HYDRAGEL Lp(a)

Ref. 4057

2012/09

HYDRAGEL Lp(a) - 2012/09

ESPECIFICACIONES DE USO

El kit HYDRAGEL Lp(a) est diseado para la cuantificacin de la lipoprotena Lp(a) en suero humano mediante electroinmunodifusin en geles de
agarosa tamponados ligeramente alcalinos (pH 7.6). Los geles contienen un anticuerpo monoespecfico anti-apo (a). Despus de la migracin, los
cohetes resultantes se tien con violeta cido. El exceso de tincin se elimina con una mezcla cido/alcohol. Se construye una curva de calibracin
a partir de valores ensayados obtenidos en un suero patrn de Lp(a) calibrado. De este modo, las alturas de los cohetes de los pacientes proporcionan
los niveles sricos de Lp(a).
Cada gel de agarosa en el kit HYDRAGEL Lp(a) est destinado para procesar 14 muestras.
Para Uso Diagnstico In Vitro.

PRINCIPIO DEL TEST

Lp(a) es una lipoprotena plasmtica que se parece a LDL en sus propiedades fsico-qumicas y funcionales. Sin embargo, su componente proteico
es diferente. Es un apo B100 unido mediante puentes disulfuro a la glicoprotena especfica apo (a). Este particular antgeno presenta una importante
homologa estructural con el plasmingeno (concerniente al dominio Kringle IV). Por tanto, Lp(a) puede competir con el plasmingeno para unirse a
la fibrina. Est implicada en la trombosis as como en la arteriosclerosis.
Muchos estudios demostraron su transmisin hereditaria y tambin su heterogeneidad de tamaos: hoy en da se conocen seis fenotipos. No se ha
establecido una correlacin clara entre los fenotipos y el riesgo aterognico.
Una concentracin de Lp(a) por encima de 0.3 g/L es hoy considerada como un factor de riesgo arteriosclertico independiente y adicional. As pues,
la cuantificacin de Lp(a) debera tenerse en cuenta por su valor predictivo.
El desarrollo de un anticuerpo especfico contra el componente proteico de Lp(a) sin la existencia de reacciones cruzadas con la LDL y el
plasmingeno ha conducido a la mejora de este fcil ensayo de electroinmunodifusin.
NOTA:
LDL: Lipoprotenas de Baja Densidad.

REACTIVOS Y MATERIALES SUMINISTRADOS EN EL KIT HYDRAGEL Lp(a)

ATENCIN : Ver las fichas de datos de seguridad.

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ARTCULO
Geles de agarosa (listos para su uso)
Tampn TGM (solucin stock)
Colorante Violeta Acido (solucin stock)
Solucin Decolorante (solucin stock)
Suero Patrn (liofilizado)
Papeles de Filtro - Finos
Papeles de Filtro - Gruesos

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PN 4057
5 geles
2 viales, 100 mL cada uno
1 vial, 75 mL
1 vial, 100 mL
5 viales
1 paquete de 10
2 paquetes de 10 cada uno

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Durante el transporte, el kit puede permanecer a temperatura ambiente (entre 15 y 30 C) durante 15 das sin que la calidad del test se vea afectada.

PARA OBTENER RESULTADOS PTIMOS :

Los elementos de un mismo kit deben utilizarse conjuntamente y segn las instrucciones incluidas.
LEER ATENTAMENTE LAS INSTRUCCIONES.

1. GELES DE AGAROSA*
Preparacin

Los geles de agarosa estn listos para usar. Cada gel contiene : agarosa ; tampn pH 7,6 0,5 ; componentes inocuos a las concentraciones usadas,
necesarios para un funcionamiento ptimo.

Uso

Medio de soporte para la electroinmunodifusin.

Almacenamiento, estabilidad y seales de deterioro

Almacenar los geles en posicin horizontal en sus recipientes protectores originales y refrigerados (2 a 8 C). Son estables hasta la fecha de
caducidad indicada en la caja del kit y en sus recipientes. (La flecha situada en la cara frontal de la caja del kit debe apuntar hacia arriba). Evitar su
almacenamiento cerca de una ventana o de una fuente de calor. Evitar variaciones importantes de temperatura durante su almacenamiento.
NO CONGELAR.
Desechar cuando:
(i) haya cristales o precipitados en la superficie del gel o su textura sea muy blanda (consecuencias de la congelacin del gel),
(ii) se observe crecimiento bacteriano o fngico,
(iii) haya una cantidad excesiva de lquido en el recipiente del gel (como resultado de la exudacin del tampn debida a un almacenamiento
inadecuado).

2. TAMPON TGM
Preparacin

Cada vial de tampn concentrado debe completarse hasta 1 litro con agua destilada o desionizada.
Despus de la dilucin, la solucin contiene : tampn pH 7,5 0,5 ; componentes inocuos a las concentraciones usadas, necesarios para un
funcionamiento ptimo.

Uso

Tampn de electroforesis.

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INSTRUCCIONES SEBIA - Espaol

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Almacenamiento, estabilidad y seales de deterioro

Almacenar la solucin stock del tampn a temperatura ambiente o refrigerada. Es estable durante varios aos, por lo menos hasta la fecha de
caducidad indicada en la caja del kit o en las etiquetas del vial.
La solucin diluida del tampn es estable durante un ao a temperatura ambiente en una botella cerrada.
Desechar el tampn diluido si cambia su aspecto, por ejemplo, se vuelve turbio debido a contaminacin microbiana.

3. COLORANTE VIOLETA ACIDO

Preparacin

El vial del colorante violeta cido concentrado debe completarse hasta 300 mL con agua destilada o desionizada.
Despus de la dilucin, la solucin colorante contiene : solucin cida pH 2 ; violeta cido ; etiln-glicol ; componentes inocuos a las concentraciones
usadas, necesarios para un funcionamiento ptimo.

Uso

Para la tincin de los geles despus de la electroinmunodifusin.

Almacenamiento, estabilidad y seales de deterioro

Almacenar la solucin stock y de trabajo del colorante a temperatura ambiente o refrigeradas en contenedores cerrados para impedir la evaporacin.
La solucin stock del colorante es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las etiquetas del vial. La solucin de trabajo
del colorante es estable durante 6 meses.

4. SOLUCION DECOLORANTE
Preparacin

El vial de decolorante concentrado debe diluirse 1/50 con agua destilada o desionizada, y permite obtener 5 litros de solucin decolorante.
Se aconseja diluir 20 mL hasta 1 litro con agua destilada o desionizada.
Despus de la dilucin, la solucin decolorante contiene una solucin cida pH 2.
Al menos 15 minutos antes de usarla, prepare una solucin que contenga (vol./vol.) : 50 % de etanol puro y 50 % de decolorante.
Es posible usar etanol de 90 ajustando el volumen en consecuencia.

Uso

Para decolorar, esto es, eliminar el exceso de tincin y la coloracin de fondo de los geles.

Almacenamiento, estabilidad y seales de deterioro

Almacenar la solucin decolorante stock a temperatura ambiente o refrigerada. La solucin stock es estable hasta la fecha de caducidad indicada en
la caja del kit o en las etiquetas del vial. La solucin decolorante diluida es estable durante un mes a temperatura ambiente en una botella cerrada.
Desechar la solucin decolorante diluida si cambia su aspecto, por ejemplo, se vuelve turbia debido a la contaminacin microbiana.
No aadir azida sdica.
Para evitar la proliferacin microbiana en la solucin decolorante diluida que se vaya a almacenar durante ms de una semana, aada 5 L/dL de ProClin 300.
El decolorante diluido al que se ha aadido ProClin es estable en un contenedor cerrado a temperatura ambiente o en la nevera hasta la fecha de
caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de decolorante.

5. SUERO PATRON*

El suero patrn de Lp(a) est hecho a partir de un conjunto de sueros humanos, estabilizado mediante un proceso particular y liofilizado.

ATENCION: Aunque este suero patrn ha superado las pruebas de deteccin del HIV, virus de la hepatitis B y C o cualquier otro agente
infeccioso, debe ser manipulado siguiendo las precauciones habituales para prevenir la contaminacin.

Preparacin

Reconstituir un vial de suero liofilizado con 0.5 mL de agua destilada. Esperar 30 minutos a temperatura ambiente (15 a 30 C). Mezclar suavemente,
evitando la formacin de espuma.
Diluir el patrn como sigue y agitar en el vrtex.

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Uso

Puntos
1
2
3
4

Para calibrar.

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Salina (L)
180
150
100
0

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Patrn (L)
20
50
100
200

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Almacenamiento, estabilidad y seales de deterioro

Concentracin
Patrn x 0.1
Patrn x 0.25
Patrn x 0.5
Patrn x 1

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Almacenar el suero patrn liofilizado refrigerado (2 a 8 C). Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las etiquetas del
vial.
Almacenar el suero patrn reconstituido refrigerado hasta 5 das.
Almacenar las soluciones de calibracin refrigeradas. Son estables durante un da.

6. PAPELES DE FILTRO - FINOS

Uso

Papeles de filtro finos precortados absorbentes, de un solo uso, para absorber las protenas que queden en el gel.

Conservacin

Les papeles de filtro finos deben conservarse en un lugar seco a temperatura ambiente o en la nevera.
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7. PAPELES DE FILTRO - GRUESOS

Uso

Papeles de filtro grueso precortados absorbentes, de un solo uso, para absorber las protenas que queden en el gel.

Conservacin

Los papeles de filtro gruesos deben conservarse en un lugar seco a temperatura ambiente o en la nevera.

* NOTA: Durante el transporte, los geles y el suero patrn de Lp(a) pueden permanecer a temperatura ambiente (15 a 30 C) durante 15 das sin
verse afectadas sus caractersticas.

REACTIVOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS

ATENCIN : Ver las fichas de datos de seguridad.

1. ETANOL PURO
2. SALINA
Preparacin

Preparar una solucin de NaCl 0.15 M (9 g/L) con agua destilada o desionizada.

Uso

Para la dilucin del suero patrn.

Para eliminar las protenas que queden en los geles.

Almacenamiento, estabilidad y seales de deterioro

Almacenar la solucin salina a temperatura ambiente o refrigerada. Desechar despus de 3 meses o si cambia su aspecto, por ejemplo, se vuelve
turbia debido a contaminacin microbiana. Para perodos de almacenaje superiores, aadir azida sdica, 1 g/L.

NOTAS :
Las pruebas realizadas durante la validacin de los reactivos muestran que, para las diferentes soluciones y usando material adaptado al volumen a
reconstituir, una variacin del volumen final de un 5 % no tiene ningn efecto adverso en el anlisis.
El agua destilada o desionizada, usada para la reconstitucin de las soluciones, debe estar exenta de contaminacin bacteriana o fngica (use un
filtro de 0,22 m) y debe tener una resistividad superior a 10 Megohms x cm.

EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS

1.
2.
3.
4.
5.

Fuente de alimentacin: MG 300 SEBIA, PN 1302 o MG 500 SEBIA, PN 1303.

Cubeta de Electroforesis: K20 SEBIA, PN 1400.
Tanques y Soportes para el procesado de los geles HYDRAGEL: Kit de Accesorios HYDRAGEL K20 SEBIA, PN 1420.
Pipetas: 5 L, 20 L, 100 L y 200 L.
Estufa-Secador para secar los geles de agarosa: IS 80 SEBIA, PN 1430.

MUESTRAS PARA ANALISIS

Extraccin y almacenamiento de muestras

Se recomienda analizar muestras de suero frescas. Los sueros deben obtenerse de acuerdo con los procedimientos establecidos de uso en los
laboratorios clnicos. Si es necesario, almacenar los sueros entre 2 y 8 C durante una semana ; congelar las muestras para perodos de almacenaje
superiores. Las muestras congeladas son estables durante un mes por lo menos.

Preparacin de las muestras

Usar muestras de suero tal cual.

PROCEDIMIENTO

I. MIGRACION

1. Desenvolver el gel. El gel puede ser convenientemente colocado encima de su recipiente cerrado.
2. Aplicar 5 L de muestra o de patrn diluido en cada pocillo. Cambiar la punta de la pipeta antes de cada aplicacin. No aplicar muestra o
patrn en el primer y ltimo pocillo, para evitar el efecto de borde. Llenarlos con 5 L de salina.
3. Dejar difundir las muestras en el gel durante 20 minutos.
4. Al usar la cubeta SEBIA K20, colocar el HYDRAGEL en el puente con la parte de agarosa hacia abajo ; el puente debe estar fuera de la
cmara para evitar que el tampn entre en los pocillos. Entonces, poner el puente en la cubeta con cuidado, con las muestras situadas en la
parte catdica. El gel se sumerge en el tampn alrededor de 1 cm por cada lado.
Ver las instrucciones de la caja de la cubeta K20 para ms detalles.
5. Conectar la cubeta a la fuente de alimentacin.

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CONDICIONES DE MIGRACIN
Volumen de tampn por compartimento
Volumen total de tampn
Tiempo de migracin
Voltaje constante
Corriente inicial (por gel)

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6. Tras la migracin, desconectar la cubeta y sacar el gel. Ponerlo en una superficie plana.
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SEBIA K20
150 mL
300 mL
4h
50 V
18 3 mA

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II. ELIMINACION DE LAS PROTEINAS RESTANTES

1. Aplicar un papel de filtro fino, previamente empapado con salina, sobre el gel. Aadir dos capas de papel de filtro grueso y colocar un peso
de 1 - 1.5 kg encima del montn durante 20 minutos. Asegurarse de que el peso est distribuido uniformemente. Cuando se procesan varios
geles a la vez, se pueden poner en el mismo montn.
2. Sacar los papeles de filtro. Lavar el gel en posicin vertical en salina durante un mnimo de 60 minutos.
3. Aplicar un papel de filtro fino, previamente empapado en salina, sobre el gel. Aadir dos capas de papel de filtro grueso y colocar un peso de
1 - 1.5 kg encima del montn durante 10 minutos.
4. Sacar los papeles de filtro. Secar el gel completamente en la estufa-secador a 80 C.

III. TINCION Y DECOLORACION

1. Sumergir el gel secado y enfriado, en posicin vertical, en la solucin de tincin durante 5 minutos.
2. Decolorar en tres baos sucesivos de solucin decolorante hasta que la coloracin de fondo haya desaparecido.
3. Eliminar el exceso de lquido de la superficie del gel con un papel suave y secar el gel en una corriente de aire a 80 C. Si es necesario,
limpiar la parte posterior (el lado de soporte del gel) con un papel suave humedecido.

IV. LECTURA

1. Medir los cohetes.

2. Construir la curva de calibracin, situando las concentraciones del patrn de Lp(a) en el eje de las X y las correspondientes alturas de los
cohetes en el eje de las Y.

CONTROL DE CALIDAD

Se aconseja incluir un suero control valorado (Suero Control Normal SEBIA, PN 4785) en cada procesado de muestras.

RESULTADOS
Valores

Para las muestras, medir las alturas de los cohetes de Lp(a), situarlos en el eje de las Y de la curva de calibracin. Leer directamente las
concentraciones de Lp(a).
Valores fisiolgicos: 0.3 g/L

Interpretacin

En un sujeto normolipmico, una concentracin plasmtica de Lp(a) por encima de 0.3 g/L se considera como un factor de riesgo arteriosclertico
importante.
Es hoy en da aceptado que el riesgo de desarrollar una enfermedad cardaca se ve multiplicado por 2.5 cuando el nivel de Lp(a) alcanza 0.5 g/L.

Resolucin de problemas

Llamar al Servicio de Asistencia Tcnica del distribuidor cuando falle el funcionamiento de la prueba pese a haber seguido cuidadosamente las
instrucciones para la preparacin y conservacin de los materiales y para el procedimiento de la tcnica.
Las hojas de seguridad de los diferentes reactivos del kit, as como las informaciones relativas a la eliminacin de los desechos, estn disponibles
en el Servicio de Asistencia Tcnica de su distribuidor.

CARACTERSTICAS TCNICAS

Los resultados siguientes, obtenidos mediante anlisis cuantitativo de un suero control, indican una muy buena reproducibilidad intraserial e interserial
de la tcnica HYDRAGEL Lp(a) en todos los aspectos probados, con un coeficiente de variacin medio del 1.8 % en la concentracin de lipoprotena
Lp(a).

Reproducibilidad intraserial

Se evalu la reproducibilidad intraserial analizando un suero control con la tcnica HYDRAGEL Lp(a) en 4 geles del mismo lote, a razn de 12 anlisis
por gel durante 2 das sucesivos.
La tabla siguiente presenta los resultados obtenidos para la concentracin de lipoprotena Lp(a) de este suero control analizado en cada gel : media,
desviacin tpica (SD) y coeficiente de variacin (CV %) (n = 12) :
Concentracin lipoprotena Lp(a)
Gel N 1
Gel N 2
Gel N 3
Gel N 4

Reproducibilidad interserial

MEDIA (g/L)

SD

CV (%)

0.015

2.8

0.527

0.014

0.536

0.010

0.525

2.6

0.013

0.534

2.5
1.9

Se evalu la reproducibilidad interserial analizando un suero control con la tcnica HYDRAGEL Lp(a) en 4 geles del mismo lote, a razn de 12 anlisis
por gel y durante 2 das sucesivos.
La tabla siguiente presenta los lmites de los valores medios, SD y CV (%) obtenidos para la concentracin de lipoprotena Lp(a) de este suero control,
y un coeficiente de variacin medio calculado a partir de todos los coeficientes de variacin (n = 12) :
Concentracin lipoprotena Lp(a)

MEDIA (g/L)

0.510 - 0.548

SD

0.004 - 0.013
- 25 -

CV (%)

0.8 - 2.5

CV MEDIO (%)
1.6

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BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY

1. Berg K. A new serum type system in man : the Lp(a) system. Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1963, 59, 369-382.
2. Carlson LA, Ericsson M. Quantitative and qualitative serum lipoprotein analysis. Part 1 : Studies in healthy men and women. Atherosclerosis, 1975,
21, 417-433.
3. Fruchart JC, Clavey V, Vanhoutte G. Mthodes dexploration biochimique des hyperlipoprotinmies. Path. Biol., 1983, 31, 4, 235-245.
4. Fruchart JC, Puchois P. Mthodes danalyses des lipoprotines. Ann. Biol. Clin., 1986, 44, 551-555.
5. Naito H. The association of serum lipids, lipoproteins, and apolipoproteins with coronary disease, assessed by coronary arteriography. Ann. Ny.
Ac. Sc., 1984, 454, 230-238.
6. Schreiner PJ, Morrisett JD, Sharett AP, Patsh W, Tyroler HA, Wu K, Heiss G. Lipoprotein (a) as a risk factor for preclinical atherosclerosis.
Arterioscler. Thromb., 1993, 13, 826-33.
7. Schreiver H, Assmann G, Sandkamp M, Schulte H. The relationship of lipoprotein (a) (Lp(a)) to risk factors for coronary disease. J. Clin. Chem.
Clin. Biochem., 1984, 22, 591-6.

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