Trabajo en condiciones de

esterilidad

Cando se ha de utilizar la tcnica de esterilidad?

Siempre que se trabaja con organismos vivos o con cualquier medio,
tampn o contenedor que se usa para organismos vivos.
Preparacin de cultivos bacterianos para transformacin
Preparacin de placas para cultivos de levaduras
Filtracin de suero para medios de cultivo
Apertura de un tubo que contiene bacterias liofilizadas

Cando es conveniente utilizar la tcnica de esterilidad?

Siempre que no queremos que los contenidos de un rea entren en
otro.
Preparacin de digestiones con enzimas de restriccin
Preparacin de reacciones de PCR
Marcaje de clulas con 32P

Fuentes de contaminacin
Aire
Superficie de trabajo
Agua

100 bacterias/mL
Protozoos

Manipulador

Cuero cabelludo
Secrecin nasal
Estornudo
Saliva
Manos
Sentado
Sentado movindose
Sentarse

1.5 x 106/cm2
106-107/mL
107/mL
106-108/mL
2x103/cm2
100.000
1.000.000
2.500.000

Cintica de destruccin: condiciones que

la afectan

Concentracin del agente

Tiempo de exposicin
pH del medio
Temperatura
Presencia de materiales
extraos
Resistencia propia del
microorganismo
Nmero inicial de la
poblacin

Tcnicas de esterilizacin
Agentes fsicos
* Calor seco
* Calor hmedo
* Filtracin
* Radiaciones

Agentes qumicos

Esterilizacin por calor seco

Provoca
desnaturalizacin de
protenas y oxidacin
Mediante flambeado,
incineracin o, ms
habitualmente en el
laboratorio, horno
Pasteur o Poupinell

Condiciones de esterilizacin por

calor seco
160C
170C
180C

180 minutos
90 (metlico) 120 minutos
30 minutos

Esterilizacin por calor hmedo

Determina la
desnaturalizacin del
DNA, la generacin de
cortes de cadena
sencilla en el mismo, la
alteracin de la
integridad funcional de
la membrana y la
activacin de
ribonucleasas que
destruyen rRNAs.

Esterilizacin por calor hmedo

Pasteurizacin:
< 100C
(65 30 o 72 15)
Tindalizacin y
ebullicin
100C
Autoclavado
>120C
(121 20)

Condiciones de esterilizacin por

calor hmedo
TEMPERATURA (C)

TIEMPO DE
EXPOSICION
MINIMO (minutos)

121

20

126

10

134

El papel de la presin en la
esterilizacin por calor hmedo
Presin relativa por
encima de la
atmosfrica (bar)

Temperatura de
vaporizacin del
agua

99,63

0.5

111,7

1 *

120,23 *

2 **

133,54 **

143,62

151,84

Comparacin entre las condiciones

de esterilizacin por calor seco y
hmedo
Calor seco

Calor hmedo

150-160C
>3h

121C
15-30 min

160-170C
2-3h

132C
3-5 min

170-180C
1-2h

140C
1-2 min

Modificaciones qumicas en los medios

de cultivo durante el autoclavado

destruccin de algunos aminocidos

caramelizacin de azcares
hidrlisis de la sacarosa
variacin del pH
precipitacin de sales de Mg, K, amonio, fosfato
desnaturalizacin de protenas
inactivacin de vitaminas

Comparacin entre las condiciones

de esterilizacin por calor seco y
hmedo

Esterilizacin por mtodos

mecanicos: filtracin

Filtros de steres de celulosa de 0.22 m de poro

Esterilizacin por radiaciones

Ionizantes
Uso rutinario en
laboratorios para material
desechable
Ultravioleta
Daos en el DNA que
afectan su capacidad de
replicacin
Se aplican mediante
lmparas de mercurio

Esterilizacin, desinfeccin y
asepsia mediante productos qumicos

Esterilizacin
Proceso mediante el cual se alcanza la muerte de
todas las formas de vida microbianas, incluyendo
bacterias y sus formas esporuladas altamente
resistentes, hongos y sus esporas y virus.
Se entiende por muerte la prdida irreversible de
la capacidad reproductiva del microorganismo.

Desinfeccin
Proceso mediante el cual se eliminan los agentes
patgenos reconocidos, pero no necesariamente
todas las formas de vida microbianas. Solamente
se aplica a objetos inanimados.

Antisepsia
Proceso que, por su baja toxicidad, se utiliza para
la destruccin de microorganismos presentes sobre
la superficie cutneo-mucosa. Como la
desinfeccin, tampoco implica la destruccin de
todas las formas de vida.

Desinfectantes y antispticos
De alto nivel:
Actan incluso sobre esporas bacterianas y por tanto con un
tiempo adecuado de exposicin permiten una esterilizacin
qumica
Modifican (p.e. alquilacin) de forma irreversible grupos de
protenas y cidos nucleicos, inhibiendo actividades enzimticas
Son desinfectantes estrictos y no pueden utilizarse como
antispticos
xido de etileno (gas)
Formaldehdo 8% en alcohol 70%, al 37% p en forma de gas
Glutaraldehdo al 2%
Perxido de hidrgeno en soluciones al 10%

Desinfectantes y antispticos
De mediano nivel:
No actan sobre esporas pero s sobre M. tuberculosis, hongos
y virus no lipdicos
La mayora se pueden utilizar como desinfectantes y
antispticos
Oxidantes que actan a nivel de protenas y cidos nucleicos:
Compuestos clorados: hipoclorito de sodio
Compuestos yodados: betadine
Compuestos que lesionan la membrana plasmtica
Compuestos fenlicos
Alcoholes: etanol al 70%
Jabones
Clorohexidina

Desinfectantes y antispticos
De bajo nivel:
No actan sobre esporas ni sobre Micobacterium,
hongos o virus no lipdicos
Se utilizan slo para limpieza domstica. Estn en
desuso en hospitales y laboratorios
Compuestos de amonio cuaternario: agentes
catinicos que actan a nivel de membrana: cloruro
de benzalconio
Compuestos mercuriales: bacteriostticos
(bactericidas slo a concentraciones muy elevadas):
mercuriocromo

Qu normas se han de seguir para

trabajar con material estril?
1. El rea de trabajo ha de estar alejado de corrientes y trfico
2. El rea de trabajo se ha de limpiar antes de utilizarla y al
acabar con un antisptico (etanol 70%). Se debe mantener
limpio y sin elementos innecesarios.
3. Todas las pipetas y botellas han de ser estriles
4. Se ha de organizar el rea de trabajo para minimizar los
movimientos
5. Todo lo que se necesite debe tenerse preparado previamente
para no tener que abandonar el rea de trabajo
6. Resulta conveniente llevar guantes y cambiarlos a menudo

Qu normas se han de seguir para

trabajar con material estril?
7. Para transferir lquidos es conveniente utilizar pipetas
8. Las botellas se deben abrir formando un ngulo aproximado de
45 y deben taparse lo antes posible evitando dejar el tapn
9. Botellas y pipetas de vidrio se han de flamear
10. Se ha de pipetear de forma suave y se deben evitar
remolinos con los lquidos de las botellas
11. Para esterilizar por filtracin se ha de mantener el filtro
cerrado por la parte inferior hasta que est situada la jeringuilla
en la parte superior y est listo el recipiente estril de recogida
12. Se tirar cualquier pipeta que haya tocado una botella o
superficie y no se reutilizarn pipetas.

Qu normas se han de seguir para

trabajar con material estril?

Cabinas de seguridad de flujo

laminar

Horizontal

Vertical

Estn diseadas para proporcionar

proteccin personal,ambiental y del producto
(esterilizacin) cuando se realizan prcticas
y procedimientos adecuados.

Cabinas de seguridad de flujo

laminar

Cabina de seguridad de clase I

Cabina ventilada para
proteccin personal con
entrada de aire desde el
operador. El aire
descargado al exterior
atraviesa un filtro de
partculas de elevada
eficacia para proteger el
ambiente de las
descargas de agentes
patgenos. Es adecuada
para trabajar con
agentes de riesgo
moderado, cuando se
necesita contencin pero
NO para la proteccin de
productos
(esterilizacin).

Cabina de seguridad de clase II

Cabina ventilada para la
proteccin del personal,
el producto y el
ambiente. Dispone de
filtros de partculas de
elevada eficacia a la
entrada y salida. Se
utilizan con agentes que
producen riesgos desde
bajos a moderados,
cantidades muy pequeas
de sustancias qumicas
txicas y cantidades
traza de sustancias
radiactivas.

Cabina de seguridad de clase III

Cabina de seguridad de clase III

Cabina totalmente
cerrada, a prueba de
fugas de gas, y
mantenida a una presin
inferior a la atmosfrica
(1cm de columna de
agua). Posee un filtro de
partculas de elevada
eficacia a la entrada de
gases y dos, en serie, a
la salida. El acceso a su
interior se realiza
mediante el uso de
guantes de caucho
sujetos a la cabina.

Seleccin del tipo de cabina de

seguridad biolgica

Seleccin del tipo de cabina de

seguridad biolgica
Clase I
Agentes biolgicos de los grupos :
GRUPO 1: Agentes biolgicos que tienen escassimas probabilidades de
causar enfermedades en el ser humano. No producen infecciones y
tienen pocas probabilidades de propagarse en la colectividad.
GRUPO 2: Agentes biolgicos que pueden ser causa de enfermedades
humanas y que podran constituir un peligro para los trabajadores. Rara
vez producen infecciones. Es poco probable que se propaguen en la
colectividad y se suele disponer de profilaxis o tratamientos efectivos.
Otros compuestos:
Pueden ser usadas para aquellas operaciones que impliquen la
manipulacin de compuestos qumicos txicos y/o cancergenos
modificando el sistema de tratamiento del aire expulsado. Siempre
teniendo en cuenta que muchas de las operaciones con estos compuestos
precisan ser realizadas en un ambiente estril y que este tipo de
cabinas no lo proporcionan puesto que el aire es tomado del ambiente de
trabajo y no recibe ningn tratamiento.

Seleccin del tipo de cabina de

seguridad biolgica
Clase II
Agentes biolgicos pertenecientes a los grupos 1 y
2; algunos autores incluyen los agentes pertenecientes al grupo :
GRUPO 3: Agentes biolgicos que pueden ser causa de enfermedades
humanas graves y que representan un serio peligro para los trabajadores.
Puede existir el riesgo de que se propaguen en la colectividad, pero se
suele disponer de profilaxis y tratamientos efectivos.
Otros compuestos
Pueden ser utilizadas para la manipulacin de compuestos qumicos de alta
toxicidad siempre y cuando se modifique el sistema de tratamiento del aire
expulsado
Diversos autores desaconsejan su uso en operaciones con compuestos
inflamables y/o explosivos si el porcentaje de aire recirculado es elevado
(70%).

Seleccin del tipo de cabina de

seguridad biolgica
Clase III
Agentes biolgicos pertenecientes a los grupos 3 y 4:
GRUPO 4: Agentes biolgicos que son causa de enfermedades humanas
graves y que constituyen un serio peligro para los trabajadores. Puede
existir el riesgo de que se propague en la colectividad y no se suele
disponer de profilaxis o tratamientos efectivos.
Otros compuestos
Este tipo de cabinas puede ser utilizado para la manipulacin de
compuestos qumicos txicos y/o cancergenos, siempre y cuando se
modifique el sistema de tratamiento del aire expulsado.

Uso de las campanas de flujo laminar

1. Se ha de verificar que la campana est encendida y que el

aire est circulando
2. Se ha de evitar bloquear el flujo de aire colocando material
3. Antes de su uso se ha de limpiar con etanol 70%
4. Es conveniente minimizar los movimientos dentro y fuera de
la campana

Uso de las campanas de flujo laminar

5. No se debe utilizar la llama
6. Si tienen dispositivos de luz UV, se ha de comprobar que
estn apagados antes de empezar a trabajar
7. Al acabar de trabajar se ha de sacar todo el material
utilizado y se ha de limpiar la campana
8. Es fundamental el mantenimiento con cambios regulares de
filtrol y prefiltros as como descontaminaciones con
formaldehdo

Uso de las campanas de flujo laminar

Materiales

Calor
hmedo

Calor
seco

EtO

Flash

No

Material plstico

R - 1
8

No

0 3

Material de goma

0 3

Instrumental de acero
inox.

0 2

0 4

0
7

Instrumental cromado y
niquelado

0 5

Material de vidrio

0 6

0
7

Talco

Vaselina / aceites

Instrumental ptico

R 8

0 8

Prtesis / marcapasos /
implantes

R 8

0 8

Contenidos acuosos

Cepillos para ciruga

0 9

Material textil
(gasas, ropa, vendas etc.)

Clasificado y
seleccin del
mtodo de
esterilizacin

R = recomendado 1: solo si resiste la temperatura del calor hmedo

2: solo cuando no se dispone de autoclave a vapor
3: solo se deteriora con la accin del calor hmedo
4: solo para instrumental muy delicado de microciruga
5: solo cuando no se dispone de estufas
6: solo cuando este tipo de materiales pertenece a un conjunto que debe esterilizarse con EtO
7: solo en casos de urgencia y bajo normas
8: solo cuando lo recomienda el fabricante
9: solo cuando contienen plstico o son de este material

Material

Clasificado
y
seleccin
del
mtodo
de
esterilizacin

Condiciones

Ropa

No comprimida. En los equipos de ropa se colocar arriba lo que

se usa primero. Armar con doblado quirrgico, no sobrecargar.
Tamao mximo 30 x 30 x 50 peso mximo 5 Kg

Tubuladuras: de plstico
termosensible

Tamaos mayores a 45 cm: disponer en forma de espiral

Tubuladuras de goma

Tamaos mayores a 45 cm: disponer en forma de espiral, pero

humedecer previamente su lumen con agua destilada
recientemente esterilizada (no humedecer para xido de etileno)

Jeringas de vidrio

Separados camisa y mbolo (para calor hmedo y EtO)

Optativo: ensamblada, si se esteriliza con calor seco, pero
cuidar los tiempos de calentamiento del material

Talco

En pequeos sobres de 1 2 gramos, en capa fina

Vaselina

En potes de vidrio con tapa hermtica, cantidad mxima: 30 grs

Aceites

En frascos de vidrio neutro con tapa hermtica, cantidad

mxima 30 grs

Tubo de ensayo

Cuando se esteriliza con calor hmedo: con tapn de gasa y

capuchn de papel u otro tapn que permita la penetracin del
vapor. Si se utiliza algodn recubrir con gasa
Cuando se usa calor seco: con una tapa hermtica y resistente
al calor

Gasas

Para ciruga: el plegado debe realizarse manteniendo los bordes

hacia adentro, sin dejar hilachas ni pelusas. Disear las medidas
necesarias. Confeccionarlas con gasa hidrfila segn F. A. 6ta.
Edicin

Apsitos

Confeccionarlos con gasa y algodn hidrfilos, segn F. A. 6ta.

Edicin. Sin dejar pelusas ni hilachas

Contenidos acuosos

Cargar slo el 70% de la capacidad del envase. Con tapa

hermtica y capuchn de papel

Caja con instrumental

1. POR CALOR SECO: no sobrecargar. Ordenar internamente

por tiempos quirrgicos. El tamao de la caja no debe exceder
10 x 10 x 30, y el peso no mayor a 8 Kg.
Cuidar los tiempos de precalentamiento
2. POR CALOR HUMEDO: pinzas e instrumental abiertos o
cerrados en el primer punto de la cremallera.

Clasificado y seleccin del

mtodo de esterilizacin
Envoltorio

Calor hmedo

Calor
seco

EtO

Flas

Bolsas (pouche) doble faz papel grado

mdico / poliester / polipropileno

Cajas o envases metlicos con tapa

hermtica

Cajas organizadoras metlicas con filtro

Cajas organizadoras plsticas con filtro

R1

R-1

Film de polietileno grado mdico

Frascos y tubos con tapn de gasa y/o

papel

Muselina: 140 hebras/pulg. 55 hilos/cm2

Papel grado mdico

Poliamida

Cmo se puede detectar

contaminacin?
* MACROSCPICAMENTE
Turbidez
Cambio de color
Olor
* MICROSCPICAMENTE
Levaduras
Bacterias

Objetivo 10X
Objetivo 40X

* SIEMBRA DE UNA PARTE DEL CULTIVO EN PLACAS

CON MEDIO RICO