima de
anticuerpos por una cantidad ptima de antgeno.

acuerdo a la teora del enrejado (lattice theory)

de Heidelberger, Kendall y Marrack. Ellos
sugirieron que la precipitacin puede ser
consecuencia del crecimiento del agregado
antgeno-anticuerpo de tal manera que la molcula
del antgeno se une a ms de una molcula de
anticuerpo y cada molcula de anticuerpo se une
a ms de una de antgeno en que participan
activamente interacciones Fc-Fc, de manera que
cuando el agregado excede un volumen crtico,
precipita espontneamente.
El precipitado formado puede disociarse y
volver al equilibrio con adicin de Ag fresco. Cuando
se produce un exceso suficiente se forman pequeos

Figura 40-1. Curva de precipitacin para un complejo especfico Ag-Ac.

complejos solubles y el precipitado se solubiliza.

En la curva de precipitacin se encuentra una

zona de exceso de anticuerpos, el sobrenadante
contiene anticuerpo libre, una zona de exceso de
antgeno, el sobrenadante contiene antgeno libre
y una zona de equivalencia o punto de equivalencia, el sobrenadante est libre de anticuerpo y
antgeno libre.
Es importante tener presente que en las zonas de exceso de anticuerpos y de antgenos se
detectan complejos inmunes solubles. En la zona
de exceso de antgeno los sobrenadantes contienen
complejos solubles de varias composiciones como
Ag4 Ac3, Ag3 Ac2 y Ag2 Ac. En el extremo de
esta zona los complejos que principalmente se
forman son Ag2 Ac que se atribuye a los dos sitios
activos o a la divalencia de la molcula de anticuerpo IgG. Este fenmeno es explicado de

b) Floculacin. La floculacin es una reaccin de

precipitacin anmala, donde la precipitacin se
observa solamente en un rango muy estrecho de la
proporcin Ag/Ac. Los agregados insolubles se
forman en una relativa gran cantidad de Ag. Estas
reacciones se dan slo con algunos antisueros, como
por ejemplo, sueros de caballos antitoxina diftrica,
antitoxina tetnica y antitoxinas estreptoccicas y
suero humano anti-tiroglobulina. Es posible que los
antisueros que floculan contengan algunos
anticuerpos no precipitantes de alta afinidad que
deben ser previamente saturados con el antgeno.
c) Turbidimetra. La turbidimetra cuantifica la
nubosidad o turbidez de una solucin en que

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2.1.1.2. Reaccin de precipitacin en gel

reacciona el antgeno con el anticuerpo en baja

concentracin. El fotodetector est en lnea a la
luz incidente y la solucin, en ngulo de 0 o 180
y mide una disminucin de la seal o reduccin
en la intensidad de la luz que ocurre como
resultado de la combinacin de la reflexin,
absorcin o dispersin de la luz incidente.

Los mtodos de precipitacin en gel

permiten detectar la presencia y/o concentracin
de antgenos y/o anticuerpos presente, por la
formacin de bandas opacas de precipitado que
corresponden a complejos antgenos-anticuerpos
en la zona de equivalencia.

d) Nefelometra. La nefelometria es una tcnica

que permite determinar niveles de antgeno o de
anticuerpo en soluciones a muy baja concentracin. La nubosidad o turbidez que producen los
pequeos inmunocomplejos es medida por la luz
que se dispersa (scattered light), a travs de un
fotodetector que est en un ngulo diferente a la
fuente de luz incidente (30 a 90). Se puede
obtener una gran sensibilidad usando luz
monocromtica de un rayo lser y por adicin de
polietilenglicol que aumenta el tamao de los
agregados. En el laboratorio clnico se est usando
masivamente por sus ventajas en la cuantificacin
de protenas, como: rpido, altamente automatizado, simple de operar, usa pequeos volmenes
de muestra y reactivo, alta sensibilidad (menor que
1 ng/litro) y excelente precisin.

a) Inmunodifusin doble. La inmunodifusin

doble fue desarrollada principalmente por
Ouchterlony en Suecia. Se basa en la difusin del
Ag y el Ac en un medio semislido (gel de agar),
formando bandas de precipitacin donde los
reactantes estn en proporciones equivalentes.
Estos complejos son insolubles y pueden ser
analizados visualmente.
La tcnica se basa en preparar un gel uniforme
de agar en una placa Petri o portaobjeto. En el agar
se practica perforaciones de un dimetro y esquema
previamente establecidos. Las soluciones que
contiene el antgeno y el anticuerpo se colocan en
perforaciones adyacentes y se deja difundir hasta
formar lneas o bandas de precipitacin. La
intensidad, nitidez y posicin de estas bandas es
dependiente de la concentracin del Ag y Ac.
La inmunodifusin doble se utiliza para anlisis
de antgenos y anticuerpos. Permite determinar la
relacin inmunoqumica entre dos antgenos a travs
de componentes idnticos o de reactividad cruzada.
Se distinguen tres patrones de reactividad: reaccin
de identidad, de no identidad y de identidad parcial
o cruzada (figura 40-2). Tambin, puede utilizarse
para determinar monoespecificidad de un antisuero
y para conocer el ttulo de los anticuerpos.

e) Precipitacin de complejos inmunes solubles.

Existen algunas situaciones que hacen necesario
precipitar complejos inmunes solubles para
identificar el antgeno o determinar el contenido de
anticuerpos, que se lleva a cabo modificando la
solubilidad del complejo con polietilenglicol al 2%
o sulfato de amonio al 50% o por adicin de un
reactivo anti-inmunoglobulinas (anticuerpos antiinmunoglobulinas o protena A de estafilococo).

Figura 40-2. Inmunodifusin doble. Reacciones de precipitacin en agar que ilustran reacciones de identidad, identidad parcial
y no identidad.

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hmeda y temperatura constante, se leen los

dimetros del halo de precipitacin. Se construye
un grfico o se obtiene la ecuacin de la recta con
las concentraciones de referencias versus rea o
dimetro del anillo y se interpola la lectura de la
muestra problema.
Este procedimientos ha sido ampliamente
adaptado para medir muchos antgenos, como por
ejemplo, inmunoglobulinas en diversos lquidos
biolgicos y su sensibilidad puede llegar a 0,1 mg/
ml y su coeficiente de variacin es menor al 20%
(figura 40-4).

La figura 40-3 muestra la utilidad de la

inmunodifusin doble en la deteccin de antgenos
proteicos en orina.
b) Inmunodifusion radial. La inmunodifusin
radial es una tcnica de precipitacin en gel, en
que el agar se ha mezclado con un antisuero monoespecfico sobre un portaobjeto o placa de Petri.
Se hacen perforaciones cilndricas que se llenan
con volmenes fijos de soluciones de referencia
de antgeno para el cual el antisuero es especfico
y con soluciones o muestras problemas. La
difusin del Ag en el agar permite la formacin
de anillos de precipitacin, cuya rea es
proporcional a la concentracin inicial del Ag. Al
trmino de 16 a 48 horas de difusin en cmara

c) Inmunoelectroforesis. La inmunoelectroforesis
(IEF) desarrollada por Grabar y Williams, es una
tcnica cualitativa que permite la identificacin

Figura 40-3. Inmunodifusin doble de una muestra de orina. Se observa un elevado nivel de albmina y ausencia de IgG, lo
que indica un posible dao inicial del glomrulo.

Figura 40-4. Cuantificacin de IgG humana por Inmunodifusin radial. Curva de referencia IgG (pocillos 1 al 4) y muestras
de suero de pacientes (pocillos 5 al 8).

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electroforesis se aplican antisueros monoespecficos y la presencia del antgeno complementario

forma complejos antgeno-anticuerpo que
precipitan. La formacin de un precipitado estable
antgeno-anticuerpo fija la protena en el gel
(figura 40-6). Se utiliza esencialmente en la
caracterizacin de inmunoglobulinas monoclonales.
La inmunofijacin y la inmunoelectroforesis
son tcnicas complementarias en la identificacin
de una gamapata monoclonal. La inmunofijacin
debiera ser utilizada frente a protenas anmalas
que son difciles de caracterizar por inmunoelectroforesis.

de diferentes antgenos en mezclas complejas, que

pueden tener semejante movilidad electrofortica
y peso molecular, pero diferentes determinantes
antignicos.
Esta tcnica se realiza en geles de agar o
agarosa y se distinguen dos etapas: (1) la solucin
de protenas se somete a separacin electrofortica
y (2) terminada la electroforesis, las protenas son
analizadas con antisueros poli o monoespecficos
en el agar en un canal paralelo al eje de migracin.
Luego de un perodo de difusin en cmara
hmeda, se observan arcos de precipitacin cuya
forma y posicin dependen de las caractersticas
inmunoqumicas y de la concentracin de cada
antgeno.
La IEF es de gran utilidad para el anlisis e
identificacin de componentes monoclonales que
caracterizan las enfermedades asociadas con
gammapatas monoclonales (figura 40-5).

e) Contrainmunoelectroforesis. La contrainmunoelectroforesis se realiza en gel agar, donde

el pH del tampn de electroforesis permite que el
anticuerpo de cargue positivamente y el antgeno
negativamente. La sensibilidad del mtodo es
aproximadamente 20 veces mayor que la doble
difusin. Actualmente el uso ms importante es
en el diagnstico de enfermedades infecciosas
cuyos antgenos migran hacia el polo positivo en
el agar (figura 40-7).

d) Inmunofijacin. La inmunofijacin es un
procedimiento que utiliza, en una primera etapa,
la electroforesis de protena en gel de agarosa y
luego, la inmunoprecipitacin. Sobre la placa de
agarosa en que se han separado las protenas por

Figura 40-5. Electroforesis e inmunoelectroforesis del suero de un paciente (p) con gammapata monoclonal IgG, g. Suero
control (c), suero anti-IgG (a), suero anti IgA humana (_), suero anti-IgM humana (), suero anti-kappa libre humana (g) y suero
anti-lambda libre humana (h).

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Figura 40-6. Electroforesis e inmunofijacin del suero de un paciente (p) con gammapata monoclonal IgG, g. Suero antiIgG humana (a), suero anti-IgA humana (_), suero anti-IgM humana (), suero anti-kappa libre humana (g) y suero anti-lamdda
libre humana (h).

Figura 40-7. Contrainmunoelectroforesis para la determinacin de antgeno de superficie del virus de la hepatitis B. Pocillos
a: Suero de conejo anti-antgeno de superficie del virus de la hepatitis B. Pocillos b: Sueros humanos positivos y negativos a
antgeno de superficie del virus de la hepatitis B.

f) Rocket Inmunoelectroforesis. El rocket

inmunoelectroforesis es la combinacin de la
electroforesis y la inmunodifusion radial que han
proporcionado un mtodo rpido para medir
concentracin de antgenos. El Ag migra por
electroforesis (aplicado en un pequeo pozo) en un
agar que contiene antisuero (anticuerpos en exceso).
El tiempo requerido para la precipitacin es de

aproximadamente 2 horas. La altura de la zona de

precipitacin que tiene la forma de un rocket es
proporcional a la concentracin de antgeno.
El antgeno debe migrar hacia el polo positivo
en la electroforesis, por tanto, es conveniente para
albmina, transferrina y ceruloplasmina, pero para
inmunoglobulina es ms conveniente la
inmunodifusin radial (figura 40-8).

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Figura 40-8. "Rocket" inmunoelectroforesis para la determinacin de albmina humana. Concentraciones de referencia
de albmina (pocillos 1 al 3) y muestras de pacientes (pocillos 4 al 7).

2.1.2. Reaccin de aglutinacin

g) Inmunoelectroforesis cruzada o bidimensional de Laurell. La inmunoelectroforesis cruzada

requiere inicialmente la separacin electrofortica
de una mezcla de antgeno en una direccin perpendicular al fenmeno final de precipitacin o
de etapa rocket. Esta es capaz de resolver mezcla
de antgenos altamente complejas y cuantificar
cada uno de ellos (figura 40-9). Por ejemplo, se
ha utilizado para estimar el grado de conversin
de tercer componente del complementario (C3) a
la forma inactivada C3c.

Los antgenos particulados, como microorganismos y suspensiones celulares son corrientemente

aglutinados cuando se mezclan con sus antisueros.
Los anticuerpos son dirigidos contra determinantes
antignicos de superficie que permiten un adecuado
entrecruzamiento con el Ag particulado permitiendo
la reaccin de aglutinacin. Los principios de la
aglutinacin son los mismos descritos para las
reacciones con antgenos solubles.
Las reacciones de aglutinacin se utilizan
preferentemente para identificar bacteria y tipificar
glbulos rojos, es llevada a cabo, generalmente
en solucin fisiolgica (NaCl 0,15 M; pH 7,0) y
es ampliamente utilizada en determinaciones
semicuantitativas.
En las reacciones de aglutinacin se debe
considerar el fenmeno de prozona que consiste en
que algunos sueros dan una efectiva reaccin de
aglutinacin solamente cuando estn francamente
diluidos. Sueros no diluidos o diluidos levemente no
reaccionan visiblemente con el Ag. Actualmente se
conoce que en la prozona existen anticuerpos
absorbidos en la superficie celular y el fenmeno se
explica por el exceso de anticuerpos y a la presencia
de anticuerpos conocidos como bloqueadores o
incompletos que corresponden a anticuerpos
univalentes (Acs con un solo sitio activo).

Figura 40-9. Inmunoelectroforesis cruzada o bidimensional

de Laurell. Primera dimensin. El pocillo contiene suero
humano. Segunda dimensin: el gel de agar contiene un
antisuero oligoespecfico. Los precipitados o "rocket"
corresponden a las siguientes protenas: (1) transferrina, (2)
alfa 2-macroglobulina, (3) ceruloplasmina, (4) alfa 1antitripsina, (5) alfa 1-glicoprotena cida.

a) Aglutinacin directa. La aglutinacin directa

se utiliza cuando el antgeno particulado posee

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2.2. Inmunoanlisis con reactivos marcados

suficientes determinantes antignicos en su

superficie permitiendo que el antisuero (Ac)
correspondiente produzca espontneamente el
fenmeno de aglutinacin. Se usa regularmente
en la serotipificacin bacteriana.

Los inmunoanlisis con reactivos marcados

se clasifican en: homogneos y heterogneos y
existen dos tipos bsicos: competitivo y no
competitivo.

b) Aglutinacin indirecta. La aglutinacin

indirecta se utiliza para clulas que tienen un
nmero reducido de determinantes antignicos o
que existe una cantidad insuficiente de anticuerpos
que dificultan el procedimientos de aglutinacin,
para lo cual es necesario disponer de otro reactivo
que es el anticuerpo anti-inmunoglobulinas. Por
ejemplo, determinacin del antgeno D (Rh) de
los glbulos rojos.

El inmunoanlisis homogneo no requiere

separacin fsica del antgeno unido, del libre.
Considera las diferencias fisicoqumicas (tamao
o cambios conformacionales) entre el antgeno
libre y el acomplejado al anticuerpo, siendo este
hecho el que caracteriza la seal de respuesta. La
sensibilidad puede verse afectada debido a que no
hay separacin de la muestra del paciente con la
seal de deteccin final, facilitando interferencias.
A veces se recomienda tratamiento previo de la
muestra para eliminar estas interferencias. Su
automatizacin es fcil y se utiliza preferentemente
en la deteccin de drogas y hormonas.

c) Aglutinacin pasiva. La aglutinacin pasiva

se utiliza para antgenos solubles que se absorben
en forma covalente a la superficie de las partculas.
Se han usado partculas como glbulos rojos
(hemaglutinacion pasiva) o polmeros sintticos
tal como el poliestireno o un coloide mineral como
la bentonita. La determinacin del factor
reumatodeo utiliza partculas de poliestireno de
aproximadamente 0.20 a 0.25 m de dimetro
recubiertas con gammaglobulina humana.
La aglutinacin es considerada ms sensible
que la precipitacin para detectar anticuerpos,
debido bsicamente a que grandes partculas
cubiertas con Ag sirven para amplificar la reaccin.

El inmunoanlisis heterogneo contempla la

separacin del antgeno unido del libre, considerando las diferencias fsicas, qumicas o inmunolgicas (tamao, carga, adsorcin a superficie
slida). Permite eliminar la mayora de las interferencias de la muestra, mejorando la sensibilidad
de la determinacin. Su automatizacin es compleja y se aplica en la determinacin de anticuerpos
especficos, marcadores tumorales y hormonas.
El inmunoanlisis competitivo se basa en la
competencia entre el antgeno de inters (analito)
y una cantidad constante del antgeno similar
marcado por una cantidad fija y limitada de
anticuerpo especfico. En este caso esta marcado
el analito.

2.1.3. Reaccin con participacin del complemento

a) Fijacin del complemento. La fijacin del
complemento permite detectar anticuerpos por la
formacin de complejos inmunes que fijan
complemento por la va clsica y que por una
reaccin secundaria, lisis de un sistema indicador
glbulos rojos-anti glbulos rojos permite
determinar la cantidad de antgeno o de anticuerpo
presente en la reaccin.

El inmunoanlisis no competitivo usa un exceso

de anticuerpo especfico marcado contra el
antgeno o analito de inters. En este caso est
marcado el reactivo.
En la tabla 40-2 se muestra los mtodos
inmunoqumicos que utilizan reactivos marcados.

b) Actividad hemoltica del complemento

(CH50). La determinacin de la actividad
hemoltica del complemento (CH50) permite
conocer la actividad funcional del sistema
complemento y se basa en determinar la cantidad
mnima de suero (complemento) que lisa el 50%
de glbulos rojos indicadores que han sido
previamente sensibilizados en forma ptima con su
anticuerpo (hemolisina). La hemlisis se produce
por la activacin de la va clsica del complemento.

2.2.1. Inmunoanlisis fluorescente

a) Microscopa inmunofluorescente. La
microscopa inmunofluorescente incorpora el
concepto tradicional de inmunofluorescencia (IF)
que bsicamente es una tcnica inmunohistoqumica o inmunocitoqumica que permite la
localizacin de antgenos en clulas y tejidos y la

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Tabla 40-2. Inmunoanlisis con reactivos marcados

Inmunoanlisis fluorescente
Microscopa inmunofluorescente
Inmunofluorescencia directa
Inmunofluorescencia indirecta
Inmunoanlisis de fluorescencia polarizada (FPIA)
Inmunoanlisis de fluorescencia unida a enzima (ELFIA)
Citometra de flujo
Enzimainmunoanlisis (EIA)
EIA homogneo. EMIT
EIA heterogneo. ELISA, MEIA
Electroinmunotransferencia o Western blot o Immunoblotting
Radioinmunoanlisis (RIA)
RIA en fase soluble
RIA en fase slida
Deteccin inmunorradiomtrica para antgeno
Quimiluminiscencia
Bioluminiscencia

regularmente en el laboratorio: directa e indirecta.

deteccin y titulacin de anticuerpos especficos.

La fluorescencia es un fenmeno producido
por molculas excitadas que emiten radiacin,
energa o luz que cesa inmediatamente despus
que se retira la luz excitante. Las molculas que
tienen esta caracterstica se llaman fluorocromos.
Los fluorocromos o fluorforos son sustancias
coloreadas que absorben radiacin y luego son
excitadas emitiendo mxima energa a una
determinada longitud de onda.
Para obtener un mximo rendimiento de la
IF es necesario conocer los peak de excitacin
y de emisin del fluorocromo en uso que permita
seleccionar adecuadamente la fuente de luz y la
combinacion de filtros (primarios y barrera) del
microscopio de fluorescencia. El peak de
excitacin es la longitud de onda a la que el
fluorocromo absorbe radiacin con una mxima
eficiencia. El peak de emisin es la longitud de
onda a la que la energa fluorescente resultante es
mxima.
Los fluorocromos ms utilizados son el
isotiocianato de fluoresceina (FITC), rodamina B
y ficoeritrina. Los anticuerpos con uno o dos
residuos de fluorocromo por molcula son
intensamente fluorescentes y mantienen su
actividad especfica. Existen dos procedimientos
de inmunofluorescencia que se utilizan

a.1) Inmunofluorescencia directa (IFD) . La IFD

utiliza un anticuerpo especfico conjugado con el
fluorocromo que se aplica directamente sobre el
sustrato (tejido, clula, u otro) permitiendo
identificar la estructura responsable de la
especificidad. Se utiliza preferentemente para
identificar microorganismo y tipificar clulas (por
ejemplo: linfocitos).
a.2) Inmunofluorescencia indirecta (IFI). La IFI
es una tcnica de doble capa, en que un anticuerpos
no marcado se aplica directamente sobre el sustrato
y se visualiza la reactividad con un conjugado antiinmunoglobulinas-fluorocromo. Se utiliza
preferentemente para la deteccin de autoanticuerpos (figura 40-10).
En la inmunofluorescencia se puede aumentar
la sensibilidad con el sistema avidina
(estreptavidina)-biotina que tiene una alta afinidad,
que utiliza primariamente un conjugado
anticuerpo-biotina y luego conjugado avidinafluorocromo.
b) Inmunoanlisis de fluorescencia polarizada.
El inmunoanlisis de fluorescencia polarizada
(fluorescence polarization immunoassay"; FPIA)

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detector (ver captulo 43). La molcula de

fluorocromo unida al anticuerpo monoclonal
absorbe luz del rayo lser y emite luz en otra
longitud de onda, en que su intensidad es captada
por otro detector que est en ngulo recto al rayo.
Ambos fenmenos facilitan la correcta
identificacin de las poblaciones celulares.
2.2.2. Enzimainmunoanlisis
El enzimainmunoanlisis (EIA) ha reemplazado a muchas tcnicas tradicionales en el
diagnstico clnico e investigacin biolgica desde
que se introdujo en 1966 por Avrameas y Uriel.
Este mtodo se basa en dos fenmenos biolgicos:
alta especificidad del anticuerpo por un antgeno
(reaccin inmunolgica) y la amplificacin por
reacciones qumicas llevadas a cabo por enzimas
que actan sobre sustratos que originan productos
coloreados (reaccin indicadora).
La tcnica de EIA es utilizada rutinariamente
para localizacin de antgeno o anticuerpo sobre
tejidos o clulas, para la deteccin de antgeno o
anticuerpos inmovilizados en una fase slida, para
la titulacin de anticuerpo y para la medicin de
antgeno. Los antgenos pueden ser medidos por
procedimientos inmunoenzimticos homogneos
o heterogneos.
Las enzimas que se utilizan corrientemente
para marcar anticuerpo o antgeno son: fosfatasa
alcalina, cuyo sustrato es el p-nitrofenil-fosfato y
la lectura de absorbancia se lleva a cabo a 405
nm; peroxidasa que puede utilizar tres sustratos
diferentes: o-fenilendiamina (oPD)/H202; 3,3',5,5'tetrametilbenzidina (TMB)/H202 y 2,2'-di-azino(3etilbenzotiazolina 6-cido sulfnico (ABTS)/H202
con lecturas de densidad ptica a 492, 450 y 415
nm respectivamente y beta-galactosidasa, cuyo
sustrato es el o-nitrofenil-beta-D-galactopiransido (oNPG) y la lectura se realiza 420 nm.
En los EIA automatizados se usa corrientemente la fosfatasa alcalina como enzima marcadora y como sustrato el 4-metilumbeliferil fosfato
(MUP). El MUP es catalizado a un producto
fluorescente (metilumbeliferona) que es medido
por fluorometra.
El EIA, tambin puede ser amplificado
utilizando la interaccion avidina (estreptavidina)biotina. Se utiliza los conjugados anticuerposbiotina y avidina-enzima.

Figura 40-10. Deteccin de anticuerpos antinucleares por

inmunofluorescencia indirecta. Se usa clulas HEp-2. En este
caso se observa un patrn homogneo.

es un inmunoanlisis homogneo y competitivo

que usa un antgeno marcado con un fluorforo y
polarizado, y su sistema de deteccin est basado
en la fluorometra. Es fcilmente automatizado y
se utiliza para medir pequeas molculas como
drogas y hormonas.
c) Inmunoanlisis de fluorescencia unida a
enzima. El inmunoanlisis de fluorescencia unida
a enzima (enzyme-linked fluorescence immunoassays", ELFIA) es un inmunoanlisis
heterogneo y puede ser de tipo competitivo o no
competitivo, en que el inmunorreactante marcado
con enzima est en combinacin con un sustrato
fluorognico que permite la deteccin por
fluorometra. El ELFIA est automatizado y es uno
de los mtodos ms sensibles hoy en da en el
laboratorio clnico. Utiliza preferentemente como
enzima marcadora fosfatasa alcalina y como
sustrato fluorognico el 4 metil umbeliferona
(4MUP).
d) Citometra de flujo. La citometra de flujo
permite medir la cantidad de anticuerpo monoclonal fluorescente unido a cada clula en forma
individual, facilitando la identificacin y tipificacin de diferentes subgrupos de poblaciones
celulares con una extraordinaria sensibilidad,
eficiencia y rapidez.
En el citmetro de flujo las clulas atraviesan
un rayo lser y son analizadas individualmente.
Las clulas deflectan o dispersan la luz de un lser
de una forma estrechamente relacionada con su
tamao y granularidad que es registrada en un

a) EIA homogneo. El enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT) es un EIA

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homogneo y competitivo que usa una enzima

marcadora y el sistema de deteccin es
espectrofotomtrico. La enzima marcadora es
unida covalentemente al antgeno en una posicin
cercana al sitio activo de la enzima. Durante la
reaccin inmunolgica, cuando el antgeno
marcado con la enzima se une al anticuerpo, el
sitio activo de la enzima es bloqueado fsicamente
y la enzima es inhibida funcionalmente. En la
forma libre del antgeno marcado con la enzima,
la enzima permanece activa funcionalmente y
actuar sobre el sustrato que se aade generando
un producto coloreado. El cambio de color
resultante es proporcional a la cantidad de antgeno
marcado libre disponible y debido a la naturaleza
competitiva del inmunoanlisis, ser proporcional
a la cantidad de analito (antgeno) presente en la
muestra. El EMIT se ha automatizado fcilmente
y es usado principalmente en la deteccin de
drogas.

Figura 40-11. Esquema de enzimainmunoanlisis en fase

slida (ELISA) para deteccin y cuantificacin de
anticuerpos especficos. En el esquema el antgeno se ha unido
a un soporte slido; luego el anticuerpo (Ac primario) a pesquisar
(suero del paciente) reconoce el antgeno. Posteriormente el
conjugado anticuerpo secundario-enzima se une al Ac primario,
evento que es reconocido con la adicin del sustrato que
catalizado por la enzima forma productos coloreados cuya
densidad ptica se lee a una determinada longitud de onda.

b) EIA heterogneo. Los procedimientos EIA

heterogneos son en general ms sensibles que los
homogneos.
El "enzyme-linked inmunosorbent assay"
(ELISA) se realiza sobre una fase slida (placas
de poliestireno u otro similar) y es un EIA
heterogneo, no competitivo y su deteccin
preferentemente es por espectrofotometra (figura
40-11). Es ampliamente utilizado en el laboratorio
clnico en la deteccin y medicin de autoanticuerpos y varias otras protenas. Existe una
variedad que se realiza sobre papel de nitrocelulosa
que se ha llamado inmunofijacion en punto o
"immuno blot, "dotimmunobinding" o "dot"
(figura 40-12).
El "microparticle enzyme immunoassay"
(MEIA) es un mtodo heterogneo, no competitivo
y de tipo sandwich. Utiliza una enzima
marcadora y el sistema de deteccin es por
fluorometra o espectrofotometra. Incorpora
micropartculas que permiten aumentar el rea en
la cual ocurre la reaccin antgeno-anticuerpo
facilitando la cintica de la reaccin y
disminuyendo el tiempo de incubacin. Ha sido
automatizado permitiendo cuantificar una gran
cantidad de molculas, incluyendo hormonas y
marcadores tumorales.

Figura 40-12. Inmunodifusin en punto o "dot

immunobinding". Enzimainmunoanlisis sobre papel de
nitrocelulosa para deteccin de anticuerpos especficos. Los
puntos coloreados indican positividad.

mainmunoanlisis para originar una poderosa

herramienta que permite estudiar cualitativa y
cuantitativamente las reacciones antgenoanticuerpo. Los antgenos son separados en gel
SDS-poliacrilamida y transferidos a una membrana de nitrocelulosa unindose inespecficamente e identificados con procedimientos
inmunoenzimticos. Debido a que existe un
proceso de denaturacin de los antgenos por los

c) Electroinmunotransferencia ("Western blot"

o "Immunoblotting"). La electroinmunotransferencia combina la electroforesis en gel SDSpoliacrilamida y la alta sensibilidad del enzi-

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detergentes utilizados se recomienda utilizar

antisueros policlonales en el anlisis ("blotting")
para aumentar la probabilidad de detectar eptopos
o determinantes antignicos que no se han alterado
por la denaturacin.
La electroinmunotransferencia se utiliza en
el diagnstico viral (confirmacion de anticuerpos
anti-HIV), tipificacin de bacterias (Neisseria
meningitidis), deteccin de autoanticuerpos
(anticuerpos anti-antgenos nucleares extractables), etc.

de IgE especfica unida al soporte es estimada por

la adicin de un anticuerpo anti-IgE radiomarcado.
c) Deteccin inmunorradiomtrica para
antgenos. En las pruebas inmunorradiomtricas
el reactivo marcado es utilizado en exceso. Para
la determinacin de antgeno, los anticuerpos estn
absorbidos sobre un soporte slido al que se le
agrega la solucin de antgeno. Luego el soporte
es lavado y la cantidad de antgeno unido puede
ser estimado por la adicin en exceso de un
anticuerpo radiomarcado. La prueba muestra una
mayor especificidad cuando los anticuerpos
utilizados reconocen diferentes eptopos del
antgeno. La aplicacin clsica de esta prueba es
el RIST ("radioimmunosorbent test") para la
determinacin de IgE total, donde el anticuerpo
anti-IgE se ha unido covalentemente a
microcristales de celulosa y se le adiciona el suero
del paciente y los sueros controles. La IgE total
unida es medida por la adicin de un anticuerpo
anti-IgE radiomarcado.

2.2.3. Radioinmunoanlisis
El radioinmunoanlisis (RIA) utiliza antgeno
o anticuerpo generalmente marcados con istopos
como, 125I o eventualmente 131I. Este inmunoanlisis puede llevarse a cabo en fase soluble o
slida.
a) RIA en fase soluble. El RIA en fase soluble
permite determinar la capacidad de unin de un
anticuerpo, por adicin de un moderado exceso
de antgeno marcado a un antisuero, los
anticuerpos forman complejos solubles y se
precipitan por los procedimientos ya indicados.
En el precipitado se mide la radiactividad dando
una estimacin de la capacidad de unin del
anticuerpo especfico por su antgeno. Este
inmunoanlisis en fase soluble, tambin permite
determinar antgeno (RIA clsico) por adicin de
un antgeno marcado a una cantidad fija y limitada
de anticuerpo, cuya unin puede ser parcialmente
inhibida por la adicin de antgeno no marcado.
La extensin de esta inhibicin puede ser usada
como una medida del antgeno no marcado. Se
debe realizar la medicin de la radiactividad del
antgeno radiomarcado libre, que debe estar
separado de los otros constituyentes del sistema.

2.2.4. Quimiluminiscencia
La quimiluminiscencia es la emisin de luz
producida en ciertas reacciones qumicas de
oxidacin. La mayoria de las reacciones
quimiluminiscente son de oxidacin debido a que
la produccin de luz visible requiere reacciones
altamente energticas. La reaccin quimiluminiscente ms estudiada ha sido la oxidacin del
luminol. Los marcadores ms populares son los
derivados de isoluminol y steres de acridina. Para
detectar un marcado quimiluminiscente se usa una
amplia variedad de luminmetros que miden la
emisin de luz.
En este ltimo tiempo se est usando como
marcador la fosfatasa alcalina que reacciona con
sustratos basados en el adamantil 1,2-dioxetano
aril fosfato, que los desfoforila para producir un
fenxido intermediario y ste al descomponerse
produce emisin de luz a 470 nm. Actualmente,
los inmunoanlisis quimiluminiscentes son
utilizados por varios analizadores automatizados.
En ellos se determinan drogas, hormonas,
marcadores tumorales y otras protenas.

b) RIA en fase slida. El RIA en fase slida

permite medir un anticuerpo a travs de su
capacidad de unin al antgeno que ha sido
insolubilizado por adsorcin fsica a un soporte
plstico. La inmunoglobulina unida puede ser
estimada por la adicin de un anticuerpo antiinmunoglobulinas radiomarcada producida en otra
especie. Este procedimiento se ha utilizado en la
prueba RAST ("radioallergosorbent test") para la
determinacin de IgE especfica en pacientes
alrgicos. En este caso, el alergeno es
covalentemente unido a un soporte y que luego es
incubado con el suero del paciente. La cantidad

2.2.5. Bioluminiscencia
La bioluminiscencia es un fenmeno natural que
se encuentra en muchas formas inferiores de vida.
Un sistema natural es la D-luciferina/luciferasa,

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Wild, D., The Immunoassay Handbook,

Segunda Edicin, CPL Scientific Publishing,
Hardback, U.S.A., 2000.

en que la luciferasa cataliza la oxidacin de la Dluciferina en presencia de ATP y Mg +2 a

oxiluciferina, con emisin de luz a 546 nm. En
los inmunoanlisis bioluminiscentes se est
utilizando conjugado anticuerpo-fosfatasa alcalina
o conjugado analito-fosfatasa alcalina que
reacciona con la D-luciferina-o-fosfato liberando
D-luciferina. La D-luciferina es oxidada por la
luciferasa con emisin de luz. An no est
disponible inmunoanlisis bioluminiscente para
aplicacin rutinaria en el laboratorio.
LECTURAS SUGERIDAS
Avrameas, S., Amplification systems in
immunoenzymatic techniques, J Immunol. Meth.,
150: 23-32, 1992.
Chan, D. and Sokoll, L., Immunoassays automation at the millenium, Editorial, J. Clin. Ligand
Assay , 22(1), 1999.
Diamandis, E. and Christopoulos, T., Immunoassay, Academic Press. U.S.A.,1996.
Eisen, H., Immunology, Harper and Row Publishers, U.S.A., captulo 16, pp. 297-336, 1980.
Kemeny, D., Titration of antibodies, J. Immunol
Meth., 150: 50 76, 1992.
MacCrindle, C., Schwenzer, K. and Jolley, M.,
Particle concentration fluorescence immunoassay: A new immunoassay technique for quantification of human immunoglobulins in serum, Clin.
Chem., 31/9:1487-1490, 1985.
Porstmann, T. and Kiessig, A., Enzymes immunoassay techniques. An overview, J. Immunol.
Meth., 150: 5-21, 1992.
Roitt, I., Essential Immunology, chapter 5,
Blackwell Scientific Publications, London, 1991.
Slagle, K. and Ghosn, S., Immunoassays. Tools
for sensitive, specific and accurate test results,
Lab. Medicine, 27: 177-183. 1996.
Volland, H.; Vulliez Le Normand, B.; Mamas, S.;
Grassi, J.; Crminon, C.; Ezan, E. and Pradelles,
P., Enzyme immunometric assay for leukotriene
C4, J. Immunol. Meth., 175: 97, 1994.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica

Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C.,
Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C.
Editorial Universidad de Talca, 2002

http://booksmedicos.org
Captulo 41
MTODOS DE ESTUDIO DE LA
INMUNIDAD CELULAR
Jorge Gonzlez C. y Pilar Vega C

1. Introduccin
2. Preparacin y aislamiento de diferentes poblaciones celulares
2.1. Mtodos de purificacin tradicionales
2.2. Separacin inmunomagntica
3. Estudio de la respuesta inmune celular especfica
3.1. Estudio de las subpoblaciones de
linfocitos
3.2. Estudio de las funciones de inmunidad celular especfica
3.3. Estudio de la sntesis de citoquinas y sus receptores
3.4. DNA microarrays
3.5. Pruebas para evaluar reacciones
de hipersensibilidad retardada
(RHR)
3.6. Estudios de la especificidad de
clulas T
3.7. Deteccin de clulas T precursoras

4. Estudio de la inmunidad celular

inespecfica
4.1. Ensayos funcionales de neutrfilos
4.2. Ensayos funcionales de eosinfilos
4.3. Ensayos funcionales de monocitos y macrfagos
5. Evaluacin de laboratorios del paciente infectado con el virus de la
inmunodeficiencia humana. Un modelo del estudio de las deficiencias
en la respuesta celular
5.1. Estudio fenotpico de linfocitos
5.2. Estudio de la respuesta proliferativa
5.3. Estudio de la respuesta citotxica
5.4. Evaluacin de los niveles de
citoquinas y subpoblaciones de
linfocitos T

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RESUMEN
La respuesta inmune celular del hombre debe ser evaluada mediante pruebas de laboratorio, no slo frente a la sospecha de estados inmunes alterados, sino tambin frente a tratamientos
con modificadores biolgicos de la respuesta y en eventuales estudios de vacunacin. Frente a
cualquiera de estas situaciones, la respuesta inmune celular puede ser evaluada tanto in vivo
como in vitro. Las respuestas in vivo, se evalan nicamente mediante pruebas cutneas, llamadas reacciones de hipersensibilidad.
Por otro lado, un vasto arsenal de pruebas in vitro, estn disponibles, para evaluar la respuesta celular y la factibilidad de su uso dependen tanto del nivel de equipamiento de cada
laboratorio como de la formacin de sus recursos humanos. No obstante, de manera general
ningn ensayo aislado es suficiente para un adecuado diagnstico; una visin adecuada del
funcionamiento de la respuesta celular puede obtenerse por la combinacin e interpretacin de
varios mtodos y parmetros.
Especial cuidado debe tenerse en el anlisis, manejo e interpretacin de los resultados.
Debe considerarse que los resultados obtenidos podran variar dependiendo de la metodologa
empleada, del background gentico de los diferentes individuos e incluso dentro de un mismo
individuo. Por ello resulta de especial valor que cada laboratorio determine y maneje con propiedad los parmetros normales para cada prueba, pudiendo as acceder a interpretaciones
laboratoriales ms adecuadas.
El desarrollo de ensayos sensibles para analizar la respuesta inmune celular tanto en el
hombre como en modelos experimentales ha llevado a importantes descubrimientos tanto en
inmunologa bsica como clnica.
En el futuro, el empleo de mtodos ms sensibles y especficos, sumados a la utilizacin de
tecnologas emergentes como los DNA microarrays y el estudio de protenas (proteomica),
permitir mejorar el diagnstico y el pronstico de las diferentes enfermedades infecciosas y de
base inmunlogica

1.

INTRODUCCIN

poblaciones celulares. De esta forma, mientras la

respuesta humoral, permite controlar y eliminar
microorganismos extracelulares y neutralizar sus
productos, la respuesta celular es responsable del
control de microorganismos intracelulares, la destruccin de clulas infectadas por virus, clulas
tumorales y el rechazo a injertos. De esta forma
se puede afirmar que la respuesta celular est adaptada para reconocer y eliminar clulas alteradas,
sean stas infectadas por patgenos intracelulares
o que expresen antgenos tumorales.
La importancia de la inmunidad mediada por
clulas, resulta evidente cuando el sistema es defectuoso. Por ejemplo, en nios con sndrome de
Di George, quienes nacen sin timo y por ende son
deficientes en clulas T, generalmente controlan
patgenos extracelulares, pero no as los
intracelulares (ver captulo 29). Esta falla funcional en la respuesta inmune mediada por clulas,

La rama celular de la respuesta inmune, confiere inmunidad mediante la generacin de clulas efectoras. Aunque en estos mecanismos, pueden adems participar tanto anticuerpos como factores del complemento, stos juegan un papel secundario. Por ello, tanto clulas especficas como
no especficas estimuladas para un mismo antgeno
contribuyen a la respuesta inmune mediada por
clulas.
Las clulas especficas, corresponden a las
diferentes subpoblaciones de linfocitos T CD4+ y
CD8+, mientras que en las clulas no especficas
se incluye a macrfagos, neutrfilos, eosinfilos
y clulas "natural killer" (NK). No obstante, la
actividad de ambos tipos de clulas depende de
las concentraciones locales de citoquinas, que son
mediadores solubles secretados por diferentes

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2.1. Mtodos de purificacin tradicionales

resulta en infecciones a repeticin por diferentes

patgenos intracelulares, donde incluso vacunas
atenuadas pueden producir estados infecciosos.
La evaluacin de la respuesta inmune celular
permite, en pacientes, conocer de manera cualitativa y cuantitativa la funcionalidad de clulas y mediadores de esta rama de la respuesta inmune, de
manera de determinar en correlacin con los antecedentes clnicos, el estado inmune del paciente.
La deteccin de estados alterados puede corresponder a las llamadas inmunodeficiencias las cuales pueden ser congnitas o adquiridas (ver captulos 29 y 30). Por otro lado, tambin se consideran
estados de inmunidad alterada la reactividad contra antgenos propios conocida como autoinmunidad (ver captulo 23) y la hiperreactividad propia de la alergia (ver captulo 22).
De igual forma, el monitoreo de los niveles
de productos de la funcin celular como citoquinas
y monoquinas, puede ser de utilidad clnica en estudios frente a modificadores de la respuesta biolgica (MRB). En el mbito de la investigacin
biomdica, ya sea en modelos animales, como en
personas, permite conocer y definir de manera
experimental las caractersticas de la respuesta
inmune celular posibilitando la identificacin de
antgenos protectores tanto frente a patgenos
como frente a tumores, en eventuales estudios de
vacunacin.
En este captulo se describe los principales
mtodos diagnsticos que permiten evaluar el estado de la rama celular de la respuesta inmune.
Muchas de las pruebas que permiten la evaluacin de la respuesta inmune celular han sido utilizadas por muchos aos. Otras son de incorporacin ms reciente al arsenal de pruebas de laboratorio. Algunas de ellas son de reciente aplicacin
en el mbito de la inmunologa y aunque no siempre podran ser factibles de aplicar de manera
masiva en los laboratorios, es necesario conocer
la existencia de ellas y sus posibles proyecciones.

Utilizan soluciones de ficoll-hipaque o

percoll en diferentes densidades, las que mediante centrifugacin permiten la separacin de las diferentes poblaciones celulares, basndose en sus
diferencias de tamao y densidad.
2.1.1. Separacin de linfocitos
Para ello la sangre total es diluida en buffer
fosfato salino en proporcin 1:1, depositndola
sobre ficoll-hipaque a densidad de 1,077. Luego
de centrifugar, en la interfase entre el plasma diluido y la solucin de ficoll, se forma un anillo
blanco rico en leucocitos, mientras que en el pellet
se encuentran los eritrocitos y los polimorfonucleares (PMN).
2.1.2. Separacin de polimorfonucleares y
linfocitos
La sangre heparinizada se mezcla con una
solucin de dextrano al 6% y se deja sedimentar a
temperatura ambiente. De esta manera, se obtiene
un plasma rico en PMN, monocitos y linfocitos
pero libre de eritrocitos (figura 41-1).
2.1.3. Separacin de linfocitos y PMN
Una buena separacin de linfocitos y PMN
se consigue a partir del plasma obtenido por sedimentacin con dextrano al 6%. Esta se obtiene
mediante centrifugacin diferencial sobre ficollhipaque con densidad 1,077, observndose en la
interfase un anillo blanco que contiene los
linfocitos mientras que el pellet contiene los
eritrocitos (figura 41-1).
En todos los casos los procedimientos de purificacin deben ser monitoreados mediante frotis
y evaluacin morfolgica de las clulas recuperadas. La confirmacin del tipo celular recuperado
se puede realizar mediante inmunofluorescencia
utilizando anticuerpos monoclonales contra marcadores de superficie. El control de la viabilidad
de estas clulas debe realizarse mediante pruebas
de exclusin con azul tripan, o mediante mtodos
fluorescentes utilizando steres de acetoxymetil
calcena (calcena-AM).

2. PREPARACIN Y AISLAMIENTO DE
DIFERENTES POBLACIONES CELULARES
El estudio de la respuesta inmune celular requiere, en algunos casos, disponer de poblaciones
celulares puras o enriquecidas que permitan la evaluacin de diferentes parmetros. Se puede utilizar mtodos de purificacin tradicionales y basados en separacin inmunomagntica.

2.1.4. Aislamiento de monocitos humanos

Gradientes de ficoll-hipaque han sido

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Figura 41-1. Separacin de PMN y linfocitos. Utilizando dextrano 6% se pueden separar los PMN y linfocitos de los glbulos
rojos y a la vez los dos primeros se pueden separar usando ficoll hipaque 1.077 o bien una gradiente doble de ficoll hipaque.

hipodensos. Debe tenerse en mente que diferencias funcionales han sido observadas dependientes del mtodo utilizado en la purificacin. Aparentemente, eosinfilos purificados mediante separacin celular magntica son menos respondedores a lpidos quimiotcticos que las clulas
obtenidas por gradiente.

rutinariamente utilizadas para inicialmente aislar

clulas mononucleares, de las cuales entre 10-20%
corresponden a monocitos. Para aislar los
monocitos, se usa su capacidad de adherir al plstico, luego de incubacin por 1 h a 37 C. El procedimiento de aislamiento se desarrolla en esterilidad, a temperatura ambiente, utilizando medios
y material de vidrio o plstico que estn libres de
endotoxinas, debido a que endotoxinas bacterianas
como el lipopolisacrido (LPS) son potentes
activadores de monocitos y macrfagos.

2.1.6. Aislamiento de basfilos

Los basfilos son los leucocitos de menor
abundancia en sangre humana y por ende su purificacin es relativamente difcil. Los procedimientos basados en centrifugacin por gradiente permiten enriquecer las preparaciones de basfilos
hasta en un 50%, pero contienen una significativa
contaminacin con otros tipos celulares especialmente linfocitos. Durante cualquier procedimiento de enriquecimiento deber tenerse presente en
prevenir su estimulacin y degranulacin.

2.1.5. Aislamiento de eosinfilos

El bajo nmero de eosinfilos en sangre
perifrica de individuos normales ha hecho relativamente difcil obtener preparaciones en nmero
y pureza apropiadas para estudios funcionales.
Para ello, protocolos basados en la separacin de
eosinfilos de neutrfilos la principal clula contaminante, mediante densidad han sido utilizados
por largo tiempo. Estas tcnicas resultan en clulas de alta viabilidad, no obstante posean bajo
rendimiento y grados de pureza variable. Ms an
la mayora de los eosinfilos son de alta densidad
(1095-1100 g/mL), por lo que presumiblemente
representaran poblaciones no activadas. Recientemente, se ha introducido la seleccin negativa,
basada en la remocin de neutrfilos por medio
de separacin celular magntica usando perlas
recubiertas de anticuerpo monoclonal anti-CD16.
Este mtodo aumenta la recuperacin y pureza de
los eosinfilos con respecto a las tcnicas que utilizan gradiente de densidad. No obstante, estas preparaciones difieren de las obtenidas por gradiente,
ya que contienen adems los eosinfilos

2.2. Separacin celular inmunomagntica

Recientemente han sido utilizadas tcnicas
basadas en la separacin inmunomagntica de
neutrfilos, usando perlas magnticas recubiertas
de anticuerpo monoclonal anti-CD16. Aunque el
marcador CD16 no es exclusivamente expresado
por neutrfilos (tambin est presente en algunos
eosinfilos y en algunas clulas mieloides precursoras), el aislamiento inmunomagntico a partir
de sangre perifrica permite obtener preparaciones enriquecidas de neutrfilos con ms de 99%
de pureza (figura 41-2). De igual manera, usando
perlas sensibilizadas con anticuerpos anti-CD14
es posible separar monocitos humanos, mientras

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que perlas magnticas con anticuerpos CD4 y CD8

permiten separar estas poblaciones linfocitarias.

para secretar algunos mediadores biolgicos como

son las citoquinas. Entonces, es necesario conocer los niveles de linfocitos T (LT), tanto CD4+
como CD8+ y sus propiedades funcionales evaluando las principales citoquinas secretadas por
stos. De igual manera es importante ensayar tanto la especificidad de estos linfocitos, basndose
en aspectos estructurales, como tambin detectar
clulas T precursoras en poblaciones que proliferan en respuesta a un antgeno. En todos los casos, la hiptesis diagnstica permite orientar la investigacin de laboratorio, as como los resultados del laboratorio deben ser interpretados a la
luz de los hallazgos clnicos.

3. ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE

CELULAR ESPECFICA
La evaluacin de la respuesta inmune celular especfica, requiere conocer tanto el nmero
de clulas como su capacidad funcional. De igual
manera, hoy es necesario conocer su capacidad

3.1. Estudio de las subpoblaciones de linfocitos

El estudio de la competencia celular debe comenzar por determinar los niveles de las clulas
que participan en esta respuesta. Por ello, el nmero y capacidad funcional de los leucocitos circulantes en sangre perifrica refleja el estado general de competencia inmune de un determinado
individuo. De esta manera en una variedad de situaciones clnicas, la evaluacin del nmero y funcin de linfocitos, granulocitos y monocitos han
comenzado a ser rutinarias tanto en el diagnstico
de diferentes patologas como en el monitoreo de
tratamientos con inmunosupresores o inmunorrestauradores.
Inicialmente, la determinacin en el laboratorio de linfocitos T y B, se realiz, mediante la
utilizacin de eritrocitos de cordero y la formacin de rosetas. Los linfocitos T poseen la capacidad de unirse a los eritrocitos de cordero, formando un complejo en el que estas clulas estn rodeadas de eritrocitos, de manera semejante a una
flor, denominada roseta E (eritrocito). La evaluacin de rosetas se realiza mediante lectura microscpica. De igual manera, linfocitos B, polimorfonucleares y macrfagos poseen receptores de
superficie para fragmentos Fc de IgG y para complemento. Por ello, en presencia de anticuerpos y
el factor C3b del complemento, forman las rosetas
EAC (eritrocito, anticuerpo-complemento), las
cuales son tambin evaluadas mediante microscopa ptica (figura 41-3).
3.1.1. Determinacin del fenotipo inmunolgico
mediante citometra de flujo
Figura 41-2. Separacin inmunomagntica de neutrfilos,
utilizando anticuerpo monoclonal CD16 unido a partculas
magnticas.

En los ltimos aos, el uso de las pruebas de

citometra de flujo (ver captulo 42) en la deter-

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Figura 41-3. Determinacin de linfocitos por formacin de Rosetas E y Rosetas EAC. La roseta E se produce por unin del
glbulo rojo al receptor CD2 del LT. La roseta EAC se produce por interconexin entre el receptor para C3b del LB y la unin de
C3B al fragmento Fc de IgG. Tambin pueden haber uniones de Fc al receptor que tiene LB humano.

antgenos CD45 y CD3, mientras que las

subpoblaciones de LT helper son reconocidos
por los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD4. Las
subpoblaciones de LT citotxicos y supresores se
definen con los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD8,
mientras que los linfocitos B presentan el marcador CD19. Por otro lado, las clulas NK, se definen por el fenotipo CD3-, CD16+ o CD56+. No
es posible identificar clulas NK mediante un nico antgeno, no obstante, el fenotipo CD3-/CD56+,
incluye la mayora de las clulas NK. Por ello se
requiere marcacin con dos fluorocromos, siendo
que existe un porcentaje de LT que son CD3+/
CD56+. En esta perspectiva, el uso de anti-CD3
marcado con fluorescena y anti-CD16 y antiCD56 marcados con otro fluorocromo (ficoeritrina
o texas red) es recomendable para determinar en
definitiva el fenotipo de las clulas NK.

minacin de las diferentes subpoblaciones de

linfocitos, se ha transformado en un importante
mtodo tanto en el diagnstico como en el pronstico de varias entidades clnicas, incluyendo
la evaluacin de las inmunodeficiencias y los desrdenes inmunolgicos.
La citometra de flujo, permite la enumeracin de diferentes tipos de linfocitos, los cuales
difieren en sus propiedades funcionales, su linaje
y su estado de maduracin. Entonces mediante esta
tcnica es posible determinar los diferentes tipos
de linfocitos mediante el uso de anticuerpos
monoclonales marcados con substancias
fluorescentes, que reconocen sus marcadores de
superficie (figura 41-4). Desde la invencin de
los anticuerpos monoclonales, miles de ellos han
sido generados contra determinantes de superficie de clulas hematopoyticas. Inicialmente, grupos de estos anticuerpos que demostraron propiedades semejantes en cuanto a su ligacin y distribucin tisular fueron designados como "clusters
differentiation" o antgenos CD (ver captulo 45).
La identificacin de estos CD en la superficie celular de los linfocitos, mediante anticuerpos
monoclonales, ha sido esencial en delinear los
componentes del sistema inmune. Estos
anticuerpos son ahora rutinariamente usados en
la identificacin, recuento y separacin de diferentes subpoblaciones de leucocitos y en la clasificacin de afecciones malignas de estos
leucocitos.
Los anticuerpos monoclonales usados para
reconocer LT totales estn dirigidos contra los

3.1.2. Determinacin de subpoblaciones de

linfocitos mediante inmunofluorescencia
La determinacin de subpoblaciones
linfocitarias, es tambin posible mediante
microscopa de fluorescencia utilizando
anticuerpos anti-CD, marcados con compuestos
fluorescentes. Para ello, luego de purificar los
linfocitos, se confecciona un frotis con las clulas
fijadas, las que se incuban con los respectivos
anticuerpos. Al microscopio, se cuentan a lo menos 250 clulas, determinando su fenotipo, mediante la marcacin del anticuerpo. Este mtodo
permite calcular el porcentaje de un determinado

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Figura 41-4. Identificacin de clulas natural killer mediante citometra de flujo. Para la identificacin, separacin y recuento de
estas clulas se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra sus antgenos marcadores de superficie CD16 y CD56. Uno de estos
anticuerpos est marcado con fluorescena y el otro con rodamina por lo que emiten fluorescencia en diferentes longitudes de onda.

fenotipo. Mediante un procedimiento un tanto ms

sofisticado, como es la microscopa confocal, es
tambin posible utilizar dos o tres diferentes
anticuerpos marcados con diferentes fluorocromos.

dad para as lograr una apropiada interpretacin

de los resultados, resulta importante evaluar estos
parmetros funcionales. La importancia del anlisis funcional resalta porque cada vez son ms
frecuentes sus aplicaciones en el diagnstico y
monitoreo de pacientes con sndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA), cncer, enfermedades autoinmunes y en casos de pacientes
que requieren trasplantes de rganos. De igual
manera, el uso de inmunomoduladores y MRBs
en estudios clnicos precisa de un monitoreo
confiable del sistema inmune por parte del laboratorio clnico. Entonces, hoy es posible medir un
amplio espectro de parmetros funcionales que in-

3.2. Estudio de las funciones de inmunidad celular especfica

Es aceptado que las caractersticas fenotpicas
de las clulas del sistema inmune no proveen informacin sobre su actividad. Por ello, aunque el
anlisis funcional es algo ms complejo por requerir experiencia y adecuados controles de cali-

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cluyen desde la activacin, proliferacin y productos de sntesis hasta la funcin de clulas efectoras.
Ms an, considerable progreso se ha obtenido en
la separacin y aislamiento de varias subpoblaciones de clulas del sistema inmune. Sin embargo, no slo los ensayos funcionales pueden ser de
utilidad sino que tambin los estudios estructurales
y la deteccin de clulas T precursoras.
As, con un arsenal considerable de ensayos
de laboratorio y opciones de evaluar diferentes funciones, la eleccin de las pruebas ms apropiadas
permitir al inmunlogo clnico disponer de la
informacin que permita conocer el estado de la
respuesta inmune celular del paciente.

terapias inmunomoduladoras y para detectar la

memoria inmunolgica frente a diferentes
antgenos como: derivado de protena purificada
(PPD), streptoquinasa, Candida, tetanus y difteria.
Ciertos desrdenes inmunolgicos como
Lupus eritematoso sistmico se manifiestan con
mltiples disfunciones de clulas T. Por ello, cuantificar la activacin de clulas T es tambin til
para monitorear el efecto de las terapias
inmunomoduladoras.
Interpretacin de los datos. La capacidad de
linfocitos para proliferar, in vitro, en respuesta a
lectinas mitognicas como fitohemaglutinina
(FHA) y concanavalina A (Con A), es el mtodo
ms comn para evaluar la inmunidad mediada
por clulas. La proliferacin celular es ensayada
72 horas despus, evaluando la incorporacin de
3
H timidina en el DNA recientemente sintetizado
por la clula T. Mtodos de ms reciente aplicacin permiten evaluar eventos tempranos del proceso de activacin, tales como la elevacin de calcio intracelular, la activacin de protena quinasa
C (PKC) o eventos que ocurren en las primeras
24 h, tales como la sntesis de IL-2 y la expresin
de su receptor IL-2R. Estos ltimos son los
abordajes ms directos y presentan varias ventajas tcnicas, como el hecho de requerir un pequeo nmero de clulas mononucleares de sangre
perifrica (CMSP), no necesitan enriquecer los
linfocitos T de CMSP, su ejecucin requiere menos tiempo y realizada en serie resulta de ms bajo
costo. Desde este punto de vista resulta apropiado
evaluar la sntesis de IL-2 y su receptor, IL-2R, ya
que la sntesis de stos muestra adems que las
vas en que participa fosfoinositol/Ca++ y PKC,
estn intactas.
La IL-2 es evaluada en sobrenadantes de cultivo de CMSP, luego de la estimulacin con
mitgenos por 24 h. La cantidad de IL-2 producida por CMSP normales en cultivo, depende del
estmulo, las condiciones de cultivo y del mtodo
empleado en su cuantificacin. La activacin de
clulas T puede ser inducida utilizando diferentes
agonistas tales como lectinas, anticuerpos anti-receptor, ionforos y forbol steres. Lectinas como
FHA y Con A pueden adicionarse directamente a
los cultivos de CMSP. En presencia de monocitos
que secretan IL-1, las clulas T producirn IL-2 y
desarrollarn una enrgica respuesta proliferativa
con "peak" a las 72 h. Las ventajas de usar
mitgenos son su estabilidad, bajo costo y fcil

3.2.1. Activacin de Linfocitos T

La activacin de linfocitos T es un proceso
caracterizado por una compleja cascada de eventos bioqumicos y moleculares, cuyo resultado final es la produccin de citoquinas, la expresin
de receptores, la proliferacin y en algunas clulas la expresin de citotoxicidad. En condiciones
fisiolgicas, este fenmeno se inicia con la presentacin antignica en el contexto de molculas
del Complejo Principal de Histocompatibilidad
(MHC) clase I o II e involucra complejos mecanismos de sealizacin con participacin de
quinasas, fosfatasas y segundos mensajeros (ver
captulo 10).
Indicaciones clnicas. La activacin de clulas T,
debe evaluarse frente a la sospecha de desrdenes
inmunolgicos congnitos o adquiridos. Dentro de
stos se incluyen la inmunodeficiencia combinada
severa (falla en el desarrollo de clulas B y T), el
sndrome de Di George (falla en el desarrollo del
timo), sndrome de Wiskott-Aldrich, sndrome de
Chediak-Higashi (inmunodeficiencia por ataxia
telangiectasia con albinismo parcial), inmunodeficiencias variables comunes y frente a infecciones recurrentes por virus, parsitos y hongos.
Las disfunciones de clulas T, predisponen a
infecciones virales por Herpes simplex, Varicellazoster y Cytomegalovirus. De igual manera la
candidiasis mucocutnea recurrente es frecuentemente asociada con disfuncin de clulas T. Dentro de las infecciones por protozoos, Pneumocystis
carinii y Toxoplasma gondii a menudo complican
el curso de pacientes con SIDA, en los cuales la
subpoblacin de linfocitos CD4+ es deficiente.
La activacin de clulas T, tambin puede
monitorearse, para evaluar el tratamiento mediante

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yen interacciones de membrana con citoesqueleto,

influjos de Ca2+, activacin de fosfolipasa C, liberacin de Ca2+ inducida por inositol-trifosfato y
activacin de genes (ver captulo 10). Las seales
de transmembrana causan cambios significativos
en el linfocito como ser la redistribucin de receptores, secrecin de citoquinas y anticuerpos, movilidad celular, reconocimiento entre clulas o iniciacin de la proliferacin celular. Entonces, la capacidad de un linfocito para responder a un ligando, es utilizada tanto en investigacin bsica como
clnica, evaluando la proliferacin. Como ya se
describi, diferentes lectinas, anticuerpos y compuestos qumicos pueden estimular la proliferacin
de linfocitos. La respuesta proliferativa puede entonces ser evaluada en cultivos de sangre total, o
en clulas mononucleares aisladas y en diferentes
subpoblaciones de linfocitos. No obstante, debe
considerarse que en muchos casos se requiere ms
de un tipo celular para responder a un determinado
ligando. Frecuentemente, adems de las clulas T,
se requiere la participacin de clulas accesorias
que expresen asociadas a su membrana molculas
MHC clase II, como monocitos y macrfagos.
De manera sucinta, un ensayo de proliferacin debera medir el nmero de clulas sobrevivientes y aquellas generadas como consecuencia
del estmulo. Esto comnmente se evala de manera indirecta por medio de la incorporacin de
un nucletido radiactivo (3H-timidina) en el DNA
sintetizado (figura 41-5).

uso. Agonistas especficos como anticuerpos

monoclonales contra el receptor CD3 pueden usarse para activar clulas T y permiten evaluar la capacidad del receptor para iniciar la traduccin de
seales por la va fosfoinositol/Ca++/PKC.
Una disminucin en la produccin de IL-2
es asociada con una disminucin en la expresin
de IL-2R. La disminucin en la sntesis de IL-2 y
en la expresin de IL-2R sugiere un defecto en la
va fosfatidilinositol/Ca2+/PKC. Entonces para determinar si esta va de sealizacin no es funcional, la medicin de Ca2+ y de la actividad de PKC
pueden ser de utilidad. La determinacin de Ca2+
en clulas T puede realizarse usando algunos
indicadores fluorescentes como Fura 2 o Quin 2.
Por otro lado los ensayos para PKC son sensibles
y especficos, no obstante requieren poblaciones
enriquecidas en clulas T. En este tipo de ensayo
las clulas T deben ser activadas por un agonista,
para luego preparar un extracto celular en el cual
se evala la incorporacin de P 32ATP en un
substrato peptdico sinttico o en histonas. Es claro que ambos ensayos requieren personal entrenado y algunas condiciones del laboratorio por lo
que no se realizan de manera rutinaria.
3.2.2. Estudio de proliferacin de linfocitos
El reconocimiento entre receptores de superficie de linfocitos y determinados ligandos, inicia
una cascada de seales intracelulares que inclu-

Figura 41-5. Estudio de la proliferacin de linfocitos T, mediante la incorporacin de 3H-timidina al ADN. Se miden las
cuentas por minuto (cpm) incorporadas al DNA de los linfocitos T que proliferan luego del estmulo mitognico.

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Indicaciones clnicas. Parece claro que los ensayos de proliferacin o blastognesis poseen amplias aplicaciones clnicas. El ensayo es utilizado
para estudiar alteraciones derivadas de
inmunodeficiencias congnitas, as como tambin
aquellas secundarias derivadas de enfermedades
infecciosas, cncer, desnutricin, cirugas y enfermedades autoinmunes. Dentro de las inmunodeficiencias congnitas se incluye la inmunodeficiencia combinada severa, caracterizada por una
marcada deficiencia en las funciones de clulas B
y T (ver captulo 29). Entonces la utilidad clnica
de este ensayo radica en proveer informacin de
la capacidad funcional de linfocitos de sangre
perifrica. Esta informacin es de valor para conocer el estado del sistema inmune del paciente y
como indicador del progreso de una terapia.
La aparicin del SIDA, atrajo nuevamente la
atencin a la investigacin clnica de las
inmunodeficiencias y reafirm la importancia de
las determinaciones in vitro de las funciones de
la inmunidad celular. Por ejemplo, una disminucin en la respuesta proliferativa a Phytolacca
americana (una lectina que acta como
estimulador de clulas B y T) o frente a algunos
antgenos de memoria tales como Cndida
albicans o toxoide tetnico, tiene valor pronstico, por ser la capacidad de proliferar un indicador
precoz del deterioro de la funcin inmune en personas infectadas con el virus de la
inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1), en perodos de la infeccin en que los niveles de CD4+
estn an dentro de lmites normales.
De igual manera, el ensayo de proliferacin
puede ser utilizado para definir otras inmunodeficiencias adquiridas, como el sndrome de fatiga
crnica (SFC), que frecuentemente se acompaa
con reactivacin frente a virus de alta prevalencia
como Epstein-Barr o virus Herpes. Por ejemplo,
la respuesta proliferativa a PWM estuvo bajo la
media de los controles normales en el 95% de pacientes con SFC. De igual manera, la habilidad de
linfocitos estimulados con mitgenos a producir
IFN, generalmente se puede correlacionar con respuesta proliferativa.
Los antgenos de potencial uso en clnica son
numerosos y deben ser escogidos con cuidado de
acuerdo al problema a investigar. Para evaluar respuesta frente a antgenos en los cuales altos porcentajes de la poblacin estn expuestos, (marcadores generales de inmunocompetencia celular),
Cndida albicans y toxoide tetnico deberan utilizarse.

La reaccin mixta de linfocitos (RML) es

una respuesta proliferativa a dos poblaciones de
clulas T alognicas cultivadas en conjunto. En
otras palabras, se usa para conocer la reactividad
de la poblacin de linfocitos de un paciente frente
a las clulas de otro individuo. El principal estmulo en este tipo de reacciones son los antgenos
del MHC, presentados en la membrana de los
linfocitos T. Esta es sin duda la tcnica de ms
amplio uso para estudiar la respuesta
inmunolgica de los linfocitos. En esta reaccin
se verifican tres eventos principales: sntesis de
macromolculas, transformacin blstica y proliferacin. Las clulas respondedoras en RML son
principalmente linfocitos CD4+. stas reconocen molculas de MHC clase II por lo que
antgenos de Clase II son sus principales
estimuladores. Adems de poder determinar los
niveles de la respuesta de linfocitos, esta reaccin sirve para demostrar la compatibilidad de
MHC. Se conoce dos tipos de RML, la
unidireccional y la bidireccional. En la
unidireccional, una poblacin celular sirve como
antgeno (tambin conocidas como clulas
estimuladoras) y es usada slo despus de la
inhibicin de su propia proliferacin. Entonces
slo se determina la respuesta proliferativa de la
segunda poblacin celular (tambin llamadas clulas respondedoras). En la RML bidireccional
la respuesta proliferativa de ambas poblaciones
celulares es evaluada ya que ninguna poblacin
celular es inhibida en su divisin. Si existe reconocimiento o reactividad de los linfocitos habr
proliferacin e incorporacin de 3H-timidina (figura 41-6).
Esta reaccin ha sido usada para evaluar los
defectos de la respuesta inmune. No obstante, su
aplicacin ms importante es en el rea de
tipificacin de tejidos y trasplante de rganos y
clulas.
Interpretacin, rangos normales y control de
calidad. La utilidad clnica del ensayo de proliferacin depende de la habilidad del inmunlogo
clnico para interpretar de manera adecuada los
resultados. Esto requiere conocer de manera
exacta la respuesta a esperar en individuos
inmunocompetentes, para poseer los adecuados
controles. Esto implica, adems, que cada laboratorio debiera poseer sus propios rangos de valores normales para la respuesta a cada
inmungeno, tomando en consideracin aspectos como edad, sexo y grupo tnico.

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Figura 41-6. Cultivo mixto de linfocitos. Las clulas no respondedoras (irradiadas) presentan sus antgenos de superficie a las
clulas respondedoras, que como respuesta entran a divisin celular e incorporan 3H-timidina en el DNA.

3.2.3. Estudio de la citotoxicidad celular

presar diferentes tipos de estructuras de reconocimiento y mediar ms de un tipo de citotoxicidad.

Las clulas citolticas efectoras humanas comprenden diferentes tipos celulares los cuales dependiendo de su microambiente difieren en nmero,
estado de activacin y en el mecanismo utilizado
en reconocimiento y muerte de la clula blanco.
Luego del reconocimiento y el contacto de superficie, la clula citoltica efectora activa una cascada
de seales, desencadenando una accin irreversible y letal hacia la clula blanco. La clula efectora,
generalmente puede asociarse a nuevas clulas blanco en dos o tres ocasiones sin necesitar de reactivar
su cascada de seales. En el captulo 19 se describen los diferentes mecanismos de citotoxicidad que
presenta los LTc y clulas NK.

La citotoxicidad celular es una de las funciones ms importantes de esta rama de la respuesta

inmune. La citotoxicidad se entiende como la capacidad de una clula de atacar o ser txica para
otra clula blanco. Esta propiedad la poseen los
LT citotxicos (LTc), las clulas NK y aquellos
tipos celulares que participan de fenmenos de
citotoxicidad dependientes de anticuerpos
(ADCC) (ver captulo 19).
De manera general las clulas citolticas
efectoras se pueden dividir en dos grupos: aquellas
que requieren sensibilizacin previa con un antgeno
y reconocen en el contexto de molculas de HLA y
aquellas que no requieren sensibilizacin previa,
ya que poseen reactividad espontnea, su respuesta
no est restringida a HLA y son activadas por
citoquinas. La mayor parte de las clulas T CD8- y
CD4-, no actan restringidas a HLA, pero las
subpoblaciones (tanto CD4+ como CD8+) pueden
ser restringidas a HLA. De igual manera las clulas T L/B (clulas TCR2+) pueden mediar ambos
tipos de citotoxicidad, donde la expresin de la
molcula CD56 permite separar ambas
subpoblaciones. La restriccin de HLA parece ser
ms bien relativa que una propiedad constante de
los linfocitos T citolticos. Esto podra depender de
la naturaleza y presentacin del antgeno, implicando que una clula efectora tiene potencial para ex-

Significancia clnica e interpretacin de los resultados. La evaluacin de las funciones citolticas

provee una medida eficaz para evaluar la eficiencia de las diferentes subpoblaciones celulares en
estados de salud y de prdida de ella.
Estos ensayos constituyen una parte sustancial de la evaluacin clnica de pacientes
inmunocompetentes. Las clulas citolticas
efectoras parecen jugar un importante papel en una
variedad de enfermedades del hombre. Por un lado,
una funcin citotxica ausente o disminuida, al
anlisis in vitro de clulas citolticas, se observa
en pacientes con inmunodeficiencias como SIDA,

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intracelulares, en trasplante de rganos y en el control de neoplasias. La actividad antiviral puede ser

detectada directamente en CMSP, slo en perodos
relativamente cortos en la infeccin aguda. Esta respuesta de LTc, se desarrolla dentro de pocas semanas luego de la infeccin viral. Despus de la resolucin de la infeccin aguda, la respuesta de LTc slo
puede detectarse por estimulacin in vitro de CMSP,
cultivando estas clulas durante varios das en presencia del antgeno viral especfico. La CMSP de
dadores normales generalmente contienen cantidades suficientes de clulas presentadoras de antgeno
(monocitos) y clulas ayudadoras (linfocitos T
CD4+) para estimular esta respuesta de LTc de memoria. No obstante citoquinas exgenas como IL-2
y IL-6, pueden adicionarse al cultivo para aumentar
la diferenciacin de LTc precursoras en clulas killer
funcionales. Una excepcin la constituyen los pacientes con SIDA quienes parecen mantener niveles
detectables de clulas circulantes maduras con
fenotipo CD8+ especfico para HIV.
Todas las otras respuestas por LTc pueden ser
evaluadas por medio de una estimulacin in vitro
de las clulas T de memoria mediante incubacin
de CMSP con antgenos relevantes, para as inducir una activacin in vitro y una expansin clonal
de las clulas T reactivas al antgeno. Por ello una
falla en la respuesta para generar respuesta por
LTc in vitro, podra ser indicativo de: a) ausencia
de clula T de memoria; b) falla en las clulas T
de memoria para activarse, proliferar o diferenciarse en respuesta al antgeno; c) fallas en la presentacin del antgeno por parte de las clulas presentadoras de antgeno; d) incapacidad para inducir la muerte de la clula blanco.
Los nuevos abordajes teraputicos como trasplante de mdula sea, transferencia pasiva de
clulas y terapia con citoquinas, estn tornando
cada vez ms importante identificar la causa de la
deficiencia de la respuesta por LTc de manera tan
precisa como sea posible. Debe quedar claro que
una clula citoltica puede ser capaz de reconocer
y matar a una clula blanco por ms de un mecanismo. Entonces la activacin in vitro de LTc puede ser capaz de matar tanto de manera especfica
y restricta a HLA como de manera no restricta a
HLA y semejante a como matan las clulas NK.
Por ello la interpretacin de los ensayos de LTc es
a menudo difcil y requiere una cuidadosa consideracin de la historia clnica del paciente, su estado clnico actual y la interpretacin de los
parmetros de laboratorio en el contexto de los
valores normales establecidos por el laboratorio.

en pacientes con cncer, en infecciones crnicas

por virus y hongos y en ciertas enfermedades
autoinmunes. Por otro lado, la activacin de la
funcin citoltica se observa en pacientes
inmunodeficientes que reciben una terapia exitosa,
en pacientes que se recuperan de infecciones
virales y en personas con cncer que responden a
la terapia. Las clulas citolticas participan en el
rechazo a trasplantes (entre ellos los de mdula
sea), eliminacin de clulas anormales y en numerosos procesos patolgicos.
Ensayos en sangre humana. Los estudios clnicos a menudo requieren monitorear la actividad de
clulas NK. Sin embargo, en algunos pacientes incluyendo nios la cantidad de sangre disponible es
escasa. Por ello, ha sido necesario desarrollar protocolos sensibles que usen pequeos volmenes de
sangre total evitando procesos de purificacin. Estos protocolos han proporcionado resultados comparables con los procedimientos tradicionales.
3.2.4. Linfocitos T citolticos
Las clulas T LB+ (TCR2+), que incluyen
aquellas clulas que participan en la respuesta
citoltica restringida por HLA, son la principal
poblacin circulante de clulas T. Una poblacin
significativamente menor, aunque importante, corresponde a los linfocitos T g/d+, los cuales pueden
mediar reacciones citolticas no restringidas por
HLA, o semejantes a NK, despus de cultivarse en
presencia de IL-2, pero podran tambin mostrar
lisis por antgenos que son restringidos por molculas de HLA clase semejante a I. Las clulas LB
TCR2+, de linfocitos citotxicos reconocen segmentos relativamente cortos, de 10-20 aminocidos,
que asociados a molculas de HLA se exponen en
la superficie de la clula. Por ello la susceptibilidad
de una determinada clula blanco al ataque de una
determinada clula citotxica, depende primariamente del tipo de va de procesamiento del antgeno
en la clula blanco. As, antgenos que son
endgenamente procesados y asociados en la superficie celular con molculas de clase I, son reconocidos por LTc, CD8+. Por otro lado, antgenos
procesados por medio de proteasas endosomales se
asocian con molculas de HLA clase II y son reconocidos por LTc, CD4+. Es claro que bajo ciertas
circunstancias, ambos procesamientos pueden ocurrir en la misma clula blanco.
Los LTc, son importantes en la inmunidad del
husped a infecciones por virus y otros patgenos

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est significativamente asociada con el desarrollo

de metstasis a distancia. Las clulas NK responden rpidamente a MRB, aumentando la
citotoxicidad, por lo que esta propiedad puede ser
utilizada como un sensible indicador en estudios
in vitro destinados a evaluar la capacidad de las
clulas del paciente en responder frente a la activacin de un determinado agente teraputico. De

Los mtodos que evalan citotoxicidad son

comunes a todas las clulas involucradas en este
tipo de reacciones y se basan en la marcacin previa de las clulas blanco con 51C. Las clulas blanco marcadas son incubadas con las clulas
efectoras citolticas y el 51Cr, liberado por las clulas y presente en el sobrenadante, es un ndice
de la actividad citoltica (figura 41-7).

Figura 41-7. Medicin de la citotoxicidad mediada por clulas. Clulas blanco marcadas con 51 Cr, son incubadas con clulas
efectoras (LT, clulas NK) HLA idnticas; luego la lisis de las clulas blanco se detecta cuantificando el 51Cr liberado.

3.2.5. Clulas NK

igual manera el monitoreo seriado de la actividad

de clulas NK puede ser usado para demostrar
cambios en el estado de activacin de clulas inmunes circulantes durante la terapia con MRB.
El papel de clulas NK como primera lnea
de defensa frente a las infecciones es conocido.
Por ende en pacientes inmunocomprometidos, hay
una estrecha correlacin entre actividad NK y la
presencia de infecciones severas. En el trasplante
de mdula sea, clulas NK parecen ser las primeras en re-colonizar la mdula, por lo que estas
clulas pueden ser importantes para su instalacin
exitosa y control de las infecciones virales
postrasplante. Anormalidades en la respuesta NK
pueden encontrarse tambin en enfermedades
autoinmunes. Por todo lo anterior, la evaluacin
seriada de la actividad NK es necesaria para conocer el estado de la respuesta inmune frente a
varias enfermedades.

Las clulas NK circulantes, representan entre el 10-15% de las CMSP y son capaces de inducir la lisis espontnea de clulas blanco neoplsicas
o infectadas por patgenos intracelulares, sin una
necesaria sensibilizacin y sin restriccin de HLA.
Evidencias recientes muestran que clulas NK
pueden ser activadas para producir citoquinas tales como TNF_, ` e IFNa, factor estimulador de
colonias de granulocitos y macrfagos, IL-3 y probablemente otros factores necesarios para el desarrollo clulas hematopoyticas. Las clulas NK
parecen ser importantes y activos componentes de
varios procesos patolgicos en el ser humano. Por
ello la medicin de la actividad de clulas NK circulantes o en tejidos parece necesaria para definir la contribucin de estas clulas al proceso patolgico. Por ejemplo en cncer, una baja actividad de clulas NK tiene un valor predictivo en el
progreso del tumor, la respuesta pobre al tratamiento y la disminucin en el tiempo de sobrevida sin
metstasis. Una baja en la actividad NK tambin
puede significar un factor de riesgo en la instalacin de procesos malignos. De igual manera, una
baja actividad de NK en la sangre de pacientes

3.2.6. La reaccin de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos

Los ensayos de ADCC pueden ser clnicamente tiles para valorar la inmunocompetencia
de subpoblaciones de clulas efectoras caracteri-

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3.2.7. Clulas killer activadas por linfoquinas

zadas por la presencia del receptor FcaRII y

FcaRIII. En el hombre, las clulas NK CD3CD56+ CD16+ y una pequea fraccin de clulas
T CD3+ CD16+ participan en ADCC. As, en
pacientes con varias enfermedades y especialmente en pacientes con cncer que han sido tratados
con MRB, estas pequeas subpoblaciones pueden
expandirse in vivo y ser responsables por una fuerte respuesta antitumoral y antiviral. Siendo que
las actividades NK y ADCC parecen ser mediadas por diferentes subpoblaciones de CMSP (CD3CD56+CD16- versus CD3- CD56+CD16+ y
CD3+CD56+CD16+, respectivamente), podra ser
necesario monitorear todas ellas en estados de enfermedad. De igual manera, se sabe que estos dos
tipos de citotoxicidad parecen participar en momentos diferentes de una determinada enfermedad. Las clulas NK son la primera lnea de defensa mientras que las reacciones de ADCC asumen un papel importante una vez que las IgG dirigidas contra un patgeno o clula blanco han sido
sintetizadas y se encuentran en la circulacin (figura 41-8).
Otra de las principales aplicaciones de
ADCC es la evaluacin de la reactividad de
anticuerpos contra aloantgenos, clulas
tumorales y virus. La ADCC puede utilizarse para
estudiar el suero de pacientes que recibirn un
injerto o estn desarrollando un rechazo a injerto, en pacientes con cncer que estn siendo tratados con anticuerpos monoclonales dirigidos
contra el tumor y en pacientes con infecciones
virales. Entonces ADCC entrega importante informacin acerca de la funcin de la
citotoxicidad mediada por clulas en dichos pacientes durante la enfermedad.

El ensayo de clulas killer activadas por

linfoquinas (LAK) es frecuentemente usado para
monitorear la respuesta a la terapia en pacientes
tratados con citoquinas u otros MRBs. Clulas
efectoras activadas in vivo pueden ser capaces de
matar clulas blanco resistentes a NK. As, CMSP
no son capaces de matar tales clulas en ensayos
de 4 h que miden liberacin de 51Cr, mientras que
algunos linfocitos residentes en tejidos pueden
tener una actividad LAK espontnea. Entonces,
la evaluacin de la actividad LAK en CMSP frescas es una medida de la activacin in vivo de clulas efectoras. Por ello el ensayo de la actividad
de clulas LAK, realizado antes y despus de la
activacin in vitro de CMSP con IL-2 u otra
citoquina es una medida de la capacidad de clulas NK y T para activarse y expresar sus funciones efectoras.
3.2.8. Citotoxicidad por macrfagos
En el ensayo para evaluar la competencia de
monocitos para destruir clulas blanco, el tipo de
clula blanco puede indicar el tipo de mecanismo
involucrado en la destruccin in vitro. Alteraciones de la funcin de monocitos se presentan en
algunas inmunodeficiencias o pueden ser secundarias a episodios infecciosos, as como tambin
en procesos malignos y enfermedades autoinmunes y pueden en general acompaarse de
inmunosupresin. Generalmente otros ensayos son
ms comunes para evaluar la capacidad funcional
de monocitos, no obstante la evaluacin de la
citotoxicidad es una funcin especializada que

Figura 41-8. Reaccin de citotoxicidad mediada por clulas dependiente de anticuerpos. Clulas blanco incubadas en presencia de anticuerpos IgG, son reconocidas por clulas efectoras NK que expresan receptores del tipo FcaRII y FcaRIII. Como
resultado final, la clula recubierta de anticuerpos es lisada.

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podra ser importante en pacientes con cncer y

en aquellos que padecen de enfermedades infecciosas. El ensayo de la citotoxicidad de monocitos
debe ser usado en conjunto con otras pruebas funcionales, para evaluar la regulacin positiva o negativa de la funcin de monocitos luego del tratamiento in vivo o in vitro con MRBs.

acridina tie de verde el DNA y de naranja el

RNA, ya que este colorante no intercala RNA. Las
clulas muertas son teidas con bromuro de etidio
y se ven naranjas, mientras que las clulas vivas
excluyen este colorante.
c) Cuantificacin de la fragmentacin del DNA.
Estas tcnicas se basan en el hecho que DNA fragmentado no sedimenta junto con el cromosoma
ntegro cuando es centrifugado. Siendo que esta
tcnica es complicada sin ventajas comparativas
sobre las otras tcnicas ya descritas, se recomienda slo para evaluar poblaciones celulares que no
puedan ser fcilmente marcadas en su DNA, como
por ejemplo los linfocitos en reposo.

3.2.9. Nuevos mtodos de evaluacin de la actividad citotxica

a) Ensayos de fragmentacin de DNA. Diferentes observaciones muestran que las clulas sujetas a ataque de linfocitos citotxicos presentan
cambios morfolgicos semejantes a los observados en clulas que desarrollan muerte celular programada, tambin llamada apoptosis. Este proceso es acompaado por prdida de la integridad de
la membrana celular, lo cual la hace ms simple
de cuantificar.
Los mecanismos de esa muerte celular estn
basados en la induccin de fragmentacin del DNA
de la clula blanco, hecho que ocurre pocos minutos luego del contacto con la clula citotxica.
El grado de solubilizacin del DNA depende de la
naturaleza de la clula blanco. Esta afirmacin se
basa en la observacin de que las clulas
citotxicas inducen el mismo tipo de dao en el
envoltorio nuclear de todas las clulas, sin embargo estos daos llevan a la desintegracin celular
slo en algunas clulas. No obstante, evidencias
posteriores no mostraron que el envoltorio nuclear
resulte daado por los LTc en clulas que no desarrollan desintegracin celular.
La verificacin de la fragmentacin del DNA,
requiere de electroforesis en geles de agarosa para
demostrar el clsico patrn en escala. Para cuantificar la fragmentacin del DNA, es necesario evaluar la fraccin soluble. El principio de esta tcnica se basa en que el DNA de doble hebra que ha
sufrido un extensivo dao se mantiene soluble,
mientras que el DNA intacto permanece insoluble. Recientemente el uso de 3H-timidina en vez
de 125I-UdR ha sido propuesto por poseer ventajas
como ser menos txica para el propio DNA.

d) Ensayo de prdida de adhesin de clulas

blanco. Esta tcnica tiene por objetivo evaluar las
consecuencias funcionales resultantes de la
interaccin tumor-clulas T. Por ello la medicin
de la prdida de la adhesin de las clulas
tumorales permite evaluar adems la actividad
ltica de esas clulas T.
e) Aislamiento de grnulos citoplasmticos. El
estudio de grnulos citoplasmticos aislados y
purificados entrega conocimientos ms profundos
acerca de los mecanismos de citotoxicidad celular, ms all de la simple observacin in vitro de
la actividad citotxica.
f) Ensayo de esterasa. Las serino esterasas estn
dentro de las numerosas molculas biolgicas que
participan en los mecanismos de toxicidad celular. El ensayo es simple y confiable y se basa en la
medicin de las esterasas liberadas durante las
reacciones de citotoxicidad en que participan LTc.
Los linfocitos citotxicos pueden ser activados por
diferentes mecanismos como anticuerpos
monoclonales que semejan el efecto de clulas
blanco portadoras de antgeno, por combinacin
de ionforos de calcio y proteno quinasa C (o
forbol ster) o de manera tradicional incubndolos con clulas blanco.
3.3. Estudio de la sntesis de citoquinas y sus
receptores

b) Cuantificacin de apoptosis usando colorantes fluorescentes. El uso de compuestos

fluorescentes que se asocian a DNA es una tcnica simple que nos permite determinar el porcentaje de clulas que estn en proceso apopttico.
La combinacin de bromuro de etidio y naranja
de acridina es ampliamente utilizada. Naranja de

Las citoquinas son glicoprotenas solubles

que desempean funciones reguladoras. Son sintetizadas y secretadas por diferentes clulas, siendo capaces de estimular clulas del sistema
inmunolgico para inducir cambios en su funcin,

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activacin y expresin gnica (ver captulo 11).

Las citoquinas son producidas como resultado de
la activacin celular y se caracterizan porque su
sntesis y secrecin es breve y autolimitada. Por
ello, la evaluacin de ellas en muestras biolgicas puede ser utilizada para monitorear tanto la
respuesta inmunolgica como inflamatoria,
correlacionndose con el estado de activacin de
la respuesta inmune celular.
De igual manera, es conocido que los
linfocitos T helper, pueden subdividirse en dos
subpoblaciones, llamadas Th1 y Th2, las que se
pueden caracterizar por el patrn de secrecin de
citoquinas. El predominio de una determinada
subpoblacin de LT en el hombre, ha sido asociada a la patognesis en algunos desrdenes como
el asma, las enfermedades alrgicas, enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso y artritis reactiva, as como tambin en la resistencia
a enfermedades infecciosas y parasitarias. Por ello
la determinacin de los patrones de citoquinas
secretadas por linfocitos humanos es cada vez de
mayor relevancia.
Aunque las citoquinas pueden ser directamente evaluadas por medio de ensayos biolgicos (evaluando su funcin biolgica sobre clulas
blanco) o por medio de enzima inmunoanlisis
(ELISA) (ver captulo 39), estos mtodos poseen
algunas limitaciones. La primera, se refiere al tipo
de muestra disponible. El ensayo de actividad de
citoquinas es apropiado para muestras lquidas,
tales sobrenadantes de cultivo o fluidos biolgicos, pero no es factible de realizarse en muestras
de tejido slido. El segundo aspecto a considerar
es que la cantidad de citoquina en un determinado
fluido representa un remanente de la cantidad de
citoquina producida con respecto a la utilizada o
degradada. As, los valores de citoquinas como
IL-2 e IL-4 en sobrenadantes de cultivo conteniendo anticuerpos anti-IL-2R o IL-4R que bloquean
su utilizacin, son considerablemente ms altos
que en mediciones realizadas en cultivos en ausencia de estos anticuerpos, sugiriendo que las
concentraciones de citoquinas producidas son generalmente mucho ms altas que lo que las mediciones tradicionales suelen indicar. Entonces, bajo
estas circunstancias la medicin en sobrenadantes
o en fluidos biolgicos, no siempre podra entregar resultados representativos de los reales niveles de sntesis de una determinada citoquina cuando mtodos basados en la captura y posterior identificacin mediante ensayos tipo ELISA son utilizados.

Aunque los mtodos que cuantifican el

mRNA especfico para cada citoquina, resultan
algo ms complejos y demandan ms trabajo, se
han empleado para evitar los problemas derivados de los mtodos basados en la evaluacin de la
protena o de su actividad. La ventaja de este tipo
de ensayos radica en que permiten el anlisis de
la expresin de una citoquina particular o un grupo de citoquinas en un tejido definido, rgano o
grupo de clulas en un perodo de tiempo determinado. Ms an, la alta sensibilidad de estas tcnicas permiten estudiar la expresin de citoquinas
en un pequeo nmero de clulas, lo que resulta
imposible si se utilizan otros ensayos. Varios mtodos han sido propuestos para cuantificar mRNA
de citoquinas. Dentro de los ms usados estn el
Northern blotting, ensayo de proteccin para
ribonucleasa y la reaccin de polimerasa en cadena- transcriptasa reversa (RT-PCR). Estos mtodos, requieren como primer paso del aislamiento
del RNA, previo a evaluar la expresin gnica de
las citoquinas o su receptor. Por ello, errores en
este procedimiento de aislamiento llevan a menudo a errores en los resultados y en la
reproductibilidad del mtodo. Se debe considerar
de manera especial que el RNA aislado es inestable y sensible a la degradacin por ribonucleasas
presentes tanto en la muestra original como en el
material donde se realiza la extraccin. Por ello,
para obtener una buena preparacin de ARN se
debe minimizar la actividad de ribonucleasas durante la lisis de clulas o tejidos, evitando introducir trazas de ribonucleasas en soluciones o material de vidrio. Para evitar en parte este problema, el material debe ser autoclavado, se deben usar
guantes durante todas las fases de la extraccin y
agua tratada con dietilpirocarbonato, que es una
substancia inhibidora de ribonucleasa. De igual
manera, el uso exclusivo de material para la extraccin de RNA es fuertemente recomendado.
Los procedimientos de extraccin de RNA,
utilizan la mezcla de isotiocianato de guanidina y
cloroformo ms agentes reductores como 2mercaptoetanol, los cuales desintegran las estructuras celulares, disocian las nucleoprotenas y al
mismo tiempo inactivan las ribonucleasas
endgenas.
De esta manera, a partir del RNA aislado, se
puede purificar el mRNA mediante cromatografa
de afinidad en columna de oligo(dT) celulosa, para
investigar la expresin de un determinado receptor. No obstante, la mayora de los mtodos utilizados para este propsito, los cuales se describen

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Estos partidores especficos para cada citoquina, permiten su amplificacin a partir de pequeas cantidades del cDNA generado. Los productos de la PCR
pueden ser fcilmente detectados por medio de varias tcnicas como la electroforesis en geles de
agarosa, los cuales son teidos con bromuro de etidio,
el Southern blotting seguido de hibridizacin con
sondas marcadas con 32P o mediante tcnicas
colorimtricas que usan sondas marcadas con substancias fluorescentes. La sensibilidad de estas
metodologas de RT-PCR hacen de ellas mtodos de
eleccin para la deteccin de RNA especfico, especialmente cuando se trabaja con pocas cantidades de
clulas o con RNA, que normalmente son expresados en pequeas cantidades.

a continuacin, no requieren de este paso de purificacin.

3.3.1. Reaccin de polimerasa en cadenatranscriptasa reversa (RT-PCR)
Luego de la descripcin original de esta tcnica orientada a amplificar pequeas cantidades de
DNA, el mtodo fue adaptado para la deteccin de
RNA, incluyendo un paso inicial que utiliza
transcriptasa reversa en el cual el cDNA es sintetizado para ser usado como molde en la amplificacin
posterior (ver captulo 44). La PCR usa partidores
especficos, ya definidos para la mayora de las
citoquinas tanto humanas como murinas (tabla 41-1).

Tabla 41-1. Secuencias de partidores para la deteccin de algunas citoquinas humanas mediante
reaccin de polimerasa en cadena
Citoquina

Partidores

IL-1B

S5-TACGAATCTCCGACCACCACTACAG-3
A5-TGGAGGTGGAGAGCTTTCAGTTCATATG-3

IL-2

S5-ACTCACCAGGATGCTCACAT-3
A5-AGGTAATCCATCTGTTCAGA-3

IL-4

S5-CCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCC-3
A5-CCAACGTACTCTGGTTGGCTTCCTTCA-3

IL-6

S5-AGCTCAGCTATGAACTCCTTCTC-3
A5-GTCTCCTCATTGAATCCAGATTGG-3

IL-10

S5-ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA-3
A5-TCTCAAGGGGCTGGGTCAGCTATCCCA-3

IL-12p40

S5-CCAAGAACTTGCAGCTGAAG-3
A5-TGGGTCTATTCCGTTGTGTC-3

IL-13

S5-TATGCATCCGCTCCTCAATCCTC-3
A5-CGAAGTTTCAGTTGAACCGTCC-3

TNF_

S5-CGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAG-3
A5-CACCAGCTGGTTATCTCTCAGCTC-3

IFNa

S5-AGTTATATCTTGGCTTTTCA-3
A5-ACCGAATAATTAGTCAGCTT-3

`-actina

S5-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3
A5-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3
P5-CAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCA-3

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3.3.2. Ensayo de proteccin de ribonucleasa

(EPR)

Estas tcnicas se basan en la deteccin

intracelular, previa permeabilizacin de la clula,
de una determinada citoquina mediante el uso de
anticuerpos anti-citoquina marcados con
compuestos fluorescentes, seguida de un corto
perodo de activacin de las clulas en presencia
de un estimulador conocido de la sntesis y en
presencia de bloqueadores del transporte de
protenas como Brefeldina A o Monesina. Estos
inhibidores impiden la secrecin induciendo la
acumulacin citoplasmtica de la citoquina. Las
clulas son tambin teidas con anticuerpos
dirigidos contra marcadores de membrana (CD3,
CD4, CD8, etc.) en atencin a definir la poblacin
celular productora de una determinada citoquina.
Anticuerpos marcados con diferentes fluorocromos estn disponibles comercialmente. No obstante depender de la poblacin celular a estudiar
y de las citoquinas a investigar el tipo de anticuerpo
anti-marcador celular y anti-citoquina a ser
utilizado.

Es una tcnica sensible y especfica para la

deteccin y cuantificacin de mRNA. Se basa en
la hibridizacin en fase lquida, de una sonda
radiactiva de RNA antisenso con el mRNA,
seguida de la exposicin a RNAasas que degradan
la sonda remanente as como tambin cualquier
RNA no hibridizado. El material remanente
"protegido" es separado mediante electroforesis,
visualizado y cuantificado mediante autorradiograrfa, densitometra o aparatos y "softwares" que
permiten evaluar fosfoimgenes. Entonces la
intensidad de las bandas es comparada con las
cantidades del RNA blanco, originalmente presentes
en la muestra. En los ltimos aos, "kits" comerciales
para esta metodologa estn disponibles, los cuales
permiten el anlisis simultneo de mltiples
citoquinas en una misma muestra.
3.3.3. Tincin intracelular de citoquinas

3.3.4. Evaluacin del interfern

Una eventual limitacin de los mtodos
moleculares radica en la imposibilidad de poder
seleccionar una determinada clula para su estudio
y la imposibilidad de obtener informacin acerca
de la identidad y frecuencia de clulas productoras
de una citoquina particular dentro de una poblacin
celular. Entonces, en ausencia de preparaciones
celulares puras, estas tcnicas no pueden ser
utilizadas para estudiar la produccin de citoquinas
por subpoblaciones definidas de clulas como es
el caso de las subpoblaciones Th1 y Th2 de clulas
T CD4+. Ms aun considerable evidencia muestra
que cambios en la frecuencia de diferentes
subpoblaciones celulares puede ocurrir en
diferentes enfermedades por lo que la capacidad
para detectar la produccin de citoquinas por
clulas individuales y fenotpicamente definidas
resulta hoy de particular importancia.
Inicialmente, mtodos de dilucin limitante y
ELISPOT se utilizaron para determinar la
frecuencia de clulas productoras de una
determinada citoquina. Estos mtodos son
laboriosos y consumen mucho tiempo. Por ello,
tcnicas de reciente introduccin basadas en la
tincin intracelular de citoquinas han simplificado
el estudio de la produccin de citoquinas en clulas
individuales. Aparte de ser tcnicas de gran
sensibilidad y especificidad, no son afectadas por
factores como son la presencia de receptores
solubles y de membrana para la citoquina en estudio.

Aunque esta molcula fue identificada a fines

de la dcada del cincuenta, como una protena antiviral, sus vastos efectos biolgicos la sitan como
una molcula inmunorreguladora capaz de alterar
una amplia variedad de procesos tales como
crecimiento celular, diferenciacin, transcripcin
gnica y traduccin. Los interferones son
producidos por una variedad de clulas en
respuesta a la infeccin, y son por ello sintetizados
como producto de la activacin de la respuesta
inmune (ver captulo 11). Existen tres tipos
conocidos de IFN _, ` y a, por lo que tanto el tipo
celular como el agente que acta como inductor
de su sntesis son importantes en determinar el tipo
de IFN producido. De esta manera IFN_ es
producido por linfocitos T y B, macrfagos, clulas
NK y linfocitos granulares grandes, en respuesta
a variados estmulos como virus, productos
bacterianos, polinucletidos, clulas tumorales y
clulas alognicas. Estos mismos inductores
podran gatillar la sntesis de IFN`, al tomar
contacto con fibroblastos, clulas epiteliales y en
menor medida con linfocitos. Por otro lado, el IFNa
es producido por linfocitos T CD4+ y CD8+, para
cuya sntesis requieren de la cooperacin de
monocitos y macrfagos. Esta citoquina es
producida de manera especfica cuando clulas T
sensibilizadas actan frente a un antgeno o
complejos antgeno anticuerpo. De igual manera,

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su sntesis es inducida de forma inespecfica por

mitgenos, anticuerpos anti-linfocito o citoquinas
como IL-2.
Todos los IFNs pueden aumentar o disminuir
en una amplia variedad de reacciones inmunes.
Los tipos celulares y las funciones que pueden ser
modificadas por los IFNs son variados. Los IFNs
modifican la reactividad inmune actuando sobre
clulas B, T, NK, macrfagos, basfilos o clulas
germinales de mdula sea. La alteracin
resultante de tales estmulos se traduce en la
produccin de anticuerpos, la citotoxicidad de
clulas T, reacciones de injerto versus husped,
blastognesis mediada por mitgenos y antgenos,
alteracin de varias funciones de los macrfagos,
hipersensibilidad retardada, citotoxicidad por
clulas NK, liberacin de histamina mediada por
IgE y maduracin de clulas germinales de la
mdula sea. Estos estados de inmunidad alterada
pueden ser importantes en la fisiopatologa de la
autoinmunidad, inmunodeficiencia, procesos
linfoides malignos y en infecciones virales.
La sobreproduccin, la subproduccin o la
produccin selectivamente localizada de IFNa
puede ser un importante factor en autoinmunidad
y en las inmunodeficiencias.
Los tres IFNs son protenas diferentes desde
el punto de vista antignico, por lo que anticuerpos
pueden utilizarse para su identificacin y
evaluacin mediante mtodos de RIA y ELISA
(ver captulo 39).

mediante algn bioensayo o mediante ELISA.

La produccin in vitro de IFNa por clulas
mononucleares de sangre perifrica, seguida de la
estimulacin con mitgenos o antgenos
especficos es una manera efectiva de evaluar la
funcin de clulas T (en lo que respecta a la
produccin de citoquinas) y la interaccin
monocito-clula T. Un defecto en la produccin
de IFNa u otras citoquinas puede ser sugestivo de
que el problema de fondo es una aberracin en
las seales regulatorias. La depresin en la
produccin de IFNa, en respuesta a mitgenos,
antgenos especficos o a IL-2 puede indicar un
defecto en el nmero y funcin de clulas T y un
defecto en la habilidad de monocitos para
interactuar con clulas T. La alteracion in vitro de
los linfocitos para secretar IFNa frente a un
estmulo, se asocia con enfermedades de base
inmune como autoinmunidad, inmunodeficiencia,
procesos linfoides malignos e infecciones con
ciertos virus incluyendo VIH.
a) Ensayos biolgicos
Los ensayos biolgicos para IFNs, permiten
evaluar la extensin en que esta molcula inhibe
una o varias manifestaciones del crecimiento viral
como son, la inhibicin de la produccin de
partculas virales, la inhibicin del efecto citoptico,
la inhibicin de la formacin de placas, la inhibicin
de la formacin de antgenos virales o de la sntesis
de DNA viral. Estos ensayos requieren la incubacin
de clulas con IFN, la remocin del IFN, la infeccin
de las clulas con virus y la evaluacin de la
reduccin del crecimiento viral. La actividad antiviral observada es cuantificada en unidades (U),
donde 1U de IFN corresponde al recproco de la
ms alta dilucin de IFN que inhibe una magnitud
especfica del crecimiento o de la actividad viral
(generalmente el 50%), comparado con un control
no tratado con IFN.

Indicaciones clnicas. Se debe evaluar los

niveles circulantes de IFNs, en pacientes con una
variedad de desrdenes, as como la deteccin in
vitro de la produccin de IFNa podra ser un
marcador de la funcin de clulas T. De igual
manera, IFNs pueden ser evaluados en la
circulacin de pacientes con desrdenes
autoinmunes sistmicos como el lupus
eritematoso. En estos pacientes la presencia de
IFN_ se correlaciona con enfermedad clnica
activa. Adems, las determinaciones de IFNs son
esenciales en el monitoreo de pacientes que
participan en estudios clnicos. Ensayos biolgicos
deberan usarse para asegurar la actividad
biolgica de IFNs que sern administrados a los
pacientes. Tambin, es importante monitorear los
niveles sricos de IFN de pacientes que estn
recibiendo terapia con IFN. La sntesis de
anticuerpos anti-IFN, puede ser detectada en el
suero de pacientes en respuesta a terapias con IFN.
En estos casos, los sueros deberan ser evaluados

b) Inmunoensayos para IFN

Todos los tipos de IFNs, pueden ser
determinados mediante ensayos inmunoenzimticos e inmunorradiomtricos. La principal
ventaja de estos ensayos es la rapidez y la
posibilidad de tamizar muchas muestras. No obstante, los inmunoensayos no siempre reemplazan
a los ensayos biolgicos, especialmente cuando
se requiere identificar una molcula biolgicamente activa, como es el caso de la evaluacin de

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diferentes partidas de IFNs para uso en inmunoterapia.

precozmente en pacientes que desarrollan SIDA

y por ello poseen elevado valor pronstico.

Interpretacin. Los ensayos para IFN en suero

de pacientes con HIV, evalan la respuesta de
clulas linfoides frente a HIV y agentes
oportunistas as como alteraciones en los aspectos
inmunorregulatorios. La replicacin de HIV puede
ser responsable de la presencia de IFN _, ` y a,
mientras que la respuesta T a protenas de HIV,
puede ser responsable de los niveles de IFNa. No
obstante, debe quedar claro que en la infeccin
aguda por diferentes patgenos oportunistas se
podra observar sntesis de IFNs. Elevados niveles
de IFN, se asocian con anormalidades en la funcin
inmune tales como hipergamaglobulinemia o
depresin de algunas respuestas celulares. Sin
embargo la produccin de IFNs puede asociarse
con sntesis de otros factores no relacionados
como son produccin de neopterina, aumento de
la expresin de molculas de HLA clases I y II,
expresin de `2 microglobulina y produccin de
2-5 oligoadenilato sintetasa.
Niveles sricos de IFNs son detectados en
personas infectadas con HIV y se observan de
manera precoz en el desarrollo del sndrome de
inmunodeficiencia adquirida. De hecho los niveles
sricos de neopterina y `2 microglobulina, las
cuales son inducidas por IFNs, se elevan

3.4. DNA microarrays

Este tipo de anlisis, denominados genmicos,
se han desarrollado en los ltimos cinco aos y
permiten evaluar en forma simultnea la expresin
de miles de genes. Los genes de un determinado tipo
celular son dispuestos de manera ordenada sobre un
soporte slido. Estos genes estn representados ya
sea por oligonucletidos o por fragmentos de cDNA.
El mRNA de las clulas en que se desea estudiar la
expresin gnica es utilizado para generar las sondas
de cDNA total para hibridizar con el microarray.
Estas sondas estn marcadas con compuestos
fluorescentes, por lo que su eventual hibridizacin
con genes del microarray es cuantificada mediante
fluorescencia, cuya intensidad refleja la abundancia
de un determinado mRNA dentro de la clula en
estudio. La medicin de la expresin gnica mediante
esta tcnica ha mostrado estar en estrecha correlacin
con los resultados obtenidos con otras metodologas
convencionales como northern blot y PCR
cuantitativa. Entonces, es posible mediante este
mtodo estudiar a gran escala la expresin gnica
durante la activacin de clulas T, durante la respuesta
inmune a diferentes agentes infecciosos o durante la
terapia con inmunomoduladores (figura 41-9).

Figura 41-9. DNA microarrays. Representacin esquemtica de la preparacin del material gentico, hibridacin, captura y
anlisis de imgenes.

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3.5. Pruebas para evaluar reacciones de

hipersensibilidad retardada (RHR)

moniotorear los resultados de inmunoterapia en

algunas enfermedades malignas o en inmunodeficiencias, para monitorear el curso de enfermedades
como coccidiomicosis y para el diagnstico de
algunas enfermedades infecciosas.

La inyeccin intradrmica de antgenos,

como tuberculina (PPD), estreptoquinasa y Candida entre otros, puede inducir una o ms de los
cuatro tipos de reacciones cutneas: (a) una
reaccin circular y enrojecida que alcanza su
mxima induracin 15-20 minutos despus de la
inoculacin y es debida a la presencia de IgE
especfica en la piel, (b) una reaccin de fase tarda
mediada por IgE con una mxima induracin entre 12-24 h posteriores a la inyeccin, (c) una
reaccin caracterizada por una vasculitis local,
denominada reaccin de Arthur, que toma lugar
entre 12-24 h luego de la inoculacin y es mediada
por anticuerpos fijadores de complemento
presentes en el sitio de la inoculacin y (d) una
reaccin de hipersensibilidad retardada dependiente de macrfagos y linfocitos, caracterizada
por eritema e induracin en el sitio de la
inoculacin que se produce en 24-48 h posteriores
al contacto con el antgeno. De esta manera las
RHR representan un fenmeno de memoria
inmunolgica, para uno o ms grupos de antgenos
frente a los cuales el individuo se ha sensibilizado.
Esto significa que una exposicin previa caus la
sensibilizacin a un determinado antgeno y la
nueva presencia de ese antgeno recuerda y alerta
al sistema inmunolgico. Ello desencadena una
respuesta inflamatoria especfica al antgeno,
donde el dimetro de la reaccin es un ndice de
la hipersensibilidad cutnea. As, las pruebas de
hipersensibilidad retardada usando inyeccin
intradrmica son an un mtodo vlido, de costo
razonable para detectar hipersensibilidad y evaluar
inmunidad celular en el hombre (nica prueba
funcional in vivo). Respuestas drmicas positivas
generalmente se correlacionan con los ensayos in
vitro para hipersensibilidad retardada, incluyendo
la proliferacin de linfocitos y la medicin de la
sntesis de citoquinas.

Interpretacin. Debe considerarse que algunos

individuos podran no responder a un determinado
antgeno, por no haber tenido contacto previo con
l. No obstante, ciertos antgenos son ubicuos y
por ello la gran mayora de las personas responden
frente a ellos por haber sido sensibilizados un algn
momento de sus vidas. Una revisin de la literatura
extranjera, acerca de la respuesta de personas sanas
a diferentes antgenos, evaluada mediante RHR
mostr que: 75,5% responde a paperas; 53,3% a
Cndida albicans; 43,5% a Trichophyton; 38,3%
a toxoide tetnico; 37,6% a tuberculina (PPD) y
20,4% a coccidina. En base a estos estudios, los
referidos antgenos podran ser utilizados en los
paneles de evaluacin, o al menos ser utilizados
para validar la realidad nacional. En orden a
obtener resultados reproducibles, deber existir
consenso en lo referente a los antgenos a ser
utilizados y establecer criterios uniformes en
cuanto a su preparacin, va y forma de
administracin del antgeno as como tambin
respecto a los criterios a ser utilizados en la
evaluacin de la respuesta drmica.
3.6. Estudios de la especificidad de clulas T
3.6.1. Tetrmeros. Las clulas T reconocen
pequeos pptidos, los que son presentados en el
contexto de molculas de MHC, en asociacin con
el receptor para clulas T (TCR). Entonces, es
posible utilizar complejos MHC-pptido,
marcados con colorantes fluorescentes, los que al
asociarse con el TCR permitan visualizar esta
ligacin y a la vez evaluar la especificidad de esas
clulas T por un determinado antgeno. No obstante, debe considerarse que la asociacin entre
TCR y el complejo pptido-MHC es bastante dbil
como para producir un complejo estable. Esto,
puede ser compensado mediante el uso de
multmeros fluorescentes del complejo pptidoMHC, lo cual aumenta su avidez por la clula T.
As, dmeros y an mejor, tetrmeros de complejos
pptido-MHC clase I, han sido usados en ensayos
de citometra de flujo, para enumerar, caracterizar
y purificar clulas CD8+, especficas para un
determinado pptido. En este tipo de ensayos, tanto
la cadena ligera como la pesada de MHC, son

Indicaciones clnicas de la RHR. Es til en la

evaluacin de pacientes con sndromes de
inmunodeficiencias primarias o adquiridas. Si un
paciente no presenta reaccin despus de la
inoculacin intradrmica de cualquier antgeno,
se dice que es anrgico o presenta un estado de
anergia. Esta condicin debe necesariamente ser
comprobada utilizando concentraciones ms altas
de antgeno.
Las RHR, tambin han sido utilizadas para

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Relevancia clnica. La inmunoscopa provee

informacin acerca del repertorio de clulas T que
ha sido seleccionado durante la respuesta inmune.
En combinacin con la tcnica de tetrmeros es
posible evaluar la diversidad de clones de clulas
T especficos para un epitopo, expandidas luego
de la inmunizacin. De igual manera, el uso
simultneo de ambas tcnicas permite el anlisis
detallado del repertorio de clulas T sin necesidad
de que estas poblaciones celulares sean
amplificadas in vitro.

producidas en Escherichia coli, para luego ser

ensambladas in vitro, en presencia del pptido
antignico. Los complejos as formados son
purificados mediante filtracin en gel. Entonces,
una molcula de biotina es adicionada en el
carboxilo terminal de la cadena pesada de MHC.
Esto permite su incubacin con fluorescena
marcada con streptoavidina, permitiendo que estos
tetrmeros puedan ser utilizados en ensayos de
ligacin.
Relevancia clnica. La frecuencia de clulas T
evaluadas mediante el ensayo de tetrmeros es
generalmente 10 veces ms alta de lo que revelan
las mediciones realizadas con mtodos
convencionales. Considerando que la ligacin del
complejo MHC-tetrmero, requiere la expresin
del TCR apropiado, este ensayo no provee
evidencia acerca de la funcionalidad de la clula
T ya que el ensayo est restringido a epitopos de
clulas T previamente identificados. No obstante
la caracterstica ms interesante del ensayo de
tetrmeros es su capacidad para visualizar todas
las clulas T especficas sean stas precursoras,
efectoras, funcionales o anrgicas.

3.7. Deteccin de clulas T precursoras

Las clulas T precursoras no tienen ninguna
funcin efectora. Sin embargo pueden proliferar
al enfrentarse al estmulo antignico. Esta
proliferacin ha sido ensayada mediante variados
mtodos que utilizan la incorporacin de precursores radiactivos o compuestos fluorescentes. Sin
embargo, ninguno de estos mtodos permite
purificar y caracterizar las clulas precursoras que
proliferan frente a un antgeno. La capacidad de
una clula precursora para proliferar, permite la
amplificacin de una poblacin especfica para
un antgeno, as como tambin determinar la
frecuencia de estas clulas precursoras. Esto es
posible mediante tcnicas de dilucin limitante
y citometra de flujo. Esta ltima, utiliza
colorantes fluorescentes para teir la membrana
de la clula por lo que es ms sensible y de mayor
utilidad. Entonces, las clulas son teidas con
colorantes fluorescentes como carboxifluorescena o PKH26. Despus de cada divisin celular,
las clulas acaban siendo dos veces menos
fluorescentes, producto de la particin del
colorante fluorescente en las dos clulas hijas
resultantes de cada ciclo. Esto permite deducir
el nmero de ciclos celulares a partir de la
intensidad de la fluorescencia. De igual manera,
la frecuencia inicial de clulas T precursoras
puede ser calculada a partir de la fluorescencia
observada al final del experimento (generalmente
entre 4 y 15 das).

3.6.2. Inmunoscopa. La diversidad del

repertorio de clulas T, es creada mediante un
proceso de rearreglo del DNA somtico
denominado recombinacin V(D)J. La tercera
regin hipervariable (CDR3) tanto de las cadenas
_ como ` de TCR, son producto de esta
recombinacin. Entonces, mediante PCR
utilizando partidores especficos para V y C, las
diferentes regiones de CDR3 pueden ser
amplificadas y su distribucin de tamaos puede
ser analizada mediante electroforesis en geles de
agarosa. Varias docenas de segmentos de genes
BV y 4 5 de BJ que codifican para la cadena `
son conocidos en el ratn y el hombre. Por ello,
las posibilidades de combinacin de los
segmentos V y J con los posibles CDR3
representan ms de 2.000, las que pueden ser
analizadas en una nica muestra. Despus de la
inmunizacin, unos pocos clones de clulas T son
amplificados. Todas las clulas pertenecientes a
un mismo clon presentarn el mismo CDR3. Este
abordaje, ha sido utilizado para visualizar y
cuantificar la expansin clonal tanto en el hombre
como el ratn. Utilizando la tecnologa del PCR,
el mtodo inmunoscpico es altamente sensible
y una nica clula T especfica puede ser
detectada en 2 x 105 clulas.

Relevancia clnica. El ensayo de la respuesta

proliferativa de clulas precursoras mediante
citometra de flujo es un mtodo que presenta
ventajas sobre aquellos que utilizan la incorporacin de precursores radiactivos, ms an si se
considera que se puede utilizar la misma muestra
para determinar en paralelo la asociacin de
tetrmeros.

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4. ESTUDIO DE LA INMUNIDAD CELULAR

INESPECFICA

como bacterias (Staphylococcus aureus) y

levaduras (Cndida albicans). Los microorganismos fagocitados pueden ser detectados
mediante la tincin con colorantes y lectura
microscpica as como tambin mediante el uso
de clulas microbianas marcadas con substancias
fluorescentes (citometra de flujo; ver captulo 42)
o precursores radiactivos para luego evaluar la
fluorescencia o radiactividad asociada a los PMN.

El estudio de este tipo de inmunidad, involucra evaluar las clulas y mediadores que participan
en esta va de la respuesta inmunitaria. Dentro de
ellos debemos considerar los neutrfilos
(leucocitos polimorfonucleares, PMN), monocitos,
eosinfilos y basfilos.
Los defectos en la fagocitosis y muerte celular
llevan a un aumento en la susceptibilidad a
infecciones y pueden asociarse a alteracin de estas
clulas o bien a deficiencias en factores
quimiotcticos como C3a y C5a. stos tambin
pueden deberse a fallas en la opsonizacin sea esta
por dficit de anticuerpos opsonizantes o de factores
opsonizantes del complemento como C3b y C4b.

b) Ensayo de actividad microbicida. Para evaluar

la actividad microbicida de PMN, clulas
purificadas son incubadas con microorganismos
(S. aureus, C. albicans), en una proporcin clula:
microorganismo igual a 1:5, en presencia de
anticuerpos del paciente y de C3b ms controles
apropiados. Los tubos se incuban durante 3 h,
tomndose alcuotas cada 30 minutos. En cada
caso, las alcuotas son centrifugadas, las clulas
lisadas y la suspensin resultante es sembrada en
medios de cultivo apropiados para mediante el
desarrollo bacteriano, evaluar la cantidad de
bacterias fagocitadas que permanecen viables.

4.1. Ensayos funcionales de neutrfilos

Los neutrfilos o leucocitos PMN constituyen el
ms abundante tipo de leucocito en sangre
perifrica normal, donde sus concentraciones
varan entre 2000 y 5000 clulas/l (ver captulo
3). Estas clulas participan en la fase efectora de
la respuesta inmune jugando adems un importante
papel en la inflamacin y en la patognesis de
muchas enfermedades. Su funcin en el control
de microorganismos es potenciada por actuar en
interdependencia con algunos factores del sistema
de complemento y anticuerpos opsonizantes. Los
defectos intrnsecos de los neutrfilos que alteran
su funcionamiento son, generalmente, de base
gentica, como es el caso de la enfermedad
granulomatosa crnica (ver captulo 29). En este
proceso se observa una ingestin normal, pero el
proceso de destruccin intracelular no ocurre. Esto
es debido a la inactivacin de la enzima NADPH
oxidasa, responsable de la sntesis de intermediarios reactivos del oxgeno. Por otro lado, la
deficiencia gentica de mieloperoxidasa y glucosa
6 fosfato deshidrogenasa, es responsable por los
defectos en la capacidad de PMN en inducir la
muerte celular de los microorganismos.
Los neutrfilos en su calidad de clulas
fagocticas, son la principal poblacin celular
involucrada en la respuesta inflamatoria aguda.
Estas clulas pueden ser aisladas en gran nmero
y pureza de la sangre del hombre y animales.

c) Prueba de reduccin del azul de nitrotetrasoliun. La habilidad de neutrfilos para reducir el

azul de nitrotetrasolium (NTB) es una medida de
su actividad de NADPH oxidasa y su capacidad
para generar productos reactivos intermediarios de
oxgeno. El O2- y otros productos del estallido
respiratorio tienen la capacidad de reducir el NTB
a formazn, un precipitado negro azulado que se
determina espectrofotomtricamente. Alternativamente, los neutrfilos se pueden fijar y examinar
al microscopio, despus de la incubacin con NTB,
permitiendo de esta manera determinar el
porcentaje de clulas que contienen el colorante
reducido (formazan).
d) Generacin de anin superxido. La
generacin de anin superxido (O2-) puede ser
evaluada utilizando tanto en clulas estimuladas
como no estimuladas, mediante la medicin de la
inhibicin de la reduccin de ferricitocromo c por
superxido dismutasa.
e) Formacin de perxido de hidrgeno. La
generacin de perxido de hidrgeno (H2O2) por
neutrfilos se produce como consecuencia del
estmulo de membrana y puede medirse mediante el
mtodo basado en la oxidacin del cido
homovainillnico. Esta reaccin es catalizada por
peroxidasa (HPR) y depende del H2O2 generado por

a) Medicin de la actividad fagoctica. La

actividad fagoctica de neutrfilos puede medirse
utilizando una variedad de microorganismos tales

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la clula. Mtodos fluorescentes de reciente

introduccin, permiten medir la produccin de H2O2
usando el 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazima, el cual
en presencia de HPR, reacciona con H2O2, generando
resorufina, compuesto que es altamente fluorescente
con emisin mxima a 563 nm. La lectura se realiza
en microplaca usando un espectrofluormetro.

medida en placas de 96 orificios, detectando los

eosinfilos asociados a clula por medio de la
medicin de la actividad de peroxidasa propia de
los eosinfilos.

4.2. Ensayos funcionales de eosinfilos

Desde los trabajos pioneros de Ellie

Metchnikoff, los macrfagos han sido considerados como las clulas responsables de la
regulacin de la respuesta inmune. Los macrfagos
participan en procesos de recambio celular,
incluyendo el remodelamiento tisular durante
embriognesis, destruccin tisular y reparacin de
los tejidos con posterioridad a injurias e
infecciones y renovacin tisular que permite la
eliminacin de clulas senescentes o malignas. Los
macrfagos son clulas de central importancia en
la respuesta inmune. Una de sus caractersticas
distintivas que avala su papel central en la
inmunidad es su presencia en la mayora de los
tejidos de nuestro cuerpo. Entonces su principal
funcin es monitorear y regular los fluidos
circulantes y reaccionar frente a los cambios. Los
macrfagos participan tanto de las vas aferentes
como eferentes de la respuesta inmune. Sus
funciones son variadas e involucran pinocitosis,
degradacin de material ingerido, quimiotaxis,
actividad antimicrobiana, secrecin de
monoquinas y otros factores, procesamiento y
presentacin de antgenos, cooperacin con clulas
T y B y actividad citoltica.
Los monocitos y los macrfagos son clulas
que se originan en la mdula y son programadas
para madurar y diferenciar de la clula
hematopoytica germinal hasta ser liberada para
circular en la sangre perifrica. La diferenciacin
de monocitos a macrfagos ocurre en diferentes
tejidos, dependiendo de la localizacin tisular y
del microambiente al que los monocitos son
expuestos.
Los monocitos circulantes y los macrfagos
tisulares desempean importantes funciones en la
defensa del husped contra microorganismos
invasores y clulas tumorales. Por otro lado, la
fagocitosis, degradacin y muerte de microorganismos permite a monocitos y macrfagos
participar en la presentacin de antgenos, primer
y esencial paso en el montaje de la respuesta
inmune. De igual manera estas clulas pueden responder a un determinado antgeno secretando
citoquinas (monoquinas) solubles, que permiten

4.3. Ensayos funcionales de monocitos y

macrfagos

Los eosinfilos son granulocitos derivados

de la mdula sea y cuyos grnulos contienen
protenas bsicas que se tien con colorantes
cidos como la eosina. En personas sanas no
alrgicas, estas clulas corresponden al 2-5% de
los leucocitos sanguneos (ver captulo 3). Aunque
son capaces de fagocitar, su funcin est dada
frente a ciertos agentes infecciosos incluyendo los
helmintos. Adems estas clulas juegan un papel
significativo en la inflamacin y la injuria celular
seguida a las reacciones de hipersensibilidad
retardada. La produccin y activacin de
eosinfilos est bajo el control de clulas T CD4+
pertenecientes a la subpoblacin Th2, responsables
por la produccin de IL-5, que es el principal factor activador de eosinfilos. Despus de su
activacin, los eosinfilos aumentan de tamao y
disminuyen su densidad. Eosinfilos activados son
potentes efectores de reacciones de ADCC y
producen una variedad de mediadores inflamatorios incluyendo leucotrienio C4 (LTC4) y O2-.
a) Generacin de LTC4. El leucotrienio C4 es
un mediador derivado de cido araquidnico que
es producido por mastocitos, basfilos y
eosinfilos. LTC4 y sus metabolitos derivados,
LTD4 y LTE4, son poderosos mediadores de
vasocontriccin, jugando un papel central en la
patognesis del asma. La produccin de LTC4
por eosinfilos despus de estimulacin con varios
agentes (IL-5,GM-CSC, Zynosan, ionforo
A23187) puede medirse utilizando diferentes kits
comerciales basados en el radioinmunoanlisis.
b) Ensayo de anin superxido. Al igual que
neutrfilos, los eosinfilos luego de su activacin
pueden generar O2-. ste puede medirse inhibiendo
la reduccin de ferricitocromo c por superxido
dismutasa.
c) Ensayo de adhesin de peroxidasa de
eosinfilos. La adhesin de eosinfilos al colgeno
o a clulas de endotelio vascular humano, es

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a) Produccin de intermediarios del metabolismo oxidativo. Durante la fagocitosis y la

actividad citotxica, los macrfagos son capaces
de producir varios intermediarios del metabolismo
del oxgeno. Durante las fases iniciales de la
fagocitocis, los macrfagos muestran un aumento
en el consumo de oxgeno, cortocircuito de la
actividad de hexosa monofosfato y produccin de
intermediarios de oxgeno, en un proceso conocido
como estallido respiratorio. La generacin de
radicales superxido es catalizada por una NADPH
oxidasa localizada en la membrana, siendo generado
por una apropiada estimulacin de membrana. Esta
oxidasa transfiere electrones de NADPH citoslica
al oxgeno extracelular, produciendo H2O2, el que
es necesario para la muerte de los microorganismos
invasores, pero al mismo tiempo causa inflamacin
y dao tisular. El estallido respiratorio no
necesariamente depende de la fagocitosis pero
permite caracterizar la actividad fagoctica. La
produccin de O2-, es el paso inicial de la conversin
de oxgeno a perxido de hidrgeno y radicales
hidroxilo, los cuales son potentes metabolitos
microbicidas. Por ello la evaluacin del nivel de
produccin de O2-, es un importante indicador del
potencial microbicida de los macrfagos. En este
aspecto, el mtodo ms apropiado para la medicin
de O2- es evaluar la inhibicin de la reduccin de
citocromo c Fe3+ a Fe2+, la que es dependiente de
superxido dismutasa.

activar y reclutar diferentes tipos de clulas

efectoras. La primera monoquina secretada frente
a un estmulo antignico es interleucina 1 (IL-1),
que inicia la respuesta inmune actuando sobre
clulas T CD4+ y CD8+, permitiendo la secrecin
de IL-2 y la expresin de receptores para IL-2,
que permite la proliferacin de estas clulas. Otra
monoquina es IL-6, que posee capacidad para
activar clulas NK, timocitos y linfocitos T.
Monocitos activados tambin producen el
factor estimulador del crecimiento de granulocitos
y macrfagos, el cual induce la maduracin de
monocitos y neutrfilos de la mdula sea y la
activacin funcional de los monocitos circulantes.
Monocitos estimulados por antgenos tambin
producen IL-8. El TNF sintetizado por monocitos
activados posee propiedades antitumorales pero
adems es capaz de activar monocitos, granulocitos y eosinfilos. No obstante monocitos y
macrfagos no slo producen monoquinas capaces
de estimular la respuesta inmune sino que adems
pueden producir factores inmunosupresores como
prostaglandina E2. Entonces el aislamiento de
monocitos de sangre perifrica permite evaluar la
actividad microbicida y antitumoral de estas
clulas as como su funcionalidad en producir
monoquinas y prostaglandinas.
Indicaciones clnicas. La evaluacin in vitro de
la funcin de monocitos se recomienda en
pacientes en los cuales se sospecha deficiencias
en la inmunidad mediada por clulas. Deficiencia
en la funcin de monocitos se puede manifestar
clnicamente como aumento en la frecuencia de
infecciones las que podran ser debidas a fallas
en la capacidad de matar grmenes, en deficiencias
en el procesamiento y la presentacin de antgenos
o en la produccin de monoquinas. En estos casos,
el primer y ms simple ensayo consiste en evaluar
la capacidad antimicrobiana seguida de la
evaluacin de la capacidad de secretar monoquinas
como TNF. En pacientes con cncer, la evaluacin
de la capacidad tumoricida puede entregar valiosa
informacin acerca de las capacidades funcionales
in vivo de estas clulas. Por otro lado la medicin
de la produccin de PGE2 por monocitos permite
conocer el nivel de actividad supresora de los
monocitos. Ciertas enfermedades crnicas como
cirrosis, tuberculosis, sarcoidosis, actinomicosis
y enfermedad de Crohn, pueden asociarse con
disfuncin de monocitos por lo que el monitoreo
de la funcin de estas clulas puede ser informativo
acerca del estado de la enfermedad.

b)Estudio de la fagocitosis. Bajo el trmino de

fagocitosis se describe la capacidad de clulas de
tomar partculas slidas, tales como eritrocitos,
diferentes microorganismos, materiales orgnicos
e inorgnicos. Diferentes eventos celulares han sido
asociados con la internalizacin y subsecuente
procesamiento del material ingerido. Cada fase de
la fagocitosis es un proceso celular complejo, con
caractersticas funcionales propias y diferentes
requerimientos metablicos donde participan
factores intra y extracelulares. Por ello, la fagocitosis
representa uno de los parmetros funcionales usados
para caracterizar la funcin de los macrfagos.
Para obtener una evaluacin ms objetiva de
este proceso biolgico, es importante escoger de
manera cuidadosa la partcula a ser fagocitada.
Adems de eritrocitos y varias cepas de bacterias,
existen partculas comnmente clasificadas como
inertes que son empleadas como reactivos para la
cuantificacin de la actividad fagoctica. Ellas son
slica, metales carboxilados, microcristales y
partculas de ltex. No obstante, la fagocitosis de

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lisis de los monocitos. Por ello slo incorporarn

el istopo aquellas levaduras que permanecen
viables, por lo que la radiactividad incorporada se
compara con un control en que se cultiv idntico
inculo inicial pero en ausencia de monocitos.
Tambin es posible evaluar la actividad
microbicida mediante recuento microscpico del
nmero de clulas infectadas y el nmero de
levaduras por cada 100 clulas infectadas.

bacterias es una de las tcnicas tradicionalmente

usadas por ms de una centuria. Prcticamente todas
las bacterias pueden ser utilizadas. Entonces cultivos
de monocitos se ponen en contacto con los
microorganismos por un perodo de tiempo. Luego,
los cultivos son lavados y se evala tanto el nmero
de bacterias intracelulares por cada 100 monocitos,
como el porcentaje de monocitos que contienen
bacterias intracelulares. El ndice fagoctico que
muestra la relacin entre el porcentaje de
macrfagos con a lo menos una bacteria y la media
del nmero de bacterias por macrfagos positivos,
puede tambin ser considerado. Tradicionalmente,
esta evaluacin se ha realizado mediante
microscopa ptica, aunque protocolos ms
recientes y algunos reactivos comerciales
disponibles utilizan bacterias (Escherichia coli K12)
marcadas con fluorescena, lo que permite evaluar
la fagocitosis por microscopa de fluorescencia,
citometra de flujo y espectrofluorometra. Resulta
interesante destacar, que las metodologas
fluorescentes permiten diferenciar entre
microorganismos localizados extracelularmente y
los microrganismos intracelulares. Estos protocolos
se basan en la observacin de la viabilidad del
microorganismo al ser teido con naranja de
acridina y luego observado en el rango ultravioleta
o con excitacin azul. El microorganismo se
mostrar de color verde si estuviese viable o de
color rojo si estuviese muerto.
Otro posible abordaje, se basa en el uso de
microesferas fluorescentes y efectos de bloqueo,
que permite la fcil diferenciacin entre las
partculas asociadas y aquellas interiorizadas. La
tcnica se basa en la propiedad de algunos
colorantes como el cristal violeta o el azul tripan
de apagar la fluorescencia de partculas fluorescentes libres o asociadas al monocito, mientras que
aquellas interiorizadas permanecen fluorescentes.
El fenmeno responsable por este bloqueo se llama
transferencia de energa de excitacin. La
transferencia ocurre cuando el espectro de
absorcin del agente bloqueador se sobrepone al
espectro de emisin del marcador fluorescente.

d) Evaluacin de la actividad citosttica frente

a tumores. La habilidad de monocitos para
controlar el crecimiento tumoral, puede evaluarse
mediante la incorporacin de 3H- timidina en
clulas tumorales que sobreviven luego de la
incubacin con monocitos y que son comparadas
con la incorporacin de clulas tumorales que
fueron incubadas en ausencia de macrfagos.
e) Evaluacin de la actividad tumoricida. La
evaluacin de la actividad tumoricida es semejante
a la evaluacin de la actividad citosttica, con la
diferencia de que las clulas tumorales son
marcadas antes de la incubacin con los
macrfagos.
f) Estudios de induccin de monoquinas. De
manera general, cultivos de monocitos purificados
son incubados por 24-48 h con algunos inductores
de la produccin de monoquinas como el LPS de
Escherichia coli. Luego los sobrenadantes son
colectados mediante centrifugacin y sometidos
a evaluacin o congelados inmediatamente. Tanto
ELISA como RIA pueden ser usados para la
deteccin de monoquinas. La principal desventaja
de estos mtodos es que tambin detectan
monoquinas biolgicamente inactivas. Por ello, los
mtodos moleculares, principalmente aquellos
basados en PCR, presentan grandes ventajas tanto
en sensibilidad como en especificidad (ver punto
3.3.1 y captulo 44).

c) Evaluacin de la actividad microbicida. La

actividad microbicida y la fagocitosis puede
evaluarse incubando cultivos de monocitos con
levaduras, como C. albicans, a diferentes
relaciones levadura : monocito (1:3; 1:10; 1:30).
Luego de incubacin a 37C por 18 h, las levaduras
son marcadas metablicamente con 14C-glucosa,
adicionando el istopo en agua, lo que permite la

Ensayo de IL-1. Para el ensayo de la

actividad biolgica de IL-1, sobrenadantes
de monocitos estimulados son usados para
estimular la proliferacin dependiente de IL1 de una lnea de clulas T (clon de clulas T
murinas). El ensayo utiliza IL-1_ como
control de la proliferacin de las clulas T.
La presencia de esta monoquina puede
ser identificada mediante ensayos de ELISA
utilizando preparados comerciales, los cuales
tienen sensibilidad en el rango de 20-50 pg/

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unidades de TNF son calculadas en base a una

curva estndar. Considerando que tanto TNF_
como TNF` (tambin llamada linfotoxina) son
detectados en este ensayo, la neutralizacin con
anticuerpos contra cada uno de stos, es
necesaria para conocer cul monoquina est
siendo detectada. No obstante slo TNF_ es
sintetizado por monocitos, por lo que la
deteccin de TNF` sugiere que la preparacin
pudiese estar contaminada con linfocitos. Si no
fuese posible o pertinente marcar las clulas con
51
Cr, el ensayo podra realizarse tiendo las
clulas al final de la incubacin con azul tripan
para as evaluar la viabilidad celular o teir con
cristal violeta que tie las clulas tumorales
residuales. Esta tcnica es particularmente
apropiada cuando se usan como clula blanco
los fibroblastos murinos L929.

mL, sin reacciones cruzadas con otras

monoquinas y citoquinas.

Ensayo de IL-6. Los ensayos biolgicos

miden la habilidad de sobrenadantes de
cultivo de monocitos estimulados en inducir
la proliferacin dependiente de IL-6 en una
lnea celular de plasmocitoma (por ejemplo
T1165 o B9). Diluciones seriadas de IL-6
recombinante son incluidas como control. De
igual manera, "kits" comerciales pueden ser
utilizados para evaluar los niveles de IL-6.
La sensibilidad de estos es de 3.5 pg/mL, de
protena por ml, no presentando reacciones
cruzadas con otras citoquinas. Estos ensayos
son a lo menos tan sensibles como los ensayos
biolgicos con la ventaja de ser ms rpidos
y la desventaja de su relativo alto costo.

Ensayo para GM-CSF. Los ensayos

biolgicos de la actividad de factor
estimulador de colonias granulocito-monocito
(GM-CSF), miden la habilidad de sobrenadantes de cultivo de monocitos estimulados
en inducir la proliferacin dependiente de
GM-CSF en una lnea celular de leucemia
humana (con frecuencia se usan los clones
Mo7e o TALL-101). Diluciones seriadas de
GM-CSF recombinante humano son
utilizados como control. En este caso debe
considerarse que las lneas tumorales
utilizadas son respondedoras tanto a GM-CSF
como a IL-3 por lo que una caracterizacin
definitiva de la actividad de GM-CSF, se
realiza incubando los sobrenadantes de
monocitos esimulados con anticuerpos antiGM-CSF y anti-IL-3, antes de evaluar la
actividad de GM-CSF. De igual manera "kits"
comerciales de ELISA pueden ser utilizados.

g) Ensayo de prostaglandina E2. La prostaglandina E2 es detectada por RIA. El sobrenadante

de monocitos estimulados es ajustado a pH 12,5
con NaOH y luego es hervido, neutralizado y
evaluado. Las concentraciones de PGE2 son
calculadas en base a una curva de referencia.
5. EVALUACIN DE LABORATORIO DEL
PACIENTE INFECTADO CON EL VIRUS
DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA: UN MODELO DE ESTUDIO DE LAS
DEFICIENCIAS EN LA RESPUESTA
CELULAR
Frente a la sospecha inicial de encontrarse
frente a un paciente infectado por HIV, el
diagnstico de laboratorio se realiza mediante la
bsqueda de anticuerpos, utilizando ELISA. Las
pruebas de Western blot y PCR se usan como
confirmatorias. Por ello, la evaluacin de la
respuesta inmune celular en estos pacientes, es de
central importancia ya que permite monitorear el
curso de la infeccin, evaluar el tratamiento y sus
resultados poseen valor pronstico (ver captulo
30).

Ensayo de TNF. Para el ensayo biolgico de la

actividad de TNF, se evala la capacidad de
sobrenadantes de cultivo de monocitos
estimulados, en lisar una lnea celular de
fibrosarcoma murino, caracterizado por ser
altamente sensible a TNF (por ejemplo WEHI
164-JD). En este caso las clulas del
fibrosarcoma son marcadas con 51Cr y luego
incubadas con diluciones seriadas del
sobrenadante de cultivo de monocitos. Controles
se realizan con clulas incubadas en ausencia
de sobrenadantes. Diluciones seriadas de TNF
recombinante son incluidas como control y las

5.1 Estudio fenotpico de linfocitos

En base a lo anterior, el estudio inicial del
laboratorio debera incluir el anlisis fenotpico
mediante citometra de flujo, de las diferentes
subpoblaciones de linfocitos T, evaluando
particularmente los marcadores CD3+, CD4+ y

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CD8+. Este examen se orienta particularmente a

conocer el porcentaje y recuento absoluto de LT
CD4+, ya que stos poseen una relacin estricta
con el estado de la infeccin. De acuerdo a la
clasificacin del Centro de Control de las
Enfermedades Infecciosas de los Estados Unidos
(CDC), en relacin a los niveles de clulas T
CD4+, se pueden clasificar a los pacientes en tres
categoras: a) Recuentos mayores 500 clulas/L,
b) Recuentos entre 200-499 clulas/L, c)
Recuentos menores a 200 clulas/L.
No obstante, el avance en las tcnicas de
citometra de flujo, ha permitido proponer nuevos
marcadores con valor predictivo. Entre stos se
incluye evaluar la prevalencia e intensidad del
marcador CD38 de clulas T CD8+, el porcentaje
de clulas CD4+ que muestran prdida de
marcadores CD26 y CD28 y el porcentaje de
clulas CD4+ que expresan el marcador CD95.
La intensidad del marcador CD38 en linfocitos
CD3/CD8+ se ha podido correlacionar de manera
estrecha a la progresin futura de la enfermedad,
de manera ms absoluta que el recuento nico de
linfocitos CD4+. Pruebas adicionales podran ser
realizadas en estudios clnicos orientados a evaluar
efectos teraputicos de una determinada droga o
el efecto protector de una eventual vacuna. En
estos casos podra ser interesante un estudio
fenotpico extensivo a otras poblaciones celulares,
incluyendo marcadores para monocitos, clulas
NK, clulas B y marcadores de la activacin de
clulas T, tales como HLA-DR o el monitoreo de
la expresin de receptor para IL-2.

respuesta por LTc se manifiesta en perodos

tempranos de la infeccin, en personas en que a
pesar de estar infectadas por ms de una dcada
no presentan signos de enfermedad, o en
trabajadoras sexuales y recin nacidos de padres
infectados que no contrajeron la infeccin Aunque
en pacientes infectados con HIV los niveles de
CD8+ son cercanos a los niveles normales, la
habilidad para generar respuesta LTc, la cual
requiere IL-2, est disminuida, ya que se observa
una reduccin en los niveles de IL-2. Por ello,
estudios recientes sugieren la evaluacin de la
respuesta citotxica de clulas T de pacientes
infectados, frente a clulas blanco infectadas con
HIV o que expresan protenas virales. En estos
casos se sugiere colectar CMSP y someterlas in
vitro a estimulacin previa con diferentes
antgenos de HIV tales como nef, gag, po1, vif y
env. Esta estimulacin previa parece ser
indispensable, ya que permite la estimulacin
especfica y la amplificacin de pequeas
poblaciones precursoras de clulas T citotxicas,
que pudieran encontrarse en la sangre perifrica
en el momento de la recoleccin de la muestra.
Por encontrarse en bajo nmero, de no mediar una
estimulacin previa, la actividad citotxica de estas
clulas no sera detectada en ensayos de
citotoxicidad convencionales.
De igual manera pueden ser importantes, la
evaluacin del efecto citotxico de clulas NK.
Aunque el porcentaje de NK en pacientes
infectados con HIV puede permanecer normal, el
nmero absoluto de algunas subpoblaciones de NK
pueden estar disminuidas, por lo que la funcin
NK se deteriora segn progresa la infeccin.
Entonces, la actividad NK puede ser detectada en
CMSP, mediante mtodos que miden la liberacin
de 51Cr por parte de clulas blanco.
Las reacciones de ADCC, especficas para
HIV, pueden tambin ser evaluadas, ya que la
actividad ADCC, mediada por clulas NK, declina
conforme progresa la enfermedad. Dos tipos de
ADCC pueden utilizarse en la evaluacin de
pacientes infectados con HIV. La primera, es
denominada ADCC clsica o indirecta, en la cual
se usa suero de pacientes infectados y linfocitos de
dadores normales. La lisis de las clulas infectadas
es evaluada de mediante la liberacin de 51Cr. Por
otro lado, la ADCC directa, usa clulas NK frescas,
aisladas de pacientes infectados, las que son
cultivadas con anticuerpos citoflicos anti HIV y
luego incubadas con clulas blanco infectadas con
HIV o recubiertas con antgenos del virus.

5.2. Estudio de la respuesta proliferativa

Una de las alteraciones ms tempranas del
paciente infectado con HIV, es una marcada
reduccin en la habilidad de los linfocitos T para
proliferar in vitro, en respuesta a mitgenos,
antgenos solubles y aloantgenos. Es por ello
importante la evaluacin de la respuesta
proliferativa de los linfocitos de pacientes
infectados con HIV. De esta manera, el estudio de
la respuesta proliferativa de clulas T a mitgenos,
antgenos solubles y aloantgenos puede ser de
gran valor.
5.3. Estudio de la respuesta citotxica
Varias evidencias sugieren que LTc podran
ser importantes en la defensa frente a HIV. stas
se basan en la observacin que una fuerte

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5.4. Evaluacin de los niveles de citoquinas y

subpoblaciones de linfocitos T

LECTURAS SUGERIDAS
Abbas A. K., Murphy, K., M, Sher, A., Functional diversity of helper T lymphocytes, Nature
383:787-793, 1996.

Varias observaciones sugieren, que en la

infeccin por HIV, ocurre una alteracin en el
balance de la expresin de citoquinas y sus
receptores, lo que podra contribuir a la
patognesis de la infeccin. Elevados niveles de
IL-1, IL-6, GM-CSF, TNF_ y TNF` se han
reportado en suero y lquido cefalorraqudeo en
pacientes con HIV. De igual manera, segn
progresa el sndrome, se observa una disminucin
en los niveles de IL-2 y IFNa, a la vez que
aumentan IL-4 e IL-10. Esta observacin sugiere
que durante el transcurso de la enfermedad, la
actividad de la subpoblacin Th1 disminuye
mientras que la subpoblacin Th2 aumenta. Siendo
que Th1 estn asociados a las RHR y a las
reacciones de citotoxicidad mientras que Th2 se
asocia a la produccin de anticuerpos, este cambio
en el predominio de una determinada subpoblacin
podra contribuir a la progresin de la enfermedad.
La disminucin en la subpoblacin Th1 se puede
asociar al hecho que en pacientes con SIDA, se
observa una significativa reduccin en la
reactividad de las pruebas de sensibilidad cutnea
("skin-test"). De esta manera, la determinacin de
citoquinas y sus receptores mediante mtodos
moleculares parece ser de central importancia en
la evaluacin de la progresin del sndrome.
Los procedimientos de laboratorio propuestos en la evaluacin de pacientes con HIV se
resumen en la figura 41-10.

Abbas A. K., Lichtman, A.H., Pober, J.S., Effector mechanisms of cell-mediated immunity.
Cellular and Molecular Immunology, chapter
13, W.B.Saunders Company, 2000.
Castillo D., Vega, P., Reid, M., Metodologa
inmunidad celular, Manual de Procedimientos
Tcnicos de Laboratorio Clnico, Inst. Salud
Pblica de Chile, 1994, pp. 26-42.
Fernndez-Botran, R. and Vetvicka, V., Advanced
Methods in Cellular Immunology, chapters 2,
3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, CRC Press, 2000.
Hagmann, M., Doing Immunology on a Chip,
Science 290: 82-83, 2000.
Kuby, J., Immunology, Chap 3, 10, 11, 12, 13,
15, 21, 23,W.H. Freeman and Company, New
York, 1994.
Michel, N., Kim. J.H., HIV Protocols. Methods
in Molecular Medicine, Humana Press, 1999.
Rose, N.R., De Macario, E.C., Fahey, J.L., Friedman, H., Penn, G.M., Manual of Clinical Laboratory Immunology, chapters 22-24, 30, 31, 3336, 41, 42, 59, 64-66, 115, 1992.

Figura 41-10. Flujograma de la evaluacin inmunolgica del paciente infectado con HIV.

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