Ensayo cometa en peces

Clara Alejandra
Serafn Bazalda


Introduccin
Gentica toxicolgica
La gentica toxicolgica es el estudio sistemtico de los agentes fsicos, qumicos y biolgicos
presentes en el ambiente afectan al sistema gentico de los organismos causando dao al ADN,
aberraciones estructurales en los cromosomas o en general mutaciones en el genoma as como la
consecuencia para las futuras generaciones (Speit et al., 2008).
A lo largo de esta disciplina se han desarrollado ms de 200 sistemas de prueba, tanto in vitro
como in vivo y dividido en cuatro grupos dependiendo el nivel de deteccin del dao gentico:
Grupo I: todas aquellas pruebas que detectan posible dao al ADN a nivel molecular,
proporcionan informacin suficiente para clasificar a los agentes como mutgenos
potenciales.
Grupo II: incluye las pruebas que detectan mutaciones a nivel celular, ya sea de una forma
directa o indirecta, mediante el empleo de microorganismos, plantas superiores, clulas en
cultivo o mamferos completos.
Grupo III: Son todos aquellos sistemas que permiten establecer los efectos directos o
indirectos de los agentes mutagnicos sobre los cromosomas.
Grupo IV: Recopila una serie de ensayos a largo plazo, que hace evidente el efecto de los
agentes sobre la descendencia de los organismos tratados (Moutschen, 1985).
Electroforesis Unicelular en Gel (EUG).
Existen diversas pruebas para detectar dao al ADN (aberraciones cromosmicas, intercambio de
cromtidas hermanas, prueba de microncleos) estas pruebas evalan el dao a nivel
cromosomal. Sin embargo hay otras pruebas como el ensayo cometa el cual puede revelar el dao
directo a una molcula de ADN.
En las ltimas dcadas se han desarrollado nuevas tcnicas en el campo de la toxicologa. Una de
ellas es la prueba de Electroforesis unicelular en gel bajo condiciones alcalinas, o ensayo cometa,
desarrollada por Singh et al. (1988), la cual combina la simplicidad de las tcnicas bioqumicas
para detectar rompimientos de cadena sencilla en el ADN, sitios lcali sensibles y
entrecruzamientos con las tpicas tcnicas de clulas individuales de los ensayos citogenticos
(Tice et al, 1996).
Muchas molculas biolgicas como aminocidos, pptidos, protenas y cidos nucleicos poseen
grupos ionizables que en una solucin pueden mostrar una carga elctrica, tanto cationes (+) o
aniones (-). La mayora de las molculas con carga similar tienen un radio de carga/masa distinta
esto es a causa de su diferencia en peso molecular; cuando los iones en solucin son sometidos a
una corriente elctrica, esta diferencia de masas moleculares produce una migracin diferencial de
las molculas. Los cationes se mueven al ctodo (-) y los aniones se mueven al nodo (+) (-)
(Williams Bryan L., 1975).
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stling y Johanson fueron los primeros en desarrollar la tcnica de la electroforesis en gel para
detectar el dao en el ADN a nivel individual en las clulas. En su tcnica, las clulas eran
embebidas en agarosa y colocadas en un portaobjetos las cuales posteriormente son tratados por
una solucin de lisis la cual contiene sales y detergentes, una vez liberado el ADN realizaron un
proceso de electroforesis en condiciones de pH neutro. Las clulas con una frecuencia ms alta de
rompimientos de doble cadena de ADN migraron hacia el nodo. Esta migracin fue cuantificada
mediante una tincin con bromuro de etidio y medida por la intensidad de la fluorescencia.
Posteriormente Singh y colaboradores en 1988 introdujeron una tcnica en microgel involucrando
electroforesis bajo condiciones alcalinas (pH>13) condiciones para detectar dao al ADN en clulas
individuales. A este pH hay un incremento en la migracin del ADN la cual est asociada con
rompimientos de cadena sencilla, rompimientos de cadena sencilla asociados con una incompleta
reparacin por escisin y sitios alcalisencibles. Debido a que la mayora de agentes genotxicos
inducen rompimientos de cadena sencilla y sitios alcalisencibles en mayor cantidad a
rompimientos de cadena doble, esta versin ofrece una gran sensibilidad para identificar agentes
genotxicos. (Tice et al., 2000).
En comparacin con otras pruebas de genotoxicidad el ensayo cometa presenta las siguientes
ventajas:
1. Ha demostrado sensibilidad para detectar bajos niveles de dao al ADN.
2. Requiere un nmero pequeo de clulas por ensayo (aprox. 10,000 clulas).
3. Tiene un bajo costo con respecto a las tcnicas citogenticas convencionales.
4. Es fcil de aplicar a prcticamente cualquier tejido, clulas aisladas y cultivos.
5. Se puede llevar a cabo estudios con pequeas cantidades de la sustancia a prueba.
6. El corto periodo de tiempo necesario para completar un ensayo.
7. Los datos obtenidos son a nivel de clulas individuales.
8. El ensayo puede evaluar dao al ADN en clulas sin proliferacin (Rojas et al, 1999; Tice et
al, 2000).


En el ensayo cometa tambin es importante la utilizacin de una prueba de citotoxicidad para la
interpretacin de los datos. Una prueba in vivo depende de una simple tincin por exclusin como
azul tripano, sin embargo este enfoque no es informativo si existe una maceracin o una
homogenizacin utilizada para obtener las clulas individuales. Es por eso que se utiliza una
prueba de viabilidad utilizando una doble tincin basada en la combinacin de 5-6 diacetato
carboxifluoresceina y bromuro de etidio, para identificar clulas que son metablicamente
competentes y/o tienen su membrana celular comprometida. (Tice et al, 2000)
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El pez como organismo modelo
Durante aos los estudios genticos se han llevado a cabo en miles de especies diferentes, entre
ellas casi todos los grupos principales de bacterias, hongos, protistas, plantas y animales. Sin
embargo, unas pocas especies han surgido como organismos modelo, seres vivos que presentan
caractersticas que los hacen particularmente tiles para el anlisis gentico y acerca de los cuales
se ha acumulado una tremenda cantidad de informacin gentica.
El pez es un organismo modelo ideal para estudiar la gentica y el desarrollo en organismos
vertebrados (Talbol, 2000; Eisen, 1996). Debido a que embriognesis ocurre externamente adems
de que los embriones son transparentes, lo que permite observar en el microscopio todos los
estadios de su desarrollo, y seguir con detalle las primeras divisiones celulares y la formacin de
las capas embrionarias (ectodermo, mesodermo y endodermo). El desarrollo de este organismo es
rpido y a las 24 horas ya se aprecia la segmentacin del cerebro y se han formado estructuras
como el tubo neural, la notocorda y los somitos (precursores de msculo y esqueleto). Para los
cinco das de desarrollo se han formado rganos sensoriales como los ojos y los odos. Asimismo,
han aparecido el corazn, el hgado, los riones y el pncreas, adems de que los sistemas
circulatorio, digestivo y nervioso son perfectamente funcionales.
En este momento el pez es perfectamente capaz de responder a estmulos visuales, olfativos y
mecnicos y comienza a nadar buscando alimento (Kimmel et al 1995).
Los anlisis genticos y la disponibilidad de material biolgico se facilitan por la cantidad de
embriones (entre 100 y 200 individuos) que una sola pareja de peces puede producir cada
semana. El pez es diploide y con ciclos generacionales cortos (de 2 a 3 meses), los adultos tienen
un tamao de 3 centmetros, por lo que en un laboratorio acondicionado con 50 tanques (cada uno
del tamao de la caja para un ratn) se puede albergar una colonia de al menos 500 peces
(Kimmel et. al., 1995).

Revisin y discusin de artculos de investigacin sobre el ensayo cometa en peces
El biomonitoreo es un tema importante dentro de las ciencias ambientales. Las pruebas de
monitoreo estn obligadas a ser rpidas, relativamente econmicas, precisas y reproducibles.
Hasta ahora no existe una prueba gentica en la actualidad cumple con todos estos requisitos. Las
pruebas de aberraciones cromosmicas y de intercambio de cromtidas hermana consumen
mucho tiempo, el ensayo de microncleos no es una herramienta de vigilancia fiable (Belpaeme et
al, 1998).

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Los trabajos que a continuacin se citan se centran en la validacin del ensayo cometa como
candidato para el biomonitoreo de los ecosistemas marinos.
La simplicidad y la sensibilidad del ensayo cometa lo convierten en un sistema de prueba
adecuado para la vigilancia biolgica de la exposicin crnica o subcrnica a xenobiticos. En
1997, el CIEM ACME concluyo que el ensayo cometa es una tcnica prometedora para la
deteccin de daos al ADN (Belpaeme et al, 1998).

La contaminacin ambiental por metales pesados es uno de los problemas ms importantes en el
mundo. Los efectos de estos contaminantes sobre la naturaleza se han incrementado debido al
uso excesivo en procesos industriales, el uso de qumicos en la agricultura, etc., afectando una
gran variedad de organismos vivos (Chandran et al, 2005).
Los metales se han identificado como los contaminantes ms peligrosos en los ecosistemas
acuticos debido a su persistencia, ya que a diferencia de otros xenobiticos no se pueden
biotransformar, por lo que se acumulan en el agua, potenciando as su toxicidad (Martnez- tabche
et al, 200). Los organismos acuticos se ven expuestos por va oral, drmica e inhalatoria, a travs
del alimento, el agua y los sedimentos. (Newman et al 2001; Baird, 2001).
La utilizacin del ensayo cometa en peces para la deteccin del dao al ADN inducido por la
presencia de mutgenos disueltos en el agua o en el medio ambiente, se ha convertido en una
herramienta de suma importancia para el monitoreo y evaluacin de agentes genotxicos
presentes en ocanos y aguas continentales.
En el 2005 Lemos et al, utilizaron el ensayo cometa en peces con el fin de evaluar los efectos de la
exposicin de los ecosistemas acuticos a los xenobiticos presentes en el ambiente, utilizando
dicha tcnica como biomarcador de genotoxicidad en el monitoreo de aguas continentales.
Segn los datos de este estudio y los criterios establecidos para Van der Oost et al en el 2003, el
ensayo cometa en T.Rendalli debe ser un buen marcador biolgico, puesto que es fiable,
relativamente barato y fcil de realizar, as mismo la evaluacin mediante esta tcnica no resulta
invasiva, ni destructiva, preservando de esta manera al organismo y al ecosistema.
El mecanismo subyacente entre las relaciones del dao al ADN y la exposicin a xenobiticos,
tienen una importancia toxicolgica que se puede establecer con las rupturas al ADN y el origen de
neoplasias por citar algn ejemplo.
Este estudio sugiere que T. rendalli es un buen bioindicador de genotoxicidad no especifica en
peces. Se ha utilizado con xito para reflejar la variacin en la exposicin in vivo en una
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determinada especie y tambin tiene el potencial como una prueba para explorar efectos celulares
especficos, la variacin interindividual y la persistencia de las lesiones.
Existen muchos tipos de sustancias qumicas las cuales son carcingenas en potencia presentes
en nuestro entorno en ros, costas, lagos, sedimentos, aire, alimentos, etc.
Los pescados y crustceos son una fuente importante de protena para los japoneses, y la ingesta
de estos productos contaminados pueden tener efectos adversos en los seres humanos. Algunas
de las consecuencias son: bajo peso al nacer, el aumento de enfermedades congnitas y ciertos
tipos de cncer, estos hallazgos se han encontrado con mayor frecuencia en personas que viven
cerca de vertederos. Los lixiviados de los vertederos son el principal origen de la contaminacin del
agua y se sospecha que no solo ocasionan dao en animales acuticos sino tambin en los seres
humanos.
Durante la evaluacin de las actividades mutagenicas de lixiviados en los vertederos mediante la
prueba de microncleos y ensayo cometa con peces de colores realizada en el 2007 por Deguchi
et al, encontraron una tendencia similar a la observada en la prueba de microncleos en las
branquias de peces dorados. Sin embargo en algunos resultados esta dio como negativo, mientras
que el ensayo cometa presento resultados positivos.
Mitchelmore y Chipman comentan que la sensibilidad a las roturas en la doble cadena del ADN
medidas por el ensayo cometa lo hacen actuar como un biomarcador de mutagenicidad en las
especies acuticas. Haciendo hincapi en que este enfoque debe combinarse con el uso de otros
marcadores biolgicos.
Por lo tanto en dicho estudio se examino la mutagenicidad mediante la combinacin de la prueba
de microncleos y ensayo cometa. La primera, detecta la rotura de cromosomas despus de la
reparacin y la segunda detecta roturas sencillas o dobles presentes en el ADN.
R.B. Jarvis y J.F. Knowles en el 2003 en el artculo titulado: El dao del ADN en larvas de pez
cebra inducida por la exposicin a dosis bajas de radiacin: deteccin mediante el ensayo cometa
en versin alcalina determinaron la sensibilidad de dicha tcnica para la deteccin de roturas de
cadena en el ADN de las clulas tomadas de un organismo completo. El ensayo se realizo en
larvas de pez cebra irradiadas durante 1 o 24 horas en dosis de 0,4, 1,2 o 7,2 mGy/h.
Las larvas de pez cebra expuestas a 1,2 mGy/h durante una hora mostraron un aumento
estadsticamente significativo en el dao al ADN en comparacin a los controles. Esto representa
una gran sensibilidad de este organismo modelo. El aumento en el tiempo de exposicin de 1 a 24
horas causo un incremento significativo en el dao al ADN.
Este estudio demuestra que el ensayo cometa puede ser utilizado con xito para detectar daos en
el ADN en clulas obtenidas mediante la maceracin de un organismo completo. Aunque este
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enfoque tiene algunas desventajas, tales como la reduccin en el nmero de clulas debido al
proceso de maceracin, la capacidad de utilizar larvas individuales u otros organismos pequeos
es importante, ya que no requiere de la difcil toma de muestras de rganos individuales. Si bien
los efectos de la radiacin ionizante se han examinado en el presente estudio, el modelo se
encuentra muy bien adaptado para la investigacin de cualquier genotoxico.
La exposicin ocupacional a plaguicidas es un fenmeno comn y alarmante a nivel mundial.
Aproximadamente, 3 millones de los casos de envenenamiento agudo y 0.22 millones de muertes
anuales son por esta causa. La utilizacin del ensayo cometa en condiciones alcalinas, para la
evaluacin de la genotoxicidad de dichos compuestos ofrece considerables ventajas sobre otros
mtodos citogenticos como aberraciones cromosmicas, intercambio de cromtidas hermanas y
microncleos, ya que para el ensayo no es necesario que las clulas sean activadas
mitticamente.
Por lo tanto, es ampliamente utilizado en los campos de la gentica toxicolgica y biomonitoreo
ambiental, incluyendo a los organismos acuticos como una herramienta para la medicin de la
relacin entre el dao al ADN y la exposicin de los mismos a genotxicos.
Los resultados obtenidos en el estudio realizado por Ali D. et al (2009) estn de acuerdo con los
resultados de Blasiak et al. (1999) para los linfocitos humanos expuestos al malatin y sus
anlogos. El dao en el ADN detectado en este estudio podra tienen su origen en roturas de
hebras de ADN individuales, dobles de ADN hebras de descanso, las formaciones de aductos de
ADN, ADN-ADN y ADN-protena enlaces cruzados (Mitchelmore y Chipman, 1998) como resultado
de la interaccin de los pesticidas o sus metabolitos con el ADN.
Klobucar et al (2002) determinaron que la evaluacin del dao al ADN es de inters primordial para
evaluar el estrs relacionado con la contaminacin en los organismos vivos. Se evalu la
genotoxicidad de los ambientes de agua dulce mediante la utilizacin de la prueba de microncleos
y ensayo cometa.
Los resultados del ensayo cometa mostraron concordancia con la prueba de microncleos en la
indicacin de la intensidad del dao al ADN. Cabe destacar que en la interpretacin de los cometas
dentro de las investigaciones de campo, hay que tener en cuenta que la genotoxicidad y toxicidad
qumica directa puede ocurrir simultneamente, de modo que los efectos son el resultado de la
suma de diversos mecanismos de dao a las molculas (Depledge, 1998) as como de la
activacin de un conjunto de adaptaciones. Rodrguez- Ariza et al (1992) sugirieron que las
poblaciones nativas de moluscos en zonas contaminadas podran estar ms protegidas contra el
dao oxidativo inducido por xenobiticos los cuales generan especies reactivas de oxigeno.
La generacin de daos en el ADN se considera como un evento importante durante el inicio de la
carcinognesis. La mayora de las pruebas genotxicas consisten en la deteccin de los diferentes
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efectos producidos en sistemas experimentales o en investigaciones por exposicin a agentes
genotxicos de manera ambiental u ocupacional.
La electroforesis unicelular es una prueba tcnicamente sencilla, relativamente rpida, barata y el
dao producido al ADN puede ser investigado en casi todos los tipos de clulas de vertebrados y
mamferos sin necesidad de cultivo celular.
El objetivo de esta revisin fue evaluar las ventajas y desventajas del ensayo cometa como una
prueba de genotoxicidad producida por agentes ambientales, abarcando organismos modelos
experimentales y de biomonitoreo.


















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Referencias
1. Speit G, Frhler-Keller M, Schtz P, Neuss S. (2008) Low sensitivity of the comet assay to
detect acetaldehyde-induced genotoxicity. Mutat Res.8; 657(2):93-7.
2. Moutschen, J. (1985) Introduction to genetic toxicology. John Wiley&Sons.EUA.Pp 1-25.
3. Singh NP. (2000) Microgels for estimation of DNA strand breaks, DNA protein crosslinks
and apoptosis. Mutat Res.20; 455(1-2):111-27.
4. Tice RR, Agurell E, Anderson D, Burlinson B, Hartmann A, Kobayashi H, Miyamae Y, Rojas
E, Ryu JC, Sasaki YF. (2000) Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo
genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen; 35(3):206-21.
5. Williams Bryan L. & Wilson Keith, (1975), Principles and tecniques of practical biochemistry,
Edward Arnold, Londres.
6. Rojas E, Lopez MC, Valverde M. (1999) Single cell gel electrophoresis assay: methodology
and applications. Chromatogr B Biomed Sci Appl.5; 722(1-2):225-54.
7. Talbot, W.S. and N. Hopkins (2000) Zebrafish mutations and functional analysis of the
vertebrate genome. Genes Dev.14 (7): p. 755-62.
8. Eisen, J.S. (1996) Zebrafish make a big splash. Cell. 87(6): p. 969-77.
9. Kimmel, C.B., et al. (1995) Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn.
203(3): p.253-310.
10. Chandran R, Sivakumar A. A., Mohandass S., Aruchami M. (2005) Effect of cadmium and
zinc on antioxidant enzyme activity in the gastropod, Achatina fulica. Com.Biochem.
Physiol.140:422-426.
11. Newman M.C., Roberts M. H., Hale R. C. (2001). Coastal and estuarine risk assessment.
Lewis Publishers.pp.347.
12. Belpaeme K, Cooreman K, Kirsch-Volders M. (1998) Development and validation of the in
vivo alkaline comet assay for detecting genomic damage in marine flatfish. Mutat Res.31;
415(3):167-84.
13. Lemos NG, Dias AL, Silva-Souza AT, Mantovani MS. (2005) Evaluation of environmental
waters using the comet assay in Tilapia rendalli. Environ Toxicol Pharmacol. 19(2):197-201.
14. Van der Oost, R., Beyer, J., Vermeulen, N.P.E. (2003) Fish bioaccumulation and biomarkers
in environmental risk assessment: a review. Environ. Toxicol. Pharmacol. 13, 57149.
15. Deguchi Y, Toyoizumi T, Masuda S, Yasuhara A, Mohri S, Yamada M, Inoue Y, Kinae N.
(2007) Evaluation of mutagenic activities of leachates in landfill sites by micronucleus test
and comet assay using goldfish. Mutat Res; 627(2):178-85. Epub 2006 Dec 29.
16. C.L. Mitchelmore, J.K. Chipman. (1998) DNAstrand breakage in aquatic organisms and the
potential value of the comet assay in environmental monitoring, Mutat. Res. 399 135147.
Ensayo cometa en peces
Clara Alejandra
Serafn Bazalda

17. Jarvis RB, Knowles JF. (2003) DNA damage in zebrafish larvae induced by exposure to
low-dose rate gamma-radiation: detection by the alkaline comet assay. Mutat Res 10;
541(1-2):63-9.
18. Ali D, Nagpure NS, Kumar S, Kumar R, Kushwaha B, Lakra WS. (2009) Assessment of
genotoxic and mutagenic effects of chlorpyrifos in freshwater fish Channa punctatus (Bloch)
using micronucleus assay and alkaline single-cell gel electrophoresis. Food Chem Toxicol.
47(3):650-6. Epub 2008 Dec 25.
19. Blasiak, J., Jaloszynski, P., Trzeciak, A., Szyfter, K. (2009) In vitro studies on the
genotoxicity of the organophosphorus insecticide malathion and its two analogues. Mutat.
Res. 445, 275283.
20. Klobucar GI, Pavlica M, Erben R, Papes D. (2003) Application of the micronucleus and
comet assays to mussel Dreissena polymorpha haemocytes for genotoxicity monitoring of
freshwater environments. Aquat Toxicol.19; 64(1):15-23.
21. Depledge, M.H. (1998) The ecotoxical significance of genotoxicity in marine invertebrates.
Mutat. Res. 399, 109/122.
22. Rodriguez-Ariza, A., Abril, N., Navas, J.I., Dorado, G., Lopez-Barea, J., Pueyo, C. (1992)
Metal, mutagenicity, and biochemical studies on bivalve molluscs from Spanish coasts.
Environ. Mol. Mutagen. 19, 112/124.
23. .Moller P. (2005) Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet
assay. Basic Clin Pharmacol Toxicol.;96 Suppl 1:1-42. Institute of Public Health, University
of Copenhagen.