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ADN Antiguo
ADN Antiguo
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INTRODUCCIN.
Figura 2.
Dble hlice
de ADN.
Fernndez
Domnguez E.
Turbn D.
Prez-Prez A.
Arroyo-Pardo E.1
Unidad de Antropologa
Departamento de Biologa Animal
Facultad de Ciencias Biolgicas
Avda. Diagonal 645
08028-Barcelona.
1
Figura 1.
Esquema de la
situacin del
ADN dentro
del ncleo
celular.
autenticidad de algunos de los resultados obtenidos. Algunos investigadores creyeron que las secuencias de ADN presuntamente
antiguas no eran sino ADN moderno
introducido en la muestra por fallos
de procedimiento; es decir, lo que los
especialistas denominan "contaminaciones".5-7 Con la llegada de la
Reaccin en Cadena de la
Polimerasa (PCR)8,9 -y en parte con
la secuenciacin automtica- la tecnologa del ADN antiguo (ADNa) ha
sufrido una autntica revolucin (ver
figura 3). La PCR ha hecho posible
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la obtencin de informacin gentica a partir de cantidades nfimas y muy fragmentadas de ADN y el uso de
secuenciadores automticos ha permitido analizar de
forma rpida la variabilidad de las secuencias, para
comparar muestras antiguas con modernas, e inferir as
conclusiones filogenticas.
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Figura 7. Corte
esquemtico de
un diente. El
interior de la
cmara pulpar
retiene gran
cantidad de
ADN postmortem.
En primer lugar, el ADN antiguo est sumamente fragmentado. Algunos autores mantienen que no es posible
la amplificacin por PCR de fragmentos de ADN de
tamao superior a 150 pares de bases (bp) en tejidos
blandos.3 Este lmite es sensiblemente superior en tejidos slidos como hueso o diente, siendo de 300 pares
de bases (bp) para ADN mitocondrial y de poco ms de
100 bp para material nuclear.14,15 La longitud del fragmento a amplificar guarda una relacin inversamente
proporcional con la cantidad de producto obtenido tras
la amplificacin.16 Sin embargo no parece existir una
correlacin entre la antigedad de la muestra y su
grado de fragmentacin.3 Esto se debe a que la
degradacin del ADN depende ms de las condiciones
medioambientales en s, que del tiempo que ste ha
estado expuesto a ellas. As, aunque la cantidad total de
ADN antiguo presente en la muestra sea en principio
suficiente para garantizar su recuperacin mediante
una PCR exitosa, la fragmentacin de este material
hace que slo sean recuperables aquellos fragmentos
ms pequeos.
En la estructura del ADN existen dos lugares especialmente sensibles a la hidrlisis: los enlaces fosfodister,
que unen las diferentes desoxirribosas entre s, y los
enlaces glicosdicos, que conectan stas a las bases
nitrogenadas (ver figura 8). La rotura de los enlaces
fosfodister rompe la cadena de ADN y la de los
enlaces glicosdicos suele provocar la prdida de la
base nitrogenada correspondiente formndose sitios
apurnicos (AP sites) o sin base (baseless) en un proceso conocido como depurinizacin o depirimidinacin.
Este proceso tiene lugar "in vivo" aproximadamente
cada 10 horas, aunque puede verse acelerado por factores como la temperatura, la fuerza inica del entorno,
el pH o la presencia de metales pesados. Tras la produccin de un sitio apurnico, puede tener lugar la rotura, conocida como -eliminacin, de la cadena de ADN
en ese punto.
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2.- AISLAMIENTO
CONTAMINACIN
DEL
ADN
ANTIGUO
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monitorizar la contaminacin introducida por los investigadores directamente implicados en el anlisis de las
muestras, as como el ya mencionado carry over inherente a cada laboratorio.
amplificacin.32,33
La naturaleza del inhibidor est todava por determinar,
aunque se han propuesto un conjunto de molculas
candidatas, bsicamente compuestos del suelo o productos de degradacin del organismo. A continuacin
se citan los ms importantes.
cidos hmicos y flvicos
La posible accin inhibidora de los cidos hmicos y
flvicos sobre las enzimas de biologa molecular fue
sealada por vez primera por Svante Pbo.3 Los cidos hmicos y flvicos son una familia de molculas
muy abundantes en el suelo, que pueden acompaar al
ADN en el proceso de purificacin y que son inhibidores
muy potentes de la reaccin de PCR (ver figuras 9 y
10). Tan solo 100 ngr. de cido flvico son suficientes
para la inhibicin total de una amplificacin control de
fago .11 Las propiedades fluorescentes de esta familia
de compuestos se han relacionado con la fluorescencia
observada en agarosa de algunos de los extractos de
ADN antiguo.
Residuos de porfirinas o productos derivados de su
degradacin:
Los derivados de la porfirina o sus productos de
degradacin han sido sealados como tales inhibidores
por algunos autores durante los aos 90.32,33 La accin
inhibidora de estas molculas se debe a su capacidad
para secuestrar iones metlicos, necesarios para el funcionamiento de polimerasas, gracias a estructuras similares al grupo hemo. Las porfirinas se encuentran
presentes en sangre, tejidos blandos y en hojas vegetales, y constituyen una familia molecular que puede
considerarse como derivada de un compuesto tetrapirrlico original: la porfina. Las porfirinas ms abundantes son las protoporfirinas y aunque pueden
describirse quince protoporfirinas ismeras, solo una
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Algunos autores han estudiado el efecto del dao postmortem en los resultados de secuencias de ADNa y han
podido detectar directamente transiciones denominadas de "tipo 1" (A->G T->C) y de "tipo 2" (C->T G>A) que pueden enmascarar como mutaciones lo que
no es ms que un dao molecular.37 Por este motivo,
dado que una reduccin de 20C en la temperatura
implica una disminucin de entre 10 y 25 veces en la
tasa de reacciones qumicas, la congelacin de muestras puede ser un factor determinante a la hora de
preservar un ADN durante largo tiempo. As, para muestras de gran antigedad, en el perodo comprendido
entre 40000 y 50000 aos, la baja temperatura parece
ser de gran importancia para la ralentizacin de los procesos responsables de la degradacin de los cidos
nucleicos durante el perodo postmortem.21
donde D/L es la relacin de formas D y L y t es el tiempo. El trmino logartmico t=0 describe la cantidad de
cido D-asprtico formado mediante el procedimiento
de hidrlisis con HCl 6 M a 100C durante 6 horas y K
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Una de las explicaciones para justificar que la correlacin entre D/L y la edad sea menor en hueso que
en dentina o en cartlago, es la elevada remodelacin
del primero o que pueda existir contaminacin con protenas de otras fuentes como tejido conectivo y sangre
que pueden incrementar de forma significativa la cantidad de forma L.
Tambin se ha estudiado el grado de racemizacin de
otros aminocidos como alanina y leucina, pero el cido
asprtico tiene la ventaja de que tiene una alta energa
de activacin y su tasa de racemizacin es una de las
ms rpidas y es constante en un amplio rango de temperatura (a pH neutro).
Segn parece, los factores que influyen en el proceso
de racemizacin son tambin responsables de la
degradacin del ADN.38 Tras estudiar el grado de
racemizacin de muestras de diferentes organismos y
pocas, Poinar y colaboradores establecieron que para
relaciones D/L Asprtico mayores de 0.08 no era posible obtener una secuencia fiable de ADN. Pareca existir adems una relacin clara entre la amplitud de este
aminocido y la longitud de secuencia de ADN que
poda recuperarse: en muestras con una D/L igual a
0.05 se obtenan secuencias de entre 140 y 340 pares
de bases, mientras que en aquellas con una tasa de
racemizacin mayor tan slo era posible amplificar fragmentos ms cortos.49
La ventaja de este mtodo es que permite identificar
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Midiendo esta fluorescencia puede estimarse la concentracin de un ADN problema comparndola con
unos patrones de concentraciones conocidas.
Recientemente la casa comercial Applied Biosystems
ha comercializado una nueva modalidad de sondas,
denominadas TaqMan MGB (Minor Groove Binding),
que presentan la particularidad que se unen al surco
pequeo de la doble hlice de ADN y aumentan as la
temperatura de desnaturalizacin Tm, permitiendo el
uso de sondas con menos pares de bases.
La ventaja de este procedimiento es que permite cuantificar una secuencia de ADN especfica y no la cantidad
total de ADN, tal y como sucede con otras tcnicas
como la espectrofotometra. Adems, marcando diferentes sondas con diferentes fluorocromos pueden
cuantificarse distintas secuencias a la vez. La principal
desventaja es que este mtodo requiere una sonda
diferente para cada secuencia a cuantificar, lo que suele
encarecer bastante el proceso. Un ejemplo de RT-PCR
puede verse en la figura 13.
Figura 14. Estructura gentica del ADN mitocondrial.
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Figura 15.
Retrato de la
familia imperial
Zarista. El misterioso destino
de la princesa
Anastasia solo
pudo resolverse por el
estudio del
ADN de sus
restos.
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El resultado de los anlisis realizados apoya la hiptesis de que los restos se correspondan con los del
crimen de Ekaterimburgo: los individuos 4 y 7 eran el
Zar y la Zarina respectivamente; 3, 5 y 6 eran sus hijas;
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AGRADECIMIENTOS.
Este artculo ha sido parcialmente
financiado
por
el
proyecto
BMC2002-2741 (DT).
BIBLIOGRAFIA
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BIBLIOGRAFIA
50.- S. Hummel, Ancient ADN
Typing: methods, strategies and
applications. Springer Verlag,
Heidelberg, Berln, Nueva York, pp.
193-197. 2003.
51.- P. Gill, P. L. Ivanov, C.
Kimpton, R. Piercy, N. Benson, G.
Tully, I. Evett, E. Hagelberg, K.
Sullivan, Nat. Genet., 1994, 6(2),
130.
52.- Sin autores, Nat. Genet.,
1994, 8(3), 205.
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