LABORATORIO ENSAYO COMETA Y MICRONUCLEO

Jos Mercado - Carlos lvarez - Carlos Prez - Yeison Tenorio

Universidad de Sucre, Facultad de Educacin y Ciencias, Programa de
Biologa, Qumica .Ambiental
Doc. Carlos Vergara
Resumen
Las investigaciones relacionadas con el tema de la genotoxicidad adquieren
cada da mayor importancia a nivel mundial, debido al creciente deterioro del
ambiente al que se encuentra expuesto el hombre moderno. Existen tres
razones fundamentales que justifican la preocupacin por la exposicin del
hombre a los agentes mutagnicos. Primero, el incremento en el grado de
mutacin de las clulas germinales (vulos, espermatozoides y sus
precursores) lo cual puede provocar un aumento de la incidencia de las
enfermedades genticas en futuras generaciones. Segundo, la existencia de
una estrecha relacin entre la inestabilidad genmica de clulas somticas con
el cncer y las enfermedades degenerativas crnicas. Tercero, el origen
ambiental del cncer. Ello orienta a la utilizacin de ensayos a corto plazo los
cuales, informan en poco tiempo acerca de la actividad mutagnica de dichas
sustancias y en algunos casos brindan informacin suficiente para establecer
los niveles de seguridad para el hombre. En estos ensayos de genotoxicidad
se emplea un gran nmero de sistemas biolgicos dentro de los cuales se
encuentran: virus, bacterias, hongos, cultivos de clulas eucariotas, plantas,
insectos y mamferos. Para lo cual nos trazamos como objetivo de este trabajo
ver la metodologa sobre el uso del ensayo cometa y el ensayo de
microncleos.(ARENCIBIA, Daniel.2003.)
Palabras clave: Genotoxicidad; ensayo de cometa; ensayo de microncleos.
Abstract
The research related with the genotoxicity topic acquire every day bigger
importance at world level, due to the growing deterioration of the environment
that is exposed the modern man. Three fundamental reasons exist that justify
the concern for the exhibition from the man to the mutagenics agents. First, the
increment in the degree of germinal cells mutation (ova, sperms and their
precursors) that which can cause the increase of the genetic illnesses incidence
in the future generations. Second, the narrow relationship existence among the
uncertainty of somatic cells genomic with cancer and chronic degenerative
illnesses. Third, the environmental origin of the cancer. It bears to the use of
short term assays and they inform in little time about the mutagenic activity of
this substances, in some cases they offer enough information to establish the
levels of security for the man. These genotoxicity assays used a great number
of biological systems inside which are: virus, bacterial, fungus, eukaryote cells
cultivations, plants, insects and mammals.
Key words: Genotoxicity, comet assay, micronuclei assays.

INTRODUCCION
La integridad de nuestro DNA es un
aspecto fundamental para la salud y
el buen funcionamiento de nuestro
organismo. Sin embargo, sabemos
que el material gentico es
susceptible a ser danado por
numerosos agentes y/o procesos;
asi, por ejemplo, la guanina es
especialmente susceptible a las
especies reactivas de oxigeno
producidas durante el metabolismo
normal de la celula (Moller y Loft,
2002).
En relacin al ejemplo anterior, se
ha estimado que en el cuerpo
humano
se producen diariamente alrededor
de 10.000 puntos de oxidacin en el
DNA
por clula, y se han encontrado ms
de 35 formas diferentes de bases
oxidadas en el DNA in vitro
(Halliwell, 2000).
Aunque la mayora del dao que se
produce
en
nuestro
material
gentico
es reparado eficientemente por una
compleja maquinaria enzimtica de
reparacin (Jackson y Loeb, 2001),
parte de l escapa a este proceso
(acumulndose con la edad)
constituyendo uno de los sustratos
para el potencial desarrollo de un
proceso carcinognico (Hollander et
al., 1995).
Estas lesiones no reparadas, o mal
reparadas, pueden afectar diversos
mecanismos tales como el control
del ciclo celular, la expresin gnica
y la comunicacin citoplasmamitocondria, entre otros (Halliwell,
1996; Singh, 1996; Wiseman y
Halliwell, 1996).
Si se acepta que el dao en el DNA
es perjudicial, la prevencin del
mismo o, en su defecto, el
incremento en la eficiencia de
reparacin,
cabe
considerarlos

como beneficiosos; as, surge la

necesidad
de
contar
con
herramientas sensibles y fiables que
nos permitan profundizar en los
aspectos
relacionados
con
ladeteccin de dao en el DNA, as
como
con
su
proteccin
y
reparacin.
En los ltimos treinta aos, se han
desarrollado con xito nuevas
metodologas capaces de evaluar el
dao en el DNA, metodologas que
han
sido
exhaustivamente
investigadas, disendose tcnicas
que permiten medir directamente
roturas de cadena simple (SSB) y
de doble cadena (DSB) en el DNA.
(Halliwell, 2000).
El ensayo cometa y micronucleo ha
tenido un gran impacto en
numerosas reas del conocimiento
cientfico,
especialmente
en
bioqumica, gentica y biologa
molecular. Actualmente el uso de
estos dos tipos de ensayo, tanto
para su optimizacin como para sus
aplicaciones, sigue desarrollndose
continuamente.
Ensayo del cometa
Es ampliamente reconocido que el
ensayo del cometa fue descrito
como
un nuevo mtodo para la deteccin
del dao en el DNA a mediados de
la
dcada de 1980, aunque la
deteccin de dao en el DNA en
clulas embebidas en agarosa ya
haba sido descrita con anterioridad
As, en 1976, Cook et al. publicaron
un artculo donde se investigaba la
estructura nuclear basndose en la
lisis de clulas usando detergentes
no inicos y una alta molaridad de
cloruro de sodio. Este tratamiento

eliminaba membranas, citoplasma y

nucleoplasma, y alteraba los
nucleosomas dejando casi todas las
histonas solubles en la alta
concentracin de sales contenidas
en la solucin de lisis. El resultado
de esta reaccin es una estructura a
la que denominaron nucleoide y
que consiste en una matriz (o
andamiaje) nuclear compuesto de
DNA, RNA y protenas. Esta matriz
posee
un
superenrrollamiento
negativo como consecuencia de las
torsiones de la doble hlice
alrededor de las histonas que
conforman los nucleosomas. La
permanencia
de
este
superenrrollamiento implica que la
libre rotacin del DNA no es posible;
as,
estos
investigadores
propusieron un modelo en el cual el
DNA est anclado a intervalos a la
matriz, organizado en una serie de
lazos. Cuando los nucleoides fueron
sometidos a la accin de un agente
intercalante (bromuro de etidio), se
relaj
el
superenrrollamiento
negativo y los lazos de DNA se
expandieron fuera del nucleoide,
visualizndose
mediante
la
formacin de un halo alrededor del
mismo.
Efectos similares fueron observados
cuando
se
utiliz
radiacin
ionizante.
As, en 1978, Rydberg y Johanson
describieron un mtodo para el
anlisis de clulas individuales
basado en la lisis alcalina de las
clulas previamente irradiadas.
Posteriormente, esta tcnica fue
adaptada a la metodologa de
citometra de flujo mediante la
encapsulacin de las clulas en
agarosa antes de la irradiacin,
seguido de una lisis alcalina
(Rydberg, 1984). El tratamiento de
las clulas con cloruro de sodio 2 M
mezclado con detergentes aninicos

produjo
los
ya
descritos
nucleoides.
Estas
estructuras
estaban compuestas por lazos de
DNA de entre 50 y 100 kb que
permanecan anclados a una red de
naturaleza
proteica (Cook et al., 1976), lo que
condujo al desarrollo del ensayo
del halo (Roti Roti y Wright, 1987),
estructura que se visualizaba
alrededor del nucleoide despus de
un tratamiento alcalino. En este
ensayo, las roturas en el DNA
producan el relajamiento del
superenrrollamiento de la molcula
de DNA, lo que permita la
expansin del halo anclado a una
matriz de protenas en cada una de
las clulas. Esto permite interpretar
que una sola rotura en un lazo de
DNA es suficiente para relajar el
superenrrollamiento
del
mismo
(Rydberg y Johanson, 1978).
En 1984, stling y Johanson
presentaron una idea nueva que
consisti en la utilizacin de
microgeles de electroforesis. As, las
clulas embebidas en agarosa
fueron lisadas para la formacin de
los halos descritos anteriormente y
sometidas luego a un campo
elctrico, lo que permiti la
migracin del material que haba
sido expulsado desde el nucleoide.
Esta migracin de las molculas de
DNA, cargadas negativamente,
desde dicho nucleoide hacia el
nodo permiti, tanto un evidente
incremento de la sensibilidad en la
deteccin del dao, como un
aumento en la resolucin de
subpoblaciones de clulas que
mostraban diferente magnitud de
dao (stling y Johanson, 1987).
El tipo de dao ms simple
detectado
con
este
ensayo
correspondi a roturas de cadena
doble (DSB), que resultaron en

fragmentos de DNA que pudieron

ser
fcilmente
revelados
sometindolos a la movilidad en una
electroforesis a pH neutro, como lo
realizaron stling y Johanson. Las
roturas de cadena simple (SSB) no
producen fragmentos de DNA a
menos que exista una separacin
(desnaturalizacin) de las hebras, lo
que se logra sometiendo el material
a condiciones alcalinas con un pH
superior a 12.
Los primeros describieron la versin
del ensayo en la que aumentaron
considerablemente el pH de la
electroforesis (pH >13), lo que les
permiti detectar SSB, sitios lcalilbiles (ALS) y SSB asociados a la
reparacin incompleta por escisin.
Debido a que la produccin de SSB
y/o ALS por parte de los agentes
genotxicos es varias veces mayor
en orden de magnitud, comparado
con la produccin de DSB, esta
versin del ensayo brind un
notable
incremento
de
la
sensibilidad para identificar agentes
genotxicos. Es en este trabajo
donde se denomina formalmente a
la tcnica como Electroforesis de
geles de clulas individualizadas
(SCGE del ingls Single Cell Gel
Electrophoresis), ms popularmente
llamada ensayo del cometa.
Esta tcnica alcalina es la que ha
sido adoptada por la mayora de
laboratorios frente a la versin
neutra de Olive (1989), que slo
detecta DSB. Una idea de la
aceptacin de la versin alcalina la
da el nmero de trabajos publicados
que la utilizan (1650), respecto a los
que utilizan la versin neutra (44),
tal y como se obtiene en la Web of
Science,
Octubre
2005
(http://wok.mimas.ac.uk/).

Este mtodo ha sido recomendado

como la versin ptima del ensayo
para la identificacin de agentes con
potencial actividad genotxica en el
International
Workshop
on
Genotoxicity
Test
Procedures
(IWGTP) (Tice et al., 2000).

En las siguiente siguientes

imgenes podemos observar
cometas obtenidos de linfocitos
aislados
Imagen a) se observa cometas que
podran estar clasificados en 0-1
b) se observa la forma tpica de un
cometa: cabeza y cola. Donde
podramos tener en el rango 3 y 4

en la siguiente imagene se observa

un Esquema de la formacin de la
cola del cometa

rendimiento de cada una de estas

etapas permite una deteccin muy
fiable del dao en el DNA.
Los dos objetivos principales de
una buena preparacin de las
capas de
agarosa son asegurar un soporte
estable para la manipulacin de
las clulas a evaluar durante todo
el proceso, y permitir una fcil y
buena visualizacin con un
mnimo
ruido
de
fondo.
Generalmente, se reparan las
capas de agarosa a modo de
sndwich, en cuya capa central se
encuentran las clulas.
METODOLOGA Y
CONSIDERACIONES
TCNICAS
Actualmente se estn aplicando
numerosas versiones del ensayo del
cometa con mayor o menor
frecuencia. Debido a que la versin
alcalina (pH>13) es superior en
cuanto al espectro de lesiones que
reconoce en el DNA y en su mayor
sensibilidad para la deteccin de
bajos niveles de
dao, en
comparacin a la neutra (pH = 9,5)
o a la medianamente alcalina (pH ~
12,3), se ha elegido como versin
estndar, tanto para la descripcin
en detalle de su proceso como para
la comparacin con otras versiones.
Despus de la obtencin de las
clulas de inters, los pasos bsicos
en el ensayo del cometa incluyen la
preparacin de los portaobjetos
precubiertos con las clulas a
evaluar embebidas en agarosa, la
lisis de membranas para liberar el
DNA, la desnaturalizacin del DNA,
la electroforesis, la neutralizacin de
la alcalinidad, la tincin y la
visualizacin. El
aumento del

Las clulas son suspendidas en

agarosa de bajo punto de fusin
(LMP), generalmente a 37 C, y
depositadas sobre una primera capa
de agarosa de punto de fusin
normal (NMP) que cubre el
portaobjetos. Se deposita una
tercera capa de agarosa sobre la
capa de clulas una vez la segunda
se haya solidificado.
La primera capa es utilizada para
asegurar una buena adherencia de
la capa celular y de la tercera capa
al portaobjetos.
Se utilizan soluciones de lisis neutra
y alcalina para la deteccin de DSB
y
SSB,
respectivamente.
La
seleccin del pH de la solucin
depender de los objetivos del
estudio. Como ya mencionamos, la
lisis alcalina es mucho ms
frecuentemente
utilizada,
en
comparacin con la lisis neutra, ya
que detecta una amplia gama de
daos que, adems, son los ms
comnmente producidos por los
agentes genotxicos, y consiste en
someter las clulas ya embebidas
en una solucin con una alta
concentracin
de
sales
y

detergentes a un pH entre 10 y >12,

durante al menos una hora.
No existe mucha diferencia entre las
soluciones de lisis utilizadas en los
distintos laboratorios en cuanto a su
composicin, sin embargo existen
tipos celulares que requieren de un
segundo detergente para lograr la
completa lisis de las membranas.
Esto debe ser evaluado caso a
caso.
Antes de la electroforesis, las
preparaciones
son
incubadas
durante un tiempo en la solucin de
electroforesis alcalina (pH > 13, baja
concentracin de sales y sin
detergentes), con lo que se
consigue la separacin de la doble
cadena de DNA y, con esto, la
produccin de SSB y la expresin
de ALS como SSB y SSB
transitorias relativas al proceso de
reparacin.
La electroforesis de las clulas para
producir los cometas ha mostrado
ser uno de los parmetros ms
complejos de validar, por lo que en
la literatura es el paso descrito con
ms variaciones. Las propiedades
de la electroforesis son muy
analizadas a la hora de estudiar la
naturaleza de la formacin de los
cometas.
La eleccin del voltaje y del tiempo
de
electroforesis
debe
estarrelacionada con los niveles de
dao en el DNA expresados y con la
concentracin de sales del tampn.
La electroforesis en el ensayo del
cometa es diferente de una
electroforesis convencional, ya que
el DNA necesita migrar slo una
fraccin de milmetros para obtener
una significativa movilizacin del
DNA y, por ende, la formacin de
cometas. Esto se puede conseguir

con
un
breve
tiempo
de
electroforesis (5 - 30 minutos) y con
voltajes bajos (0,5 5 V/cm). (Singh
et al., 1994).
La
duracin,
tanto
de
la
desnaturalizacin alcalina como de
la electroforesis, pueden variar
dependiendo tanto del tipo de clula
que se quiera analizar como del tipo
de dao que ser quiera detectar.
Siempre es importante considerar
variaciones en esta etapa del
ensayo; as, se pueden obtener
largos cometas sometiendo las
preparaciones a altos voltajes y a
largos periodos de tiempo durante la
electroforesis.
Las
condiciones
ptimas
de
voltaje/amperaje y de duracin de la
electroforesis
generalmente
dependen
de
la
migracin
visualizada en los controles, y el
rango de migracin que est siendo
evaluado en las clulas tratadas.
El tampn durante la electroforesis
contina con el mismo pH (>13)
utilizado
durante
la
desnaturalizacin y, con respecto a
la temperatura, se han llevado a
cabo electroforesis en un rango
entre 5 C a temperatura ambiente,
resultando que 15 C parece ser la
temperatura
de
mxima
discriminacin.
Despus de la electroforesis, se
neutraliza la alcalinidad de las
preparaciones mediante lavados en
un tampn a pH 7,5. Comnmente
esta solucin est compuesta de
Tris y se contina utilizando, pero
una alternativa ms econmica es
utilizar PBS 1x disuelto en agua
bidestilada, conservando el mismo
pH neutro. Tpicamente se realizan
tres lavados de 5 minutos; sin
embargo, cuando se aprecia un alto
ruido
de
fondo
durante
la

visualizacin, realizar un mayor

nmero de lavados y/o incrementar
el tiempo de los mismos puede
resultar de mucha utilidad en esta y
otras situaciones.
Durante la neutralizacin, las hebras
de DNA separadas anteriormente y
ubicadas en la cabeza del cometa,
se renaturalizan debido a que la
estructura (superenrrollamiento) de
los lazos est intacta, mientras que
el DNA contenido en la cola del
cometa permanece como DNA
monocatenario.
Esto se ha confirmado mediante
tincin con naranja de acridina (AO),
donde la fluorescencia producida en
los sitios de doble cadena es de
color verde y roja en los sitios donde
el
DNA
se
encuentra
desnaturalizado As, los cometas
teidos con AO muestran cabezas
verdes y colas rojas (Collins et al.,
1997a).
Despus de la neutralizacin, las
preparaciones pueden ser teidas y
los
cometas
pueden
ser
visualizados. Alternativamente, los
geles pueden ser deshidratados
sumergindolos dos veces en etanol
absoluto por 5 minutos cada vez y,
as, las preparaciones pueden ser
almacenadas y evaluadas cuando
se estime conveniente (Singh et al.,
1995).
El ltimo paso del ensayo alude a la
tincin
especfica
del
DNA.
Variables
tales como el fluorocromo para la
visualizacin y/o la metodologa
utilizada para la recoleccin de
datos dependen principalmente de
las necesidades especficas del
investigador,
lo
que
presumiblemente
tendr
un

pequeo efecto en la sensibilidad y

en el poder de resolucin.
Hoy
en
da,
existen
aproximadamente tantos mtodos
para la cuantificacin del dao como
investigadores dedicados a esta
tcnica.
Se
han
realizado
numerosos intentos para evaluar y
cuantificar
los
patrones
de
formacin de los cometas de una
manera ms fiable y exacta. Se
dispone de una gran variedad de
sistemas de anlisis de imgenes
de clulas individuales, siendo una
de las aproximaciones ms flexibles
para la coleccin de datos; sin
embargo, los mtodos que no
disponen de un sistema sofisticado
de anlisis, son igualmente tiles.
Ensayo De Microncleos
Durante la divisin celular el
material gentico (ADN) contenido
en el ncleo celular se replica y
divide equitativamente dando lugar
a dos clulas hijas idnticas; este
proceso puede producirse de
manera errnea debido a errores
durante la replicacin y posterior
divisin del ADN, a roturas
cromosmicas y al efecto de la
radiacin
y
de
sustancias
genotxicas, producindose prdida
cromosmica y haciendo que el
reparto del material gentico no sea
equitativo. Cuando esto ocurre, el
material gentico que se desprende
y que, por tanto, queda excluido y
no se incorpora correctamente al
ncleo de la clula hija, origina un
nuevo ncleo de menor tamao que
el
primario
denominado
microncleo
(MN),
visible
fcilmente al microscopio ptico7. El
material
gentico
desprendido
puede derivar de cromosomas
enteros o, ms frecuentemente, de

fragmentos
cromosmicos
acntricos que quedan excluidos de
los ncleos de las nuevas clulas
durante anafase mittica.
El uso de la tcnica del recuento de
MN como medida de dao
cromosmico sobre cultivos de
linfocitos humanos fue propuesta
por primera vez por Countryman y
Heddle en 1976, cuyo nico
requisito era la eleccin de tipos
celulares
con
gran
actividad
8
mittica . Ms tarde, en 1985, el
ensayo de genotoxicidad fue
mejorado por Fenech y Morley,
consiguiendo frenar el proceso de
divisin celular cuando la clula slo
hubiese
sufrido
una
divisin
mittica, para ello desarrollaron la
tcnica del bloqueo de la citocinesis
(CBMN: cytokinesis-block
micronucleus) cuyo fundamento es
la utilizacin de un agente qumico
denominado citocalasina-B cuya
funcin es impedir la citocinesis
celular.

Metodologa del
microncleos

ensayo

de

El protocolo bsico para el recuento

de MN en sangre perifrica consiste
en el aislamiento de los linfocitos
mediante una centrifugacin en

gradiente. Se realiza el recuento

celular
y
siembra
de
0,5x106 clulas/mL, que crecen en
suspensin en medio de cultivo
RPMI 1.640 suplementado con
suero
fetal
bovino,
penicilina/estreptomicina
y
con
fitohemaglutinina y se incuban
durante 44 horas en estufa a 37C y
5%
CO2 para
favorecer
la
proliferacin celular.
La muestra de inicio tambin puede
ser sangre total, clulas exfoliadas
de la mucosa oral o cualquier otro
tipo celular con actividad mittica
con algunas variaciones en el
protocolo. Posteriormente y tras 44
horas, el cultivo celular se somete a
la accin de la citocalasina-B. Una
vez bloqueada la mitosis y unas 72
horas tras la siembra (28 horas tras
el bloqueo) se lleva a cabo el
cosechado celular que consiste en
someter a las clulas a un choque
hipotnico favoreciendo que se
hinchen los citoplasmas por un
proceso
osmtico
donde
la
concentracin de iones del medio es
menor que la que la del interior de la
clula. Se fijan las clulas con una
solucin fresca de metanol: cido
actico glacial (6:1 24:1), se tien
las preparaciones con Giemsa
durante 5 a 10 min y se visualizan al
microscopio ptico. El recuento de
MN se debe realizar sobre 1.000
clulas binucleadas por cultivo e
individuo.

membrana
citoplasmtica
con
ncleos
intactos
en
etapas
tempranas de necrosis; en cambio
las clulas en estados avanzados
del proceso necrtico muestran
prdida del citoplasma y dao
irregular en la membrana nuclear
con slo una parte de la estructura
nuclear intacta. Las condiciones
ptimas en un ensayo de MN
requieren un porcentaje de clulas
binucleadas entre 35-60% sobre
500 clulas viables10.
Aunque en teora los linfocitos en
cultivo se dividan de forma
sincronizada, en la prctica no
ocurre de forma idntica en todas
las clulas del cultivo, de manera
que se pueden encontrar en un
mismo cultivo celular clulas mono,
bi y multinucleadas, clulas en vas
de apoptosis y necrosis
Por ello es necesario conocer
tambin las caractersticas de
clulas en vas de apoptosis y
necrosis para que sean eliminadas
del recuento, ya que slo deben
incluirse las clulas viables. Las
clulas en vas de apoptosis se
caracterizan
por
presentar
cromatina condensada, que en
etapas tempranas de apoptosis
puede manifestarse como cromatina
marginal y que ms tarde, conforme
avanza el proceso apopttico,
culmina en la fragmentacin del
material nuclear, quedando ste
disperso en el citoplasma y
reflejndose en una tincin ms
oscura con respecto a la habitual.
En
el
caso
de
fenmenos
necrticos, las clulas que los
sufren
muestran
citoplasmas
plidos, presencia de vacuolas que
se localizan principalmente en el
citoplasma, dao evidente en la

Factores de variabilidad
Existen diversos factores que
pueden influir en la frecuencia basal
de MN; la edad ha sido
ampliamente
estudiada,
relacionndose mayor edad con
mayor ndice de MN11,13,14. En el
caso del anlisis del gnero, las
mujeres presentan una frecuencia
basal superior a la de los hombres y
el nmero de MN incrementa
cuando se superan los 35 aos de
edad. La presencia de homocistena
en plasma, el dficit de folato y
vitamina B12 conducen a un
incremento de la frecuencia basal
de MN
En el caso de las mujeres, la
entrada en la menopausia y el
posible desarrollo de osteoporosis
se relacionan con un mayor ndice
de MN16. Otros estudios relacionan
un descenso del nmero de MN al
suplementar la dieta con agentes
antioxidantes como la vitamina E,
vitamina C, -caroteno, ginseng e
incluso infusiones de t17-19.
CONCLUSIONES

El ensayo de MN es una
alternativa
al
test
de

aberraciones cromosmicas
convencional, en el que se
analizan las alteraciones
presentes
en
metafases
mitticas y permite detectar
aberraciones cromosmicas
que responden a alteraciones
de tipo estructural (efecto
clastognico) o alteraciones
numricas
(efecto
aneugnico) del agente en
estudio.
Adems, con el ensayo de MN se
consigue:
Reducir la dificultad a la hora
de realizar el recuento.
Mejorar la sensibilidad del
ensayo, ya que los MN slo
se cuentan en clulas que
han completado una divisin
nuclear.
Incrementar la potencia
estadstica de los estudios al
analizar miles de clulas en
lugar de cientos de ellas.
Reducir el coste del ensayo.
El ensayo de MN es, por tanto,
un ensayo prctico,
universalmente validado y
accesible tecnolgicamente, til
para evaluar la inestabilidad
gentica inducida por agentes
genotxicos.

BIBLIOGRAFA

Lodish
H.,
Berk
A.,
Matsudaira P., Kaiser C. A.,
Krieger M., Scott M. P.,
Zipursky S. L., Darnell J.
Molecular Biology of the
Cell, WH Freeman, New
York, 2004.
Ziga
Venegas,
L.A.
Optimizaciones
metodolgicas del ensayo del
cometa y su aplicacin en
biomonitorizacin humana.
Tesis Doctoral en Gentica,
Universidad Autnoma de
BarcelonaBarcelona,
Espaa, 2009.
M. Madigan. J. Martinko. J.
Parker, Brock, Biologa de
los
microorganismos,
Pearson, Espaa, 2003.
Albert, L. 2004. Toxicologa
Ambiental.
Universidad
Autnoma de Ciudad Jurez.
Ciudad Jurez, Chihuahua,
Mxico
Jimnez, A. M. (2004).
Estudio de la capacidad
apopttica del cuachalalate
(Amphipterygium dstringens)
evaluada con el ensayo
cometa
(Electroforesis
unicelular en gel). FESCuautitlnUniversidad
Nacional
Autnoma
de
Mxico. Tesis para obtener el
ttulo de licenciatura en
Qumico
Farmacutico
Bilogo.
Martnez, E., y Flores, G.
(2003). Estudio de la accin
anticlastognica
del
cuachalalate
(Amphipterygium
adstringens.)
sobre
la
induccin de microncleos

producidos por ifosfamida.

FES-Cuautitln-Universidad
Nacional
Autnoma
de
Mxico. Tesis para obtener el
ttulo de licenciatura en
Qumico
Farmacutico
Bilogo