Cultivos Celulares

Linfocitos humanos
Chamba Alexis, Hurtado Ma. Gabriela, Ramos Diana, Sauca William.
****Profesionales en Formacin, Ciencias de la Salud, Titulacin de Bioqumica y Farmacia, Universidad

Tcnica Particular de Loja, San Cayetano Alto s/n C.P. 11 01 608; Loja, Ecuador.

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Introduccin.
La mayora de las clulas in vivo se encuentran interaccionando con clulas
vecinas, una Membrana basal o una matriz extracelular. Estas clulas se
denominan dependientes de Anclaje y se cultivan adheridas a una superficie
(cultivo en mono capa). Sin embargo las clulas hematopoyticas y algunos
tipos de clulas tumorales se encuentran en
micro gravedad en los
organismos vivos. Estas clulas se denominan independientes de anclaje y se
pueden cultivar en suspensin en un lquido nutritivo. (Prof, P, Gil-Loyzaga.
2012)
Estos tipos de cultivos no necesitan disgregacin enzimtica, pero para poder
obtener poblaciones homogneas de clulas se tiene que recurrir a mtodos de
separacin o purificacin celular. Estos mtodos se pueden emplear antes,
durante o despus del cultivo. Algunos de ellos son mtodos fsicos o qumicos
y otros se denominan mtodos de muerte celular selectiva porque seleccionan
las condiciones de cultivo para la supervivencia selectiva de un tipo celular.
(Prof, P, Gil-Loyzaga. 2012)
OBJETIVO
Extraccin de los linfocitos de la sangre.
Fijar las clulas con metanol
Comparar la proliferacin celular mediante el ciclo celular de los
linfocitos por citometra de flujo.

Materiales y mtodos.
Del medio ya preparado se tempero a 32C el medio ya suplementado, se lo
coloc cerca del mechero para evitar posible contaminacin, se limpi el
medio y el rea de trabajo con alcohol al 70%, donde se ubicaron los
materiales necesarios para trabajar, los diferentes medios de desechos para
corto punzantes, derechos biolgicos etc.
Obtencin de linfocitos de la sangre
Se obtuvo 3 a 5mL sangre venosa heparinizada, posteriormente se dej caer
con suavidad la cantidad de sangre extrada sobre los 5mL de la superficie del

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percoll (medio que nos permiti separar los linfocitos).Se centrifug a 3.500
r.p.m. durante 45minutos a una temperatura de 4C.
Despus de los 45 minutos de centrifugacin se obtuvo las siguientes fases
Suero: color ocre suave
Banda de glbulos blancos: aspecto blanco y lechoso
Banda Percoll: transparente
Banda de glbulos rojos: sedimentados

Se recogi con una micropipeta la banda de glbulos blancos. Se re suspendi

el anillo blanco y lechoso (aquel donde se encontraban los linfocitos) en 5mL
de PBS y se centrifugo a 1.600 r.p.m. durante10 minutos a una temperatura de
4C. Se paso el pellet celular tanto de linfocitos en los micro tubos
respectivamente.
Fijacin: Linfocitos
Se coloc 1mL de la mezcla de metanol/PBS 1:1 en cada microtubo que
contena pellet linfocitario, donde se homogenizo en el vrtex y se centrifugo a
1.600 r.p.m. durante 10 minutos a una temperatura de 4C y se elimino el
sobrenadante.
Re suspendimos el pellet con 1mL de metanol al 70% fro en el vrtex para
disolver todos los grumos y lo guardamos en la refrigeradora por lo menos 12
horas antes de su lectura.
TERCERA PARTE: Preparacin de los linfocitos para su lectura en el
citmetro.
Parte NO estril Cuarto da:
Analizamos el ciclo celular
Cosecha: todo en fro
Retiramos de la refrigeradora y centrifugamos las clulas suspendidas en
metanol al 70%
a 1.600 rpm durante 10 minutos a una temperatura de 4C, posteriormente
desechamos el metanol.

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Resuspendimos el pellet en 1mL de PBS, donde esperamos 30 segundos y
centrifugamos durante
5 minutos.Resuspendimos el pellet celular en 200L de solucin de tincin IP
(0.1% (v/v) Triton
X-100, 10ug/ml IP y100 ug/ml DNase-free RNase A en PBS) .
Incubamos protegido de la luz a temperatura ambiente por 30 minutos.
Transferimos las muestras a tubos de citmetro y medimos las siguientes
condiciones:
Excitacin: 488 nm hasta 536 nm
Emisin: Long pass: 600 0 610 nm
Resultado:
En el conteo inicial para constatar si hubo proliferacin de linfocitos, antes de
la lectura en citometria de flujo contamos en la cmara de neubauer:

En el primer cuadrante obtuvimos 9 clulas, en el segundo 10, en el tercero 7 y

en el cuarto 6.
Para calcular el nmero de clulas aplicamos la siguientes formulas.

Fd= 50ul de azul de tripan+50ul de clulas

= 100ul/50 alicuota de clulas
Fd =2

cel 32
= 210000
ml 4

=800000cel/ml
El cultivo nos dio un total de 800000 celulas antes de leer en citometria de flujo
con un tiempo de incubacin menor de 24 horas a una temperatura de 37C y
CO2 al 5%.
En el conteo por citometro de flujo nos dio bajo crecimiento de linfocitos.

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Se evidencio que hubo poco crecimiento.

Discusin
Luego de haber seguido cuidadosamente los pasos para la extraccin de
linfocitos, tuvimos un resultado poco favorable en la lectura del clitmetro de
flujo en la cuantificacin de los linfocitos, aun habiendo tenido un pellet de
consideracin y un crecimiento inicial de clulas de suspensin de
800000cel/ml, que era el adecuado, porque para el cultivo de linfoctios se
debe tener un minimo de 500000celulas/ml GLORIA Y LUIS (2005), y obtuvimos
mas que el valor indicado y as solo se pudo observar un crecimiento pobre de
linfocitos en la citometria de flujo, que pudo haber sido porque no se le
adicion correctamente la fitohemaglutinina y colcemida para acelear la
divisin, o tambin puedo ser un factor muy importante el tiempo de
incubacin porque segn (GLORIA, et al 2005), para obtener un
crecimiento adecuado de linfocitos se debe incubar a 37C por lo
menos de 5 a 8 dias, y nuestro cultivo estuvo en incubacin por menos de 24
horas.

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De las tres graficas observadas, (el control sin proliferacin, la grfica con
proliferacin y la grfica sin proliferacin) podemos discutir lo siguiente: en los
histogramas del control sin proliferar se puede observar un scatterplot negro,
lo que representa nuestra poblacin de clulas existente, se puede observar
que se encuentra disminuida, es decir que la poblacin de clulas es escasa, el
scatterplot azul representa cualquier otro tipo de impurezas, ya sean restos
celulares, clulas daados que han cambiado su tamao y/o morfologa y no
son reconocidos por el citmetro de flujo como una clula normal y por ende
este no la ubica dentro del rango celular establecido en el histograma.
En la curva de crecimiento celular se observa crecimiento dentro de la fase
G0/G1, un claro descenso en la fase S, y ningn crecimiento en la fase G2, lo
que nos indica que simplemente existen linfocitos que estn empezando con la
sntesis de protenas y de RNA (Ramrez, G., et al. 2005). Esto puede deberse a
que no se ha estimulado de manera eficaz a las clulas para inducirlos a iniciar
el ciclo celular completo y simplemente estn en fase G1, esto debido
principalmente a que el tiempo de incubacin fue insuficiente.
Los histogramas de la segunda grfica, correspondiente a crecimiento celular
se puede observar que el scatterplot negro que representa a la poblacin
celular ha incrementado su tamao en comparacin a la del histograma de la
grfica control sin proliferacin, lo que nos lleva a pensar desde un principio
que nuestra poblacin se encuentra dentro de los parmetros establecidos.
Dentro de la curva de crecimiento se puede observar que en la fase de G1
existe varios picos en la poblacin, lo que nos indica que existieron pocos
eventos a contar, es decir muy pocas clulas a ser contadas por el citmetro
de flujo, por lo que se observa una curva dentada y no continua, luego
observamos un descenso en la fase S pero no se puede observar ningn
incremento en la fase G2, por lo que se puede concluir que existe no

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proliferacin celular. Esto se podra confirmar realizando un conteo manual de
clulas en metafase usando un microscopio ptico.
La tercera grafica correspondiente a una no proliferacin, observamos en los
histogramas que el scatterplot negro correspondiente a nuestras clulas a
analizar se encuentra normal, lo que nos indica que si existen clulas en fase
G1, pero tambin se observa una gran cantidad de ruido, inclusive se puede
interpretar que existe una contaminacin de la muestra ya que el scatterplot
azul es demasiado grande para ser solo restos celulares y clulas daadas.
En la curva de crecimiento celular, observamos que la curva de crecimiento en
fase G1 se encuentra sesgada a la izquierda, saliendo de los parmetros
normales, inclusive el descenso celular empieza en esta misma fase,
igualmente se encuentra muy dentada, tambin se observ que casi no existen
clulas dentro de las dems fases, S y G2. Al observar estos resultados
determinamos que las clulas no fueron estimuladas para entrar en divisin
por lo que solo quedaron en fase G1, no se observ la protuberancia clsica
que se da en la fase G2 cuando existe un crecimiento.
ACTIVIDADES
Anticoagulante utilizado
Funcin de la fitohematoglutinina
Medio utilizado
Fluorocromo utilizado

Heparina
Ayuda a la diferenciacin
clulas blsticas
Medio RPMI
Yoduro de propidio

de

1. Dibuje y explique cules son las partes del citmetro de flujo y la

funcin que cumple cada una de ellas.
Consta de cuatro componentes: sistema de fluidos, sistemas ptico, electrnico
e informtico.

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a) El sistema de fluidos Constituido por el lquido que contiene la

suspensin celular y un fluido mvil que rodea al lquido que contiene la
muestra. Las clulas son inyectadas a presin variable en el fluido mvil
o lquido envolvente. El lquido envolvente es impulsado continuamente
a salir por un orificio estrecho y se mantiene a presin constante.
Durante el trayecto, se consigue que las clulas permanezcan en el
centro del caudal del lquido envolvente alineadas y de una en una
(enfoque hidrodinmico).La presin con la que se introduce la muestra
en el fluido influye sobre la resolucin de la adquisicin de la muestra.
b) Sistema ptico La luz, al incidir sobre las clulas se dispersa en dos
direcciones: horizontal y verticalmente. Esta dispersin proporciona
informacin relativa sobre el tamao de las clulas y la granulosidad. La
luz incidente puede, adems, excitar una serie de
fluorocromos
presentes en las clulas. La presencia de fluorocromos proporciona
informacin adicional sobre las clulas. En principio, el citmetro puede
detectar cualquier propiedad celular o bioqumica que se acople a un
fluorocromo.
c) Emisin de luz (Fluorescencia) Los fluorocromos son sustancias que
absorben energa luminosa de una determinada longitud de onda. Esta
absorcin de luz provoca el ascenso de electrones a niveles energticos
superiores. Los electrones excitados regresan rpidamente a su estado
normal
emitiendo un fotn y desprendiendo energa radiante. La
energa consumida en la absorcin de luz es mayor que la liberada y, por

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lo tanto, la longitud de onda que se desprende es mayor que la que se
absorbe (salto de Stokes). E=ch/
d) El sistema informtico almacena la informacin y permite el anlisis de
los datos de manera interactiva con el operador.
2. Cules son las aplicaciones de la citometra de flujo?
Inmunofenotipo
Anlisis del ciclo celular
Genes reporteros
Medida de la proliferacin celular
Apoptosis
Flujo de calcio
Sealizacin intracelular: deteccin de fosfoprotenas a nivel unicelular
Ensayos Multiplexado de molculas en disolucin.
Otras aplicaciones:
Hematologa: tipificacin y conteo de clulas, reticulocitos y anlisis de
medula sea.
Farmacologa :estudios de cintica celular
Inmunologa :subpoblaciones de linfocitos ,tipaje tisular
Oncologa: Diagnostico y pronostico ,monitores de tratamientos
Microbiologa :diagnostico bacteriano y vrico ,estudios de sensibilidad a
los antibiticos
3. Dibuje el histograma de sus muestras y analice su ciclo celular.

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Se puede evidenciar en nuestro resultado que no hubo replicacin celular,
debido a que no hay un pico en la zona de replicacin del ADN(S), y por ende
no va a ver mitosis ni divisin celular. En el histograma no se puede observar la
curva del ciclo celular porque el nmero de clulas fue insuficiente para poder
determinar las distintas fases del ciclo en la curva.

4. Es posible observar el crecimiento celular en el microscopio

invertido, Si/NO, razone su respuesta.
El microscopio invertido es ptimo para los cultivos o muestras se pueden
colocar en diferentes recipientes con espesores y caractersticas pticas
variables, se utilizan entonces, placas de Terasaki, frascos Corning, frascos
Roux, cajas de Petri plsticas y de vidrio, lo cual permite observar organismos o
tejidos en cultivo sin una preparacin previa, se pueden adems observar
grandes cultivos o muestras bajo estados muy naturales, lo cual permite
disminuir las condiciones de estrs.

5. De acuerdo las grficas observadas en el citmetro, simule como se

veran en el citmetro de flujo los datos y luego con esos datos una
grfica de barras y descrbala ambas acerca de los siguientes cultivos
celulares:
a. Linfocitos estimulados con nicamente el medio de cultivo
b. Linfocitos estimulados con un compuesto que detienen el ciclo celular
en G0/G1
c. Linfocitos estimulados con un compuesto que detienen el ciclo celular
en G2/M
d. Linfocitos estimulados con un compuesto que detienen el ciclo celular
en S

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Bibliografa.
P, Gil-Loyzaga. (2012). Cultivo de Clulas Animales Y Humanas,
Aplicaciones en Medicina Regenerativa.
Victor J. (2005). Cultivos de clulas animales. Colombia.
Cabrera. CBM. Principios y Aplicaciones. 2008. [fecha de consulta: 22
Junio 2014].Disponible en:
http://www2.cbm.uam.es/mkfactory.esdomain/webs/cbmso/plt_Servicio_P
agina.aspx?IdServicio=5&IdObjeto=217

CRDOVA A, NAVAS F. "Fisiologa deportiva". Ed. Gymnos. Madrid,

2000.
Loken MR (1990). Immunofluorescence Techniques in Flow Cytometry and
Sorting (2nd edicin). Wiley. pp. 34153.
Goldstein,D.
Inverted
Microscopes.
Washington,
http://micscape.simplenet.com/mag/artjul98/invert.html

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USA.

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Perez., J. Fundamentos y aplicaciones de la citometra de flujo.

Recuperado
el
4
de
julio
del
2014,
de
https://www.uclm.es/irec/divulgacion/seminarios/JoseManuelPerezLastra.
pdf

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