Demostracin de factores R en Bordetella Bronchiseptica aislado de cerdos.

Nobuyuki Terakado, Hayami Azechi, Kiyoji Ninomiya, and Takeshi Shinmizu.

Laboratorio nacional de ensayos veterinarios, Kokubunji, Tokio, Japn and el instituto
nacional de salud animal, Kodaira, Tokio, Japn.
Recibido para su publicacin 9 de febrero de 1973
Se examin la transferibilidad de la farmacorresistencia en cepas de Bordetella
bronchiseptica aisladas a partir de cerdos. Estas cepas fueron resistentes a la
sulfadimetoxina (SA, ms de 1600 g / ml), estreptomicina (SM, ms de 800 g / ml), y
aminobencil penicilina (APC, 200 g / ml). Todos ellos podran transferir su resistencia a
los frmacos como una unidad a una cepa sensible de Escherichia coli, as como a B.
bronchiseptica por cultivo mixto. La resistencia SM-SA-APC transferida en los
exconjugantes de E. coli y B.bronchiseptica tambin era transmisible por el cultivo mixto.
Pero la transferencia de triple resistencia no fue mediada por el filtrado libre de clulas de
la cepa de resistencia a frmacos de B. bronchiseptica que se utiliz como donante. Se
encontr que se elimina como un todo la triple resistencia en los exconjugantes E. coli
ML1410 mediante el tratamiento con acriflavina. De acuerdo con estos resultados, podra
concluirse de forma segura que los factores R portadores de resistencia SM-SA-APC
fueron demostrados en cepas de B. bronchiseptica aisladas a partir de cerdos.
Bordetella bronchiseptica es un habitante frecuente del tracto respiratorio de diversos
animales y se cree que es un agente causal de la rinitis atrfica infecciosa de cerdos
jvenes (8,9). Muchos antibiticos y quimioterpicos de origen sinttico han sido
ampliamente utilizados para su control. Un informe reciente (2), no obstante, indica que
muchos aislamientos de B. bronchiseptica se han convertido resistentes a la sulfonamida.
Recientemente hemos aislado de las cavidades nasales de los cerdos jvenes cepas de
B. bronchisetica que eran resistentes no slo a sulfadimetoxina (SA), sino tambin a la
estreptomicina (SM) y aminobencil penicilina (APC). A partir del patrn de estas cepas
resistentes, se sospech que su resistencia podra ser mediada por factores transferibles
de resistencia a los frmacos (factores R) (5). Este artculo trata de la demostracin de los
factores R en cepas de B. bronchiseptica aisladas a partir de cerdos.
MATERIALES Y MTODOS
Cepas bacterianas.
Siete cepas de B. bronchiseptica aisladas a partir de cerdos fueron utilizadas como
donadoras de resistencia a frmacos. B. bronchiseptica ATCC 4617 se utiliz como
control. Subcepas de Escherichia coli K-12 se utilizaron como clulas receptoras de
resistencia al frmaco; ML1410 , F- met- (requiere metionina) nal+ (resistente al cido
nalidxico), ML1410 - RFP, F- met- nal+ rft + (resistente a la Rifampicina), W3630 , F- mal(no fermentadores de maltosa). Los subcepas de K-12 fueron suministrados por S.
Mitsuhashi. B. bronchiseptica 114, una mutante resistente a cido nalidxico (NA) obtenida
mediante la difusin en una placa de agar nutritivo que contiene 200g/mL de NA tambin

fue utiliz como receptora. (Para sensibilidad a los frmacos de estas cepas, vase el
cuadro 1.)
Medios.
Caldo Penassay (Difco es la marca) se utiliz como un medio lquido.
Agar infusin de corazn (Difco).
Medio Mueller-Hinton (Difco).
Agar DHL (Eiken Qumica Co., Tokio).
Agar nutritivo (10g de peptona, 5g de NaCl y
Utilizados como
15g de agar en 1000 mL de caldo de infusin
medio slido.
carne de caballo (pH 7,5).
Agar AL (1000mL de medio A (1), 20g de lactosa,
40mL de azul de bromotimol 0,2 %, y 13g de agar).
La metionina se aade a una concentracin de 50 g / ml cuando sea necesario.
Drogas.
Se utiliz SA , SM, APC , rifampicina (RFP ) , tetraciclina ( TC ) , cloranfenicol (CP ) ,
kanamicina ( KM ) y gentamicina (GM ). RFP y GM fueron un regalo de Y. Yagisawa,
Asociacin de Investigacin de Antibiticos de Japn. SA fue suministrada por Industrias
farmacuticas Takeda, Ltd., Osaka; y NA por Daiichi Seiyaku Co., Ltd. de Tokio. Otros
antibiticos fueron estndares de trabajo en nuestro laboratorio.
Prueba de sensibilidad a los frmacos.
Se utiliz el mtodo de dilucin de agar para la determinacin de sensibilidad al frmaco.
Una asada de una dilucin 10-2 de un cultivo que se dej incubando durante toda la noche
fue cultivada en una caja con agar de infusin de corazn que contena diluciones
seriadas (en las que se fue duplicando la dilucin) de cada frmaco. Para el ensayo de
resistencia a SA, se utiliz medio Mueller- Hinton. La concentracin mnima inhibidora de
cada frmaco se ley despus de incubar a 37 C durante 18 hr.
La transferencia de resistencia a medicamentos.
La transferencia de resistencia a los frmacos en B. bronchiseptica se examin mediante
una modificacin del mtodo informado anteriormente. Volmenes iguales (5 mL) de
cultivos agitados durante toda la noche de cepas donadoras y receptoras, de densidad
celular de aproximadamente

109 / mL, se mezclaron y se incubaron a 37 C sin

agitacin. Despus de 1 h de incubacin, se sembr en medios selectivos una dilucin

apropiada de la mezcla.
Cuando se utiliz ML1410 como clula receptora de resistencia al frmaco, se ocup una
placa de agar DHL contiene tanto NA (50g/mL) y SM (12,5 g /mL) para la seleccin de
la exconjugante ML1410. Cuando se utiliz B. bronchiseptica 114 como clula receptora,
se utiliz una placa de agar nutritivo que contiene tanto NA (200g/mL) y SM (400g/mL).
El nmero de clulas viables de E. coli y B. bronchiseptica se determin mediante un
mtodo de dilucin en agar despus de 24 y 48 h de incubacin a 37 C,
respectivamente.

El nmero de clulas viables de E. coli y B. bronchiseptica se determin mediante un

mtodo de dilucin en agar despus de 24 y 48 h de incubacin a 37C, respectivamente.
La frecuencia de la transferencia siempre se calcul en relacin con el nmero de
donantes (es decir, la transferencia por clula donante). Alrededor de 10 colonias que se
desarrollaron en la placa selectiva, se escogieron al azar en cada caso y se purific en la
misma placa. Despus de lo anterior la transmisin de su resistencia se examin ms a
fondo mediante un cultivo mixto, ya sea con W3630 ML1410-RFP. Cuando se utiliz
W3630 como receptora, se utiliz una placa de agar AL libre de metionina que contiene
12.5g/mL de SM. Cuando ML1410-RFP fue usado como receptor, se utiliz una placa de
agar DHL que contiene tanto RFP (50 g / ml) y SM (12,5 g / ml).
Preparacin de los cultivos filtrados.
Para confirmar la transmisin conjugativa de resistencia a los frmacos B. bronchiseptica,
los filtrados de cultivo se preparan a travs filtros de membrana de 0,45m (Millipore Co.,
Bedford, Mass .: (i) un filtrado de un cultivo de toda una noche de B. bronchiseptica de 016 y (ii) un filtrado de cultivo-irradiado de ultravioleta (UV) 0-16). El filtrado de cultivoirradiado con una dosis de UV con una lmpara UV (ultravioleta Products, Inc., San
Gabriel, California.) dio aproximadamente 0,1 % de supervivientes.
Tratamiento con acriflavina.
El exconjugante ML1410 R+te16, que adquiri resistencia a los frmacos a partir de B.
bronchioseptica de 0-16, se utiliz como una cepa resistente. El tratamiento con
clorhidrato de acriflavina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Osaka) se realiz
esencialmente por un mtodo igual que el de Mitsuhashi et al. (6), y Watanabe y
Fukasawa (12). Las clulas sensibles, que haban perdido sus marcadores de resistencia,
fueron detectadas por rplica en placa (4). Todas las colonias que se desarrollaron en la
placa principal, pero no crecieron en la placa de rplica fueron escogidas, y se examin la
resistencia a los frmacos.
RESULTADOS
Resistencia a frmacos en B. bronchiseptica.
Sesenta cepas de B. bronchiseptica se aislaron de las cavidades nasales de cerdos
jvenes criados en granjas de cerdos en varios distritos de Japn, y se examin su
resistencia a los agentes antimicrobianos. De sesenta cepas analizadas, siete resultaron
ser altamente resistente a la SA, SM, y APC, pero an sensibles a NA, RFP, TC, CP, KM y
GM. La resistencia a los frmacos de estas cepas se muestra en la Tabla 1.
Transferencia conjugativa de la resistencia en B. bronchiseptica.
Siete cepas de B. bronchiseptica aisladas a partir de cerdos fueron utilizadas como
donadoras de resistencia a frmacos en cultivo mixto. Como se muestra en la Tabla 2, la
resistencia a SM-SA-APC fue transferida como un todo para ML1410 a una frecuencia de
aproximadamente 1O-7 a 10-8 por clula donante. Cabe sealar que los niveles de
resistencia a la SM y APC se redujeron en el exconjugante ML1410 en comparacin con

la de la cepa donante. Del mismo modo, la resistencia SM-SA-APC en siete cepas de B.

bronchiseptica se transfiri conjugativamente a una cepa sensible a los frmacos de B.
bronchiseptica 114 a una frecuencia de 10-4 a 10-6. En este caso, los niveles de SM y APC
en los exconjugantes de B. bronchiseptica 114 fueron los mismos que los de las
donadoras (Tabla 3). Adems, se encontr que la resistencia a SM-SA-APC transferida en
la exconjugante ML1410 podra ser transferido por un cultivo mixto a cualquiera de W3630
o ML1410-RFP. Del mismo modo, se encontr que la triple resistencia en el exconjugante
B. bronchiseptica 114 era transmisible mediante cultivo mixto a ML1410-RFP. Por otro
lado, la transmisin de la resistencia a SM-SA-APC no se demostr cuando se utiliz el
filtrado libre de clulas de una cepa resistente de B. bronchiseptica de 0-16, cuya
resistencia era transmisible mediante cultivo mixto, como donante.
Eliminacin de la resistencia a los frmacos.
Para confirmar el hecho de que la resistencia a los frmacos transmisible en B.
bronchiseptica fue mediada por factores R, la exconjugante ML1410 resistente a SM- SAAPC se trat con acriflavina. Las muestras a ser tratadas con acriflavina, fueron divididas
en dos grupos; una fue irradiada con una lmpara de UV antes del tratamiento con
acriflavina y el otra no se irradi. Como se muestra en la Tabla 4, la resistencia a SM-SAAPC podra ser eliminada a una frecuencia desde 13 hasta el 21% por tratamiento con
5.0g/Ml del frmaco. Como se muestra en la Tabla 4, la resistencia a SM-SA-APC podra
ser eliminada a una frecuencia desde 13 hasta el 21% por tratamiento con 5.0g/Ml del
frmaco. No se detect ninguna segregacin del patrn de resistencia.
DISCUSIN
Desde el descubrimiento de factores transferibles de resistencia a frmacos (factores R)
en Japn (5), los estudios epidemiolgicos y genticos sobre los factores R han sido
llevadas a cabo por muchos trabajadores en diferentes partes del mundo. La transferencia
de la resistencia a los frmacos mediado por factores R incluye muchos frmacos tiles
contra las infecciones bacterianas. En consecuencia, un aumento de la prevalencia de los
factores R en bacterias de origen animal es un grave problema no slo para la higiene de
los animales sino tambin para la salud pblica. El presente trabajo muestra que la triple
resistencia a SM-SA-APC de B. bronchiseptica puede transferirse como una unidad a una
cepa sensible de E. coli, as como a B. bronchiseptica por cultivo mixto. Pero la
transmisin de triple resistencia en B. bronchiseptica no pudo demostrarse mediante el
filtrado de cultivo de B. bronchiseptica de 0-16, cuya resistencia era transferible por el
cultivo mixto. La resistencia a SM-SA-APC en el exconjugante ML1410, cuya resistencia
fue trasferida por el cultivo mixto de B. bronchiseptica 0-16, fue eliminado por el
tratamiento con acriflavina. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que la
resistencia a SM-SA-APC en B. bronchiseptica fue mediada por factores R. Informaron
Watanabe y Fukasawa (11) que los niveles de resistencia SM de los factores R que se
originaron a partir de Shigella, disminuyen notablemente cuando se introduce en una cepa
de E. coli K-12. Se encontr en el presente estudio que el nivel de resistencia a SM es
muy alto en B. bronchiseptica, pero baja en E. coli cuando se transfiere. La razn de esto

es desconocida. Las tetraciclinas son ampliamente utilizadas en la cra de animales y la

medicina veterinaria, en consecuencia, los factores R que llevan la resistencia a TC
pueden demostrarse en alta frecuencia de bacterias entricas aisladas de ganado en
Japn (3, 7). Por el contrario, las cepas TC-resistentes de B. bronchiseptica no se han
aislado hasta el momento. Por el contrario, las cepas resistentes a PCA de B.
bronchiseptica se aslan a una frecuencia considerable, aunque el frmaco no se ha
utilizado ampliamente en la medicina veterinaria en Japn.
Estas discrepancias pueden requerir ms estudios epidemiolgicos y genticos de
resistencia en bacterias aisladas de ganado. Los estudios genticos de factores R
procedentes de B. bronchiseptica se encuentran ahora en progreso y se describen en otra
parte.
TABLA 1. SENSIBILIDAD A LOS FRMACOS DE LAS CEPAS UTILIZADAS.

Concentracin inhibidora mnima de cada frmaco se determin por el mtodo de

dilucin en agar.
TABLA 2. TRANSFERENCIA DE RESISTENCIA A LOS FARMACOS DE Bordetella
bronchiseptica a Escherichia coli ML1410 POR CULTIVO MIXTO.

a.

Cultivo mixto hecho por el mtodo descrito en Materiales y Mtodos.

b.

Frecuencia de transferencia se calcula como el nmero de beneficiarios

exconjugantes, que adquieren resistencia a los medicamentos, dividido por el de
las clulas del donante.
c.
La Concentracin Mnima Inhibitoria de 10 colonias examinadas, se encontr que
era la misma. Medido en g/mL.
TABLA 3. TRANSFERENCIA DE RESISTENCIA A LOS MEDICAMENTOS DE
Bordetella bronchiseptica a B. bronchiseptica 114 POR CULTIVO MIXTO.

a. b. c.

Vase la nota correspondiente a la Tabla 2.

TABLA 4. ELIMINACIN DE LA RESISTENCIA A LOS MEDICAMENTOS MEDIANTE

EL TRATAMIENTO CON ACRIFLAVINA.

a.

Se utiliz E. coli ML1410 que haba adquirido resistencia a los frmacos por el cultivo
mixto con B. bronchiseptica 0-16.