3.

Morfologa Colonial y
Microscpica de los Microorganismos

M. en C. Sandra Ruiloba de Len y Frescas

Departamento de Microbiologa
Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas, IPN

3. Morfologa Colonial y Microscpica

de los Microorganismos
El desarrollo de colonias sobre superficies slidas permite
al microbilogo identificar las bacterias a partir de una
poblacin mixta porque las especies forman a menudo
colonias caractersticas.
En general, el crecimiento celular ms rpido se produce
en el extremo de la colonia siendo ms lento en el centro.
Esto se debe a gradientes de oxgeno, nutrientes y
productos de desecho txicos dentro de la colonia. En el
extremo de sta, el oxgeno y los nutrientes son
abundantes. El centro de la colonia es, evidentemente ms
grueso y por ello el oxgeno y los nutrientes no se difunden
tan fcilmente

3.1 Caractersticas coloniales de algunos

grupos de bacterias:
Colonia Microbiana
Una colonia microbiana est
constituida por individuos de
la
misma
especie
provenientes de una clula o
de un grupo de ellas. Por
definicin
un
buen
aislamiento en placa es aquel
que nos da colonias aisladas,
con una distancia que permita
distinguir y describir la
morfologa colonial

Descripcin de la Morfologa Colonial

1. Tamao en milmetros
2. Color
3. Forma: puntiforme, circular o
irregular
4. Bordes: enteros o irregulares
(lbulos, filamentos, aserrados,
enrollados etc.)
5. Elevacin: plana o elevada
(convexa, pulvinada, umbonada,
crateriforme o umbilicada)
6. Superficie: lisa, rugosa o
granular
7. Aspecto: hmedo o seco
8. Luz reflejada: brillante o mate
9. Luz transmitida: transparente,
transl-cida u opaca
10. Produccin de pigmento
11. Consistencia: dura o suave
(butirosa, mucoide o friable)

Cultivo puro
Con la experiencia en la observacin de cultivos, las
caractersticas de morfologa colonial constituyen una gua
muy til en el reconocimiento de los principales grupos de
microorganismos y tambin permite corroborar la pureza
de un cultivo o alertar sobre una posible contaminacin.
El cultivo puro permite la caracterizacin e identificacin
correcta de un microorganismo capaz de causar una
infeccin en el hombre los animales o las plantas o bien ser
usado en la produccin de vacunas, sueros, antibiticos,
hormonas, enzimas, colorantes o en productos de inters
en la industria alimentaria como vinos, queso, pan, cerveza

Caractersticas coloniales de los

Actinomicetos
Son un grupo de bacterias Gram positivas que poseen en su
genoma un alto contenido de Guanina Citosina. El nombre
proviene de las races griegas actinos proyecciones radiales
y mykes hongo.
Las colonias de este grupo bacteriano son en general secas,
duras, mate, lisas o muy ornamentadas, hundidas en el
medio de cultivo e hidrofbicas. Algunas pueden sintetizar
pigmentos que son excretados al medio de cultivo.

Colonias de actinomicetos

Colonias de actinomicetos
Colonias de Steptomyces
coelicolor.
Las colonias de color rojo
son productoras de
antibitico.

Caractersticas coloniales de los

Micoplasmas

La mayora de los procariotes no pueden sobrevivir sin pared celular

pero existe un grupo de bacterias, denominadas micoplasmas, que
carecen de pared.
Los micoplasmas son protoplastos de vida libre que disponen de
membranas citoplasmticas muy resistentes (poseen esteroles) o bien
viven en medios protegidos osmticamente.
Cuando crecen en agar estos microorganismos tienden a incrustarse
en el medio y las colonias adoptan un aspecto caracterstico de huevo
frito, debido a la formacin de un ncleo central denso, que penetra
en el agar, rodeado de un rea circular de dispersin, de color menos
intenso.

Colonias de micoplasmas

Caractersticas coloniales de las Mixobacterias

Mixobacterias o Bacterias deslizantes
Las mixobacterias son bacterias Gram negativas y aerobias,
caracterizadas por tener movilidad por deslizamiento, tener un ciclo
vital complejo con produccin de cuerpos fructferos, y formar
mixosporas.
En presencia de una fuente de alimento, las mixobacterias migran a
lo largo de una superficie slida, alimentndose y dejando tras de s
un rastro mucoide. Durante esta fase las clulas suelen constituir un
grupo, y se mueven de manera coordinada. Algunas especies se
congregan para producir una lmina de clulas que se desplaza de
forma rtmica y genera ondas. Cuando se agota su aporte de
nutrientes, las mixobacterias se renen y se diferencian en un cuerpo
fructfero,

Colonias de Mixobacterias

Bacterias que producen swarming

Algunas bacterias mviles no

forman colonias discretas sino
que crecen invadiendo toda la
caja de Petri.
Este tipo de crecimiento
llamado
swarming
es
caracterstico
de
algunos
gneros como Proteus.
Las clulas en el extremo de la
colonia se mueven mas
rpidamente que las que estn
en el centro, se mueven en
masa una corta distancia
alejndose de la colonia y
luego
experimentan
una
disminucin de la movilidad,
se detienen y se dividen. Como
resultado la colonia madura
tiene aspecto de discos
concntricos,
con
una
alternancia de altas y bajas
concentraciones de clulas.

Ejemplos de colonias bacterianas

Diversas colonias bacterianas

Colonias de Bacillus

Morfologa colonial de Serratia marcescens

Colonias fluorescentes de Pseudomonas

aeruginosa

Microfotografa de colonias bacterianas

3.2 Morfologa Microscpica de las

Bacterias

Morfologa celular
A la forma de una clula se le denomina morfologa celular.
Las bacterias poseen una considerable variedad en su forma, agrupacin y
tamao.
La mayora de ellas exhiben tres formas generales: cocos, bacilos y espirilas.
Si la clula es esfrica se describe como coco pudiendo haber ligeras
variaciones.
A las clulas cilndricas se les denomina bacilos y se pueden observar con
extremos diversos (rectos, curvos, bulbosos, ahusados, bifurcados etc.). Los
cocobacilos son bacilos cortos y regordetes. Los bacilos ligeramente curvos
son vibrios.
Las bacterias que tienen la forma de un cilindro en forma de espiral rgida se
llaman espirilas y las que tienen una forma mas flexible y se asemejan a un
resorte se denominan espiroquetas.

Tambin es posible observar bacterias triangulares, cuadradas, en forma de

estrella de David etc.

Esquema de diversas formas y agrupaciones

bacterianas

Esquema de diversas morfologas microscpicas

Morfologa microscpica: esquemas y microfotografas

Morfologa microscpica, esquemas y microfotografas

Microfotografas de diversas formas y agrupaciones

bacterianas

Observacin microscpica de diversas formas bacterianas

Ejemplos representativos de espiroquetas

Agrupacin de las bacterias

Agrupaciones en los cocos

Las bacterias pueden existir como clulas individuales, pero se asocian tambin
en agrupaciones caractersticas que son tiles frecuentemente para identificarlas.
Los cocos pueden crecer como clulas aisladas o bien agruparse en pares dando
lugar a los diplococos (Neisseria). Cuando las clulas permanecen adheridas
despus de dividirse en un plano, se forman largas cadenas de cocos llamadas
estreptococos; este modelo se observa en los gneros Streptococcus,
Enterococcus y Lactococcus. Las bacterias del gnero Staphylococcus se dividen
en planos aleatorios para generar agrupaciones irregulares en forma de racimos
de uvas llamadas estafilococos. Las divisiones en dos o tres planos pueden
producir grupos simtricos de cocos. Los miembros del gnero Micrococcus se
dividen a menudo en dos planos para formar grupos cuadrados de cuatro clulas
denominados tetradas. En el gnero Sarcina, los cocos se dividen en tres planos,
formando paquetes cbicos de ocho clulas denominados precisamente sarcinas.

Agrupaciones en los cocos

Observaciones microscpicas de cocos en pares

(diplococos) y cocos en cadena (estreptococos).

Cocos en tetradas

Agrupacin de las bacterias

Agrupaciones en los bacilos
Aunque muchos bacilos aparecen aislados,
pueden permanecer juntos despus de dividirse
para formar pares constituyendo los diplobacilos
o cadenas de distinta longitud llamados
estreptobacilos. Algunos se agrupan formando
una especie de valla que se describe como
empalizada y otros mas toman agrupaciones
irregulares conocidas como letras chinas.

Observacin microscpica de algunos bacilos

Observacin microscpica de diversas formas y

agrupaciones bacterianas

Morfologa microscpica de diversas bacterias

Morfologa microscpica del actinomiceto

Planomonospora sp.

Morfologa microscpica de Escherichia coli

Morfologa microscpica de Staphylococcus aureus

Morfologa microscpica de Mycoplasma pneumoniae

Morfologa microscpica de Helicobacter pylori

Morfologa microscpica de Bacillus anthracis

Morfologa microscpica de Borrelia burgdorferi

agente causal de la enfermedad de Lyme

Morfologa microscpica de
Campylobacter jejuni

Observacin microscpica de Mycobacterium

tuberculosis causante de la tuberculosis

Morfologa microscpica de diversas bacterias

fotosintticas

Morfologa microscpica de diversas bacterias

metangenas

Morfologa microscpica de Caulobacter

Morfologa microscpica de algunas halobacterias

Morfologa microscpica de Legionella

pneumophila causante de la enfermedad
de los legionarios

Morfologa microscpica de
Leucothrix spp formando
agrupacin en rosetas

Morfologa microscpica de
Streptococcus pneumoniae

Morfologa microscpica de
diversas bacterias deslizantes

Morfologa microscpica de
Neisseria gonorrhoeae

Morfologa microscpica de
Spirillum spp

Pleomorfismo
Es muy comn que clulas de la misma especie muestren
ligeras variaciones en forma y tamao. Este fenmeno se
denomina pleomorfismo y se debe a variaciones
individuales en la estructura de la pared celular por
diferencias nutricionales o hereditarias. Corynebacterium
diphteriae es un bacilo pero en cultivo muestra una amplia
variacin en su forma observndose curvo, filamentoso,
cocoide etc.
El pleomorfismo alcanza su punto extremo con los
micoplasmas que no poseen pared celular y muestran por
lo tanto una gran versatilidad en su forma

Pleomorfismo en Corynebacterium diphteriae

Este gnero exhibe

una gran variedad en
formas y tamaos.
Adems se agrupa de
una
manera
caracterstica llamada
empalizada.

Pleomorfismo en los Micoplasmas

Estas bacterias carecen de pared

celular lo que les permite una
gran plasticidad de forma.
La microfotografa corresponde
a Mycoplasma pneumoniae
observada con un microscopio
de barrido a 62000X
y
coloreada artificialmente por
computadora .

Tamao de las bacterias

Las bacterias varan tanto de tamao como de forma. Las ms

pequeas, miembros del gnero Mycoplasma miden aproximadamente
0.3 m de dimetro, casi el tamao de los virus mayores (poxvirus).
Recientemente se han publicado investigaciones sobre clulas incluso
menores. Las nanobacterias o ultramicrobacterias que tienen un
dimetro aproximado de entre 0.2 y 0.05 m.
Escherichia coli es un bacilo de tamao medio que mide 1.1-1.5 m de
ancho por 2-6 m de largo. Algunas bacterias son bastante grandes;
ciertas espiroquetas pueden alcanzar a veces una longitud de 500 m.
Se ha descubierto una bacteria enorme en el intestino del pez cirujano.
Esta bacteria llamada Epulopiscium fishelsoni (80 x 600 m) tiene un
tamao mayor que el promedio de las culas eucariticas.

Una bacteria de tamao monstruoso

Esta fotografa realizada
con un microscopio de
campo oscuro, muestra a
Epulopiscium fishelsoni
(procariote) en la parte
central de la fotografa,
empequeeciendo a los
paramecios (eucariotes)
que aparecen en la parte
inferior (x200)

Otro microorganismo gigantesco llamado

Thiomargarita namibia

Bibliografa

Black, J.G. 1999. Microbiology Principles and Explorations. 4a. Ed.

Prentice Hall, Inc.
Madigan M.T., J.M. Martinko y J.Parker. 1999. Brock Biologa de los
Microorganismos. 8a Ed. Prentice Hall, Inc.
Madigan, M.T., J.M. Martinko y J. Parker. 2000. Brock Biology of
Microorganisms. 9a. Ed. Prentice Hall Inc.
Prescott L.M., J.P. Harley y D.A. Klein. 1999. Microbiologa. 4a. Ed.
McGraw Hill-Interamericana

Caractersticas tintoriales. Tamao, forma,

agrupacin y presencia de esporas.
Los microscopios tendran poca utilidad a menos que los
especimenes a observar sean preparados adecuadamente.
El poder de resolucin y el aumento son cualidades
importantes en microscopa, pero igualmente cruciales son
el grado de contraste observado entre las estructuras a ser
observadas y el entorno, por lo que se han desarrollado
tcnicas especiales que acentan las caractersticas
morfolgicas de los microorganismos y que permiten
conservarlos para su estudio posterior. Aunque los
microorganismos vivos se pueden observar directamente
con un microscopio ptico, a menudo hay que fijarlos y
teirlos para aumentar su visibilidad.

Fijacin
Las clulas teidas que se observan con un microscopio
deben parecerse lo mas posible a las clulas vivas.
La fijacin es el proceso por el cual se conservan y fijan en
su posicin las estructuras externas e internas de las
clulas. Inactiva enzimas que podran alterar la morfologa
y endurece las estructuras celulares, de manera que no
cambien durante la tincin ni la observacin. El proceso de
fijacin mata al microorganismo, coagula sus protenas y
lo adhiere firmemente al portaobjetos.

Tipos de Fijacin
Existen
dos
tipos
de
fundamentalmente diferentes:
1.- Fijacin Fsica
2.- Fijacin Qumica

fijacin

Fijacin Fsica
Los bacterilogos la utilizan rutinariamente fijando al calor
frotis bacterianos. Esto se logra calentando suavemente a la
flama del mechero una fina pelcula de bacterias secada
previamente al aire. Si el frotis no se ha secado
completamente, al pasarlo por el mechero se provoca la
ebullicin y destruccin del microorganismo.
Si la fijacin es insuficiente, la fina pelcula de bacterias no
se pegar al portaobjetos y ser fcilmente arrastrada en los
pasos subsecuentes. Si se fija en exceso incineraremos a
los microorganismos.

Fijacin Qumica
Se emplea cuando se desea proteger la subestructura
fina y la morfologa de microorganismos delicados. Los
fijadores qumicos penetran las clulas y reaccionan con
los componentes celulares, normalmente protenas y
lpidos para inactivarlos y convertirlos en insolubles e
inmviles. Entre las sustancias comnmente utilizadas
como fijadores qumicos se encuentran el etanol, cloruro
mercrico, cido actico, formaldehdo, cido tnico y
glutaraldehdo.

Colorantes

Un colorante es cualquier sustancia colorida que al combinarse con

una segunda sustancia, le imparte color. En trminos qumicos es un
compuesto orgnico que posee un grupo cromforo y un grupo
auxcromo unidos a un anillo benceno.
El grupo cromforo imparte al compuesto la propiedad de color. El
anillo benceno que tiene radicales cromforo se le conoce como
cromgeno. Este compuesto que es colorido no tie, es decir no tiene
afinidad o capacidad de unirse a fibras o tejidos. El color puede
entonces removerse fcilmente por medios mecnicos. Para ser
colorante es necesaria la presencia del grupo auxcromo que le imparte
al compuesto la propiedad de disociacin electroltica. La funcin del
auxcromo es la de proporcionar la propiedad de sal al compuesto.

Colorantes usados en Microbiologa

Los numerosos tipos de colorantes
empleados para teir microorganismos
poseen dos caractersticas en comn:
1) Todos poseen grupos cromforos, grupos
con enlaces dobles conjugados que dan
color al colorante.
2) Pueden unirse a las clulas mediante
enlaces inicos, covalentes o hidrofbicos.

Clasificacin de los colorantes por su carga

Los colorantes ionizables se pueden dividir en dos clases, tomando

como base la naturaleza de su grupo cargado.
Los colorantes bsicos como el cristal violeta (violeta de genciana),
azul de metileno, safranina, fucsina bsica, verde de malaquita, son
catinicos o tienen grupos cargados positivamente. Estos colorantes se
unen a molculas cargadas negativamente, como cidos nucleicos y
muchas protenas. Como las superficies de las clulas bacterianas estn
cargadas negativamente.
Los colorantes cidos, como la eosina, la fucsina cida,y el rosa de
bengala son aninicos o poseen grupos cargados negativamente como
hidroxilos (-OH) o carboxilos (-COOH). Estos colorantes debido a su
carga, se unen a estructuras cargadas positivamente.

Utilidad de las Tinciones

Las bacterias son semitransparentes y difciles de ver sin
teir por lo que se utilizan colorantes que :
1.-Permiten hacer visibles a los objetos microscpicos y
transparentes.
2.-Nos revela su forma y tamao.
3.-Muestran la presencia de estructuras internas y externas
4.-producen reacciones qumicas especficas.
Adems, la presencia de ciertas estructuras as como su
reaccin a determinadas tcnicas nos permite
CLASIFICAR a las bacterias.

Tincin simple

Los microorganismos se pueden teir adecuadamente con una tincin

simple, esto es utilizando un solo colorante. El valor de esta clase de
tincin radica en su simplicidad y facilidad de empleo. Se cubre el
frotis previamente fijado al calor, con un colorante durante el tiempo
adecuado, se lava el exceso de colorante con agua y se deja secar al
aire. La tincin simple se emplea con frecuencia para determinar:

a) el tamao
b) la forma
c) la agrupacin
d) la presencia de esporas

Tinciones diferenciales
Los mtodos de tinciones diferenciales
clasifican a las bacterias en grupos
distintos segn sus propiedades tintoriales.
Las tinciones diferenciales mas
comnmente utilizadas son la tincin de
Gram y la tincin de Ziehl-Neelsen

Tincin de Gram
La tincin de Gram desarrollada por el
mdico dans Christian Gram en 1884, es el
mtodo de tincin mas ampliamente
utilizado en bacteriologa. Se trata de un
mtodo de tincin diferencial porque divide
a las bacterias en dos grandes grupos: Gram
positivas (G+) y Gram negativas (G-)

Tincin de Gram

En el primer paso de esta tincin, el

frotis se cubre con el colorante bsico
cristal violeta llamado colorante
primario. Se deja actuar durante un
minuto y se enjuaga el exceso con agua
corriente, se adiciona posteriormente
lugol que es una solucin yodada que
acta como mordente. Esto es, el yodo
aumenta la interaccin entre la clula y
el colorante, de forma que la clula se
tie mas intensamente. Luego se
decolora el frotis lavndolo con una
mezcla de etanol-acetona. Este es el
paso crtico de la tincin, las bacterias
G+ retienen el cristal violeta y las G- lo
pierden y se decoloran. Finalmente el
frotis se tie de nuevo con un colorante
distinto al cristal violeta. La safranina
es el colorante secundario o de
contraste mas comn. Y tie a las
bacterias G- de rosa o rojo dejando a las
G+ de color violeta

Tincin de Gram del Bacilo de

Dderlein
Tincin de Gram de
Lactobacillus acidophilus,
microorganismo
predominante en la vagina
de las mujeres.
Los bacilos tienen una
longitud de 3-4 um

Tcnica de Tincin de Gram

Tcnica de Gram por pasos

Fundamento de la tcnica de Gram

La diferenciacin entre las bacterias

Gram positivas y Gram negativas se
establece en la naturaleza de la pared
celular bacteriana.
Las bacterias Gram positivas poseen
una gruesa pared de peptidoglicana que
es capaz de retener al complejo cristal
violeta-yodo. Durante la decoloracin
con alcohol acetona se provoca una
deshidratacin de esta gruesa pared y se
reduce la porosidad, atrapando entonces
al complejo dentro de la clula. En
cambio en las Gram negativas, la
delgada capa de peptidoglicana no
puede impedir la salida del complejo
colorante-mordente y es entonces
fcilmente teida por el colorante
secundario o de contraste.

Tincin de Ziehl-Neelsen
La tincin de Ziehl_Neelsen desarrollada inicalmente por Paul Ehrlich
para poner de manifiesto la presencia de los bacilos causantes de
tuberculosois en muestras clnicas de pacientes es otra muy importante
tincin diferencial. Algunas especies, particularmente del gnero
Mycobacterium y Nocardia no se tien con colorantes comunes y
requieren de tratamientos mas drsticos que incluyen calentamiento y
el uso de una mezcla de colorante en soluciones alcalinas con una
pequea cantidad de fenol. Una vez que el colorante ha penetrado, las
clulas llamadas cido alcohol resistentes no son decoloradas por la
mezcla alcohol-cido y permanecen teidas con el colorante primario.
Las no cido alcohol resistentes son fcilmente decoloradas y toman
el colorante secundario o de contraste.

Tcnica de tincin de ZiehlNeelsen

1.-Hacer un frotis con la cepa de prueba, dejar

secar al aire y fijarlo al calor.
2.-Cubrir el portaobjetos con fucsina fenicada.
3.-Calentar suavemente con el mechero hasta la
emisin de vapores. El colorante no debe hervir
ni secarse, aadir ms si es necesario.
4.-lavar con agua
5.-Decolorar exhaustivamente con alcoholcido.
6.-Lavar con agua.
7.-Cubrir el frotis con azul de metileno durante
un minuto
8.-Lavar con agua, escurrir, dejar secar.
9.-Observar al microscopio con el objetivo de
inmersin.
Las bacterias ZN+ o BAAR se observarn
teidas intensamente de color rojo.

Fundamento de la tincin de
Ziehl-Neelsen

Los gneros Mycobacterium y Nocardia presentan en su pared celular un alto

contenido de cidos grasos de cadena muy larga constituidos en ceras, cidos
miclicos y nocrdicos, respectivamente.
Se ha postulado que el alto contenido de cidos grasos interviene decisivamente
en la coloracin ya que al calentar la preparacin con el colorante primario hasta
la emisin de vapores se favorece la fusin de las ceras y se aumenta la energa
cintica de las molculas facilitndose la penetracin del colorante a la clula; al
suspender el calentamiento y lavar con agua fra se provoca la solidificacin de
las ceras de modo que el colorante ya no puede salir. Tambin se ha postulado
que la mezcla del colorante-fenol es mas soluble en los lpidos bacterianos que
en el agente decolorante, lo que contribuye a su permanencia en el interior de la
clula.
Puesto que el proceso de decoloracin es muy enrgico, cualquier bacteria que
no contenga abundantes lpidos perder el colorante primario durante la
decoloracin y tomar el colorante de contraste.

Importancia de la Tcnica de Ziehl-Neelsen

Las bacterias que resisten la decoloracin por
alcohol-cido se denominan bacilos cido-alcohol
resistentes (BAAR).
Actualmente la tincin de Ziehl-Neelsen tiene
gran importancia como una de las pruebas en el
diagnstico de Mycobacterium tuberculosis,
agente causal de la tuberculosis, enfermedad cuya
incidencia est aumentando recientemente. As
como en la identificacin de Mycobacterium
leprae, agente etiolgico de la lepra.

Mycobacterium leprae
Tincin
de
ZiehlNeelsen.
Observe las masas de
micobacterias rojas en
el interior de las clulas
husped azul-verdosas.
Mycobacterium leprae.
400X

Diversos tipos de tinciones

Tinciones selectivas

Las tinciones selectivas tienen por objeto poner de manifiesto las

estructuras de las clulas aprovechando las propiedades qumicas o
fsicas de algunos de sus componentes o bien, proporcionar
informacin acerca de la naturaleza de ciertas estructuras a travs de su
comportamiento tintorial. Estas tcnicas de tincin se basan en el
hecho de que la estructura celular que se desea poner de manifiesto
tiene afinidad mayor por los colorantes utilizados que el resto de la
clula.
Se pueden entonces demostrar estructuras como la pared celular,
cpsula, flagelos, material nuclear, e inclusiones como depsitos de
materiales de reserva de poli--hidroxibutirato, glucgeno y grnulos
metacromticos.

Observacin de esporas

Algunas bacterias producen endosporas en un estadio particular de su

ciclo de vida. Las endosporas son las estructuras ms resistentes que
se conocen a agentes fsicos y qumicos debido al nmero y estructura
qumica de las cubiertas. Por ese motivo, las endosporas son
impermeables a los colorantes, por lo que cuando se hace una
tincin, se observan al microscopio como cuerpos altamente
refringentes y sin teir. Sin embargo, las endosporas se pueden teir
aplicando calor a la preparacin previamente cubierta con una solucin
de colorante que en la tcnica de Shaeffer y Fulton es el verde de
malaquita. El lavado con agua elimina este colorante de las clulas
vegetativas y la aplicacin de un colorante de contraste permitir
distinguir claramente a las esporas de color verde.

Tincin de esporas

Tcnica de Shaeffer y Fulton

1.-Hacer un frotis con la cepa de

prueba. Dejar secar al aire y fijarlo al
calor
2.-Cubrir todo el portaobjetos con verde
de malaquita y calentar suavemente la
preparacin a emisin de vapores
durante 5 minutos. El colorante no debe
hervir ni secarse, aadir mas si es
necesario
3.-Lavar
la
preparacin
exhaustivamente con agua de la llave.
4.-Cubrir la preparacin con safranina y
dejar actuar durante un minuto.
5.-Lavar de nuevo con agua, dejar secar
al aire y observar a inmersin.
Las esporas se observan intensamente
teidas de color verde y la clula
vegetativa toma el colorante secundario
mostrndose de color rojo.

Observacin de esporas con una

tincin simple

Observacin de endosporas: esquema y

microfotografas

Observacin de cpsula
Los colorantes cidos, que no tien a la clula, son a veces
tiles para revelar las capas superficiales con bajo ndice
de refraccin, como la cpsula, que se encuentra sobre la
pared celular envolviendo a los microorganismos.La
cpsula puede hacerse visible con una tincin negativa
como el mtodo de rojo Congo, o aadiendo tinta china o
nigrosina al medio de suspensin y como las partculas
coloidales de carbn o las molculas del colorante no
pueden penetrar a travs de la cpsula, esta se observa
como una zona clara que rodea a la clula.

Mtodo del Rojo Congo para

cpsula

Tincin de Rojo Congo

1.-Con el asa estril tomar un poco

del cultivo de una bacteria
capsulada, suspenderlo en una gota
de Rojo Congo y hacer un frotis.
Dejar secar al aire.
2.-Sin fijar al calor, cubrir el frotis
con mordente de cpsula y dejarlo
actuar durante un minuto. Lavar
con agua destilada y dejar secar al
aire.
3.-Observar la preparacin al
microscopio. La cpsula se observa
como una zona clara alrededor de
la bacteria de color rojo en un
campo de color azul oscuro.

Mtodo de la tinta china para cpsula

1.-En
el
centro
de
un
portaobjetos se coloca una gota
de agua, otra de tinta china y un
poco del cultivo de una cepa
capsulada.
Se
mezcla
suavemente sin extender.
2.-Se coloca un cubreobjetos
sobre la suspensin y se presiona
suavemente evitando que queden
burbujas.
3.-Observar inmediatamente al
microscopio.
4.-Desechar la preparacin en un
recipiente con antisptico.
La cpsula se observa como una
gran estructura alrededor de la
clula delimitada por los
pequeos fragmentos de carbn
de la tinta china.

Observacin de pared
La pared celular bacteriana puede
teirse por un colorante bsico despus
de aplicar cido tnico y alumbre de
potasio
como
mordente.
Este
tratamiento permite observar la pared
como una estructura engrosada

Tincin de pared celular

Tcnica de Knaysi

1.-Hacer un frotis con la cepa de

estudio en la forma usual y fijarlo al
calor.
2.-Cubrir el frotis con mordente de
Knaysi y dejarlo actuar durante 10
minutos.
3.-Lavar con agua destilada.
4.-Colocar con el asa una gota de
fucsina sobre la preparacin.
5.-Poner un cubreobjetos y observar al
microscopio. La pared se observa de
color rojo intenso alrededor de la
bacteria cuyo citoplasma se ver de
color rosa o rojo tenue.

Observacin de grnulos
metacromticos

Los grnulos metacromticos,

de polimetafosfato o volutina se
encuentran en muchas bacterias,
hongos, algas y protozoarios,
estn formados de cmulos de
polimetafosfato y sirven como
material de reserva de energa
de la clula. Se ponen de
manifiesto con el colorante azul
de metileno de Leffler y se
tien de color rojo violeta en
tanto que la clula se observa de
color azul tenue.

Tincin de Flagelos
Los flagelos son estructuras frgiles y
termosensibles que requieren de cuidadosas
manipulaciones para ser observados. El xito de
las tcnicas depende del mordente que debe ser de
reciente preparacin.
Los flagelos estn por debajo del poder de
resolucin del microscopio ptico por lo que
deben de cubrirse con un mordente que permita
engrosarlos. Los mtodos de tincin mas
utilizados son el de Gray y el de Leifson.

Observacin de flagelos
Algunos
apndices
como los flagelos se
pueden observar bajo
el microscopio ptico
despus de aplicar la
tincin de Leifson

Observacin de diversas bacterias flageladas

Tinciones fluorescentes

En microbiologa se han diseado diversos mtodos de tincin que

permiten cuantificar a los microorganismos en su habitat. A pesar de
que estos mtodos revelan poco sobre la fisiologa o la composicin
filogentica, son muy empleados y altamente confiables para obtener
informacin cuantitativa sobre el nmero total de clulas en una
muestra natural.
Se han utilizado ampliamente dos colorantes fluorescentes: el naranja
de acridina y el 4,6-diamido-2-fenil indol (DAPI). Estos colorantes se
unen a los cidos nucleicos. La observacin de las clulas se hace
utilizando un microscopio de epifluorescencia.
En la actualidad, estas tcnicas de tincin han tenido importantes
aplicaciones y se utilizan en la cuantificacin de microorganismos en
alimentos, muestras clnicas y del ambiente.

Tincin con Naranja de Acridina

Esta imagen corresponde a
una microfotografa de
fluorescencia
de
una
comunidad
microbiana
natural que se encuentra
colonizando las races de
una planta. La tincin se
hizo con naranja de
acridina.

Tincin con DAPI

Clulas de Escherichia
coli teidas con DAPI se
observan de color azul
brillante sobre un fondo
oscuro.
Esta tcnica se utiliza
frecuentemente para hacer
cuentas totales

Tinciones Vitales
Se han desarrollado diversos mtodos que permiten
diferenciar clulas vivas de clulas muertas utilizando
colorantes fluorescentes. Esto nos permite tener
informacin no solo del nmero de microorganismos
presentes en una muestra sino que tambin nos informa
sobre su viabilidad. La base de la diferenciacin est en la
membrana citoplsmica que debe mantenerse intacta. Se
utiliza una combinacin de dos colorantes el verde penetra
todas las clulas viables y no viables mientras que el
colorante rojo que contiene yoduro de propidium se
incorpora solo a las clulas muertas

Tinciones Vitales
En esta microfotografa se
observan clulas vivas (de
color verde) y clulas
muertas (de color rojo) de
Micrococcus luteus (coco)
y Bacillus cereus (bacilo)
teidas con la tcnica de
viabilidad que utiliza
LIVE/DEAD Bac Light
TM

Tinciones por hibridacin in

situ fluorescente (FISH)

Bibliografa

Black, J.G. 1999. Microbiology Principles and Explorations. 4a. Ed.

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Madigan M.T., J.M. Martinko y J.Parker. 1999. Brock Biologa de los
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McGraw Hill-Interamericana