Rev Esp Med Legal.

2013;39(2):54---62

REVISTA ESPAÑOLA DE
MEDICINA LEGAL
www.elsevier.es/mlegal

REVISIÓN

Revisión de métodos de extracción de ADN a partir de restos óseos

en el laboratorio forense
Pedro A. Barrio-Caballero ∗

Servicio de Biología, Departamento de Barcelona, Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses, Barcelona, España

Recibido el 5 de septiembre de 2012; aceptado el 5 de noviembre de 2012

Disponible en Internet el 29 de diciembre de 2012

PALABRAS CLAVE Resumen En el campo de la identificación humana, la genética forense está teniendo un papel
ADN; relevante en los últimos años. Sin embargo, existen circunstancias en las que su labor puede
ADN antiguo; verse dificultada. Tal es el caso del hallazgo de restos humanos esqueletizados, en los que las
Restos humanos; condiciones tafonómicas de dicho hallazgo pueden suponer una limitación en la obtención de
Huesos; ADN a partir de ellos en cantidad y calidad suficiente para su identificación. En estos casos
Dientes; se han de aplicar estrategias especiales y diferentes a las habitualmente empleadas en los
Extracción ADN; laboratorios forenses.
Identificación En la presente revisión, en primer lugar, se valora la idoneidad del uso de restos óseos para
la obtención de ADN, que será empleado en los subsiguientes estudios genéticos de identifica-
ción. En segundo lugar, se comentan los problemas de preservación del ADN obtenido a partir de
este tipo de muestras. Igualmente se exponen las complicaciones metodológicas que implica la
obtención de este ADN. Aunque no debe olvidarse la degradación y las modificaciones molecula-
res de este tipo de ADN, la presente revisión se centra en su coextracción junto con inhibidores
de la PCR. Finalmente, se valoran los principales protocolos de extracción de ADN a partir de
restos óseos, encaminados precisamente a la eliminación de dichos inhibidores.
© 2012 AsociaciÓn Nacional de Médicos Forenses. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los
derechos reservados.

KEYWORDS Revision of DNA extraction methods from bone fragments in forensic laboratories
DNA;
Ancient DNA; Abstract In the human identification field, Forensic Genetics serves an outstanding role every
Human remains; time. However, there are circumstances where its task could be obstructed. This is the case of
Bones; human dried bones discovery. The taphonomic conditions of this finding could imply a limitation
Teeth; on adequate quantity and quality of obtaining DNA for bone identification. In these cases, special
DNA extraction; and different strategies to the usual ones must be executed on forensic laboratories.
Identification In the present revision, firstly, the adequacy of using bone fragments to obtain DNA is assessed.
This extracted DNA will be employed on subsequent identification genetic studies. Secondly,
preservation problems of DNA obtained from this type of samples will be presented. Likewise,
methodological complications to obtain this DNA will be set out. In particular, the co-extraction

∗ Autor para correspondencia.

Correo electrónico: pedroalberto.barrio@mju.es

0377-4732/$ – see front matter © 2012 AsociaciÓn Nacional de Médicos Forenses. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.
http://dx.doi.org/10.1016/j.reml.2012.11.002
Revisión de métodos de extracción de ADN a partir de restos óseos en el laboratorio forense
with PCR inhibitors will be considered, although degradation and molecular modification of
DNA must not be forgotten. Finally, principal DNA extraction protocols of bone fragments will
be evaluated. The protocols, which are designed to eliminate those PCR inhibitors, will be
especially considered.
© 2012 AsociaciÓn Nacional de Médicos Forenses. Published by Elsevier España, S.L. All rights
reserved.
Introducción
En la actualidad, frecuentemente se producen circunstan-
cias en las que aparecen restos humanos y/o cadáveres, que
deben ser identificados y en los que es necesaria la exhuma-
ción de los restos óseos (RO). Tal es el caso de personas
desaparecidas, de restos de víctimas de atentados terro-
ristas o grandes catástrofes, restos procedentes de fosas
comunes de conflicto bélicos y casos de litigios de filiación
o de adopciones irregulares. En todos ellos, se trata de asig-
nar a los restos humanos una «identidad», entendida como
el conjunto de elementos que individualizan a una persona
y la diferencian de las demás1 .
La identificación de un cadáver constituye una priori-
dad por razón propiamente humanitaria y social2,3 , por el
hecho en sí mismo de perder a un ser querido y la nece-
sidad netamente humana de tener conocimiento de dicho
fallecimiento, saber dónde se encuentran los restos y poder
despedirlos en las condiciones que se crean necesarias. Pero
además, dentro de nuestro ámbito, son fundamentales las
implicaciones legales que tiene el fallecimiento de toda
persona. En todos los Estados de Derecho, las distintas regu-
laciones legales atribuyen una relevancia jurídica esencial al
hecho del fallecimiento, y nuestro ordenamiento lo regula
tanto en el ámbito civil4 como en el penal5 .
El proceso de identificación suele tener una compleji-
dad variable, que a menudo requiere de la intervención
de equipos multidisciplinares, integrados por especialis-
tas en medicina forense, antropología forense, odontología
forense, dactiloscopia y genética forense6 . En algunas
situaciones, como en excavaciones de fosas comunes de
conflictos bélicos, también se puede requerir la partici-
pación de especialistas en arqueología e historia7 , cuyas
técnicas de excavación arrojan información adicional que
contribuye al proceso de identificación.
Cuando nos enfrentamos a cadáveres bien conservados,
existen multitud de herramientas que permiten resolver
el proceso de identificación de forma rápida. Estas van
desde los datos fisonómicos (peso, talla, defectos físicos
aparentes, marcas, tatuajes, etc.), pasando por la propia
documentación personal encontrada con el cadáver, hasta
la identificación necrodactilar, principal método empleado
en las identificaciones8---10 .
Sin embargo, en muchos casos, estos métodos no pue-
den ser aplicados o se han de complementar y/o confirmar
mediante el estudio comparativo del perfil de ADN obte-
nido a partir del cadáver, con el de familiares, muestras
biológicas antemortem del difunto (muestras hospitalarias)
o con el de restos biológicos encontrados en objetos atri-
buidos al fallecido11---13 . Pero incluso en estos casos existe un
tipo de muestras (huesos y dientes) que presentará dificul-
tades añadidas. Estos obstáculos adicionales habitualmente
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serán resultado de las propias condiciones en las cuales se
encontraron los restos (condiciones tafonómicas), que lle-
varán aparejada, aparte de la degradación y/o modificación
del material genético que pueda ser obtenido de los mis-
mos, la presencia de sustancias inhibidoras, que interferirán
en las subsiguientes etapas de la identificación genética. La
variabilidad en la preservación de las muestras que lleguen
al laboratorio obliga a la aplicación de distintas estrate-
gias para la extracción del material genético presente en
dichas muestras. De este modo, la presente revisión se
centra en la valoración de los principales métodos de extrac-
ción de ADN a partir de las muestras de restos cadavéricos
esqueletizados.
Muestras más adecuadas para la obtención
de ADN a partir de estructuras esqueléticas
Numerosos estudios14---17 señalan que el material genético se
degrada más rápidamente en tejidos blandos que en hue-
sos, debido a la estructura más resistente del hueso que
actúa como barrera física frente a las influencias tafonómi-
cas. La densidad del hueso también es un factor importante
que influye en su preservación18 . De este modo, el ADN está
normalmente menos degradado en las porciones más densas
del esqueleto, como el fémur y la tibia11,19,20 . Pese a todo,
existen pocos estudios que hayan valorado las diferencias
de las tasas de éxito en obtener un perfil genético entre los
diferentes elementos esqueléticos21,22 .
Algunas publicaciones sugieren que el ADN está mejor
preservado en clavículas que en costillas19 , en huesos lar-
gos más densos que en elementos menos densos23,24 , y en
hueso compacto que en hueso esponjoso o trabecular25 . En
un interesante estudio de Milós et al.24 se registraron las
tasas de éxito para obtener un perfil genético a partir de
25.361 huesos y dientes de restos recuperados de víctimas
de fosas comunes en la antigua Yugoslavia, enterrados en un
intervalo de 4-11 años. Sus resultados indicaron que el ADN
está mejor preservado en fémures y dientes, seguido por
tibias, peronés, húmeros, cráneos, radios y cúbitos. Estos
hallazgos son acordes con la literatura tafonómica que mues-
tra una robusta relación entre la densidad del hueso y la
preservación esquelética26 .
Está claro que las tasas de éxito para obtener un perfil
genético varían entre estructuras esqueléticas, aunque la
razón de este hecho no es del todo bien conocida22 . Leney27
ha argumentado que las áreas bajo una carga mecánica alta,
tales como la mandíbula y las estructuras poscraneales den-
sas, tienen una cortical más gruesa que podría actuar como
una barrera protectora frente a la degradación del ADN. En
cambio, en el caso de los dientes, es el esmalte dental el
que protege al ADN de la degradación y la contaminación24 .
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De este modo, y siendo sensible a dichas peculiaridades,
la legislación española, cuando detalla las muestras que se
han de enviar para su identificación genética en el caso de
cadáveres en avanzado estado de descomposición o esque-
letizados, recomienda específicamente el envío de piezas
dentales y/o un hueso largo, preferiblemente el fémur28 .
Factores que influyen en la preservación
del ADN
En el momento en que un organismo muere, comienzan los
procesos de degradación de sus biomoléculas, entre ellas
el ADN. Los agentes causantes de esa degradación serán
las propias enzimas del organismo (autolisis29 ), la poste-
rior invasión de los restos por bacterias, hongos e insectos,
y, finalmente, procesos químicos, principalmente hidrólisis
y oxidación, que completarán la degradación del material
genético30 .
Sin entrar en el proceso químico que lleva a esa degrada-
ción del ADN, ampliamente descrito en la bibliografía29---34 ,
cabe destacar que estos procesos llevarán tanto a la pro-
pia fragmentación del ADN (proceso de hidrólisis) como a la
modificación del mismo (daño oxidativo).
La velocidad y el grado de descomposición del material
genético de un resto va a depender de diversos facto-
res endógenos y exógenos35 . El éxito en la obtención de
información genética a partir de estructuras óseas está
condicionado, aparte de por el tipo de estructura, por la con-
diciones del enterramiento. Las características del ambiente
en el que se encuentra depositado un resto pueden ralen-
tizar o incluso detener el proceso de degradación. Así las
condiciones que más afectarán a la degradación del ADN
serán la temperatura, la humedad, el pH o la presencia de
ciertos compuestos en el suelo:
- La temperatura es el factor que más condiciona la pre-
servación del material genético. Las temperaturas bajas
durante el período de deposición de un resto favorecen
su conservación óptima30,36 , debido a que, a bajas tem-
peraturas, se produce una ralentización de las reacciones
químicas responsables de la degradación orgánica32 . En
el lado opuesto, la presencia de elevadas temperaturas
puede favorecer la deshidratación parcial del ADN, dete-
niendo los procesos de hidrólisis30 .
- La humedad ejerce un efecto adverso sobre la preserva-
ción del material genético. Debido a la porosidad propia
del hueso y a la acción disolvente de la humedad, se
favorece la penetración de las sustancias orgánicas del
sedimento en el interior del resto. Esto incrementa la
posibilidad de que el extracto de ADN presente moléculas
inhibidoras, además de favorecer la degradación hidrolí-
tica y oxidativa36 .
- Un pH neutro o ligeramente alcalino en el enterramiento
favorece la preservación del ADN30 . Sin embargo, Herr-
mann y Newesely37 , demostraron que una disminución
paulatina del pH provocaba la degradación de la hidro-
xiapatita de los huesos o dientes.
- Los compuestos del suelo. Se ha apuntado la posibilidad
de que ciertos compuestos minerales del suelo, como la
montmorilonita, la kaolinita, el feldespato o el cuarzo,
podrían asociarse al ADN protegiéndolo frente a la acción
P.A. Barrio-Caballero
endonucleásica38---40 . También se ha documentado la posi-
bilidad de que la unión del ADN con los ácidos húmicos del
suelo causaría el mismo efecto protector41 . Sin embargo,
otros componentes propios del suelo pueden ejercer el
efecto contrario, como se detallará a continuación.
Problemas metodológicos en la obtención
de ADN a partir de restos óseos
La obtención de material genético endógeno a partir de
restos óseos se enfrenta con una serie de dificultades de
tipo técnico, relacionadas la mayor parte de las veces
con el estado de preservación del ADN. Este tipo de ADN
presenta un conjunto de características físico-químicas,
similares al ADN antiguo, que lo diferencian del procedente
de organismos vivos, también denominado «ADN fresco»35 .
Se podrían resumir fundamentalmente en 4: escasez, frag-
mentación de las cadenas, modificaciones moleculares y la
presencia de inhibidores de la PCR en los extractos.
Escasez y fragmentación de las cadenas de ADN: son
manifestaciones de un mismo fenómeno, la degradación
posmortem del material genético35 . Así, la longitud de los
fragmentos amplificables depende de las condiciones de
preservación de los restos óseos36 . Además, las modifica-
ciones moleculares del ADN, consecuencia también de dicha
degradación posmortem, provocan sobre el ADN lesiones que
bloquearán la polimerasa, como las modificaciones oxidati-
vas de las bases nitrogenadas y los residuos de azúcar32 , o la
creación de puentes cruzados (cross-links) entre las propias
cadenas de ADN o entre el ADN y las proteínas del medio
(reacción de Maillard)42---44 . Estas modificaciones también
provocan lesiones que causarán la incorporación incorrecta
de bases, «miscoding lesions»45---48 .
La presencia de inhibidores de la PCR en los extractos
está íntimamente relacionada con el resto de característi-
cas. La naturaleza y mecanismos de acción de muchos de
dichos inhibidores resultan todavía hoy desconocidos35,44 , y
lo que queda claro es que el protocolo de extracción con-
vencional de ADN (método de extracción «orgánica»), no
consigue eliminar gran parte de las moléculas inhibidoras,
pues aparecen en los extractos finales. Así pues, se pueden
enumerar dichos posibles inhibidores, según la naturaleza de
los mismos y que básicamente serán compuestos del suelo,
o subproductos de la degradación orgánica.
Respecto a los componentes del suelo, se suele hablar
de la posible acción inhibidora de los ácidos húmicos y fúlvi-
cos sobre las enzimas biológicas43,49 . Estos compuestos, muy
abundantes en el suelo, pueden acompañar al ADN en el
proceso de extracción y son inhibidores muy potentes de la
reacción de PCR34,35,50 . Por otro lado, los residuos deriva-
dos de la porfirina o sus productos de degradación podrían
ser responsables de la actividad inhibidora de la PCR51,52 ,
por su capacidad para secuestrar iones metálicos, necesa-
rios para el funcionamiento de la polimerasa53 . Las porfirinas
se encuentran presentes en algunas hojas vegetales, además
de en la sangre y en los tejidos blandos34,35 .
Asimismo, muchos autores29,30,43,44,54---56 han relacionado
los productos de la reacción de Maillard con la capacidad
inhibidora de algunos extractos de ADN de muestras anti-
guas. Esta reacción es muy conocida en el campo de la
tecnología de los alimentos, y sus productos son muchos y
Revisión de métodos de extracción de ADN a partir de restos óseos en el laboratorio forense
variados, pudiendo tener numerosos grupos reactivos, entre
los que se cuentan los grupos hidroxilo, carbonilo y metilo,
que pueden reaccionar con el ADN34,44 .
Y por último, los propios productos de degradación del
material genético, sea por rotura de sus enlaces o por modi-
ficaciones químicas tales como la reducción de azúcares,
generan ciertos productos capaces de inducir la inhibición
directa de su propia amplifiación44,57,58 .
Proceso de extracción de ADN a partir
de estructuras óseas
Un alto porcentaje de los problemas que afectan al éxito en
la obtención de ADN a partir de RO son debidos a la acción
de los inhibidores. Independientemente de la naturaleza
o de sus mecanismos de acción, constituye una prioridad
la eliminación o atenuación del efecto inhibidor. Aunque se
podrían tomar medidas para minimizar su efecto durante la
propia amplificación del ADN (PCR)29,51,52,59 , es mejor elimi-
nar el problema en su inicio. Por ello, todo el proceso de
extracción de ADN se convierte en un paso primordial a la
hora de obtener resultados positivos. Esto ha obligado, en
muchos casos, a la implementación de protocolos específi-
cos.
Antes de valorar el proceso de extracción, conviene
comentar por su importancia la necesidad de aplicación de
una serie de medidas de seguridad para evitar y/o controlar
posibles problemas de contaminación. Van desde la propia
infraestructura del laboratorio (separación física de áreas),
pasando por las recomendaciones específicas de limpieza del
propio laboratorio y material empleado, preparación asép-
tica de reactivos, hasta llegar a la inclusión de controles a lo
largo de todas las etapas del proceso y la aplicación de cri-
terios de autentificación. No obstante, sobre estas normas
se ha escrito ampliamente25,34,35,43,45,60,61 y no es la finalidad
de esta revisión.
Pretratamiento (descontaminación)
Uno de los primeros pasos, previos a la propia etapa de
extracción, suele consistir en un pretratamiento de los RO,
encaminado a acondicionar y/o mejorar el rendimiento en
la posterior extracción de ADN.
La mayor parte de los protocolos recomiendan una
limpieza superficial de los RO o dientes, para la elimina-
ción de los posibles contaminantes (material exógeno y/o
bacterias). Esta limpieza puede basarse en lavados con
lejía diluida y/o agua destilada62 . Sin embargo, algunos
estudios63 han demostrado que se trata de un procedimiento
demasiado agresivo y que puede ser contraproducente para
el posterior éxito en la obtención de ADN60 , proponiéndose
métodos químicos alternativos64 . La mayor parte de los pro-
tocolos propone la eliminación de dicha capa superficial
mediante abrasión mecánica o lijado. Algunos emplean dis-
positivos («arenadora») que inyectan un material abrasivo
(óxido de aluminio) a presión sobre la superficie de la pieza,
provocando la eliminación de la capa más externa35 .
Otro método alternativo, aunque la mayoría de los pro-
tocolos lo recogen como complementario a los otros 2,
suele consistir en la irradiación de las piezas a analizar con
luz ultravioleta35,60 . Existen protocolos que combinan los
57
3 métodos para asegurar la eliminación de cualquier posi-
ble contaminación exógena61,62 o aplican tratamientos aún
más elaborados de descontaminación65 .
Una vez limpiadas las muestras (descontaminadas), si se
trata de huesos largos se cortan en fragmentos35,61,62 . Y sean
huesos largos o dientes, siempre se pulverizan mediante
un molino de impactación electromagnética refrigerado con
nitrógeno líquido, para así aumentar la superficie disponible
para los tratamientos químicos posteriores60 . El nitrógeno
líquido congela la muestra, facilitando así su pulverización
y evita la posible degradación del material genético del
hueso por el exceso de calor generado con la trituración
mecánica35 . Para Rohland y Hofreiter66 este paso es crucial,
pues han detectado diferencias estadísticamente significati-
vas entre pulverizar los huesos o tan solo pasar las muestras
por un mortero manual.
Antes del propio proceso de extracción, algunos protoco-
los recogen un paso previo de descalcificación del polvo de
hueso mediante lavados con EDTA, que es un quelante iónico
que actúa secuestrando las sales iónicas contenidas en la
muestra, incluyendo el calcio de los huesos35,56,67---69 . Aunque
en la actualidad, la mayor parte de los protocolos prescinden
de este paso, pues dichos lavados previos podrían eliminar
el posible ADN libre en suspensión existente, no obstante,
incluyen el EDTA en la propia solución de digestión62,70,71 .
Extracción
Finalmente, el último paso consistirá en la propia
digestión de la muestra, mediante proteinasa K, y puri-
ficación del extracto resultante. De este modo, como
métodos más ampliamente extendidos se pueden des-
tacar el basado en la extracción mediante disolventes
orgánicos (fenol:cloroformo)56,67 o mediante resinas que-
lantes (método de unión a «glass-milk» o suspensión de
silica)32,69,72 . También han sido sugeridos otros como el uso
de otro tipo de resinas, tipo Chelex73 , poco eficaz y que
actualmente no se emplea debido a la escasa o nula elimina-
ción de sustancias inhibitorias74 , o el empleo de dispositivos
de ultrafiltración (filtros de distinto tamaño de poro)54,69,75 .
Por otro lado, algunos protocolos incluyen sustancias
reductoras. Se sospecha que el ADN de calidad suficiente
presente en las muestras pueda fallar cuando se analiza.
Poinar et al.76 registran que una de las potenciales razo-
nes de esto es la masiva unión cruzada de macromoléculas
(cross-linking) que ocurre posmortem. Estos investigadores
sugieren que el ADN puede quedar atrapado con productos
entrecruzados, impidiendo su amplificación. Para liberar el
ADN de tales matrices, Poinar et al.76 emplean N-fenacil tia-
zolio bromido (PTB) para romper los entrecruzamientos, y
registran tanto un incremento en la tasa de éxito por mues-
tra, como un incremento en la fuerza de la señal obtenida.
Algunos autores66 sugieren el uso de otras sustancias reduc-
toras, como el DTT, y señalan la inefectividad del PTB.
En la actualidad, uno de los métodos más comúnmente
usados es el basado en la combinación de descalcificación
con EDTA y purificación con silica69,77,78 . Sin embargo, exis-
ten otras muchas variaciones, por lo que a continuación se
detallan aquellos más ampliamente empleados y estableci-
dos en la mayoría de los laboratorios, y que han demostrado
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sobradamente su rendimiento en determinado tipo de mues-
tras.
Protocolo «Fenol:cloroformo»
Este protocolo es una adaptación del procedimiento están-
dar de extracción de ADN por fenol:cloroformo79 , en el cual
las muestras son digeridas con proteinasa K y un deter-
gente como Triton X-100 o SDS, que rompe las membranas
celulares. El digerido es mezclado con una solución de
fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:25:1), paso que es
repetido hasta eliminar la coloración. Se ha escrito mucho
sobre esta coloración «marronácea» del extracto29,35,60,76 ,
pero no siempre existe coloración y, si existe, no siempre se
consigue eliminar.
De la fase anterior de fenolización se descarta la fase
orgánica. Dependiendo del protocolo aplicado, para elimi-
nar las trazas de fenol, se puede añadir una solución de
cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). La fase acuosa, que
contiene el ADN se trasvasa a un tubo limpio. A partir de
este punto, el protocolo estándar incluía una fase de preci-
pitación con acetato amónico y etanol absoluto frío, pero los
últimos protocolos desarrollados introducen la concentra-
ción en pequeños volúmenes usando sistemas de filtración
por centrifugación54,69,74 . Dicha concentración se realiza
mediante dispositivos de ultrafiltración80,81 , que permiten
la retención selectiva del ADN extraído.
Aunque la fase acuosa normalmente se encuentra por
encima de la fase orgánica durante la extracción de
fenol:cloroformo, es importante indicar que, en ocasiones,
altas concentraciones de sales pueden causar inversión de
fase82 . Este hecho podría darse en el caso de extractos a
partir de RO, debido a la composición de la propia matriz
ósea y, en ocasiones, a las condiciones de preservación. No
obstante, suele ser bastante marginal.
Protocolo «Silica-sal»
Aunque este protocolo fue inicialmente descrito por Höss
y Pääbo83 , adaptado de Boom et al.84 , ha sufrido muchas
modificaciones a lo largo de los años85 . La última y mejorada
versión es de Rohland y Hofreiter70 ; ha sido ampliamente
testada en comparación con otros métodos66 y finalmente
adaptada para estudios a gran escala86 .
Este protocolo se fundamenta en la adición al polvo de
hueso/diente de una solución de extracción (extraction buf-
fer), consistente en EDTA y proteinasa K, y su incubación
toda la noche. Al sobrenadante obtenido se le añade una
solución de unión (binding buffer) de base de tiocianato de
guanidinio (GuSCN) concentrado y cloruro o acetato sódico
(NaCl/Ac), y la suspensión de silica, todo lo cual se incuba
en oscuridad. Para muestras que no contienen inhibidores
de la PCR, se pueden usar otras sales diferentes al GuSCN,
como por ejemplo el cloruro sódico66 . Estas sales no caotró-
picas son mucho más baratas y actúan igual de bien o incluso
mejor en términos de recuperación de ADN. Sin embargo,
tienden a copurificar inhibidores de la PCR y, por tanto, no
deben ser usadas con muestras que probablemente conten-
gan inhibidores70 .
El siguiente paso es el de purificación y elución, en el que,
una vez descartado o almacenado el sobrenadante (el cual
puede pasar por un nuevo proceso de binding), al precipi-
tado de silica se le somete a lavados sucesivos con solución
P.A. Barrio-Caballero
de lavado (washing buffer) de base etanólica (EtOH 50%,
NaCl y EDTA). Y finalmente se le añade la cantidad requerida
de tampón TE para eluir el ADN retenido en la silica.
Aunque se trate de un método largo y, en algunos puntos
complejo, se ha demostrado su rendimiento en la obten-
ción de ADN66 , sobre todo en la obtención de un ADN libre
de inhibidores. En la actualidad, hay disponibles colum-
nas comerciales en las cuales se introduce la suspensión de
silica o «glass-milk», a través de los cuales se hace pasar
el digerido60,86 , que permiten simplificar y estandarizar este
método, automatizándolo y miniaturizándolo.
Protocolo «Desmineralización-silica» (International
Commission on Missing Persons)
Este protocolo podría ser considerado como una varia-
ción del anterior, pues se basa también en la retención
en silica (comercial), aunque no incluye la sal GuSCN.
Se valora de forma independiente, pues es el procedi-
miento operativo estándar de la Comisión Internacional de
Personas Desaparecida (International Commission on Mis-
sing Persons [ICMP])61,87 . Es similar a otros recientemente
publicados88,89 , y ha sido perfeccionado gracias al desarrollo
de multitud de proyectos de identificación de personas des-
aparecidas en todo el mundo61,90,91 . Presenta 2 claves funda-
mentales: la digestión completa, aumentando la proporción
de tampón de digestión y polvo de hueso; y la eliminación
de inhibidores, mediante la purificación con resina.
Una vez pretratada la muestra, el método consiste en una
digestión inicial de toda la matriz ósea, lo que supone una
desmineralización total de la misma. Es decir, no se pasa
a la siguiente fase hasta que casi no quede ningún resto de
matriz ósea61 . El tampón de desmineralización consiste bási-
camente en EDTA (0,5 M), N-laurilsacnosinato sódico (1%) y
proteinasa K. Una vez digerido, el sobrenadante es filtrado
en dispositivos de ultrafiltración92 , y el volumen recuperado
pasa a ser procesado siguiendo las especificaciones de la
casa comercial del kit QIAquick® 92 , con algunas modifica-
ciones introducidas por la ICMP61 . Aunque este kit comercial
ha sido diseñado para la purificación de productos de PCR,
según los autores61 parece ofrecer un buen rendimiento en
la purificación de ADN total.
Además, proponen un proceso de «repurificación»61 , en
aquellos casos extremos en los que se detecte la copuri-
ficación de inhibidores durante el proceso de extracción (a
través de algunos métodos de cuantificación de ADN humano
o en la posterior obtención de perfiles). Este proceso puede
ser aplicado tanto en este protocolo de extracción como
en extractos obtenidos a partir de otros protocolos. El pro-
ceso de «repurificación» consiste en procesar de nuevo el
extracto con el kit QIAquick® 81 , siguiendo prácticamente las
especificaciones de la casa comercial.
Protocolo «Fishing» (purificación)
Este método de extracción está basado en la hibridación
y separación magnética que proporciona ADN puro sin nin-
gún inhibidor detectable71,93 . Previo al propio proceso de
«captura de ADN», la muestra (polvo de hueso/diente) es
sometida inicialmente a una extracción con el tampón están-
dar ampliamente descrito (EDTA, SDS y proteinasa K). El
sobrenadante obtenido se somete de forma repetitiva a
una solución de unión y lavado (binding/washing buffer) y
Revisión de métodos de extracción de ADN a partir de restos óseos en el laboratorio forense 59

Tabla 1 Tabla resumen con las ventajas e inconvenientes de cada uno de los protocolos de extracción de ADN a partir de
muestras de restos humanos esqueletizados
Protocolo
«Fenol:cloroformo»
Ventajas
Mayor cantidad de ADN
(rendimiento)
Pureza (eliminación de
compuestos orgánicos)
Procedimiento habitual
en la mayoría de los
laboratorios (simplifica su
uso)
Inconvenientes
No eliminación completa
de inhibidores de la PCR
Uso de disolvente
orgánicos (muy tóxicos)
Procedimiento largo
Protocolo
«Silica-sal» (GuSCN)
Mayor posibilidad de
obtener un perfil genético
Eliminación eficiente de
inhibidores de la PCR
Posibilidad de
automatización
Procedimiento largo
Procedimiento complejo
(aunque se han conseguido
estrategias de
simplificación)
Protocolo
«Desmineralización-silica»
(ICMP)
Mayor posibilidad de
obtener un perfil genético
Eliminación eficiente de
inhibidores de la PCR
Permite procesado a gran
escala
Posibilidad de
contaminación cruzada
Aún no ha sido validado
para su automatización
Protocolo
«Fishing» (purificación)
Eliminación eficiente de
inhibidores de la PCR
Protocolo rápido (todo el
procesamiento se puede
realizar en un día) y sencillo
Procesado de elevado número
de muestras (hasta
16 muestras en una única
tanda)
Automatización
Menor cantidad de ADN
recuperado
Elevado coste,
fundamentalmente por el uso
de sistemas automatizados

posterior filtrado, manteniéndolo finalmente en dicha solu-
ción. El siguiente paso consiste en la incubación de
la muestra con iniciadores (primers) marcados con bio-
tina, para posteriormente inmovilizar el ADN en partículas
magnéticas recubiertas de estreptavidina, usando un con-
centrador de partículas magnéticas. El ADN inmovilizado es
lavado con la solución anterior y con otras soluciones que
contienen KCl. Finalmente, el ADN es resuspendido en agua
ultrapura u otro tampón (como TE), para así poder alma-
cenar el extracto de ADN que vaya a ser utilizado en los
siguientes pasos de amplificación por PCR.
En la actualidad, existen multitud de kits comerciales
basados más o menos en este método, y que permiten una
agilización, estandarización y automatización del procedi-
miento. De este modo, se pueden destacar los siguientes
kits comerciales orientados a su uso forense:
- El PrepFilerTM Forensic DNA Extraction Kit (Applied Biosys-
tem Inc.94 ) es un sistema con una química que permite
una unión específica del ADN a partículas magnéticas y
la posterior elución del mismo altamente eficiente, con
la capacidad de eliminar inhibidores y adaptarlo a siste-
mas automáticos. Un punto interesante es precisamente la
posibilidad de automatización con su propio sistema Auto-
Mate ExpressTM Forensic DNA Extraction System (Applied
Biosystem Inc.95 ), en el que todos los reactivos del kit vie-
nen en cartuchos individuales (Applied Biosystem Inc.96 ),
y que permite procesar hasta 13 muestras en una única
tanda, sin apenas intervención manual.
- El DNeasy® Tissue Kit (QIAGEN Inc.97 ) tiene un protocolo
ajustado a muestras de hueso98 . De este surgió la aplica-
ción directa al campo forense, QIAamp® DNA Investigator
(QIAGEN Inc.99 ), asimismo con su protocolo específico para
huesos y dientes. Este kit también posee una adaptación
para su automatización con su propio sistema, el
BioRobot® EZ1 (QIAGEN Inc.100 ), con los reactivos en cartu-
chos individuales101 , y que permite procesar en una única
tanda desde 6 muestras (EZ1 y EZ1 Advanced) hasta 14
(EZ1 Advanced XL), según el modelo de equipo empleado.
- Por último, el DNA IQTM System (Promega102,103 ), que usa
una resina paramagnética patentada para purificar el ADN.
Posee también su propio sistema de automatización, el
Maxwell® 16 Forensic Instrument (Promega104 ), que con
cartuchos individuales105 puede procesar en una única
tanda hasta 16 muestras. Pero, además, este sistema ha
sido probado con estaciones de trabajo de otras casas
comerciales, como: Beckman Coulter Biomek® NXP106 ,
Tecan Freedom EVO® 100107 , Biomek® 3000108 , o el sistema
en soporte sólido SlicprepTM 96 Device109 .
Para el caso específico de huesos, es interesante señalar
que tanto los kits PrepFilerTM (Applied Biosystem Inc.94 )
como el DNA IQTM System (Promega103 ), aparte de sus propios
reactivos, en la fase de lisis señalan la necesidad de incluir
DTT (agente reductor). No queda claro la justificación de
su empleo y si el mismo ofrece un rendimiento significati-
vamente mejor en la obtención de cantidad y calidad de
ADN. No obstante, es interesante reseñar el estudio compa-
rativo realizado por Rohland y Hofreiter66 , en el que, aunque
no detectaban diferencias estadísticamente significativas, sí
hallaban que la adición de DTT parecía mostrar un ligero
efecto positivo sobre la cantidad de ADN recuperado.
Valoración final de los métodos de extracción
de ADN considerados
En el caso de la identificación genética de restos humanos
esqueletizados, uno de los principales factores limitantes,
60
además de la degradación y modificación del ADN, es la
presencia de inhibidores de la PCR. Por ello, el proceso
de extracción de ADN constituye un paso primordial, igual
que en el mismo sean eliminados en la medida de lo posi-
ble dichos inhibidores. Algunos estudios60,66 han señalado al
método de extracción de ADN basado en silica-sal como el
más ventajoso frente al método de fenol:cloroformo, porque
todo aquello que no se une a la silica es eliminado mediante
lavados. Similares ventajas ofrece el protocolo desarrollado
por la ICMP61 , basado también en la purificación con silica,
el cual viene avalado por años de aplicación y perfecciona-
miento, y miles de identificaciones en todo el mundo61,88,89 .
Sin embargo, algunos investigadores60 han encontrado
que este tipo de ADN no se une a la silica tan eficiente-
mente como el «ADN fresco», probablemente porque el ADN
en este tipo de muestras puede estar dañado. Por ello, el
método de fenol:cloroformo podría extraer mayor cantidad
de ADN (tabla 1). No obstante, según diversos estudios, el
método silica-sal66,70 o el de «desmineralización-silica» de la
ICMP61 ofrecen un mayor porcentaje de muestras extraídas y
amplificadas exitosamente. Este mayor rendimiento en rela-
ción cantidad/calidad del ADN recuperado, hacen a estos
protocolos especialmente indicados en la casuística forense.
Además, como ventaja adicional, estos métodos eliminan el
uso de disolventes orgánicos (fenol:cloroformo) propios del
método estándar de extracción y que son perniciosos para
la salud del investigador (tabla 1).
No obstante, debido a la alta cantidad de ADN recupe-
rado con el método fenol:cloroformo, y a la limpieza en
inhibidores de la PCR de los métodos comerciales (automa-
tizados o no), se podría plantear una estrategia combinada
de métodos, en función de las peculiaridades de cada mues-
tra analizada. De este modo, en aquellas muestras que se
presupusiera una alta cantidad de inhibidores, se podría
aplicar el método de fenol:cloroformo, para la obtención
de la mayor cantidad de ADN posible. Y una vez extraído,
junto con los posibles inhibidores que no hubieran sido elimi-
nados, el extracto resultante, se podría purificar mediante
un sistema automatizado de «captura de ADN», o mediante
la «repurificación» planteada en el protocolo de la ICMP61 .
Mediante dichos métodos se lavarían los restos de posibles
inhibidores existentes. En cualquier caso, si se sospecha que
serán mínimas las cantidades de ADN existentes en la mues-
tra, se hace recomendable la aplicación directa del método
silica-sal66,70 o el de «desmineralización-silica» de la ICMP61 .
En definitiva, el analista deberá valorar el método de extrac-
ción de ADN a partir de restos esqueletizados más apropiado
a emplear, en función de las características y condiciones de
la muestra que llegue al laboratorio.
Conflicto de intereses
El autor declara no tener ningún conflicto de interés.
Agradecimientos
El autor quiere mostrar su agradecimiento a M. José Escu-
dero por sus aportaciones en los aspectos jurídicos, así como
a Eva Fernández por sus comentarios y perspectiva desde el
estudio del ADN antiguo. Además, quiere mostrar su más sin-
cero agradecimiento a Manuel Crespillo y Miguel Paredes,
P.A. Barrio-Caballero
por su profunda revisión y aportaciones, que indudable-
mente han completado y mejorado el texto. Y por último,
agradecer también a los revisores anónimos y editores sus
comentarios y sugerencias para mejorar este manuscrito.
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