Introducción

La tinción H&E proporciona una imagen completa de la microanatomía de órganos

y tejidos. La hematoxilina tiñe con precisión los componentes nucleares, incluidos
la heterocromatina y los nucléolos, mientras que la eosina tiñe los componentes
citoplasmáticos, como el colágeno y las fibras elásticas, las fibras musculares y
los glóbulos rojos. En una H&E de alta calidad, existen diferencias sutiles en los
tonos de color producidos por las tinciones, especialmente la eosina, y esto ayuda
a la detección e interpretación de los cambios morfológicos asociados con la
enfermedad.

Es importante que las personas que realizan y evalúan las tinciones H&E para
verificar la calidad sean conscientes de las sutilezas de la tinción, conozcan lo que
se puede lograr cuando la tinción se realiza correctamente con reactivos de alta
calidad y sepan qué buscar microscópicamente. El mantenimiento de tinciones
H&E uniformes y de alta calidad es un requisito fundamental en los laboratorios de
histopatología.

En las secciones siguientes se describen los pasos básicos para realizar una
tinción con H&E.

Retire la parafina
Tras la preparación de una sección de parafina, todos los elementos se infiltran y
rodean con cera de parafina, que es hidrófoba e impermeable a los reactivos
acuosos. La mayoría de los componentes celulares y tisulares no tienen color
natural y no son visibles. El primer paso para realizar una tinción H&E es disolver
toda la cera con xileno (un disolvente hidrocarbonado).

Hidratar la sección
Después de eliminar completamente la cera, se hace pasar la preparación por
varios cambios de alcohol para eliminar el xileno y luego se enjuaga a fondo con
agua. La sección ahora está hidratada para que los reactivos acuosos penetren
fácilmente en las células y los elementos tisulares.

Aplicar la tinción nuclear de hematoxilina

La preparación ahora se tiñe con una tinción nuclear como la hematoxilina de
Harris, que consiste en un colorante (hematoxilina oxidada o hemateína) y un
mordiente o agente aglutinante (una sal de aluminio) en solución. Inicialmente,
esto tiñe los núcleos y algunos otros elementos de color morado rojizo.
Complete la tinción nuclear mediante el “azulado”
Después de aclarar en agua del grifo, la sección se vuelve azul mediante el
tratamiento con una solución débilmente alcalina. Este paso tiñe la hematoxilina
de un color azul oscuro. Ahora se puede enjuagar y comprobar la sección para ver
si los núcleos están correctamente teñidos y muestran el contraste adecuado y
para evaluar el nivel de tinción de fondo.

Elimine el exceso de tinción de fondo (diferenciación)

En la mayoría de las ocasiones, cuando se emplea hematoxilina de Harris, se
requiere un paso de diferenciación (destinción) para eliminar la tinción de fondo no
específica y mejorar el contraste. Se utiliza un alcohol ácido débil. Después de este
tratamiento, se requiere de nuevo el proceso de azulado y enjuagar a fondo. Los
métodos de tinción que incluyen un paso de destinción o diferenciación se
denominan tinciones “regresivas”.

Aplicar la contratinción con eosina

La sección se tiñe ahora con una solución acuosa o alcohólica de eosina
(dependiendo de la preferencia personal). Esto tiñe muchos elementos no
nucleares en diferentes tonos de rosa.

Enjuague, deshidrate, aclare y monte la preparación (aplicación del cubreobjetos)

Tras la tinción con eosina, la preparación pasa por varios cambios de alcohol para
eliminar todos los restos de agua, y luego se aclara con varios baños de xileno, el
cual “limpia” el tejido y lo hace completamente transparente. Se aplica una fina
capa de medio de montaje de poliestireno, seguida de un cubreobjetos de vidrio. Si
la tinción y todos los pasos posteriores se han realizado correctamente, la
preparación revelará todos los componentes microscópicos importantes y
permanecerá estable durante muchos años.

TINCIÓN DE AZUL DE METILENO. 5.

Es una tinción simple donde todos los microorganismos toman el mismo color, tiene
afinidad por carga con componentes de la superficie de la célula, por ello sirve para
proporcionar información acerca del tamaño, forma y tipo de agrupación de los
microorganismos. Es un método directo, positivo y rápido.
OBJETIVO
El objetivo del método es proveer una estimación del porcentaje de células vivas
presentes en una muestra

● La coloración con azul de metileno tiñe a todas las bacterias por igual.
● Se utiliza el colorante para teñir las estructuras presentes en el citoplasma de
la bacteria.
● No es diferencial porque cuando se tiñen microorganismos con este colorante
tiñe a todos por igual, se comporta de la misma forma con una bacteria u
otra.
● Es una coloración simple y de gran utilidad para el género Corynebacterium.
PRINCIPIO
Las células vivas contienen enzimas capaces de reducir el azul de metileno a
compuestos incoloros.
Cuando las células están inmersas en azul de metileno, este penetra dentro de las
células y como resultado, las enzimas de las células vivas lo decoloran. En las
células muertas, donde la enzima es inactiva, esto no ocurre y, por consiguiente,
permanecen azul. El porcentaje de células no teñidas es entonces una mediada
de la viabilidad.
REACTIVOS
Azul de metileno, citrato de sodio dihidratado y agua destilada.
● Disolver el azul de metileno (0.01g) en agua destilada (10ml).
● Agregar citrato de sodio dihidratado (2g) y agitar hasta disolución.
● Filtrar con papel de filtro y llevar el volumen filtrado a 100ml con agua
destilada.
EQUIPOS
Microscopio, cubreobjetos y portaobjetos.
METODOLOGÍA (Introducción al procedimiento)
Antes de proceder a la tinción, si partimos de cortes de parafina, tenemos que
llevar a cabo unos tratamientos previos sobre las secciones como es e
desaparafinado y la hidratación, puesto que estos colorantes son hidrosolubles. Si
partimos de cortes de criostato esto no se lleva a cabo.
PROCEDIMIENTO:
● EXTENSIÓN: Mezclar la solución coloreada con igual volumen de una
suspensión de la muestra, después poner una gota de agua en el
portaobjetos y extender en ella la muestra utilizando el asa de siembra. “La
concentración de células debe ser de 40 – 60 células por campo del
microscopio, usando un aumento de 600x.”
● FIJACIÓN: Pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del
mechero con alcohol, sin permitir que llegue a hervir, hasta que este seque.
● AÑADIR: Azul de metileno y esperar 2 minutos.
● LAVAR: Se enjuaga con agua hasta eliminar impurezas y eliminar excesos.
● SECAR
● OBSERVAR: primero con el objetivo 40x, luego, se añade aceite de
inmersión y se observa con el objetivo 100x. Examinar aproximadamente
1000 células ignorando los brotes, excepto si su tamaño es mayor a un medio
de la pared de la célula madre.

Colorante de viabilidad DAPI

4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) es una tinción de ácido nucleico fluorescente
azul que se une al ADN bicatenario y parece asociarse con los grupos de AT en el
surco menor de la molécula de ADN. DAPI sufre un realce de fluorescencia de
aproximadamente 20 veces cuando se asocia con el ADN, con un máximo de
excitación de 358 nm y un máximo de emisión de 461 nm. Las propiedades
espectrales del DAPI hacen lo hacen muy adecuado para detectar viabilidad en un
citómetro de flujo equipado con un láser ultravioleta o violeta. El DAPI es un
colorante de ADN no permeable; las membranas plasmáticas competentes lo
excluyen en gran medida de las células vivas, pero puede entrar en una
membrana comprometida donde el colorante puede interactuar con el ADN en la
célula. En las condiciones recomendadas, las células muertas producen una señal
fluorescente brillante cuando se las excita con un láser violeta y se detectan en el
intervalo de longitud de onda de 425-475 nm. Se puede utilizar fácilmente con
colorantes excitados por otras líneas de láser. Las células apoptóticas, necróticas
y/o dañadas son una fuente de interferencia en el análisis de células viables
mediante citometría de flujo. Las células no viables pueden evaluarse y
discriminarse tras el etiquetado positivo del DAPI cuando las células viables
permanecen sin teñir (negativo).

Materiales y Reactivos[editar]
 DAPI ( 10 mg/ml en solución madre de H2O ; Invitrogen D1306 )

 Solución madre a 4°C, protegido de la luz . La sal de lactato de DAPI es más

soluble en H2O que en cloruro de sodio, pero DAPI no es muy soluble en PBS ,
por lo tanto , utilizar H2O para preparar la solución madre.

 El formaldehído (3,7%), de estar recién preparado

 Preparar PBS con adición de CaCl2 y MgCl2 (PBS +). Esta solución permite que
las células se adhieran entre sí y al sustrato. Si las células están en un medio que
no contiene Ca2+ o Mg++, pueden irse a la superficie y desprenderse del sustrato.

 Triton X-100 (0,2 %)

Equipo[editar]
 Placas para cultivo celular, estériles

 Microscopio de fluorescencia, equipado con una luz ultravioleta (UV) de conjunto

de filtros

 Por excitación con láser de microscopia confocal, utilizar un láser UV o, si es lo

suficientemente intensa, la línea UV de un láser de argón-ion.
Método[editar]
Las células que han sido inmunomarcadas pueden ser teñidas con DAPI comenzando en el
paso 7.
  Diluir la solución de DAPI 1:5000 en PBS+.

 Aspirar el medio de las células a partir de células cultivadas en cubreobjetos.

Lavar las células tres veces con PBS+. No permitir que las células se sequen en
cualquier momento durante el
protocolo.

 Fijar las células durante 10 minutos en formaldehído 3,7%.

 Aspirar el fijador. Lavar las células tres veces, 5 min cada una, en PBS +.

 Permeabilizar las células por inmersión en Triton X-100 0,2% durante 5 min.

 Aspirar el Triton. Lavar las células tres veces, 5 min cada una, en PBS +.

 Se incuban las células durante 1-5 min a temperatura ambiente en solución de

marcaje DAPI (del Paso 1).

 Aspirar la solución de marcaje. Lavar las células tres veces en PBS+.

 Monte los portaobjetos como se describe en Mounting Live Cells onto Microscope
Slides (Chazotte 2011).11 [2]

 La imagen de las células se observa a (λ excitación ~ 359 nm, λ emisión ~ 461 nm

cuando DAPI está unido a ADN).12

Tinción de Wright
La tinción de Wright es una técnica que se emplea generalmente para la diferenciación de
elementos celulares de la sangre y es clasifi cada como una tinción policromática, dado que
puede teñir compuestos ácidos o básicos presentes en una célula.20 Fue desarrollada por el
patólogo James Homer Wright en 1902 a partir de la modifi cación de la ya existente
tinción de Romanowsky, utilizada para diferenciar elementos formes de la sangre.21 Esta
tinción tiene diversos usos en microbiología; en la parasitología, se le emplea en la
búsqueda de hematozoarios como Plasmodium spp. El reactivo de Wright está compuesto
por eosina y azul de metileno, cuando éste se oxida se conoce como azur B a una
concentración de 0.8 g/L empleando como solvente alcohol metílico. La eosina es un
colorante ácido que tiene afi nidad por componentes alcalinos. Existen dos compuestos
conocidos como eosina y que están intrínsecamente relacionados: eosina Y, conocida
también como tetrabromofluoresceína –o, comúnmente, eosina amarilla–, y la eosina B,
conocida como dibromodinitrofluoresceína o eritrosina B azulada.20,21 Ambos
compuestos son intercambiables, sin que sean notables las diferencias entre ellos en el
resultado de la tinción, por lo que la preferencia de una sobre otra
no sigue un criterio objetivo. A pesar de ello, la eosina Y es la más utilizada en
procedimientos rutinarios. Es un compuesto ácido cuya propiedad está basada en su
polaridad negativa, lo que le permite enlazarse con constituyentes celulares de carga
positiva; por esta razón, colorea componentes citoplasmáticos y se les conoce como
acidófilos. La tonalidad resultante de la tinción con eosina es rosada-anaranjada para
citoplasmas, y rojo intenso en el caso de los eritrocitos.21,20 El típico color de los núcleos
celulares, mayoritariamente morado, se basa en la interacción molecular entre eosina y un
complejo azul de metileno-DNA. La intensidad de la coloración depende del contenido de
azur B y de la relación con la eosina amarilla. El resultado de la tinción puede ser infl uido
por diferentes factores, como el valor del pH de los colorantes y de la solución
amortiguadora, esto debido a que la tinción se funda
menta en la relación de las características ácido-base, y la variación de estos factores podría
cambiar las características tintoriales de la muestra a teñir al verse favorecida por
características más ácidas o básicas.21 Las muestras útiles para su uso son el frotis de
sangre periférica y frotis de médula ósea. Los diferentes colores que se observan en la
célula provocan el llamado efecto Romanowsky, que tiñe de púrpura a los núcleos y
gránulos neutrofílicos y de color rosa al citoplasma. Los ácidos nucleicos se tiñen de azul,
permitiendo así distinguir a los parásitos en el interior de los eritrocitos. Esta tinción es
utilizada en la búsqueda de Plasmodium spp. (en México, principalmente, Plasmodium
vivax), Leihsmania spp., (principalmente Leishmania mexicana), Trypanosoma cruzii, y en
la búsqueda intencionada de fi larias (Figura 3). En micología esta tinción es de gran ayuda
en la búsqueda de Histoplasma capsulatum (hongo dimórfi co) en extendidos de médula
ósea

Tinción de Gram Esta tinción es un procedimiento de gran utilidad empleado en los

laboratorios donde se manejan pruebas microbiológicas. Es defi nida como una tinción
diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifi ca a las bacterias en dos grandes grupos:
bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas.10 Fue desarrollada por el científi co
danés Hans Christian Gram en 1884; hoy en día, sigue siendo una de las tinciones más
utilizadas universalmente debido a lo económico, sencillo y efi caz que resulta.11 En
microbiología clínica resulta de gran utilidad, ya que a partir de muestras clínicas directas
provenientes de sitios estériles se puede saber de manera rápida las características de la
muestra y hacer una diferencia de los potenciales microorganismos causantes de una
infección.12 Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la
pared celular de las bacterias, la cual le confi ere propiedades determinantes a cada
microorganismo. La pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una
capa fi na de peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las bacterias
Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no
cuentan con membrana celular externa; así pues, la composición química y el contenido de
peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram negativas y Gram positivas explica
y determina las características tintoriales (Figura 1). 13-15 La tinción de Gram se basa en
colocar como colorante primario cristal violeta, el cual tiene afi nidad con el peptidoglicano
de la pared bacteriana. Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve como mordiente e
impide la salida del cristal violeta por la formación de un complejo cristal violetayodo que
satura los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana. En seguida, se coloca una
mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la
misma, también destruye la membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a
que ésta es soluble a la acción de solventes orgánicos, como la mezcla de alcoholacetona.
Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con
mayor fuerza este complejo, mientras que las Gram negativas no lo pueden retener por
tener menos cantidad de peptidoglicano. Por último, se coloca safranina, la cual funciona
como un colorante secundario o de contratinción y sirve para teñir las bacterias que no
pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo.16 Hay bacterias de un mismo género que
pueden observarse en la misma muestra como Gram positivas y como Gram negativas, a
este evento se le llama tinción Gram variable secundaria a alteración en nutrientes,
temperatura, pH o concentración de electrolitos.17 No todas las bacterias se pueden teñir
por esta técnica,
ya que carecen de pared celular (micoplasma) o su pared celular tiene una composición
química diferente (micobacterias, que cuentan con una gran cantidad de ácidos
micólicos).18,19 Las muestras útiles para su uso son líquidos estériles, biopsias para
cultivo, abscesos, hisopados, crecimiento de colonias aisladas en medios de cultivo. Las
bacterias Gram positivas se observan de color azul obscuro a morado, mientras que las
Gram negativas se observan de color rosa a rojo (Figura 2).