2.

Material y métodos

2.1. Caracterización molecular

El ARN total se extrajo de tejidos foliares infectados por virus de C. annum (cv. Loungi) a los 14días
después de la inoculación (dpi) utilizando el método TRI-Reagent (Life Technologies, Carlsbad,
CA, EE. UU., Cat No. 15596026) según las especificaciones del fabricante. instrucción. Para la
síntesis de ADNc, M-MLV (Moloney Murine Virus de la leucemia) Kit de síntesis de ADNc (molécula
de ADN de doble cadena, en la que una de sus hebras constituye una secuencia totalmente
complementaria al ARN mensajero a partir del cual se ha sintetizado). de primera hebra (Life
Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) Se utilizó siguiendo el protoco del fabricante

2.2. Clonación del gen CP

Productos de PCR purificados amplificados utilizando el degenerado par de cebadores: Poty3 (5-
TGAGGATCCTGGTG (C / T) AT (A / C) GA (A / G) AA (C / T) GG-3) y CVMV1037 Pol
(5’-AGCATGGAGAGAGCGACATTAGTC-3) como cebadores aguas arriba (Hiskias, 1998) y Oligo (dT)
(5´-GCGGGATCCT17-3´) como el cebador aguas abajo fueron ligado en el vector pTZ57R / T
(Thermo Scientific, EU. Kit de clonación por PCR InsTAclone, K1213). La presencia de CP
Luego se confirmó el ADNc en el vector recombinante P01. a través del proceso de secuenciación y
la comprobación de la ausencia de errores. Imprimaciones universales M13 adelante
(5 ’TGTAAAACGACGGCCA GT 3’) y M13 inversa (5 ’CAGGAAACAGCTATGACC 3’) se utilizaron para la
secuenciación el gen CP insertado en el sitio de clonación múltiple (MCS) de el gen pTZ57R / T. Se
utilizó el programa ClustalW para comparar 22 secuencias de ChiVMV altamente emparejadas
presentes en el base de datos utilizando la aplicación BLAST. El filogenético El árbol fue creado por
el método de máxima verosimilitud de secuencias alineadas ClustalW usando la versión MEGA
6.0 programa (Tamura et al., 2013) y análisis Bootstrap se realizó en 1000 repeticiones.

Clonación del gen CP amplificado con cebadores específicos

Tres pares de cebadores específicos del gen de la proteína de la cubierta basado en la secuencia
obtenida de ChiVMV (KJ472764) fueron diseñados (Tabla 1) comparando con conocidos datos de
secuencias de genes disponibles en la base de datos NCBI para la amplificación del gen CP con
sitios de restricción para posterior clonación en un vector binario. El BglII y BstEII Se colocaron
sitios de restricción en ambos extremos del gen CP imprimación respectivamente.
Fragmento amplificado por PCR del gen CP con restricción los sitios se ligaron directamente en el
vector pGEM®-T Easy (Figura 1) usando el sistema vectorial pGEM®-T Easy I. Finalmente, el
El gen CP se clonó en el vector de expresión de la planta, pCAMBIA1301, en los sitios BglII y BsteII.

2.4 Ensayo transitorio mediado por Agrobacterium

La cepa de Agrobacterium LBA4404 se utilizó para transitorios estudios de ensayo. vector
pCAMBIA1301 que alberga el El gen ChiVMV CP (p1301: CP) se movilizó en LBA4404 mediante
protocolo de congelación y descongelación. Para la agroinfiltración, se preparó cultivo a partir de
células bacterianas mediante la transferencia de la única colonia en 50 ml de medio LB líquido que
contiene kanamicina antibiótico (50 µg / ml). Las bacterias transformadas fueron incubados
durante la noche con agitación a 28 ° C a 250 rpm. Del cultivo de la noche a la mañana, se pusieron
250 μl en 10 ml de Medio LB que contiene tampón MES 10 mM (pH 5,7),
kanamicina (50 μg / mL) y acetosiringona 150 μM y se cultivó a 28 ° C hasta una DO 600 1. El
cultivo se centrifugó a 4000 rpm durante 15 min y luego se tomó el sedimento y se
suspendido en MgCl2 10 mM, MES 10 mM (pH 5,7) y Acetosiringona 100 µM. La suspensión se
dejó a 25 ° C. durante 3-4 h. Dos hojas de cada planta de N. benthamiana (Plantas de 4 a 5
semanas de edad). Las hojas eran ligeramente perforado desde el lado inferior con una aguja y
la suspensión bacteriana se infiltró bajo presión en la puñalada de la hoja con una jeringa estéril
sin aguja de 2 ml.

Tabla 1. Lista de pares de cebadores utilizados para la amplificación del gen CP del clon p01.

Los sitios de restricción dentro de la secuencia del cebador están subrayados.

Palabras: higromicina(hygromycin) promoter (promotora) border right (borde derecho)
Figura 1. Representación esquemática del plásmido p03 (T-DNA de p1301-CP de ChiVMV ATIPK)

2.5. Desarrollo de plantas transgénicas de N. benthamiana

Se desarrollaron plantas transgénicas de N. benthamiana utilizando el método del disco de la hoja
a través del protocolo de transformación mediado por agrobacterias. Brevemente, hoja discos (8
cm) se prepararon a partir de hojas más jóvenes de Plantas de N. benthamiana. los discos de hojas
se sumergieron en LBA4404 cultivo (OD600 = 0,4) que alberga p1301CP durante 30 minutos
y luego se pusieron en medios de cocultivo para EM durante 2-3 días a 230 ° C en oscuridad.
Después de 3 días, los discos de hojas se lavado con cefotaxima (250-500 mg / L) y colocado
en los medios de selección de MS. Después de 3-4 semanas, el emergente los brotes del callo se
cambiaron al medio de enraizamiento suplementado con antibiótico; a partir de entonces, el
endurecimiento fue hecho después de 3-4 semanas. Se recolectaron semillas de plantas T0
para las generaciones futuras.

2.6. Confirmación de las plantas transgénicas

De las plantas transformadas, ADN y ARN genómico se aislaron en la etapa de 3-4 hojas y se
sometieron a PCR y amplificación por RT-PCR, respectivamente. ADN y ARN
se extrajeron de las hojas de plantas transgénicas, agroinfiltrados (tres plantas) así como de la
plantas de N. benthamiana sin transformar. Aproximadamente El fragmento del gen CP de 1 kb se
amplificó a partir de 9 Plantas de N. benthamiana mediante PCR utilizando cebadores específicos.
El gen hpt se determinó mediante amplificación por PCR con cebadores directos e inversos
específicos de hpt de transgénicos plantas. También se realizó RT-PCR utilizando cebadores
específicos para el gen CP. El producto de PCR se corrió en gel de agarosa al 1%. para observar la
intensidad de la banda

2.7. Ensayo de resistencia a virus

Para infectar las plantas transgénicas, la savia pura de ChiVMVATIPK (las plantas se mantuvieron
como fuente de infección en un invernadero) se hizo triturando las hojas de un planta infectada
sistémicamente en tampón fosfato 0,1 M solución. La savia se pasó a través de una tela de
muselina y se mezcló con polvo de carborundo (malla 600, 1 mg / ml). Los la mezcla se inoculó
mecánicamente a los subestudiados plantas de control transgénicas y no transgénicas suavemente
frotando las hojas. Las plantas fueron analizadas para ChiVMV. título a través de DAS-ELISA (Clark y
Adams, 1977) después de 2 semanas de inoculación. Disponible comercialmente Kit de detección
ELISA (LOEWE biochemical, EE. UU., Cat. No. 07185S / 100) se utilizó para la detección de ChiVMV.

Figura 2. Síntomas de ChiVMV en hojas de chile recolectadas de Islamabad. (a) Muestra moteado y
severo aclaramiento y distorsión de las venas. (b) Muestra un tamaño de hoja reducido con
moteado y distorsión.

Tabla 2. Reacción de diferentes especies hospedadoras contra el aislado ATIPK de ChiVMV después
de la inoculación mecánica.