UNIVERSIDAD NACIONAL

AUTNOMA DE MXICO
INSTITUTO DE
BIOTECNOLOGA
MTODOS FSICO-QUMICOS
EN BIOTECNOLOGA
PCR
ALUMNOS:
CORTAZAR MARTNEZ
ADRIANA
SILVA RINCN ELSA
PATRICIA
JUNIO, 2004

NDICE
Introduccin
Historia y Desarrollo
Metodologa bsica
Componentes de la reaccin
Nucletidos
Primers
Especificidad
Secuencias complementarias
Contenido de G/C
Secuencia de los extremos 3
Temperatura de asociacin
Clculo de la temperatura de fusin (Tm)
Programas de Diseo de Primers
Templado
Polimerasa
Concentracin de Magnesio
Otros componentes de la reaccin
Parmetros de la reaccin
Desnaturalizacin
Alineamiento
Extensin
Nmero de ciclos
Termocicladores
Identificacin de los productos de PCR
RT PCR
PCR en tiempo real
Tcnicas de deteccin
SYBR greenTM
Hydrolysis probes
Hairpin probes (Molecular BeaconsTM)
Hybridization probes
Scorpions
Cuantificacin
Genes estndares
El efecto de limitar los reactivos
PCR competitivos cuantitativos
Mquinas para PCR en tiempo real
Ventajas del tiempo Real
Primers Degenerados
Uso de los primers degenerados
Diseo de los primers degenerados
Alineacin de la secuencia
Informacin de la secuencia terminal de aminocidos
Degeneracin de primers

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La reaccin de PCR
El cct el de PCR
Los ciclos de PCR (el termociclador)
Problemas comunes
Secuenciacin
Controles
Long PCR
Aspectos Generales
Programa genrico para Long PCR para el Perkin Elmer 9600
Hot Start
PCR in situ
Principios y Mtodos
Otras variantes de la PCR
Multiplex PCR
Nested PCR
Clonacin de productos de PCR
Clonacin TA
Clonacin de extremos romos
Clonacin direccional a travs de primers modificados.
Clonacin de fragmentos largos de DNA
Mutagnesis por PCR
Mutagnesis con PCR-extensin solapada
Mutagnesis sitio dirigida
Aplicaciones especiales de la PCR
Bibliografa

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INTRODUCCIN
La biotecnologa, en un sentido amplio se puede definir como la aplicacin de
organismos, componentes o sistemas biolgicos para la obtencin de bienes y servicios. La
Ingeniera Gentica (I.G.), conocida como tecnologa del ADN recombinante in vitro, se
caracteriza por su capacidad de cortar y empalmar genes o fragmentos de ADN de
organismos distintos, creando nuevas combinaciones no existentes en la Naturaleza,
combinaciones que ponemos a trabajar en el interior de una variedad de organismos
hospederos, para nuestro provecho.
No cabe ninguna duda de que la tcnica ms revolucionaria de los ltimos 15 aos
ha sido la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), que ha dado nuevas alas a la propia
Ingeniera gentica y a toda la biologa molecular. Fue inventada por Kary Mullis a
mediados de los aos 80.
Muchas de las tcnicas clsicas de la Ingeniera gentica estaban encaminadas a
resolver el complejo problema de cmo clonar o localizar un gen o un segmento de ADN.
Sin embargo, esas tcnicas son a menudo largas y tediosas, y no es raro que no den
resultados. La PCR ha venido a cambiar el panorama, ya que permite en principio producir
in vitro grandes cantidades de una secuencia de ADN concreta sin recurrir a la clonacin en
un organismo husped. Esencialmente la tcnica permite la amplificacin selectiva de
cualquier segmento de ADN, conociendo las secuencias que lo flanquean. Como alguien ha
dicho, "es una tcnica que consigue encontrar la aguja en el pajar, al tiempo que produce un
pajar de agujas por amplificacin selectiva".
Las aplicaciones de la PCR y de sus numerosas variantes son prcticamente
ilimitadas:

simplifica muchos experimentos de I.G.

permite muchos estudios de expresin gentica
secuenciacin directa de secuencias amplificadas
deteccin de mutaciones
seguimiento de la efectividad de tratamiento de enfermedades
diagnsticos de enfermedades genticas e infecciosas
en ciencia forense: identificacin de restos biolgicos, determinacin de paternidad,
pruebas periciales en criminalstica
en arqueologa y paleontologa

HISTORIA Y DESARROLLO

Kary Mullis
Hasta mediados de la dcada del ochenta, la nica estrategia posible para aislar un
gen y obtener grandes cantidades del mismo en estado puro era el "clonado molecular".
Este mtodo se basa en la introduccin de fragmentos de ADN, uno de los cuales contendr
el gen de inters, en vectores. stos son molculas de ADN (plsmidos o ADN de
bacterifagos) capaces tanto de transportar fragmentos ajenos a su estructura original como
de multiplicarlos dentro de bacterias. Si se conoce un pequeo tramo de la secuencia de
aminocidos de una protena cuyo gen se desea "clonar" (multiplicar), se pueden disear
mtodos para identificar qu bacterias llevan el vector que transporta dicho gen. Este
reconocimiento tambin se puede realizar si se dispone de un anticuerpo contra la protena
resultante del gen que se desea clonar. En este caso se reconoce la bacteria portadora
porque fabrica la protena codificada por el fragmento de inters, la cual se une
especficamente al anticuerpo.
Una vez aislado el gen no slo resulta posible determinar con exactitud su secuencia
de bases o analizar en detalle la informacin de la que es portador, sino que tambin se
puede estudiar su expresin (la manera en que dirige la sntesis de la protena
correspondiente) en distintos organismos y tipos celulares, introducido en clulas en cultivo
o en animales de experimentacin, etctera. Estas tcnicas, ya clsicas, han permitido el
aislamiento y caracterizacin de decenas de miles de genes de microorganismos, animales y
plantas, lo que provoc un cambio cualitativo en la comprensin del funcionamiento de la
clula.
En 1985, K. Mullis, un investigador de la Corporacin Cetus, invent un mtodo
para lograr la multiplicacin in vitro de fragmentos definidos de ADN sin necesidad de
recurrir a los vectores y su replicacin en bacterias. Este mtodo revolucionara en corto
tiempo el conjunto de tcnicas de la biologa molecular. Su uso se extendi rpidamente a
miles de laboratorios, no slo de investigacin bsica, sino tambin de diagnstico clnico.
Se trata de la reaccin en cadena de la polimerasa, ya muy conocida como PCR, siglas
provenientes del ingls Polymerase Chain Reaction.

Esta tcnica permite multiplicar ("amplificar" es, en realidad, el trmino que se ha

impuesto) pequeas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. El
tramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta ms de dos mil
nucletidos de longitud. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar
necesariamente en estado puro, sino que puede ser parte de mezclas complejas.
Cuando el proceso era manual la tcnica de PCR era lenta y requera de trabajo
intensivo. Por lo tanto, los cientficos de Cetus comenzaron a buscar las maneras de
automatizar el proceso.
Para replicar el ADN, la tcnica PCR hizo uso, en un principio, de la ADN
polimerasa de la bacteria Escherichia coli. Pero esta enzima resulta desactivada debido a la
alta temperatura requerida para desnaturalizar la doble cadena del ADN, por lo cual deba
agregarse enzima fresca al comenzar el tercer paso de cada ciclo. La primera mquina
termocicladora, "Mr. Cycle" fue creada por los ingenieros de Cetus para tratar esa
necesidad de agregar la enzima fresca a cada tubo de prueba despus del calentamiento y
del proceso de enfriamiento. Sin embargo, este inconveniente fue solucionado de manera
ingeniosa cuando se la reemplaz por su equivalente de la bacteria "termfila" Thermus
aquaticus. En efecto, la ADN polimerasa de este microrganismo, denominada Taq
polimerasa, acta eficientemente entre los 75C y los 80C y resiste ms de dos horas a
93C.
La purificacin de la polimerasa de Taq dio lugar a la necesidad de una mquina
que realizara un ciclo ms rpidamente entre diversas temperaturas. En 1985, Cetus se
asoci con la corporacin Perkin-Elmer e introdujo la DNA Termal Cycler. De esta
manera es posible mezclar todos los componentes de la PCR al comenzar el primer ciclo y
la reaccin en cadena puede llevarse a cabo mediante equipos automatizados que realizarn
los ciclos trmicos programados.
En 1989, Cetus anunci un acuerdo de colaborar con Hoffman-LaRoche en el
desarrollo y la comercializacin de productos de diagnstico humanos in vitro y de
servicios basados en tecnologa de PCR.
En 1990, los cientficos alcanzan la primera amplificacin y deteccin simultnea de
las secuencias especficas de DNA usando un colorante fluorescente, poniendo el
fundamento para la PCR en tiempo real o PCR "cintico" (pruebas TaqMan).
En 1991 Hoffmann-La Roche Inc. adquiere los derechos y las patentes mundiales de
la PCR.
El Dr. Kary Mullis comparte el premio Nobel de Qumica en 1993 por inventar la
tecnologa de PCR.

METODOLOGA BSICA

Componentes de la reaccin
Los nucletidos
Los nucletidos se diluyen en agua, la solucin debe ser protegida (por ejemplo con
el 10mM Tris pH 7,7-8,0 , concentracin final) . Si no, un pH cido promover la hidrlisis
del dNTP en dNDP y dNMP y los har intiles para las reacciones de polimerizacin de la
DNA enzimtica. Los stocks son diluidos a 10 mM, alicuotados y almacenados a -20 C.
Es recomendado usar un stock de trabajo que contenga 1mM de cada dNTP.
La estabilidad de los dNTP durante ciclos repetidos de PCR es tal que
aproximadamente el 50% permanece como dNTP despus de 50 ciclos.

Concentraciones entre 20 y 200 M resultan en un balance ptimo entre

rendimiento, especificidad y fidelidad. Los cuatro dNTP deben ser usados en
concentraciones equivalentes para minimizar errores de incorporacin de bases. Se debe
decidir la mas baja concentracin adecuad de dNTP para la longitud y composicin de la
secuencia blanco. Por ejemplo, 20 M de cada dNTP en una reaccin de 100 l es
suficiente para sintetizar 2.6 g de DNA o 100 pM de una secuencia de 400 bp.
Primers
Los oligonucletidos iniciadores o primers son fragmentos complementarios que se
van a unir a cada una de las dos cadenas separadas del templado de ADN.
La seleccin de oligonucletidos iniciadores es muy importante en la reaccin en
cadena de la polimerasa. De este paso depende el xito en el laboratorio. En la tabla 1 se
muestran los criterios principales a considerar para la seleccin adecuada de los primers.
Tabla 1. Criterios Principales

Tamao

Tamao ideal: 20-25 nucletidos de longitud

generalmente: 18-30 nucletidos de longitud

Base en el extremo 3'

Debe ser una G o una C

Temperaturas de fusin
50-65 C
(Tm)
contenido GC

40-60%

auto-complementariedad

Debe ser evitada

Para minimizar la formacin de estructuras secundarias y
los dimeros de primer

Similaridad

Debe tener un 100% de apareamiento con el molde

Cuando el objetivo a amplificar es un locus, la posicin de los iniciadores debe ser

relativa a los codones de inicio y terminacin. Es recomendable que el cebador "forward"
se encuentre mas o menos a 35 pb del inicio de la secuencia que codifica, de la misma
forma el cebador "reverse" debe localizarse 35 pb despues de la regin que codifica.
Las concentraciones ptimas de los primers son generalmente entre 0.1 y 0.5 M.
Altas concentraciones de primer pueden promover mispriming y acumulacin de
producto no especfico y puede incrementar la probabilidad de generar un templado
independiente llamado dmero de primer. Los productos no especficos y los dmeros de
primers son por si mismos sustratos para PCR y compiten con el producto deseado por la
enzima, dNTPs y primers, resultando en un bajo rendimiento del producto deseado.
Los primers pueden contener extensiones en el extremo 5 o mismatches para
incorporar sitios de enzimas de restriccin, un codn de inicio ATG, o secuencias
promotoras en la secuencia blanco. Pueden ser usados primers degenerados para extraer
genes nuevos en base a su similitud o su secuencia de aminocidos.
5

Una razn menos obvia por la que los primers fallan es la presencia de estructuras
secundarias en el templado de DNA. En este caso la substitucin de dGTP por 7-deazo-2deoxiGTP ha sido muy usada
Especificidad
La especificidad de los primers es en parte dependiente de su longitud. Los primers
deben ser elegidos de modo que tengan una secuencia nica dentro del DNA que ser
amplificado. Un primer diseado con una secuencia altamente repetida dar lugar a
productos no deseados. Sin embargo, el mismo primer puede dar una sola banda si se
amplifica una sola clona de una biblioteca genmica.
Secuencias Complementarias del primer
Los primers necesitan ser diseados con menos de 3 pares de bases de homologa
entre ellos. Si un primer tiene tal regin de homologa se formarn estructuras parciales de
doble cadena que interferirn con el alineamiento. Si la homologa ocurre en el extremo 3'
de cualquier primer, ocurrir la formacin de dmeros de primer que, a menudo, prevendr
la formacin del producto deseado por competicin.
Contenido de G/C
La composicin base de los primers debe estar entre el 45% y el 55% de G/C. La
secuencia de los primers debe ser elegida de tal forma que no haya regiones de poliG o de
poliC que pueden promover el reconocimiento no especfico. Las regiones poliA y poliT
deben tambin ser evitados ya que interfieren con el complejo del primer-templado. Esto
puede bajar la eficacia de la amplificacin. El primer tendr un contenido de G/C del 50% y
~20 bases de largo. Esto pondr la Tm en la gama de 56C - 62C.
Secuencia de los extremos 3'
Es establecido que la posicin terminal 3' en primers de PCR es esencial para el
control del mispriming. La inclusin de un residuo de G o de C en el extremo 3' de los
primers ayuda a asegurar el correcto enlace en el extremo terminal 3' debido al enlace de
hidrgeno ms fuerte de los residuos G/C. Tambin ayuda a mejorar la eficacia de la
reaccin reduciendo al mnimo la respiracin que pudo ocurrir.
Temperatura de Asociacin
La temperatura de asociacin de los primers es uno de los factores ms
determinantes de la reaccin. Se recomienda que se emplee como temperatura de
asociacin la temperatura de fusin -5C, aproximadamente. Existen muchos mtodos para
calcular la temperatura de fusin, pero siempre, despus de efectuado el clculo es
necesario ir al laboratorio y ensayar con diferentes temperaturas de asociacin cercanas a la
temperatura de fusin para determinar la temperatura ptima para cada reaccin.

Clculo de la temperatura de fusin (Tm)

Existen muchos mtodos para estimar el valor de la temperatura de fusin.
Para secuencias de 20 bp o menos, existe la siguiente aproximacin:
Tm = 2C (A + T) + 4C (G + C)
donde se asume una concentracin de sal de 0.9M, tpica de "dot blot" y otros ensayos de
hibridizacin
A continuacin tenemos otra expresin para el clculo de Tm
Tm = 81.5 + 0.41(%GC) - 500/L + 16.6 log[M],
donde L se refiere a la longitud del oligonucletido, y [M] es la concentracin de cationes
monovalentes. Esta frmulas es nicamente aplicable a secuencias polinucleotdicas largas.
El mtodo mas preciso para estimar la Tm de oligornucletidos est basado en el
anlisis termodinmico del proceso de fusin del cual se puede mostrar que,

Los cambios en la entalpa (

) y la entropa (
) de la formacin del dplex se
calculan a partir de parmetros termodinmicos de vecindades. R es la constante molar de
los gases (1.987 cal.K-1mol-1), y C es la concentracin molar del oligonucletido. Se
puede adicionar un segundo trmino a la ecuacin anterior para tener en cuenta el efecto
estabilizante de la sal sobre el dplex:

Los efectos de Na+ y K+ son equivalentes dentro de los mrgenes del error
experimental.
Programas de Diseo de Primers
Existen programas disponibles en la red que ayudan al diseo de primers. Por
ejemplo:
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
http://alces.med.umn.edu/rawprimer.html

Templado
Una de las caractersticas ms atractivas de la PCR es que la cantidad y calidad de la
muestra de DNA sujeta a amplificacin no necesita ser alta. Una sola clula o un lisado
celular crudo o especimenes con una longitud promedio de unos pocos cientos de pares de
bases son usualmente adecuadas para una amplificacin exitosa. El criterio esencial es que
la muestra contenga al menos una cadena de DNA intacta que abarque la regin que va a
ser amplificada y que las impurezas sean suficientemente diluidas como para no inhibir la
polimerizacin.
La polimerasa

Un rango de concentracin recomendado para Taq polimerasa (Perkin-Elmer

CETUR) es entre 1 y 2.5 unidades (SA = 20 unidades/pmol) por 100 l de reaccin
cuando los otros parmetros son ptimos. Sin embargo, los requerimientos de enzima
pueden variar con respecto a la secuencia blanco o los primers. Cuando se optimiza un
PCR, se recomienda probar rangos de concentracin de enzima de 0.5 a 5 unidades/100 l.
Si la concentracin de la enzima es muy alta se acumulan productos no especficos, y si es
muy baja se formara una cantidad insuficiente del producto deseado.
Tabla 2. Caractersticas de algunas polimerasas termoestables de DNA
Enzima
Taq Pol
Tli Pol (Vent)
Pfu Pol
Ruth

Eficiencia
Relativaa
88
70
60
n.d.

Tasa de errorb
2x10-4
4x10-5
7x10-7
n.d.

Procesividad

55
7
n.d.
30

Tasa de
Extensind
75
67
n.d.
60

3 a 5
exo
no
si
si
no

5 a 3
exo
si
no
no
si

Porcentaje de conversin de templado a producto por ciclo.

Frecuencia de error por pares de bases incorporadas.
c
Nmero promedio de nucletidos adicionados antes de la disociacin.
d
Nmero promedio de nuclotidos adicionados por segundo.
n.d. = no determinado
b

Concentracin de Magnesio
Es benfico optimizar la concentracin del in magnesio, ya que afecta: el
alineamiento de los primers, la temperatura de disociacin de las cadenas, tanto del
templado como del producto de PCR, la especificidad del producto, la formacin de
dmeros de primer y la actividad y fidelidad de la enzima. La Taq polimerasa requiere
magnesio libre en la unin con el templado, los primers y los dNTPs. Los PCR deben
contener 0.5 a 2.5 mM de magnesio sobre el total de la concentracin de dNTP. La
presencia de EDTA u otros quelantes en el stock del primer o del templado puede alterar la
concentracin ptima aparente de magnesio.
Otros componentes de la reaccin
Un buffer recomendado para PCR es de 10-50 mM de Tris-HCl (pH entre 8.3 -8.8).
Tris es un buffer inico bipolar que tiene un pKa de 8.3 a 20C y un _ pKa de -0.021/C sin
embargo el verdadero pH de una buffer 20mM de Tris (pH 8.3 a 20C) varia entre 7.8 y 6.8
durante las condiciones tpicas del termociclador.
Hasta 50 mM de KCl puede ser incluido en la mezcla de reaccin para facilitar el
alineamiento de los primers. NaCl a 50 mM o KCl arriba de 50 mM inhibe la actividad de
la Taq polimerasa.
La gelatina o la albmina bovina (100 g/ml) y detergentes no inicos como el
tween 20 o laureth 12 (0.05 a 0.1% ) son incluidos para ayudar a estabilizar la enzima, sin
embargo muchos protocolos trabajan bien sin estos componentes.
Parmetros de la reaccin

Con la PCR se realiza in vitro el proceso de replicacin del ADN. Est basado en la
accin de la polimerasa, que como se sabe es la enzima que dirige la sntesis de ADN, y
desde una cadena simple de ADN sintetiza la complementaria. Para ello necesita al menos
una pequea fraccin de cadena doble de ADN para iniciar la sntesis. Esto hace posible, si
de forma voluntaria le proponemos una pequea fraccin de oligonucletidos que sean
complementarios de una porcin, se unir despus de la desnaturalizacin de la doble
cadena y mediante el crecimiento hacia el extremo 3 del DNA por aposicin de los
nucletidos correspondientes suministrados y, a travs de la accin de la polimerasa, se
hace la amplificacin del fragmento deseado.
La PCR es un proceso que consta de tres pasos.

Desnaturalizacin.

La primera reaccin consiste en la desnaturalizacin del DNA, separndose las dos

cadenas por ruptura de los enlaces de hidrgeno.
Las condiciones tpicas de desnaturalizacin son 95C por 30 segundos, o 97C por
15 segundos; sin embargo temperaturas ms altas pueden ser apropiadas especialmente para
templados ricos en G + C.
La desnaturalizacin incompleta permite el apareamiento de las hebras de DNA y
por lo tanto se reduce el rendimiento el producto. En contraste, los pasos de
desnaturalizacin a altas temperaturas o por mucho tiempo provocan perdida de la actividad
de la enzima.
Alineamiento.

La segunda reaccin consiste en la hibridacin de los primers. Para ello se baja la

temperatura y las condiciones sern tales que se facilitar la unin de los primers a las
cadenas.
La temperatura y el tiempo requerido para el alineamiento de los primers depende
de la composicin, tamao y concentracin de los primers amplificadores. Una
temperatura de alineamiento ptima es 5C por debajo de la Tm de los primers. Debido a
que las DNA polimerasas son activas en un amplio rango de temperaturas, la extensin de
los primers puede ocurrir a bajas temperaturas incluyendo el paso de alineamiento. El rango
de actividad de las enzimas varia en dos ordenes de magnitud entre 20 y 85C. Las
temperaturas de alineamiento en el rango de 55 a 72C genera buenos resultados.

10

Extensin.

La tercera reaccin se efecta a 72 C, temperatura a la cual, la polimerasa lleva a

cabo su accin, insertando los diferentes nucletidos complementarios en el orden que le va
indicando la cadena que acta como molde.
El tiempo de extensin depende de la longitud y concentracin de la secuencia
blanco y de la temperatura. La extensin del primer se realiza tradicionalmente a 72C.
Las estimaciones para la tasa de incorporacin de nucletidos a 2C varia de 35 a 100
nucletidos por segundo dependiendo del buffer, pH, concentracin de sales y la naturaleza
del templado. Un tiempo de extensin de un minuto es considerado suficiente para
productos de hasta 2 kb de longitud. Sin embargo, tiempos mayores de extensin pueden
ser tiles cuando la concentracin del sustrato es muy pequea o cuando la concentracin
del producto excede la concentracin de la enzima.
Nmero de ciclos.
Los tres pasos anteriores constituyen un ciclo. La repeticin de este ciclo unas 40
veces, por ejemplo, permite obtener, como resultado de un experimento de amplificacin,
millones de copias del fragmento de inters.
El nmero ptimo de ciclos depender principalmente de la concentracin inicial
del templado cuando los otros parmetros son optimizados. Un error comn es el de
ejecutar demasiados ciclos, ya que esto puede incrementar la cantidad y complejidad de
productos no especficos. Pocos ciclos dan como resultado un bajo rendimiento del
producto.
La cantidad de DNA dobla tericamente con cada ciclo de PCR, segn lo
demostrado en la Tabla 3. Despus de cada ciclo, la cantidad de DNA es dos veces la
anterior, as que despus de dos ciclos tenemos 2 x 2 veces, despus de 3 ciclos - 2 x 2 x 2
veces u 8 (23) veces la cantidad inicial, despus de 4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2 veces o 16 (24).
As, despus de N ciclos tendremos 2N.

11

Tabla 3. Relacin entre cantidad de DNA y el nmero de ciclos.

Termocicladores

El termociclador es el aparato que permite llevar a cabo de forma automtica y

reproducible la sucesin de ciclos de temperatura necesarios para la PCR.
Los primeros termocicladores eran robots que movan una gradilla de tubos entre
varios baos termostticos a tiempos preestablecidos. Los actuales constan, bsicamente, de
un bloque de metal que puede ser calentado o enfriado, con posibilidad de programar las
temperaturas y los tiempos.
Existen multitud de termocicladores en el mercado, aunque las caractersticas
principales son las siguientes:

Constan de un bloque trmico, cuyo calentamiento y enfriamiento se produce a gran

velocidad, gracias al denominado sistema Peltier. Las rampas de subida y bajada de
temperatura son importantes para trasladar los protocolos entre termocicladores, y

12

uno de los factores de falta de reproducibilidad, lo que hace que deban ajustarse de
nuevo las condiciones de tiempos y temperaturas.
Actualmente, estn diseados mayoritariamente para tubos de 0,2 ml aunque an
existen tambin para 0,5 ml. Es importante el perfecto ajuste del tubo en el bloque. Por ello,
se recomienda utilizar los de la misma marca que el fabricante.
El rango de temperaturas suele abarcar de 4C a 110C, aunque el rango habitual
debe ser de 15C a 95C. No debe sobrecargarse al aparato con temperaturas extremas para
prolongar su supervivencia. Los 4C se utilizan para refrigerar muestras tras una PCR, pero
15C tambin es una temperatura apta para ello. Respecto a llegar a 100C o ms, tampoco
es aconsejable, al menos, de forma habitual. Es preferible emplear termobloques para llevar
a cabo esta labor.
Existen bloques que permiten ajustar distintas temperaturas en funcin de las zonas
del mismo. Se dice que tienen funcin gradiente. Son muy tiles cuando se realiza ajuste
continuo de programas de PCR, especialmente de temperaturas de hibridacin, o cuando se
necesitan realizar diversos protocolos de forma simultnea.

Tapa trmica: los ms antiguos no la poseen, pero es un elemento indispensable

para evitar la evaporacin de la muestra, al contactar totalmente con la tapa del
tubo.

Software para programacin de tiempos y temperaturas: se denomina programa a

cada conjunto de datos trmicos y temporales de un protocolo de PCR. Cada
termociclador tiene su propio software. Puede ajustarse tambin la velocidad de
subida y bajada de temperaturas, es decir, las rampas.
Identificacin de los productos de PCR

El hecho de que las molculas de ADN obtenidas al finalizar la reaccin en cadena

correspondan efectivamente al fragmento de inters queda asegurado por la intervencin de
los primers que definen los extremos "derecho" e "izquierdo" de ese fragmento. As, una
vez que la reaccin ha finalizado, el tamao del fragmento multiplicado puede determinarse
sometiendo los productos de la reaccin a una electroforesis en gel de agarosa o
poliacrilamida, es decir, a un proceso de separacin por difusin bajo la accin de un
campo elctrico.
Por otra parte, la identidad del producto puede ser confirmada mediante hibridacin
(unin complementaria) con una sonda marcada radiactivamente, cuya secuencia de bases
est contenida en el fragmento de inters. En este caso se procede as: el ADN fraccionado
por electroforesis es desnaturalizado y luego transferido a una membrana de nitrocelulosa o
nylon, que acta como soporte slido (Southern blot), y luego es puesto en contacto con la
sonda, que se unir al fragmento buscado ya que ha sido preparada de modo tal que resulta
ser complementaria del mismo. Tambin es posible colocar el ADN directamente en la
membrana en forma de pequeas manchas (dot blot) para su posterior hibridacin con la

13

sonda. La localizacin de las sondas radiactivas se logra, en ambos casos, mediante

autorradiografas

Figura 1. Tres formas de analizar los fragmentos de ADN amplificados mediante la tcnica PCR. A:
visualizacin directa. Las muestras colocadas sobre un gel y sometidas a la accin de un campo elctrico
(electroforesis) migran de una manera caracterstica que se puede visualizar por tincin (coloreado) del ADN.
(Carriles 1-8: productos de distintas PCRs; carril M: marcadores de ADN de tamao conocido.) B: Southern
blot. El ADN es desnaturalizado (separacin de sus hebras constituyentes) y transferido a una membrana de
nitrocelulosa o nylon para luego incubar la hibridacin (unin) con una sonda radiactiva. sta quedar fijada
donde se encuentre el tramo de ADN de inters y su presencia se revelar a travs de una autorradiografa
(placa fotogrfica sensible a la emisin radiactiva de la sonda). C: dot blot. Mtodo anlogo al anterior, pero
practicado sobre una siembra en forma de manchas de los fragmentos de ADN a analizar previamente
desnaturalizados.

Una estrategia distinta para confirmar la identidad del fragmento replicado consiste
en realizar dos reacciones de PCR consecutivas. Al finalizar la primera, una alcuota de la
misma es sometida nuevamente al proceso de multiplicacin tras haber colocado dos
primers internos. Mediante el empleo de esta metodologa, conocida como nested PCR
(PCR anidada), la filiacin de los fragmentos obtenidos queda confirmada por el hecho de
que poseen tamaos previsibles.
En algunos casos, los productos amplificados poseen secuencias que son
reconocidas por ciertas enzimas llamadas en endonucleasas de restriccin. La
determinacin del tamao al que quedan reducidos los fragmentos al ser puestos en
contacto con la enzima de restriccin adecuada indica que nos encontramos ante los
segmentos de inters.

14

RT PCR
Dado que el RNA usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es
necesario hacer una transcripcin reversa (RT) antes de iniciar la amplificacin por PCR.
La transcripcin reversa genera una copia de la hebra de RNA, pero esta copia es DNA
complementario (cDNA) el cual es estable al calor y puede resistir la metodologa PCR.
Los pasos de la RT-PCR son:
1. Transcripcin reversa: Unin del primer a la secuencia de RNA objetivo.
2. Transcripcin reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensin del primer mediante
la incorporacin de nucletidos complementarios.
3. Fin de transcripcin reversa, se obtiene la hebra del cDNA complementario al RNA.
4. PCR.
El mRNA es copiado a cDNA por la transcriptasa reversa usando un primer dT (los
primers al azar se pueden tambin utilizar)(Figura 2). En PCR en tiempo real, se utiliza
generalmente una transcriptasa reversa que tenga una actividad endo H. Esto elimina el
mRNA permitiendo que la segunda hebra de DNA sea formada. Se adiciona una mezcla de
PCR que incluya una polimerasa termoestable (tal como la Taq polimerasa), los primers
especficos para el gen de inters, los deoxinucletidos y un buffer conveniente.

Figura 2. Conversin de mRNA a cDNA por la transcriptasa reversa

El cDNA se desnaturaliza a mas de 90 (~94), las dos hebras se separan. A 50 o 60

los primers especficos se alinean con el sitio complementario en cada cadena. Los sitios de
unin a los primers deben estar separados 400 bases, pero generalmente se encuentran a
100 bases de distancia especialmente cuando se usa el PCR en tiempo real
A 72 la polimerasa extiende el DNA desde los primers. Se obtienen 4 cadenas de
cDNA.

15

Despus de 30 o 40 ciclos de sntesis de cDNA, los productos de reaccin son

analizdos usualmente por electroforesis en gel de agarosa. El gel se tie con bromuro de
etidio. Los geles de agarosa para analizar los productos de cDNA de la RT-PCR no nos
permite la cuantificacin ya que el bromuro de etidio es muy insensible y cuando una banda
es perceptible sobrepasa la etapa logartmica de amplificacin.
El bromuro de etidio es un colorante que se une a la doble cadena de DNA
intercalandose entre los pares de bases. Emite luz fluorescente cuando se irradia en la
parte UV del espectro. Sin embargo, la fluorescencia no es muy brillante. Otros colorantes,
como el SYBR green, que son mucho ms fluorescentes que el bromuro de etidio, se
utilizan en el PCR en tiempo real (Figura 3).

Figura 3. El SYBR green fluoresce brillantemente solo cuando se une a DNA de doble cadena.

PCR EN TIEMPO REAL

La RT-PCR es solamente semicuantitativa en el mejor de los casos, en parte por la
insensibilidad del bromuro de etidio (sin embargo, hay maneras ms sensibles de detectar el
producto). Los protocolos de PCR competitivos se han desarrollado para hacer el mtodo
ms cuantitativo pero son a menudo complicados. As la PCR en tiempo real fue
desarrollado debido a:

La necesidad de cuantificar diferencias en la expresin del mRNA

La disponibilidad de cantidades pequeas de mRNA en algunos procedimientos,

Hay una variedad de mtodos para la cuantificacin del mRNA.

stos incluyen:

northern blotting
anlisis de proteccin de ribonucleasa (RPA)
hibridacin in situ
PCR

16

La PCR es el mtodo ms sensible y puede discriminar entre mRNAs cercanamente

relacionados. Es una tcnico simple pero es difcil conseguir resultados verdaderamente
cuantitativos usando PCR convencional.
El northern blotting y RPAs son patrones excelentes, puesto que no hay
amplificacin implicada, mientras que la hibridacin in situ es cualitativo ms que
cuantitativo.
Las tcnicas tales como el northern blotting y los RPAs trabajan muy bien, pero
requieren ms RNA del que a veces se dispone. Los mtodos de PCR son por lo tanto
particularmente valiosos cuando las cantidades de RNA son bajas, puesto que el hecho de
que la PCR implica un paso amplificacin significa que es ms sensible. Sin embargo, la
PCR tradicional es solamente semicuantitativa en parte debido a las dificultades de
observar la reaccin durante la parte verdaderamente linear del proceso de la amplificacin.
En contraste con la RT-PCR y el anlisis de los geles de agarosa, la PCR en tiempo
real da resultados cuantitativos. Una ventaja adicional de la PCR en tiempo real es la
relativa facilidad y conveniencia de su uso comparadas a algunos mtodos ms viejos.
Los productos de amplificacin se observan a medida que transcurren los ciclos de
la PCR.
Est basado en:

la deteccin y cuantificacin de un reportero fluorescente, cuya seal aumenta en

proporcin directa a la cantidad de producto de PCR en la reaccin.
el empleo de un termociclador que tiene acoplado un sistema de deteccin que es
capaz de adquirir y cuantificar la seal emitida por el reportero al final de cada ciclo
para cada muestra.
Tcnicas de deteccin

La qumica de la deteccin est dada por:

Agentes intercalantes fluorescentes (SYBR Green)

Sondas hidrolizadas
Hairpin probes (Molecular Beacons, Scorpions)
Sondas de hibridizacin.

SYBR greenTM
Es un agente intercalante que se une al ADN de doble cadena dando un incremento
de la fluorescencia a medida que aumenta la cantidad de producto de PCR.
Es simple y econmico, fcil de usar, sensible, verstil y no se necesitan sondas
especficas. Sin embargo durante la reaccin de PCR puede unirse a dmeros de primers

17

y a otros productos inespecficos, resultando en una sobreestimacin de la concentracin

del DNA blanco.
Hydrolysis probes (TaqManTM)
Se emplea una sonda que tiene unidos un fotocromo reportero y un fotocromo
quencher. Cuando ambos fotocromos estn unidos a la sonda, el reportero no emite seal.
Pero, cuando la sonda hibrida con la secuencia de inters durante la reaccin de PCR, la
actividad exonucleasa de la Taq polimerasa corta al fotocromo reportero del resto de la
sonda, permitiendo la emisin una seal fluorescente (Figura 4). Se monitorea la seal
fluorescente del reportero que se va acumulando en los sucesivos ciclos de PCR.

Figura 4. Hydrolysis probes

Hairpin probes (Molecular BeaconsTM)

Estas sondas poseen secuencias repetidas invertidas (ITR) en sus extremos 5y 3.
Este diseo permite que se forme una estructura de horquilla (hairpin) por
complementariedad de las dos regiones ITR, en ausencia de la secuencia blanco.
La secuencia interna de la sonda es complementaria al blanco, dirigiendo as la
hibridacin especfica, resultando en una eficiente separacin del quencher y del reportero
y la consecuente emisin de este ltimo (Figura 5).

18

Figura 5. Funcionamiento de las Hairpin probes (Molecular BeaconsTM)

Entre sus ventajas estn el que son ms especficas que las sondas TaqMan (deben
tener un cambio conformacional para hibridar con el blanco), permiten distinguir dos
secuencias blanco muy similares entre s y que se pueden combinar varias Molecular
Beacons en una nica reaccin empleando diferentes compuestos fluorescentes para
identificar secuencias blanco especficas distintas (Mltiplex PCR).
Se requiere de un riguroso diseo de las regiones tallo y asa de la horquilla.
Hybridization probes
El diseo implica el uso de dos secuencias de oligonucletidos especficos como
sondas, cada una marcada con un fluorforo diferente, comnmente, el extremo 3de la
sonda donadora con fluorescena y el extremo 5de la sonda aceptor con LC Red 640 o LC
Red 705 (Figura 6).
Las dos sondas estn diseadas para hibridar en sus blancos especficos en un
arreglo cabeza-cola que permite que ambos fluorforos estn en estrecha proximidad
entre s. As, la transferencia de energa de resonancia slo ocurre cuando ambas sondas
se hibridan al blanco muy prximas entre s, siendo la distancia ptima de 1 a 5 bases
entre las sondas.

19

Figura 6. Hybridization probes

En comparacin con las otras dos tcnicas, estas sondas estn marcadas con un
nico fluorocromo. Esto hace que sean ms fciles de sintetizar y caracterizar, y que el
control de calidad sea ms sencillo que para las sondas doblemente marcadas.
Scorpions
Los scorpions son primers de PCR con una cola tallo y asa ("Stem-Loop") que
contiene un fluorforo y un quencher. La estructura de tallo y asa es separada de la
secuencia de del primer de PCR por una modificacin qumica que evita que se copie la
secuencia de tallo y asa del scorpion (Figura 7).
Durante la PCR, los primers de scorpions se amplifican para formar productos de
PCR. En la etapa apropiada del ciclo de PCR (la fase de alineamiento), la secuencia de la
sonda en la cola del Scorpion se enrosca para hibridarse a la secuencia blanco en el
producto de PCR. Como la cola del scorpion y del producto de PCR es ahora parte de la
misma hebra de DNA, la interaccin es intermolecular. La secuencia blanco se elige
tpicamente para estar 3 bases dentro del extremo 3' del primer scorpion.

20

Figura 7. Scorpions

Cuantificacin
La capacidad de monitorear el progreso en tiempo real de la PCR revolucion
totalmente la manera de cuantificacin basada en la PCR de DNA y de RNA. Las
reacciones son caracterizadas en el momento en el que la amplificacin de un producto de
PCR se detecta despus de un nmero fijo de ciclos. Cuanto ms alto es el nmero de
copias del blanco, ms pronto se observa el aumento significativo en la fluorescencia.
En la figura 8 se muestra un diagrama representativo de la amplificacin. Un
diagrama de amplificacin es una grfica de la seal de la fluorescencia contra el nmero
de ciclos. En los ciclos iniciales de PCR, hay un pequeo cambio en seal de fluorescencia.
Esto define la lnea de fondo para el diagrama de la amplificacin. Un aumento en
fluorescencia sobre la lnea de fondo indica la deteccin del producto acumulado de PCR.

Figura 8. Diagrama de Amplificacin

21

Se adquieren los datos cuando la amplificacin est todava en la fase exponencial.

Esto est determinado por la identificacin del nmero de ciclo al cual la intensidad de
emisin del fluorforo aumenta con respecto al ruido de fondo (background). Este nmero
de ciclo se llama ciclo umbral (Ct: threshold cycle). El Ct est determinado en la fase
exponencial de la reaccin y es ms confiable que las mediciones en el punto final
convencionales (Figura 9). El Ct es inversamente proporcional al nmero de copias del
DNA blanco: a mayor concentracin de blanco, menor Ct medido.

Figura 9. Ciclo Umbral (Ct)

La grfica del logaritmo del nmero inicial de copias del blanco para un sistema de
estndares contra Ct es una lnea recta (Figura 10). La cuantificacin de la cantidad de
blanco en muestras desconocidas es lograda midiendo Ct y usando la curva estndar para
determinar el inicio del nmero de copias. El proceso entero de calcular los Cts, de
preparar una curva estndar, y de la determinacin del nmero de copias iniciales para las
muestras es realizado por el software del sistema 5700 y 7700.

Figura 10. Curva Estndar

22

La figura 11a muestra la amplificacin, usando el sistema 5700, del gen humano de
la -actinia en diluciones de DNA genmico. En esta figura, el cambio en la fluorescencia
del SYBR Green se grafica contra el nmero de ciclos. Se corrieron seis rplicas para cada
cantidad de DNA. La figura 11b muestra los mismos datos, pero graficando el logaritmo
del cambio en la fluorescencia contra el nmero de ciclos. El software del sistema 5700
calcula el Ct para cada reaccin. Los valores de Ct se trazan contra el logaritmo de la
cantidad inicial de DNA genmico para dar la curva estndar mostrada en la figura 11c

Figura 11. Amplificacin de la -actinia.

Estos tres diagramas ilustran los principios bsicos de la cuantificacin en tiempo

real de PCR. Cuanto ms alta es la cantidad inicial de DNA genmico, mas pronto se
detecta el producto acumulado en el proceso de PCR, y ms bajo es el valor de Ct. Los
valores de Ct son reproducibles en las rplicas porque el umbral se escoge en la fase
exponencial de la PCR. Esto se demuestra en la figura 11b donde el umbral intersecta la
grfica de amplificacin en la regin donde hay una relacin lineal entre el logaritmo del
cambio en fluorescencia y el nmero del ciclo. En la fase exponencial, los componentes de
la reaccin no estn limitados y las reacciones de replicacin exhiben resultados
reproducibles y uniformes.

23

Genes estndares
Un control interno consiste en utilizar un gen cuya expresin no cambie.
Un gen que puede ser usado como loading control (o estndar interno) debe tener
varias caractersticas:

El gen estndar debe tener el mismo nmero de copias en todas las clulas.
Debe expresarse en todas las clulas
Un nmero de copias intermedio es ventajoso

Sin embargo, el estndar perfecto no existe, por tanto lo que se decida usar como
estndar o estndares debe ser validado para su muestra. Si es posible, se debe ser capaz
de demostrar que la expresin del estndar no cambia significativamente cuando las
clulas o tejidos son sujetos a las variables experimentales que se planean usar.
Estndares usados comnmente:

mRNA de Gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa

mRNA de Beta actina
mRNA de MHC I (complejo de mayor histocompatibilidad I)
mRNA de Ciclofilina
mRNAs para ciertas protenas ribosomales. Por ejemplo RPLP0 (protena ribosomal
larga, P0). Tambin es conocida como 36B4, P0, L10E, RPPO, PRLP0, 60S
protena ribosomal cida P0, protena ribosomal L10, Arbp o fosfoprotena
ribosomal cida P0.
rRNAs 28S o 18S (RNAs ribosomales)
El efecto de limitar los reactivos

Los ciclos iniciales de PCR se caracterizan por un aumento exponencial en la

amplificacin del blanco. Si los componentes de la reaccin llegan a ser limitantes, el
ndice de la amplificacin del blanco disminuye hasta que se alcanza una meseta y hay
poco o nada de aumento neto en producto de PCR.
La deteccin de la fluorescencia de los sistemas 5700 y 7700 permite que el Ct sea
observado cuando la amplificacin de PCR esta an en la fase exponencial. sta es la razn
principal por la que el Ct es una medida ms confiable del nmero de copias que comienza,
que una medida de la cantidad de producto acumulado en el punto final de la PCR.
Durante la fase exponencial, ninguno de los componentes de la reaccin est
limitado, consecuentemente, los valores de Ct son muy reproducibles para las reacciones
que comienzan con el mismo nmero de copias. Esto conduce a una mayor precisin en la
cuantificacin del DNA y del RNA.

24

Por otra parte, la cantidad de producto de PCR observada en el final de la reaccin

es muy sensible a variaciones leves en los componentes de la reaccin. Esto es porque las
medidas en el punto final se hacen generalmente cuando la reaccin esta ms all de la fase
exponencial y una diferencia leve en un componente limitante puede tener un efecto
drstico en la cantidad final de producto. Por ejemplo, las reacciones laterales, como la
formacin de dmeros de primer, pueden consumir los reactivos a diversos grados de tubo a
tubo. As, es posible que una muestra que comienza con un nmero ms alto de copias
termine con menos producto acumulado que una muestra que comienza con un nmero
ms bajo de copias. Las diferencias entre el punto final y la deteccin en tiempo real se
ilustran grficamente en la figura 12, que demuestra la amplificacin de 96 muestras
idnticas. El cambio total en la seal del reportero, en el ciclo 40, vara ampliamente entre
las rplicas (Figura 12a). Sin embargo, los diagramas de la amplificacin son notablemente
similares entre los ciclos 22 y 25, durante los cuales se determinan los valores de Ct (Figura
12b).

Figura 12. Diferencias entre el punto final y la deteccin en tiempo real

PCR competitivos cuantitativos

Para compensar los problemas con las medidas en el punto final, se han desarrollado
una variedad de tcnicas de PCR competitivo cuantitativo. Se construye un amplicon
competidor que contiene los mismos sitios de unin que el primer y tiene la misma
eficiencia de amplificacin que el blanco, pero es de alguna manera distinguible del
blanco. Una caracterstica distinguible es hacer al blanco y los amplicones competidores de
diferentes tamaos para poder utilizar la electroforesis en gel para discriminar los dos
productos.
Una cantidad conocida de competidor es colocada en la muestra, despus el blanco
y el competidor son amplificados en la misma reaccin. Si la eficiencia de amplificacin
del blanco y del competidor es idntica, el cociente del blanco y el competidor seguir
siendo constante a travs del proceso de PCR. As, determinando el cociente del blanco y
25

del competidor en el final de la reaccin y conociendo la cantidad inicial de competidor

agregada, la cantidad de blanco puede ser calculada. PCR competitivo se ha utilizado con
xito para cuantificar DNA y RNA, pero su rango dinmica se limita a un cociente del
blanco/competidor cercano de 1:10 a 10:1. La mayor exactitud es obtenida encontrando el
punto de equivalencia en el cual el cociente del blanco y el competidor es 1:1. Para lograr
esto, se deben probar varias diluciones para alcanzar un cociente conveniente.
Otra desventaja es la necesidad de construir y de caracterizar un diferente
competidor para que cada blanco sea cuantificado. Adems, se deben realizar estudios
cuidadosos de la validacin para verificar que las eficiencias de la amplificacin del blanco
y del competidor son iguales antes de que la cuantificacin de muestras experimentales
pueda comenzar. Incluso una diferencia leve en eficiencia compromete seriamente la
exactitud de la cuantificacin por PCR competitivo. En el final de la reaccin, PCR
competitivo requiere la cuantificacin exacta de los amplicones del blanco y del
competidor, que exige generalmente pasos de proceso laboriosos de post-PCR.
Mquinas para PCR en tiempo real
Hay muchas mquinas para PCR en tiempo real disponibles. El que se muestra en
la figura 13 es el ICycler de BioRad. La tapa se desliza para acomodar las muestras en
una placa de formato 96-pozos (96-well). Esto significa que podemos mirar varias muestras
simultneamente. La mquina contiene una cmara fotogrfica sensible que supervisa la
fluorescencia en cada pozo de la placa en intervalos frecuentes durante la reaccin de PCR.

Figura 13. ICycler de BioRad

El sistema ABI PRISM 7700, de Applied Biosystems (antes, Perkin Elmer) se basa
en el empleo de placas especiales, con tapas pticas para su adaptacin al lector de
fluorescencia. Cada pocillo tiene una forma similar a la de los tubos de 0,2 L. El
funcionamiento es semejante al de un termociclador convencional, en cuanto a tiempos y
temperaturas, aunque se ajusta y se controla desde un ordenador que posee el software
especfico. Se registran las emisiones de fluorescencia de forma continua, el software lo
convierte posteriormente en una representacin grfica, y preestablece un valor de Ct que
puede ser modificado con posterioridad, en funcin del anlisis del usuario (Figura 14).

26

Figura14 .El software 7700 muestra una representacin de una placa con 96 pozos, donde se pueden
identificar fcil y rpidamente los estndares y las muestras no conocidas. Despus de una corrida de PCR el
nmero inicial de copias se muestra para cada muestra en el pozo.

El sistema LightCycler de Roche (Figura 15), se basa en el empleo de capilares de

vidrio para la contencin de las muestras, y en un mecanismo de giro, similar a una
centrfuga, denominado carrusel. El calentamiento y el enfriamiento se llevan a cabo
mediante un sistema de aire. Todo ello tiene ventajas e inconvenientes. La principal ventaja
es la rapidez, que permite obtener resultados, en muchos casos, en menos de 1 hora. Sin
embargo, presenta un alto costo, ya que los capilares y otros materiales son especficos para
este sistema, y bastante caros. Adems, los protocolos de tiempos y temperaturas no son
intercambiables con otros sistemas de PCR cuantitativa, lo que requiere de nuevas
optimizaciones.

Figura 15. LightCycler de Roche

Ventajas del tiempo Real

La determinacin de valores de Ct siguiendo la cintica en tiempo real de PCR
elimina la necesidad de un competidor que debe de ser amplificado con el blanco. La
cuantificacin se puede realizar por el mtodo ms bsico que es preparar una curva
estndar y determinar cantidad desconocida por comparacin con curva estndar.
Comparado a las medidas del punto final, el uso de los valores de Ct tambin ampla la
gama dinmica de la cuantificacin porque los datos se colectan para cada ciclo de PCR.

27

La PCR en tiempo real permite una amplificacin confiable con alta especificidad
y sensibilidad. El producto de PCR se cuantifica en cada ciclo. Hay una alta correlacin
entre la seal (Ct) y la cantidad de blanco.
Con esta tcnica se tiene alta precisin y exactitud. Tambin hay la posibilidad de
PCR mltiplex. No requiere de anlisis posterior a la PCR (electroforesis,etc.). Esto reduce
la posibilidad de contaminacin y elimina fuentes potenciales de error. Se puede realizar un
mayor nmero de reacciones por da. El sistema a tubo cerrado sirve como control de
contaminacin. Existe un amplio rango de aplicacin. El diseo de primers y sondas tiene
que ser ms exigente.
PRIMERS DEGENERADOS
Son primers que tienen un nmero de opciones en varias posiciones en la secuencia
para permitir el alineamiento y la amplificacin de una variedad de secuencias
relacionadas.
Por ejemplo:
5-TCG AAT TCI CCY AAY TGR CCN T-3
Y = pirimidinas = C / T (degeneracin = 2X)
R = purines = A / G (degeneracin = 2X)
I = inosinas = C / G / A / T
N = nuclotido = C / G / A / T (degeneracin = 4X)
Uso de los primers degenerados
Los primers degenerados se pueden utilizar:

Para amplificar secuencias conservadas de un gen o de genes del genoma de un

organismo.
Para conseguir la secuencia de nucletido despus de secuenciar algunos
aminocidos de una protena de inters

Hay evidencia de regiones o motivos altamente conservados de aminocidos que se

pueden disear utilizando primers degeneradas; estas regiones pueden ser conservadas entre
especies. Las primers degeneradas se pueden utilizar para amplificar estas secuencias. Las
secuencias amplificadas de esta manera se pueden secuenciar para confirmar que la
secuencia est correcta. Pueden entonces ser utilizadas como sondas para amplificar el gen
de inters de una biblioteca geonmica (procaritica) o de una biblioteca de DNA
(eucaritica).
Cuando se ha aislado exitosamente una protena de inters, el final de esta protena
(o algunos aminocidos) pueden ser secuenciados. La secuencia del aminocido se puede

28

utilizar para disear primers degenerados. El producto de PCR puede ser secuenciado. Si
los primers producen una secuencia truncada (del gen) o parcial, pueden ser utilizadas
como sondas.
Diseo de los primers degenerados
Alineacin de la secuencia
Las secuencias de aminocidos de protenas similares u homlogas se pueden
recuperar de una base de datos tal como GenBank. Estas secuencias entonces se alinean.
Por lo menos 2 bloques de aminocidos conservados deben estar presentes para permitir el
diseo de los primers de PCR. Otra alineacin se puede hacer en el nivel del nucletido si
se desea. Si una base se conserva a travs de la alineacin se puede suponer que esta base
particular ser la misma en el caso de inters. Los primers deben tener 20-30 nuclotidos de
longitud. La alineacin de la secuencia tambin dar el tamao previsto del producto de
PCR.
Informacin de la secuencia terminal de aminocidos
Si estos datos estn disponibles pueden ser utilizados como un punto de partida para
el diseo de los primers.
Degeneracin de primers
La degeneracin de los primers depende de una multiplicidad de factores
incluyendo el templado. La degeneracin se puede bajar con el uso de las inosinas para
sustituir 4 bases wobbles en vez de usar las 4 substituciones de bases. Para conseguir la
degeneracin, simplemente se multiplican todos los valores de la degeneracin
incorporados en la secuencia del primer. Otro factor que se toma en consideracin es que
conforme la degeneracin de los primers aumenta, la concentracin de un primer especfico
disminuir. Las substituciones de las bases son solamente las substituciones comunes,
aunque se han utilizado otras opciones dependiendo de la secuencia
La Reaccin de PCR
El cctel de PCR
Una mezcla estndar del cctel de PCR ser un buen inicio. Sin embargo, una
excepcin se observa para las concentraciones de primers. Un aumento de la concentracin
puede ser necesario para compensar la degeneracin. Si los primers usados son
absolutamente degeneradas, se pueden utilizar 50 pmoles como punto de partida y
optimizar a partir de ah.

29

Los ciclos de PCR (el termociclador)

Se requiere de mucha experimentacin y optimizacin. Se comienza con las
condiciones estndar, despus se procede optimizando la temperatura de alineamiento del
primer. Se comienza con 35 ciclos y se aumenta a 50 en caso de ser necesario. Se debe
considerar la viabilidad
de
la
polimerasa
para
50
ciclos.
4-5 de los primeros ciclos de PCR se pueden correr con una temperatura de alineamiento
5-10 o C ms bajo que la temperatura de alineamiento para amplificar los primers con
mltiples mismatches.
Problemas Comunes
Algunos problemas que se pueden presentar cuando se utilizan primers degenerados
son:

Inhibicin competitiva debido a la alta degeneracin del primer (los primers se

alinean al DNA correcto pero no son extendidos por la polimerasa debido a los
extremos 3 ' inestables dando como resultado que los primeros ciclos de PCR sean
altamente ineficaces. Esto puede ser superado aumentando ciclos de PCR o
utilizando 25-30 ciclos estndares seguidos por otra reaccin de 30-35 ciclos usando
el primer producto como templado
Concentracin baja del primer especfico debido a la alta degeneracin, esto puede
ser corregido fcilmente aumentando la concentracin del primer
La DNA polimerasa con actividad exonucleasa 3'-5 no debe ser utilizada ya que
degradan los primers (la Taq polimerasa trabajar muy bien)
Apareamiento falso o no especfico debido a los primers altamente degenerados o
al templado que contiene muchos sitios de alineamiento. Se puede intentar la
optimizacin de la temperatura del alineamiento o el reajuste de los primers
Secuenciacin

Despus de que la banda del tamao previsto se haya extrado del gel de agarosa, el
producto se puede secuenciar o clonar directamente. Aunque los primers degenerados se
pueden utilizar directamente para secuenciar, pueden dar lugar al apareamiento no
especfico dependiendo del templado. La secuenciacin de los productos permite el uso de
los sitios del primer situados generalmente en los flancos del vector.

Controles
Si se amplifica un gen usando los primers diseadas de un alineamiento es
conveniente hacer un dot blot que consiste en un control positivo, DNA templado, algo de
gDNA relacionado y un gDNA distante para comprobar una posible contaminacin. Esto
debe ser hecho despus de secuenciar y asegurar que se tiene la secuencia deseada
haciendo un bsqueda en la base de datos (por ejemplo. BLASTX).

30

LONG PCR
Para llevar a cabo esta tcnica de manera eficiente es necesario el uso de dos
polimerasas: una polimerasa principal en la reaccin que no tenga actividad de
proofreading, y una polimerasa que posea una actividad exonuclease 3-5, que est
presente en una concentracin ms baja. La eficiencia disminuye drsticamente cuando se
incorporan las bases incorrectas. La actividad exonucleasa 3-5 elimina estos errores en
las bases y hace que la reaccin posterior proceda. Por lo tanto, la amplificacin de
fragmentos largos de DNA puede llevarse a cabo (Figura 16).

Figura 16. Long PCR

Aspectos Generales
Al usar la PCR para amplificar fragmentos de ms de 10 kbp es esencial la
preparacin de muestras intactas (libre de mellas) y completamente purificadas con varios
pasos de extraccin y purificacin.
La concentracin ptima de los primers est en un rango de 0.1 a 1.0 mM. En una
concentracin ms baja que la ptima, el producto de la amplificacin puede ser pobre. Por
otra parte, en una concentracin ms alta, el alineamiento no especfico pueden superar la
amplificacin del producto deseado. Las concentraciones del primer se pueden fijar
dependiendo de las caractersticas y las cantidades de DNA. Bajas concentraciones de
primer se recomiendan para DNA altamente complejo, tal como DNA genmico humano, o
para altas concentraciones de DNA templado. Mientras que altas concentraciones se
prefieren para templados de poca complejidad tales como DNA de plsmido, o para
cantidades limitadas de DNA templado.
La concentracin ptima del magnesio se puede afectar por las caractersticas y
propiedades de la mezcla de reaccin, incluyendo concentraciones de dNTPs, de los
primers y los agentes quelantes que contenga el templado. El exceso de Mg2+ tiende a
causar productos no especficos que se observan como un barrido de bandas en el gel,
mientras que el Mg2+ escaso puede generar menos productos amplificados.

31

Para establecer la concentracin de enzima deben ser consideradas la cantidad o la

complejidad del DNA templado y de la longitud del fragmento amplificado. Exceso de la
enzima puede causar reacciones no especficas. La eficacia de la amplificacin puede ser
disminuida cuando la concentracin de la enzima es baja.
El nmero ptimo de ciclos es alrededor 25 a 30 ciclos considerando la cantidad o
la complejidad del DNA templado y la longitud de los fragmentos amplificados de la DNA.
Se recomiendan condiciones de desnaturalizacin de 20 segundos en 98C o 30
segundos en 94C. Un tiempo de la desnaturalizacin demasiado corto o una temperatura
demasiado baja puede causar una eficiencia pobre en la amplificacin. Un tiempo de la
desnaturalizacin demasiado largo o una temperatura de la desnaturalizacin demasiado
alta puede no generar ningn producto identificable. La temperatura ptima de
alineamiento experimental se determina en un rango de 45-68C.
Programa genrico para Long PCR para el Perkin Elmer 9600

Inicial desnaturalizando a 94C durante 10-15 segundos.

Ciclos 1-15 94C 10 segundos, 68C por n minutos (15 veces)
Ciclos 16-30 94C, 10 segundos, 68C por n minutos +15 segundos/ciclo (15 veces)

Los 15 segundos por ciclo para los ciclos 16-30 puede ser necesaria para solamente
fragmentos ms largos (20 Kb).
Hot Start
Se puede utilizar el mtodo de hot start para hacer una Long PCR. La reaccin se
divide en dos partes: una fraccin de templado/primer que es 3/4 o 4/5 del volumen de la
reaccin, y una fraccin de la polimerasa que constituye el resto. Cada fraccin contiene la
misma concentracin de buffer. La fraccin de la polimerasa contiene solamente la
polimerasa, el buffer y agua; el resto de los componentes se incluyen en la fraccin de
templado/primer. Se pone la fraccin de templado/primer en el tubo y se calienta en la
mquina de PCR a 94C por 10 segundos. para desnaturalizar. Despus se agrega la
fraccin de la polimerasa durante el primer paso de alineamiento y extensin.
PCR in situ
La hibridacin in situ (ISH) ha demostrado ser una herramienta molecular muy
importante en diagnstico y la investigacin y ha avanzado perceptiblemente el estudio de
la estructura y de la expresin del gen a nivel de clulas individuales. Sin embargo, la
utilidad de ISH es limitada por la sensibilidad de cerca de 20 copias del mRNA por la
clula, un obstculo de la deteccin que pueda ahora ser superado gracias a las nuevas
tecnologas.
En aos recientes, las estrategias para mejorar los lmites de deteccin en estudios
de ISH han incluido protocolos que amplifican la deteccin de la seal, o incrementando la
cantidad de sondas de hibridacin usando ccteles del oligonuclotido o mltiples sondas
de cRNA. Una tercera estrategia que emplea la PCR es la amplificacin basada en las
32

secuencias de nucletidos del blanco. Esta estrategia fue desarrollada independientemente

por varios laboratorios en 1980
Principios y mtodos
Los aspectos importantes para la PCR in situ incluyen la fijacin y la
permeabilizacin durante la preparacin de la muestra, un mecanismo para ciclacin y el
material celular en la solucin o en laminillas de cristal
Antes de llevar a cabo la PCR in situ, las clulas o las muestras del tejido fino son
fijadas y permeabilizadas para preservar la morfologa y permitir el acceso de los reactivos
de PCR a las secuencias intracelulares que se quieren amplificar. La amplificacin de PCR
de las secuencias blanco se realiza despus en las clulas intactas en tubos micro-Eppendorf
o directamente en preparaciones citocentrifugadas o secciones del tejido fino en laminillas
de cristal (Figura 17).

Figura 17. PCR in situ

Las clulas en la mezcla de reaccin de PCR son termocicladas en tubos microEppendorf usando cicladores convencionales de bloque. Despus de la PCR las clulas son
citocentrifugadas sobre las laminillas de cristal con la visualizacin de los productos
intracelulares de PCR por ISH o inmunohistoqumica. La PCR in situ en las laminillas de
cristal es realizada sobreponiendo las muestras con la mezcla de PCR debajo de una tira
que se sella con cera o aceite mineral para prevenir la evaporacin de la mezcla de
reaccin. Un ciclo trmico se completa poniendo las laminillas de cristal sobre los bloques
de calentamiento de un termociclador convencional o diseado especialmente o usando
hornos que completan un ciclo trmico.
La deteccin de los productos de PCR intracelular se realiza por dos tcnicas
diferentes:
1) Indirectamente por ISH con sondas especficas para el producto de PCR (PCR in
situ indirecto)
2) Sin ISH con la deteccin directa de los nucletidos etiquetados (digoxigenina-11dUTP, fluoresceina-dUTP, 3H-CTP o biotina-16-dUTP) que se han incorporado en
los productos de PCR (PCR in situ directa)

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OTRAS VARIANTES DE LA PCR

Multiplex PCR
Es una PCR en la cual hay mltiples pares de primers (hasta 8) lo que da una serie de
productos. stos pueden verse como mltiples bandas en un gel de azarosa. Se usa
frecuentemente en diagnstico mdico. Ahorra templado, tiempo y gastos. Requiere una
cuidadosa optimizacin
Nested PCR
Consiste en dos procesos de amplificacin sucesivos, de forma que en la segunda
PCR se utilizan unos primers contenidos en la secuencia amplificada en la primera reaccin
(Figura 18). Es decir, el producto de amplificacin de la primera PCR es el molde de la
segunda. Se aplica cuando se quiere mejorar la sensibilidad y especificidad de la tcnica,
especialmente en el caso de muestras de baja calidad o con un pequeo nmerode copias de
la secuencia a amplificar.
A veces 1 ronda de PCR no da un producto nico a partir de un templado complejo,
apareciendo un barrido.
Se puede resolver utilizando un segundo par de primers que hibriden un poco ms
internamente que los primeros. Se obtiene un producto nico porque solo el fragmento
correcto de ADN posee los sitios correctos de hibridizacin para el segundo par de primers.

Figura 18. Nested PCR

CLONACIN DE PRODUCTOS DE PCR

Para conseguir una mayor eficiencia en varios usos del downstream (por ejemplo,
la expresin de genes, la transcripcin in vitro, secuenciacin, preparacin de sondas
marcadas para hibridizacin) los productos de PCR se clonan a menudo en vectores
apropiados (Figura 19).

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Figura 19. Clonacin de productos de PCR

La clonacin del DNA amplificado es a menudo un paso difcil en el anlisis de los

productos de PCR. Para facilitar la clonacin de los productos de PCR, se han desarrollado
varias tcnicas.
Para elegir un mtodo, se deben considerar varios factores, como el propsito de la
clonacin, el tipo de polimerasa usado, y la longitud del producto de PCR. Por ejemplo, si
se utiliza una polimerasa con actividad de proofreading para un estudio mutagnesis
sitio-dirigido, la clonacin en vectores con extremos romos (blunt end) puede ser
conveniente. Por otra parte, para la expresin de protenas, un mtodo que permita la
clonacin direccional es til.
Clonacin TA
La Taq polimerasa tiene una actividad transferasa terminal que agrega
preferencialmente adenina a los extremos 3' de los productos de PCR. Los productos de
PCR con esa extensin del adeninas en el extremo 3' se pueden clonar en un vector que
contiene timidinas 3' complementarias (clonacin TA).
Los vectores T pueden ser hechos usando una enzima de restriccin como la XcmI.
Sin embargo, debido a que Xcm I tiene una secuencia de reconocimiento poco comn, el
sitio de restriccin de Xcm I tiene que ser introducido por insercin de un oligonucletido
sinttico en el sitio de clonacin.
Alternativamente, los vectores T se pueden preparar por la adicin enzimtica de un
solo residuo de timidilato con la transferasa terminal y el ddTTP o la Taq polimerasa y el
dTTP. Las polimerasas usadas para el mtodo de clonacin TA deben exhibir actividad de
transferasa terminal y carecer de actividad exonucleasa 3'-5. Adems de la Taq
polimerasa, varias DNA polimerasas (por ejemplo, la Tth polimerasa) tienen estas
caractersticas y por lo tanto se pueden utilizar para la clonacin TA.

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Clonacin de extremos romos

Las DNA polimerasas con actividad exonucleasa 3'-5' remueve los nucletidos mal
apareados de los extremos 3' del DNA de doble cadena y genera productos con extremos
romos. Los productos de PCR generados por estas polimerasas se pueden clonar en
vectores con extremos romos.
Existen tcnicas que permiten remover una sola extensin de nucletidos de los
productos de PCR generados con la Taq polimerasa; estos productos de PCR se pueden
tambin clonar por la ligacin de extremos romos en un vector conveniente.
Generalmente la clonacin de extremos romos de los productos de PCR (o de
cualquier DNA) en plsmidos es menos eficiente que la clonacin extremos cohesivos. Por
lo tanto se ha desarrollado una variacin ms eficiente del mtodo de clonacin de
extremos romos. En este mtodo, una enzima de restriccin poco comn se agrega a la
mezcla de ligacin para linearizar cualquier vector ligado a s mismo formado durante la
reaccin.
Clonacin direccional a travs de primers modificados.
Varios mtodos de clonacin requieren la modificacin de los primers de PCR para
mejorar la eficacia de la clonacin y facilitar la clonacin direccional de los productos de
PCR.
Un mtodo comn para una clonacin direccional eficiente es introducir sitios de
restriccin adicionales en el extremo 5' de cada uno de los primers. Mientras que procede la
amplificacin, estos primers se incorporan en el producto de PCR. Despus de la PCR, el
fragmento de DNA amplificado se digiere con la enzima de restriccin apropiada y se liga
en un vector linearizado.
Algunas enzimas de restriccin no pueden cortar en las secuencias localizadas cerca
de los extremos del DNA de doble cadena lineal. Adems, puesto que la secuencia del
producto de PCR es a menudo desconocida, la enzima de restriccin elegida podra
potencialmente reconocer y cortar los sitios dentro del producto.
Otro mtodo que utiliza los primers modificados es la clonacin con ligaduraindependiente
En
la
clonacin
mediada
por
la
uracil
glicosilasa,
los extremos 5' de los primers de PCR son parcialmente complementarios a las secuencias
del vector y contienen varios residuos de dUMP. La incorporacin de estos primers durante
la PCR da lugar a la colocacin selectiva de los residuos de dUMP en el extremo 5' de los
productos de la amplificacin. Despus de que los residuos de dUMP sean quitados por
uracil DNA glicosilasa, los lados apirimdicos que resultan son susceptibles a ser cortados
por las condiciones alcalinas. Los extremos 3' de una sola cadena que resultan se pueden
entonces alinear a los extremos complementarios del vector y las molculas quimricas de
DNA que resultan se transforman sin ligacin in vitro.

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Un ejemplo de clonacin direccional que no requiere primers especiales es la

clonacin direccional basada en la Exonucleasa III. Bajo condiciones controladas de
reaccin, la actividad exonucleasa 3'-5' de la Exonucleasa III se puede utilizar para
degradar el producto de PCR de los extremos 3' de ambas cadenas. El producto modificado
de PCR que resulta se puede clonar fcilmente en un vector linearizado con las bases
complementarias.
Clonacin de fragmentos largos de DNA
Usando mezclas de diversas polimerasas se ha podido amplificar blancos largos de
DNA. Para la clonacin de productos grandes de PCR (mayor de 10 KB) el uso de vectores
basados en plsmidos es difcil porque la capacidad de clonacin en vectores es limitada.
La clonacin eficiente de fragmentos largos de DNA se puede alcanzar solamente
con vectores cosmidos y sistemas de empaquetado. Recientemente, un mtodo basado en
csmidos se ha desarrollado para clonar fragmentos de hasta 36 KB con alta eficiencia.
MUTAGNESIS POR PCR
Consiste en introducir cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de
ADN.
Mutagnesis con PCR-extensin solapada
El mtodo de extensin solapada (Figura 20) requiere 2 primers mutagnicos y otros
2. Amplifica un fragmento 5 y un fragmento 3 que se solapan. Ambos portan la mutacin.
Se utilizan los productos en otra reaccin para producir el ADN mutado de longitud
completa.

Figura 20. Mtodo de extensin solapada

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Mutagnesis sitio dirigida

La mutagnesis sitio-dirigida in vitro es una tcnica invaluable para estudiar relaciones
de la estructura-funcin de protenas, la expresin del gen y la modificacin del vector.
Varios mtodos de los mtodos reportados requieren de DNA de una sola cadena como
templado. La razn de esto, ha sido histricamente la necesidad de separar los filamentos
complementarios para evitar el realineamiento. El uso de PCR en mutagnesis sitio-dirigida
logra la separacin de las hebras usando un paso de desnaturalizacin que separa las hebras
complementarias y permitiendo la polimerizacin eficiente de las primers de PCR. Los
mtodos de PCR sitio-dirigidos permiten as que las mutaciones sitio-especficas sean
incorporadas en cualquier plasmido de doble cadena.
El gen de inters es amplificado con una ADN polimerasa en condiciones donde la
fidelidad transcripcional es baja y se introducen errores en las copias generadas. Dado que
la mayora de las mutaciones no son beneficiosas, dos mutaciones favorables se acumularn
en el mismo gen, solamente con baja probabilidad y muchas mutaciones beneficiosas sern
enmascaradas por las deletreas. Para combinar varias mutaciones deseables, se utiliza un
segundo mtodo, donde el conjunto de fragmentos de ADN generado por la PCR es
digerido por DNasa I, una enzima que corta en forma inespecfica, y se reensamblan los
trozos por PCR. En principio, cada mutacin puede ser recombinada y propagada
individual e independientemente de otras mutaciones. Este proceso se asemeja al crossingover que tiene lugar en los cromosomas de los organismos vivientes.
Para introducir mutaciones solamente en una regin particular de un gen, puede
utilizarse la mutagnesis en cassette por PCR. El fragmento de ADN conteniendo el punto
mutado es recortado en dos sitios de restriccin flanqueantes. Luego, un producto de PCR,
que puede ligarse exactamente en estos sitios de restriccin, se genera con un primer
degenerado. Este iniciador se sintetiza qumicamente para llevar una mezcla al azar de
nucletidos en uno o ms codones y la protena codificada lleva, por lo tanto, un conjunto
de aminocidos al azar, en esta posicin particular. Desafortunadamente, un codn
completamente formado al azar exhibir una fuerte desviacin hacia algunos aminocidos
que son codificados por ms de un codn, por ejemplo, el aminocido serina es codificado
por seis codones diferentes, mientras que triptofano est codificado por un solo codn),
siendo tambin difcil evitar la incorporacin de un codn de terminacin. La solucin a
este problema es usar trinucletidos presintetizados (codones) para todos los 20
aminocidos como bloques de construccin para la sntesis de ADN de los
oligonucletidos, en lugar de utilizar los mononucletidos convencionales. Estos bloques
pueden ser mezclados en cualquier proporcin y solamente se necesita agregar aquellos
trinucletidos que el investigador desea en esta posicin en la secuencia proteica (Figura
21).

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Figura 21. Estrategias para mutagnesis, con el fin de obtener las modificaciones localizadas o en
genes enteros. En el panel (A) se muestra en forma esquemtica el proceso de PCR sujeto a error, como
una estrategia para la distribucin no dirigida de mutaciones en un gen de inters. Se muestran dos tipos de
mutaciones, las favorables (cuadrados) y las desfavorables (crculos). En ciclos sucesivos de PCR, se
introducen ms mutaciones de cada tipo y, generalmente, las molculas contendrn alguna de cualquier tipo.
As, el efecto benfico de las mutaciones favorables puede ser opacado, completamente, por la presencia de
las desfavorables. Una posible solucin a este problema, se muestra en el panel (B) y se conoce como
mezclado de ADN. El producto de PCR se corta en pequeos trozos, utilizando la enzima ADNasa I y se
reensamblan, subsecuentemente, mediante PCR. Las mutaciones quedan, por lo tanto, cruzadas y los genes
con el mayor nmero de mutaciones favorables pueden ser enriquecido por seleccin. El panel (C) muestra el
principio de PCR utilizando un primer degenerado. Este primer o iniciador contiene una mezcla de todos
los cuatro posibles nucletidos (abreviados en la letra N) en una posicin determinada o, alternativamente,
una mezcla de codones ensamblados a partir de trinucletidos. Las protenas sintetizadas a partir de este gen
llevarn, por lo tanto, un grupo randomizado de aminocidos en esta posicin.

APLICACIONES ESPECIALES DE LA PCR

Durante los ltimos aos, la PCR se ha convertido en una herramienta importante
para analizar el genoma humano.
Adems de generar cantidades grandes de templado para secuenciar, la PCR se ha
utilizado para el mapeo de cromosomas y para analizar cambios grandes y pequeos en
estructura cromosmica. Por ejemplo, la PCR lo ha hecho posible:

Usar las secuencias repetidas en el genoma como marcadores genticos.

Genere sondas de hibridacin especficas para cromosoma.
Estudiar la evolucin de las secuencias de un gen y los efectos de variabilidad de la
secuencia en la funcin del cromosoma.
Amplificar e identificar las secuencias blanco in situ.

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BIBLIOGRAFA
1. Innis M. A., Gelfand D. H., Sninsky J. J., White T. J. PCR Protocols. Academic
Press Inc. Estados Unidos, 1990.
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Estados Unidos, 1994.
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polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology. 2000.
25,169-193.
http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/pcr_man/index.htm
http://www.med.sc.edu:85/pcr/realtime-home.htm
http://www.espanol.pcrlinks.com/
http://folk.uio.no/kristban/realtime/pfaffl.pdf

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