Manual Bioquimica II

Laboratorio de Bioqumica II
UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ

Instituto de Ciencias Biomdicas
Laboratorio
de
Bioqumica II
NDICE
Toma de muestras.......
Preparacin antes del procedimiento.
Puncin arterial...
Carbohidratos...
Metabolismo.
Gluclisis..
Fermentacin
Ciclo del cido Ctrico.
Cadena de transporte electrnico...
Cadena respiratoria.
Identificacin de Carbohidratos.....
Identificacin de Carbohidratos por Cromatografa en Capa Fina..........
Produccin de Piruvato y Acetaldehdo durante la fermentacin de la
Glucosa.
Pruebas para Sacarosa
Preparacin de Osazonas
Determinacin de Glucosa en sangre.
Curva de Tolerancia a la Glucosa..
Induccin y represin Hormonal en el metabolismo de los
Carbohidratos..
Lpidos..
cidos Grasos..
Propiedades de los cidos Grasos..
Funcin de los cidos Grasos.
Extraccin de Lpidos
Determinacin de Colesterol srico
Metabolismo Protico..
Determinacin de Urea y Creatinina.....
Determinacin de Protenas Sricas y Albmina..
Determinacin de cido rico...
Anexos..
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TOMA
DE
MUESTRAS
Forma en que se realiza el examen.

Se extrae la sangre de una vena (venopuncin), a menudo una vena de la parte
interior del codo o la parte posterior de la mano. Se limpia el sitio de la puncin con un
antisptico y se coloca un torniquete (una banda elstica) o un esfigmomanmetro
alrededor del antebrazo para aplicar presin y limitar el flujo sanguneo a travs de la vena,
lo cual hace que las venas debajo del torniquete se dilaten (se llenen de sangre). Luego se
introduce una aguja en la vena y se recoge la sangre en un frasco hermtico o en una
jeringa. Durante el procedimiento, se retira el torniquete para restablecer la circulacin.
Una vez que se ha recolectado la sangre, se retira la aguja y se cubre el punto de puncin
para detener cualquier sangrado.
Preparacin para el examen.
La preparacin puede estar sujeta a variaciones, dependiendo de la prueba
especfica y muchas de ellas no requieren de una preparacin especfica. Es posible que
se deba limitar la administracin de ciertos medicamentos un poco antes de la prueba o
suspender el consumo de alimentos la noche (ltima ingesta a 8 pm) anterior para
asegurar resultados exactos.
Bebs y nios:
La preparacin tanto fsica como sicolgica que se puede ofrecer para cualquier
prueba o procedimiento mdico depende de la edad del nio, sus intereses, la experiencia
anterior, y el nivel de confianza. Para obtener mayor informacin, se recomienda leer las
siguientes pautas:
Es la preparacin apropiada para un examen o procedimiento que puede reducir la
ansiedad del nio, estimular su cooperacin y ayudarlo a desarrollar habilidades para
hacer frente a la situacin.
Las investigaciones han demostrado que las intervenciones de preparacin son
efectivas para reducir algunos signos de angustia en los nios como llorar o resistirse al
procedimiento; lo cual ha llevado a otros hallazgos que sugieren que cuando los nios
estn preparados, presentan menos dolor y exhiben menos signos sicolgicos mostrando
menos angustia.
PREPARACIN ANTES DEL PROCEDIMIENTO
Dado el nivel de desarrollo del nio (de 0 a 1 ao),
ser beneficioso hacer una pequea preparacin antes del
examen, pero algunas consideraciones pueden aliviar la
ansiedad de los padres.
Sin importar el tipo de examen o procedimiento, el
beb probablemente llorar como respuesta normal al
ambiente extrao, a las personas que no le son familiares,
a la inmovilizacin y a la separacin de sus padres. El
beb puede llorar ms por estas razones que por la misma
incomodidad del examen o procedimiento. Saber esto
desde el principio, al igual que tener informacin especfica sobre el examen, puede
ayudar a disminuir la ansiedad que siente un padre en cuanto a lo que va a ocurrir.
Por qu la inmolizacin?
Al beb se lo puede inmovilizar con las manos o con dispositivos fsicos. A los
bebs les falta control fsico, coordinacin y capacidad para seguir instrucciones que los
nios mayores y los adultos normalmente poseen. Se puede usar la inmovilizacin durante
un procedimiento o en otras situaciones para garantizar la seguridad del beb.
Si se efecta una venopuncin para obtener una muestra de sangre o empezar un
IV, la inmovilizacin es necesaria, ya que si el nio se mueve mientras le estn insertando
la aguja, la lesin puede lastimar el sistema venoso, algn hueso, tejido o nervios.
La mayora de los exmenes y procedimientos requieren de una precisin extrema
para obtener los resultados deseados, ya sea para colocar un IV correctamente,
asegurarse de los resultados exactos de un examen o evitar lesiones al beb.
PUNCIN ARTERIAL
Forma en que se realiza el examen:
Generalmente, la sangre se extrae de la mueca, aunque tambin puede extraerse
de la parte interior del codo, la ingle u otra arteria. Los latidos cardacos (pulso) se sienten
ejerciendo presin en el rea sobre una arteria. Se limpia el rea con un antisptico y se
puede inyectar o aplicar una pequea cantidad de anestsico antes de insertar la aguja. La
sangre debe fluir fcilmente dentro de la jeringa especialmente preparada (heparinizada) y
luego de obtener una muestra suficiente de sangre, se retira la aguja y se presiona el sitio
de puncin durante un perodo de cinco a diez minutos para detener el sangrado.
Finalmente, la persona se mantiene bajo observacin durante este tiempo para estar
seguros de que el sangrado se detenga.
La sangre est formada por diversos componentes:
Glbulos Rojos o Hemates- Son las clulas sanguneas ms numerosas y la
hemoglobina
que
contienen
es
la
responsable
de
su
color
rojo.
Se forman en la mdula sea, que se halla dentro de los huesos del esqueleto, desde
donde son liberados en el torrente sanguneo.
Su funcin es transportar el oxgeno desde los pulmones a los diferentes tejidos del
cuerpo para que las clulas respiren, y tambin eliminan los residuos producidos por la
actividad celular (anhdrido carbnico).
Glbulos Blancos o Leucocitos- Son los encargados de proteger al organismo contra los
diferentes tipos de microbios. Cuando hay una infeccin aumentan su nmero para mejorar
las defensas. Unos se forman en la mdula sea y otros en el sistema linftico (bazo,
ganglios, etc).
Plaquetas o trombocitos- Son las clulas sanguneas ms pequeas. Se producen
tambin en la mdula sea y viven unos 6-7 das. Las plaquetas intervienen cuando se
produce una rotura en alguna de las conducciones de la sangre. Se adhieren rpidamente
al lugar de ruptura para que cese la hemorragia, dando tiempo a la formacin del cogulo
definitivo.
El Plasma- Es un lquido compuesto de agua, protenas, sales minerales y otras
sustancias necesarias para el funcionamiento normal del organismo y en donde se
encuentran "nadando" las clulas sanguneas.
La Albmina- Es una protena que ayuda a mantener el agua del plasma en una
proporcin equilibrada. Las Globulinas. Son los anticuerpos encargados de la defensa de
nuestro organismo frente a las infecciones. Su disminucin acarrear una bajada de
defensas.
Factores de Coagulacin- Son imprescindibles para evitar las hemorragias. La ausencia
de algn factor de coagulacin puede ocasionar trastornos hemorrgicos ya que se
dificulta la formacin del cogulo.
Otras protenas transportan sustancias necesarias para el normal funcionamiento de las
clulas (grasas, azcares, minerales, etc).
CARBOHIDRATOS
Los carbohidratos son los compuestos orgnicos ms abundantes de la biosfera y a
su vez los ms diversos. Normalmente se los encuentra en las partes estructurales de los
vegetales y tambin en los tejidos animales, como glucosa o glucgeno. Estos sirven como
fuente de energa para todas las actividades celulares vitales.
Refirindonos a la Bioqumica elemental de los Hidratos de Carbono, podemos decir
que son polihidroxicetonas o polihidroxialdehidos y sus derivados. Para los fines de estudio
en nutricin solamente se tienen en cuenta aquellos con cuatro o ms tomos de carbono.
Estos compuestos son extremadamente polares y se unen entre s dando
polmeros. Las funciones que cumple en el organismo son, energticas, de ahorro de
protenas, regulan el metabolismo de las grasas y estructural.
Energticamente, los carbohidratos aportan 4 KCal (kilocaloras) por gramo de peso
seco. Esto es, sin considerar el contenido de agua que pueda tener el alimento en el cual
se encuentra el carbohidrato. Cubiertas las necesidades energticas, una pequea parte
se almacena en el hgado y msculos como glucgeno (normalmente no ms de 0,5% del
peso del individuo), el resto se transforma en grasas y se acumula en el organismo como
tejido adiposo. Se recomienda que minimamente se efecte una ingesta diaria de 100
gramos de hidratos de carbono para mantener los procesos metablicos.
Ahorro de protenas: Si el aporte de carbohidratos es insuficiente, se

utilizarn las protenas para fines energticos, relegando su funcin plstica.
Regulacin del metabolismo de las grasas: En caso de ingestin deficiente
de carbohidratos, las grasas se metabolizan anormalmente acumulndose en
el organismo cuerpos cetnicos, que son productos intermedios de este
metabolismo provocando as problemas.
Estructuralmente, los carbohidratos constituyen una porcin pequea del peso y

estructura del organismo, pero de cualquier manera, no debe excluirse esta funcin de la
lista, por mnimo que sea su indispensable aporte. Los hidratos de carbono se clasifican en
simples y complejos:
Los simples, son azcares de rpida absorcin y son energa rpida. Estos generan
la inmediata secrecin de insulina. Se encuentran en los productos hechos o, con azcares
refinados azcar, miel, mermeladas, jaleas, golosinas, leche, hortalizas y frutas etc. Algo
para tener en cuenta es que los productos elaborados con azcares refinados aportan
caloras y poco valor nutritivo, por lo que su consumo debe ser moderado.
Los complejos, son de absorcin ms lenta, y actan ms como energa de reserva
por la anterior razn. Se encuentra en cereales, legumbres, harinas, pan, pastas. Segn el
nmero de molculas que tengan los glcidos se los puede dividir en cuatro grandes
grupos:
Monosacridos que se subdividen Pentosas y Hexosas
Las pentosas:
Xilosa- Se encuentra como componente de la madera.
Ribosa- Constituyente de los cidos nucleicos.
Arabinosa- Forma parte de las gomas, muclagos y pectinas (de este grupo, estas son las
nicas que normalmente ingerimos dentro de mermeladas y dulces).
Las hexosas:
Son 24 pero, solamente tienen importancia biolgica cuatro:
D-glucosa- aparece en los frutos maduros, sangre y tejidos animales. Esta constituye el
azcar del organismo, es muy soluble en agua, y es el carbohidrato que transporta la
sangre y el que principalmente utilizan los tejidos.
D-manosa- Siempre aparece combinado en la naturaleza. Nunca libre por tanto preferimos
no enunciar ningn componente.
D-galactosa- Aparece en lpidos complejos. El hgado puede convertirla en glucosa y
despus en energa.
D-fructosa- Se lo denomina azcar de frutas. Aparece libre en la miel y en los jugos de
frutas. Tiene un sabor muy dulce.
Representacin de una triosa, tetrosa, pentosa y una hexosa

Disacridos.- Los disacridos estn formados por la unin de dos monosacridos, que se
realiza de dos formas:
1.- Mediante enlace monocarbonlico, entre el C1 anomrico de un monosacrido y un C
no anomrico de otro monosacrido, como se ve en las frmulas de la lactosa y maltosa
.Estos disacridos conservan el carcter reductor.
MALTOSA
LACTOSA
2.- Mediante enlace dicarbonlico, si se establece entre los dos carbonos anomricos de
los dos monosacridos, con lo que el disacrido pierde su poder reductor, por ejemplo
como ocurre en la sacarosa.
-Disacridos se subdividen en maltosa, lactosa y sacarosa
Maltosa- Aparece en la malta o cebada germinada y es muy soluble en agua.
Lactosa- Es el azcar de la leche y es poco soluble en agua.
Sacarosa- Es el azcar de mesa. Se obtiene de la caa de azcar y de la remolacha, y
como todos saben, es muy soluble en agua.
SACAROSA
Oligosacridos:
Trisacridos- La rafignosa se encuentra en legumbres.
Tetrasacridos- La esteaquiosa, el ms estudiado, se encuentra en las semillas de soja.
Polisacridos:
Almidn- Este se encuentra en los vegetales en forma de granos, ya que son la reserva
nutritiva de ellos. Aparecen en la papa, arroz, maz, y dems cereales.
Glucgeno- Se encuentra en los tejidos animales, donde desempea la funcin de
reserva nutritiva. Aparece en el hgado y en los msculos.
Celulosa- Cumple funciones estructurales en los vegetales.
Inulina- Aparece en los tubrculos de dalia, en alcauciles, ajos y cebollas.
Liquenina- Aparece en los musgos y lquenes.
Mucopolisacridos- Cumplen funcin de sostn, nutricin y comunicacin intercelular.
Inicialmente solamente se les dio un papel estructural y energtico, pero se han reconocido
nuevas funciones celulares como decir que son combustibles o reservas energticas
celulares
POLMEROS QUE FORMAN EL ALMIDN
AMILOSA
AMILOPECTINA
La celulosa est constituida por unidades de b-glucosa, y la peculiaridad del enlace b(beta)
hace a la celulosa inatacable por las enzimas digestivas humanas, por ello, este
polisacrido no tiene inters alimentario para el hombre.
METABOLISMO
El metabolismo de los compuestos de carbono proveen de los metabolitos bsicos
para la biosntesis, la energa metablica necesaria y el poder reductor. Los carbohidratos
que contienen glucosa son los ms utilizados como fuente de carbono y energa por los
hongos, el metabolismo del carbono comienza por el catabolismo de la glucosa. Otras
hexosas pueden convertirse en glucosa pero las pentosas necesitan una ruta glucoltica
alternativa. Las fuentes de carbono como cidos grasos, aminocidos orgnicos y
alcoholes entran a la va de la glucosa por diferentes puntos. Las fuentes de carbono que
no son carbohidratos deben ser convertidos en glucosa por un proceso llamado
gluconeognesis.
GLUCLISIS
Es la conversin de azcares a piruvato o a acetil-CoA. Existen 3 rutas para la
gluclisis de las hexosas, la va de Embden-Meyerhof-Parnas (EM), la va de la hexosa
monofosfato (HM) y la va de Entner-Doudoroff (ED). Todas contienen glucosa-6-fosfato.
Hay dos vas para la gluclisis de las pentosas, la va del Xilitol (XP) que alimenta la va del
HM y la va de la fosfocetolasa (PK).
Las vas EM, HM y XP son generales pero no universales para todos los hongos, la
PK es ms eficiente en conversin de pentosas a unidades C2 para respiracin y
fermentacin.
La interconversin de azcares por HM ocurre por una serie de reacciones enzimticas
libremente reversibles.
FERMENTACIN
Es la regeneracin de NAD por transferencia de electrones de NADH a un aceptor
orgnico de electrones. En los hongos este aceptor es piruvato. Es un proceso anaerbico
y existen organismos fermentadores facultativos y obligados.
Son tres los principales tipos de fermentacin en los hongos, alcohlica, cido
lctica y por una mezcla de fermentaciones. En Saccharomyces se han hecho la mayora
de los estudios. La fermentacin de cido lctico, se lleva a cabo principalmente en
Chytridiomycetes, Oomycetes y Zygomycetes. Rhizopus (Zygomycetes) realiza
simultneamente fermentacin alcohlica y cido lctico.
La mezcla de fermentacin de cidos se presenta en un pequeo grupo de
Chytridiomycetes, similar a la fermentacin de Enterobacteriaceae, con acetato, lactato,
formato, etanol, metano, CO2 y H2 como productos finales.
CICLO DEL CIDO CTRICO

Ha sido demostrado un ciclo del cido ctrico en los hongos (junto con su actividad
enzimtica). El ciclo funciona aceptando unidades acetil, derivados de piruvato, oxidacin
de cidos grasos o de otras fuentes y las incorpora al cido ctrico para oxidarlas luego en
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un proceso gradual que da CO2 por resultado. En el proceso de oxidacin se reduce NAD,
excepto en la transicin del succinato al fumarato. La coenzima A es el agente de
transferencia que provee de las unidades acetil en el ciclo. El ciclo del glioxalato tiene un
atajo en el ciclo del cido ctrico, ligando isocitrato, succinato y malato. Acetil-CoA es parte
de este proceso. Las enzimas del ciclo del cido ctrico son parte de la mitocondria.
Adems de oxidar sustratos, el ciclo provee de intermediarios importantes en la biosntesis
(cido glutmico, cido asprtico), como resultado obtiene una deplecin de sus
intermediarios (si estos no son repuestos, el ciclo se interrumpe). El ciclo del cido ctrico
es uno de los ejes del catabolismo y anabolismo.
CADENA DE TRANSPORTE ELECTRNICO

Es el segundo proceso ms importante de la respiracin. En l, los tomos de
hidrgeno son transferidos por una serie de pasos de oxidacin-reduccin hacia el
oxigeno, con quien forman agua. Los electrones se toman en pares de los sustratos en el
ciclo del cido ctrico y la gluclisis, y son transferidos como pares por la unidad
ubiquinona. Los componentes de la cadena pueden ser aislados como subunidades
estructurales.
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CADENA RESPIRATORIA
Es similar a la de los otros organismos aerobios, esta compuesta por 3 procesos
independientes, el ciclo del cido ctrico, transporte de electrones y fosforilacin oxidativa.
Estos procesos estn atados a la estructura de la mitocondria que es el centro de
respiracin en eucariontes.
IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS
Introduccin.
Los glcidos o azcares son sustancias que en un principio se les denomin
hidratos de carbono, debido a que su frmula mnima es CH 2O, como si cada carbono
estuviera "hidratado". Esta denominacin no es correcta.
Los glcidos estn ampliamente distribuidos tanto en tejidos animales como
vegetales. En las plantas son producto de la fotosntesis, e incluyen la celulosa de la pared
celular vegetal. En las clulas animales, los glcidos glucosa y glucgeno sirven como
fuente de energa para las actividades vitales.
Por su funcin qumica son aldehdos polihidroxilados o cetonas polihidroxiladas,
esto quiere decir que son cadenas de tomos de carbono en donde el primer carbono tiene
una funcin aldehdo, o el segundo tiene una funcin cetona, y tienen un grupo oxhidrilo en
cada uno de los carbonos restantes.
Clasificacin:
Se dividen en tres grandes grupos:
a) Monosacridos, osas o glcidos simples:
Son no hidrolizables y constituyen las unidades
menores. Se clasifican de acuerdo con el nmero de
tomos de C que poseen: triosas, tetrosas, pentosas,
hexosas y heptosas, siendo las ms importantes
biolgicamente las que tienen 3, 5 y 6 tomos de C. Si
poseen funcin aldehdo se llaman aldosas y si tienen
funcin cetona, cetosas. Todos son reductores.
b) Oligosacridos:
Por hidrlisis dan de 2 a 6 molculas de osas. Se
forman por la unin de "n" molculas de stas ltimas con
prdida de "n -1" molculas de agua. Si por hidrlisis dan dos
molculas de osas se denominan disacridos, etc. Algunos
son reductores y otros no.
Rafinosa
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e) Polisacridos u sidos:
Por hidrlisis, dan un nmero variable de monosacridos. Si dan pentosas por
hidrlisis, se denominan pentosanos; si dan hexosas, hexosanos. Otros compuestos
dentro del grupo son los Mucopolisacridos y los poliurnidos, que por hidrlisis dan
monosacridos y ciertos cidos denominados cidos urnicos derivados de la glucosa y la
galactosa. No son reductores.
amilopectina
glucgeno
Las reacciones generales de reconocimiento general de glcidos se basan en sus

propiedades reductoras (reaccin de Fehling), en evidenciar los derivados furfricos que
se obtienen por deshidratacin de los glcidos (reaccin de Molish), y en identificar
polisacridos (reaccin de Lugol).
Los monosacridos se diferencian de los disacridos por medio de la reaccin de
Barfoed ya que slo los monosacridos dan positiva esta reaccin.
Las cetosas (glcidos con funcin cetona en carbono 2) se diferencian de las
aldosas (glcidos con funcin aldehdo en carbono 1) por medio de la reaccin de
Seliwanoff ya que slo las cetosas dan positiva esta reaccin.
La pentosas (glcidos de 5 carbonos) se diferencian de las hexosas (glcidos de 6
carbonos) por medio de la reaccin de Bial, ya que slo las pentosas dan positiva esta
reaccin.
Reaccin de Molish
Fundamento:
Todos los glcidos por accin del cido sulfrico concentrado se deshidratan formando
compuestos furfricos (las pentosas dan furfural y las hexosas dan hidroximetilfurfural).
Estos compuestos furfricos reaccionan positivamente con el reactivo de Molish (solucin
alcohlica de alfa-naftol).
Metodologa:
Tomar un tubo de ensayo y colocar 1 ml de las muestras de carbohidratos. Agregar a cada
tubo 0.25 ml del reactivo de Molish. Mezclar. Inclinar cada tubo y agregar por las paredes,
con mucho cuidado (sin agitar) 1 ml de cido sulfrico concentrado. Anotar resultados.
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Reaccin de Fehling
Fundamento:
El catin cprico (Cu++) del reactivo de Fehling reacciona con los glcidos reductores
pasando a xido cuproso, que es un precipitado de color rojo ladrillo. Esta es una reaccin
que resulta positiva slo si el glcido es reductor. Los glcidos reductores se manifiestan
en medio alcalino, pero el Cu++ en ese medio tiende a precipitar espontneamente como
xido cprico (que en esa forma no reacciona), de manera que es necesaria la presencia
de tartrato doble de sodio y potasio en el reactivo para "secuestrar" al catin Cu++, a fin de
evitar la formacin del xido cprico, y permitir que reaccione con los glcidos reductores.
(da positiva con todos los glcidos reductores).
Metodologa:
Tomar un tubo de ensayo y colocar 1 ml de reactivo de Fehling (mezclar en partes
iguales Fehling A y Fehling B). Mezclar. Calentar a bao mara por 5 min. Anotar
resultados.
Reaccin del Lugol

Fundamento:
El color que dan los polisacridos con el lugol (solucin de I 2 y de IK) se debe a que el I 2
ocupa espacios vacos en las hlices de la cadena de unidades de glucosa, formando un
compuesto de inclusin que altera las propiedades fsicas del polisacrido, especialmente
la absorcin lumnica. Esta unin del I 2 a la cadena es reversible, y por calentamiento
desaparece el color, que al enfriarse reaparece. El lugol da con el almidn color azul y con
el glucgeno color rojo caoba. (da positiva con los polisacridos).
Metodologa:
Tomar 1.0 ml glucgeno o almidn. Agitar vigorosamente para resuspender el
carbohidrato. Agregar 2 a 5 gotas de reactivo lugol. Anotar los resultados.
Reaccin de Selliwanoff
Fundamento:
Los glcidos que se clasifican como cetosas, vale decir, que en carbono 2 tienen una
funcin cetona, en presencia de un cido fuerte producen rpidamente derivados furfricos
que reaccionan con un difenol llamado resorcina. La sacarosa (un disacrido formado por
glucosa y fructosa) y la inulina (un polisacrido de la fructosa) dan positiva la reaccin, ya
que el CIH del reactivo provoca en caliente la hidrlisis del compuesto liberando fructosa
(responsable de la reaccin positiva). (da positiva con cetosas y negativa con aldosas).
Metodologa:
En un tubo de ensayo colocar 1 ml de las muestras de carbohidratos. Agregar 2 ml
del Reactivo de Seliwanoff. Calentar a bao mara por 5 minutos observando los cambios
cada minuto y anotar los resultados.
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Material y reactivos
Reactivo de Molish
Reactivo de Fehling A y B
Reactivo de Seliwanoff
Reactivo de Lugol
Reactivo Bial
cido sulfrico concentrado
Resultados:
Carbohidrato
Agua hirviendo
Vaso precipitado
Platina
Tubos de ensayo
Gradilla
Molish
Fehling
Lugol
Seliwanoff
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Cuestionario:
Explique cada uno de los resultados.
Qu son los compuestos furfricos?
Explique a quines se les conoce como glcidos reductores?
Investigue la reaccin del Lugol con los polisacridos.
Escriba la estructura de una cetosa y de una aldosa.
Escriba las estructuras de un monosacrido, de un disacrido y de un polisacrido.
IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS
POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA
La separacin de mezclas de molculas mediante la cromatografa de capa fina se

basa en el principio del reparto entre dos fases. En general, una cromatografa se realiza
permitiendo que la mezcla de molculas que se desea separar (muestra) interaccione con
un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la
fase mvil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a travs de sta para
"lavar" (elur) a las molculas en la muestra. Debido a que las distintas molculas en la
muestra presentan diferente coeficiente de reparto, la fase mvil "lavar" a los distintos
componentes con diferente eficiencia, de modo que aquellos que "prefieren disolverse" en
la fase mvil sern eludos ms rpido que los que sean preferencialmente solubles en la
fase estacionaria.
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En la cromatografa de capa fina, la fase estacionaria es una delgada capa de un

soporte slido granulado, tal como gel de slica, almina, cido silcico u otros, que se
depositan sobre una placa de vidrio, aluminio u otro soporte inerte. Para que adquiera
firmeza y no se desmorone, la capa de fase estacionaria se aglutina con una pequea
cantidad de sulfato de calcio u otro agente cementante. Las muestras se aplican
aadiendo pequeas gotas de solucin en un pequeo crculo cerca del extremo inferior de
la placa. La gota se deja secar y si se desea poner ms muestra se pueden aplicar ms
gotas, cuidando de que la mancha no se haga demasiado grande.
La placa seca se sumerge en un pequeo
volumen de fase mvil (mezcla de solventes).
La polaridad de la mezcla de solventes se elige de
acuerdo a la mezcla de compuestos que se desea
separar.
En cromatografa de capa fina la fase estacionaria
est hidratada, por lo que se le considera como la fase
polar.
Como slo la base de la placa queda sumergida,
el solvente comienza a mojar la fase estacionaria y
asciende por capilaridad. Al recorrer la placa la fase
mvil va arrastrando a las substancias apolares y
aquellas ms polares son retenidas por la fase estacionario dando lugar a la separacin.
La placa desarrollada se deja secar y se revela con un reactivo que tia a las
substancias de inters. La movilidad relativa o R f es la relacin entre la distancia recorrida
por la mancha de un compuesto, dividida por la distancia recorrida por el frente de solvente
al momento de sacar la placa del solvente.
En un sistema de TLC bien caracterizado, las substancias pueden identificarse
comparando los valores de Rf con los de estndares, que se han analizado previamente o
durante la cromatografa. Si se desea, las substancias pueden recuperarse raspando la
slica de la placa del lugar en el que se detect la mancha. Para ello, es necesario
emplear mtodos de revelado que no destruyan a la muestra.
OBJETIVO
La identificacin de carbohidratos por cromatografa en capa fina, utilizando diferentes
reveladores.
MATERIALES
Cmara de vidrio para cromatografa
Papel de celulosa
Pipetas pasteur
REACTIVOS
Carbohidratos al 1%
40 ml de butanol
10 ml de cido actico
50 ml de agua destilada
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160 ml de acetona
2.5 ml de anilina
40 ml de cido actico glacial
81 ml acetato de etilo
18 mil cido actico
18 ml agua
Difenilamina
PROCEDIMIENTO
Preparacin de fase mvil y reveladores.
Reactivo de anilina: A 100 ml de acetona se le agregan 2.5 ml de anilina. Inmediatamente
antes de usarse, este se agrega a 1.2 ml de cido fosfrico en 40 ml de cido actico
glacial y por ultimo se agregan 60 ml de acetona.
Fase mvil: Mezclar 40 ml de butanol, 10 ml de cido actico y 50 ml de agua destilada y
colocarla en la cmara de vidrio.
Preparacin del cromatograma
Se cortan 3 cuadros de el papel de celulosa que se va utilizar para la cromatografa,
manejndolo con guantes y con precaucin de utilizarlo
en direccin correcta.
Se colocan gotas de los carbohidratos en la fase

estacionaria, las gotas deben de ser pequeas y
aproximadamente 1 cm de distancia una de otra.
Colocar las placas (fase estacionaria) dentro de la cmara

de vidrio y tapar.
Cuando la fase mvil halla recorrido mas de de la placa,
sacar y dejar secar. Marque con lpiz la distancia que
recorri la fase mvil.
Revelacin de las placas
Revelacin con ninhidrina: Se roca la placa con el reactivo de ninhidrina, se calienta en la
estufa a 100 grados centgrados, cuidando que no se queme el cromatograma,
aproximadamente de 3-5 minutos.
Revelacin con anilina: Se sumerge el cromatograma en el reactivo recin preparado de
anilina, se calienta en la estufa a 100 grados centgrados por 5 minutos.
Revelacin con Molish: Se basa en la accin hidrolizante y deshidratante del cido
sulfrico en los CH. El cido sulfrico cataliza la hidrlisis de los enlaces glucosdicos de la
muestra y la deshidratacin a furfural (pentosas) o hidroximetilfurfural (hexosas). Estos
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furfurales se condensan con el alfa naftol del reactivo de Molisch dando un producto
coloreado. Calentar las placas en la estufa por unos minutos y con una brocha con cuidado
pasamos el reactivo de Molisch para el revelado, una vez hecho esto secamos en la estufa
a 120 o 140 C de 1 a 5 minutos, tener cuidado de que las manchas no se vayan a daar,
observar de rato en rato hasta que aparezcan las manchas coloreadas.
Revelacin con vapores de yodo: En una cmara de vidrio se coloca yodo, y el
cromatograma a revelar, se deja el tiempo que sea necesario para que los vapores de
yodo impregnen el cromatograma.
Sacar relacin de frentes (Rf) de los 3 cromatogramas y conclusiones, que revelador es

ms eficiente al utilizar carbohidratos y porque. Identificar los CH problema.
18
PRODUCCIN DE PIRUVATO Y ACETALDEHDO DURANTE
LA FERMENTACIN DE GLUCOSA POR LEVADURA.
OBJETIVO
Que el alumno produzca piruvato y acetaldehdo a partir de glucosa, y determine su
presencia.
INTRODUCCIN
La primera etapa de la gluclisis en las levaduras es la formacin de piruvato. La
reaccin total podra considerarse como la transferencia de dos pares de tomos de
hidrgeno de la glucosa al NAD. Ya que la enzima se encuentra solo en cantidades
catalticas, es necesario reoxidarla para que el proceso no se suspenda, y as, el NADH 2
formado es convertido a NAD por oxigeno molecular a travs de la cadena respiratoria.
Esto no es posible en condiciones anaerbicas y en este caso la reaccin se efecta
cuando el piruvato se convierte en acetaldehdo, y luego en alcohol.
Los metabolitos piruvato y acetaldehdo se encuentran presentes normalmente en
muy bajas concentraciones, por lo tanto, para demostrar su existencia como intermediario
en el camino metablico, es necesario impedir que sean transformados en otros
compuestos. Este procedimiento se usa mucho cuando se investigan caminos metablicos
y se hace bloqueando la enzima que cataliza la conversin del compuesto, que se esta
investigando mediante inhibidores. Tambin se pueden cambiar las condiciones
fisiolgicas para que la enzima funcione a una velocidad muy por debajo de su actividad
mxima, o se puede usar un agente que atrape el intermediario y que forme un compuesto
que no pueda metabolizarse.
La piruvato-descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de
manera que el piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse por la reaccin con
nitroprusiato de sodio o 2,4-dinitrofenilhidrazina. En el segundo experimento se aade a la
mezcla de incubacin sulfito de sodio que atrapa el acetaldehdo. La presencia de
acetaldehdo puede demostrarse por el color azul producido por la reaccin con
nitroprusiato de sodio y piperidina.
REACTIVOS
Fosfato de sodio bibsico (0.5 mol/lt)
20 ml.
Fosfato de potasio monobsico (0.5 mol/lt)
20 ml.
Suspensin de levadura en NaHPO4 (100 gr/lt) 5 ml.
Suspensin de levadura en KH2PO4 (100 gr/lt) 5 ml.
Suspensin de levadura en agua (100 gr/lt) 5 ml.
Glucosa (100 gr/lt) 10 ml.
Nitroprusiato de sodio (50 gr/lt) 1 ml.
Hidrxido de amonio
Sulfato de amonio 1 gr.
Sulfito de sodio 0.5 gr.
Hidrxido de sodio (100 gr/lt) 1 ml.
Hidrocloruro de 2,4-dinitrofenilhidrazina (solucin saturada en cido clorhdrico
2 mol/lt) 1 ml.
Piperidina (30 gr/lt en solucin acuosa) 2 ml.
19
cido tricloroactico (100 gr/lt) 2 ml.
Agua destilada 5 ml.
Bao de agua a 37C.
MATERIALES
8 tubos de ensaye.
Pipetas: 4 de 5ml, 4 de 2ml,2 de 1ml y 1 de 0.5ml.
1 Gotero
1 Bao Mara.
PROCEDIMIENTO
FORMACIN DE PIRUVATO A PARTIR DE GLUCOSA.
En dos tubos de ensaye pipetee 5ml de solucin de glucosa (A y B); al tubo a
agrguele 5ml de suspensin de levadura en solucin ligeramente alcalina de Na 2HPO4 y
al tubo B aada 5ml de la suspensin de levadura en solucin ligeramente cida de
KH2PO4. Coloque los tubos en un bao de agua a 37C durante una hora, luego aada a
cada tubo 2ml de la solucin de cido tricloroactico, mezcle vigorosamente y centrifugue
durante 10 minutos a 2500 rpm. Separe el sobrenadante y selo para la determinacin de
piruvato.
DETERMINACIN DE PIRUVATO MEDIANTE NITROPRUSIATO DE SODIO.
En un tubo de ensaye agregue 2ml del sobrenadante hervido previamente a 1 gr.,
de sulfato de amonio slido. Agregue dos gotas de solucin de nitroprusiato de sodio
recin preparada, mezcle vigorosamente y deje deslizar cuidadosamente por las paredes
del tubo, amoniaco concentrado hasta que formen dos capas. Si hay piruvato, se forma un
anillo verde o azul en la interfase de los lquidos. La formacin de un anillo rosado
transitorio en la interfase indica la presencia de grupos tioles y con frecuencia se observa
antes de la coloracin azul o verdosa caracterstica de la reaccin con piruvato.
DETERMINACIN DE PIRUVATO CON 2,4-DINITROFENILHIDRAZINA.
Agregue 1ml de solucin saturada de 2,4-dinitrofenilhidrazina a 2ml de
sobrenadante, mezcle fuertemente y coloque dos o tres gotas de la mezcla en un tubo de
ensaye, agregue 1ml de solucin de hidrxido de sodio y diluya con agua hasta 5ml. La
formacin de un color rojo indica la presencia de piruvato.
FORMACIN DE ACETALDEHDO A PARTIR DE GLUCOSA.
En dos tubos marcados C y D pipetee 5ml de la solucin de glucosa, agregue a
ambos tubos 5ml; de la suspensin de levadura en agua, al tubo D aada 0.5 gr de sulfito
de sodio. Mezcle vigorosamente e incube los dos tubos por 10 minutos, separe el
sobrenadante, mezcle 2 ml de piperidina acuosa y agite. Si hay acetaldehdo presente, se
observar una coloracin azul.
20
PRUEBAS PARA SACAROSA
INTRODUCCIN
Este azcar, se obtuvo por primera vez en la India, de los tallos de la caa de
azcar. Los rabes la llevaron a Arabia, Egipto y algunas regiones del sur de Espaa, de
donde pas a Canarias y de aqu, con el descubrimiento de Amrica, a las Antillas, Mxico
y Brasil. Parece ser que los antiguos mexicanos la extraan de los tallos del maz, donde
existe en parte invertida.
La sacarosa es el edulcorante universal utilizado para

endulzar toda clase de alimentos y bebidas. En farmacia se
emplea para preparar jarabes, como excipiente de muchos
preparados y en el grageado de tableado. El caramelo se utiliza
como colorante de muchas bebidas.
La sacarosa es el nico disacrido
comn no reductor y por tanto, no reduce
las soluciones alcalinas de cobre ni forma
ozasonas. La sacarosa es hidrolizada en
solucin cida a glucosa y fructosa.
MATERIALES.
Solucin de sacarosa (0.5 g / 50 ml de agua destilada)
cido clorhdrico concentrado.
Hidrxido de sodio (solucin al 10% para neutralizar)
Reactivo de Benedict
Reactivo de Seliwanoff.
21
MTODOLOGIA.
Hidrlisis de la sacarosa:
A 5 ml de la solucin de sacarosa agregar cinco gotas de HCl concentrado. Calentar
la solucin resultante por 5 min. en bao de agua hirviendo, seguido de los 5 min. enfriar y
agregar a la muestra solucin de NaOH hasta que la muestra sea neutra o dbilmente
alcalina. Con la muestra (ya hidrolizada) realizar las pruebas de Benedict y Seliwanoff.
REACCIN DE BENEDICT
Fundamento:
Algunos azcares tiene la propiedad de oxidarse en presencia de agentes oxidantes
suaves como el in Fe3+ o el Cu2+. Esta caracterstica radica en la presencia de un grupo
carbonilo libre, el cual es oxidado y genera un grupo carboxilo. A estos azucares con un
grupo carbonilo libre se les llama azcares reductores y aquellos en los que el grupo
carbonilo se encuentra combinado en unin glicosdica se conoce como azcares no
reductores. La prueba de Benedict se basa precisamente en la reaccin o no de un azcar
con el in Cu2+.
La aparicin de un precipitado amarillo,

anaranjado o rojo ladrillo evidencia la
presencia de un azcar reductor.
Metodologa:
En un tubo de ensayo mediano deposite 2.5 ml de reactivo de Benedict y agregue 6
gotas de sacarosa, repita la prueba en otro tubo con sacarosa sin hidrolizar, coloque los
tubos en un bao de agua hirviendo por 5 minutos. Observe cualquier cambio de color
durante el calentamiento saque los tubos y colquelos en una gradilla y despus de un
corto tiempo observe si se ha formado un precipitado, el cual puede ser rojo, anaranjado
o amarillo.
REACCIN DE SELLIWANOFF
Fundamento:
Los glcidos que se clasifican como cetosas, vale decir, que en carbono 2 tienen una
funcin cetona, en presencia de un cido fuerte producen rpidamente derivados furfricos
que reaccionan con un difenol llamado resorcina. La sacarosa (un disacrido formado por
glucosa y fructosa) y la inulina (un polisacrido de la fructosa) dan positiva la reaccin, ya
que el HCl del reactivo provoca en caliente la hidrlisis del compuesto liberando fructosa
(responsable de la reaccin positiva). (da positiva con cetosas y negativa con aldosas).
22
Metodologa:
En un tubo de ensayo colocar 1 ml de la muestra de sacarosa hidrolizada y en otro tubo 1
ml de la sacarosa inicial. Agregar 2 ml del Reactivo de Seliwanoff a cada tubo. Calentar a
bao mara por 5 minutos observando
los cambios cada minuto y
anotar los resultados.
Prueba de Selliwanoff positiva
Cuestionario:
1.- Por qu se le considera reductor a un azcar?
2.- Cules son ejemplos de azcares reductores?
3.- En qu consisten las pruebas que nos permiten
saber si un azcar es reductor?
4.- Escriba la reaccin de cada una de las dos pruebas
efectuadas en la prctica.
5.- Investigue y describa la importancia econmica de la
Sacarosa.
PREPARACIN DE OSAZONAS
FUNDAMENTO
Tanto las aldosas como las cetosas son oxidadas por el licor de Fehling (tartrato
cprico alcalino) o por el reactivo de Tollens (AgNO 3 amoniacal). Los glucsidos no dan
reacciones positivas con estos reactivos porque para ello se requiere el grupo carbonilo
este libre o en forma de hemiacetal. En consecuencia, la sacarosa no es un azcar
reductor, pero la maltosa si.
Los azcares no dan la prueba de Schiff y pueden ser diferenciadas de los
aldehdos alifticos comunes.
23
Las aldosas y las cetosas reaccionan con la fenilhidracina para dar fenilhidrazonas.
En presencia de la solucin cida de fenilhidracina en exceso, un grupo CHOH adyacente
es oxidado a grupo carbonilo, y este reacciona con una o ms molculas de fenilhidracina
para dar una osazona. La velocidad de formacin de la osazona y la estructura cristalina
de la osazona son tiles para la identificacin de un azcar.
En las cetonas, el tomo de carbono C-1 es oxidado a grupo carbonilo. En
consecuencia, los pares de compuestos, tales como glucosa y fructosa dan osazonas
idnticas, demostrando la similitud estereoqumica de los tomos de carbono C-3, C-4, C5, C-6.
Se forman las osazonas de cualquier compuesto que tenga la estructura:
R-C-CH-R
O OH
CHO
CHOH
C6H5NHNH2
CH=NNHC6H5
CHOH
C6H5NHNH2
CH=NNHC6H5
C=NNHC 6H5
(osazona)
PRERREQUISITOS.
- Dibujar los cristales de las osazonas de los diferentes Carbohidratos.
- Cul es la utilidad de la formacin de osazonas?
- Un mecanismo de reaccin de la formacin de osazonas.
- Estructura molecular de por lo menos dos osazonas.
- Escriba la razn por la que Glucosa, Manosa y Fructosa forman la misma osazona.
MATERIALES
cido actico
Solucin de fenilhidracina
Acetato de sodio
Microscopio
Pipetas pasteur
Papel filtro
Solucin de azcares
Tubos de ensaye
PROCEDIMIENTO
- Acidifique 5 ml de la solucin de los azcares con 10 gotas de cido actico glacial.
- Agregue tres gotas de la solucin de fenilhidrazina debe de prepararse y utilizarse
inmediatamente y un poco de acetato de sodio slido (en la punta de un cuchillo).
- Caliente en un bao de agua durante 5 min. agitando ocasionalmente, filtre y caliente el
filtrado en un bao de agua por 20 min.
- Dejar enfriar muy lentamente y examine bajo el microscopio los cristales de osazona.
- Realice los dibujos de los cristales encontrados.
- Investigue y dibuje la forma y apariencia de los cristales de las osazonas de los diferentes
Carbohidratos.
24
Metodologa opcional:
Coloque en un tubo de ensaye 0.1 g de cada carbohidrato.
Agregue 0.2 g de clorhidrato de fenilhidrazina.
Luego 0.3 g de Acetato de sdio cristalizado y 4 ml de gua.
Agitar energtica y tapar el tubo, con un tapn de papel, que permita la salida de vapor.
Coloque el tubo en bao Mara a ebullicin, agitando ocasionalmente. Observe el tiempo
que aparecen los cristales.
Si en 20 min. de calentamiento no se han formado los cristales, retire el tubo del bao
Mara y djelo reposar en fro.
Anote el tiempo de cristalizacin y si fue en fro o en caliente.
Carbohidrato
Fructosa
Glucosa
Xilosa
Arabinosa
Galactosa
Lactosa
Maltosa
Estructura observada
Tiempo en precipitar
2 minutos
4 a 5 minutos
7 minutos
10 minutos
15 a 19 minutos
Solubles en agua caliente
Cristal de osazona
Glucosa
Galactosa
Arabinosa
25
Lactosa
Maltosa
Xilosa
http://comunidad.uach.mx/carzola/MANUAL_PRACT_BIOQUIMICA.pdf
DETERMINACIN DE GLUCOSA EN SANGRE

OBJETIVO.
El alumno aprender a determinar los valores de glucosa srica.
PRERREQUISITOS.
Cul es la fuente primaria de energa oxidativa?
Cules son los valores normales de glucosa en sangre?
Defina los conceptos de Glicemia, Hipoglicemia, Hiperglicemia.
Describa el padecimiento Diabetes Mellitus.
Qu es la insulina y dnde se produce?
Cul es la funcin de la Insulina?
Qu es la adrenalina y dnde se produce?
Cul es la funcin de la adrenalina?
Describa ampliamente procesos de Gluclisis, Glucognesis,
Gluconeognesis.
Con todos los prerrequisitos construya la introduccin:
Glucogenlisis
METODOLOGA:
TCNICA PARA MEDIR GLUCOSA SANGUNEA
Blanco
Reactivo (ml)
Blanco
Patrn
Problema
2
.020
---
Patrn
2
-.020
--
Problema
2
--.020
26
Mezclar, dejar reposar a temperatura ambiente 10 minutos.
Leer los tubos a 505 nm, calibrando a cero con el tubo blanco.
Despus realizar los clculos:

Concentracin de Glucosa en suero:
mg/dl de Glucosa =
absorbancia del problema

Absorbancia del patrn
Concentracin del patrn
Valores Normales: ___________________________________________.
CURVA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA

FUNDAMENTO:
Los carbohidratos son la principal fuente de energa en corto y mediano plazo. En
los animales los carbohidratos se transportan en la sangre en forma de glucosa, la cual es
llevada hasta los tejidos para asegurar a las clulas un adecuado suministro energtico.
La concentracin de glucosa sangunea se puede alterar por
varias hormonas que actan estimulando o suprimiendo la
produccin o la utilizacin de glucosa. La actividad de las
hormonas depende de si el paciente est en ayunas o no. La
adrenalina, el glucagon, los glucocorticoides, las hormonas
pituitaria anterior y las hormonas de la tiroides causan un aumento
en la concentracin de glucosa sangunea y se llaman agentes
hiperglicemiantes.
En cambio la insulina disminuye el azcar sanguneo y es hipoglicemiante.
La insulina es producida por las clulas del

pncreas y cuando estas cesan o dejan de funcionar,
tal como ocurre en la diabetes mellitus, el azcar
sanguneo aumenta hasta alcanzar valores muy altos
y entonces se excreta glucosa en la orina.
CUESTIONARIO:
1.- Investigue el papel del pncreas como glndula de secrecin.
2.- En que parte del pncreas se produce la insulina y cul es su papel?
3.- Cul es el papel del glucagon?
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4.- Cmo se encuentra el nivel sanguneo de glucosa en enfermedades del pncreas?
(investigue al menos dos enfermedades).
5.- Qu relacin existe entre los valores sanguneos de glucosa y amilasa en una
pancreatitis y en una obstruccin intestinal (ya visto).
7.- Qu relacin existe entre el nivel de adrenalina y el nivel de glucosa?
8.- Elabore una tabla comparativa de valores normales de glucosa en sangre de cinco
especies animales, adems los del humano.
9.- Cules son las manifestaciones de probable diabetes mellitus en perros y gatos?
Diabetes mellitus:
Es un trastorno metablico que se manifiesta por unos niveles de glucosa en sangre
por encima de los lmites normales. Si no se trata adecuadamente, estos niveles alcanzan
valores excesivamente altos, dando lugar a las complicaciones agudas o crnicas de la
diabetes.
La causa de la diabetes es una anomala en la produccin o el funcionamiento de la
insulina por el pncreas. La insulina es una hormona que fabrica el pncreas, cuya misin
es facilitar el paso de los azcares de la sangre a las clulas.
Cuando no hay insulina como en los diabticos jvenes (Tipo 1), o no funciona
correctamente, como ocurre en los adultos (Tipo 2), el azcar no pasa de la sangre a los
rganos y el funcionamiento es deficiente. Al tiempo, el azcar se acumula en la sangre en
cantidades superiores a las normales, apareciendo hiperglucemia.
Cuando la glucosa en sangre es superior a 180 mg, el organismo no puede
retenerla, por lo que la elimina por la orina: Glucosuria.
En un paciente mal controlado o no tratado aparecer hiperglucemia y glucosuria.
La causa ms frecuente de la Diabetes Mellitus es la produccin insuficiente de Insulina
por el pncreas. La falta de insulina provoca hiperglucemia y glucosuria.
El estudio de diabetes se realiza mediante la medicin de la glucosa en sangre en
ayunas (glucemia basal) y se recomienda en las siguientes circunstancias:
En todos los individuos mayores de 45 aos, y repetir cada 3 aos mientras sea normal.
En poblacin ms joven cuando existan factores de riesgo.
Cuando aparezcan sntomas o signos que sugieran diabetes:
poliuria (orinar mucho).
polifagia (aumento del apetito).
polidipsia (beber mucho por sed).
prdida de peso.
retinopata.
proteinuria.
infecciones urinarias de repeticin.
infecciones cutneas de repeticin,...
Cuando el nivel de glucosa plasmtica en ayunas est entre 110 y 125, hay que
repetir la glucemia y si persiste, realizar una Curva de Tolerancia de Glucosa (75g de
glucosa disuelta en 300ml de agua que se ha de tomar en 3-5 minutos).
Pacientes con antecedentes de Hipertensin arterial o trastornos del colesterol.
28
PROCEDIMIENTO:
La primera muestra de sangre se toma en ayunas, minutos despus se ingiere una
solucin de glucosa al 50 % de agua destilada. Se toma una muestra de sangre al haber
transcurrido dos horas.
La prueba de dos horas es ordinario suficiente
para la evaluacin rutinaria de la diabetes. Los
pacientes con insuficiencia adrenal o con tumores en
los islotes del pncreas suelen tener los niveles de
glucosa bajos en la sangre en ayunas. Los valores de
la curva van aumentando hasta una lectura mxima y
luego descienden un poco por enzima de valor de
glucosa en ayunas y en los pacientes diabticos
permanece un valor alto despus de 2 horas.
Los valores en ayunas y los valores mximos aumentan con la edad debido a una
disminucin de la tolerancia a la glucosa.
Un aumento en la tolerancia a la glucosa puede encontrarse en los casos de
hipofuncin de la tiroides, adrenal o pituitaria o tambin hay un defecto de la absorcin
intestinal.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
Normalmente se puede hacer una prueba de tolerancia, en los casos en que se
sospecha de diabetes mellitus.
En casos de diabetes mellitus, el nivel de glucosa en la sangre est alrededor de 150
mg /dl al final de la primera hora y no vuelve al valor original a las 2 horas; de hecho
puede continuar subiendo. Cuando se presenta hiperadrenocorticalismo el resultado
de una prueba de tolerancia a la glucosa ser similar al que se ha encontrado en la
diabetes
mellitus.
29
La curva de tolerancia a la glucosa en una persona normal en comparacin a un
paciente con diabetes mellitus no insulina dependiente (NIDDM, diabetes tipo 2). Las
lneas punteadas indican el rango de la concentracin de glucosa en una persona normal.
Los criterios que clnicamente establecen que un individuo tenga diabetes mellitus
incluyen:
1. Tener un nivel de glucosa sangunea durante ayunas mayor a 126 mg/dL (7 mmol/L).
Los niveles normales deberan ser menores a 100 mg/dL (5.6 mmol/L)
2. Tener niveles de glucosa sangunea mayores a 200mg/dL (11mmol/L) en dos momentos
durante la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT), uno de los cuales debe ser
realizado durante las dos primeras horas de haber ingerido la glucosa.
El rango normal de los niveles de glucosa en el perro y en el
gato es del orden de 60-110 mg /dl.
En perros normales el aumento del nivel de glucosa en la
sangre, se elevar desde el nivel de ayuno al nivel mximo,
alrededor de la hora despus de la administracin de glucosa al
50 % y despus el nivel desciende nuevamente hasta el nivel
original al cabo de 2 horas aproximadamente. El valor mximo no
sobrepasa generalmente 160 mg /dl.
TCNICA PARA MEDIR GLUCOSA SANGUNEA
Blanco
Reactivo de
glucosa
Blanco
Patrn
Problema
Patrn
Problema
2.0 ml
2.0 ml
2.0 ml
.02 ml
---
-.02 ml
--
--.02 ml
Mezclar, dejar reposar a temperatura ambiente 10 minutos y luego leer a 505 nm la

absorbancia del patrn y del problema, previa calibracin a cero con el blanco. Realizar
los clculos correspondientes.
Clculos:
Concentracin de Glucosa = Abs. del Problema
Abs. del Patrn
[Concentracin del patrn]
INDUCCIN Y REPRESIN HORMONAL EN EL

METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS.
OBJETIVO
Conocer y describir detalladamente cada uno de los eventos del equilibrio homeosttico
de la glucosa tomando en cuenta el papel que juegan las hormonas insulina y
30
adrenalina en el control de este equilibrio.
PREREQUISITOS
1.- Explicar la diferencia entre induccin y activacin enzimtica.
2.- Explicar la diferencia entre represin e inhibicin enzimtica.
3.- Definir alosterismo y regulacin enzimtica.
4.- Definir hipoglucemia e hiperglucemia.
5.- Explicar funciones y caractersticas de las hormonas insulina, glucagon, adrenalina,
ACTH y somatropina.
INTRODUCCIN
La glucosa se considera, en la mayora de los organismos, como la fuente primaria de
energa oxidativa y todo el programa metablico celular esta diseado primordialmente
para usar este metabolito como principal materia prima. Este diseo implica que la
absorcin de glucosa exgena sea muy eficiente de tal modo que garantice un aporte
suficiente de la misma a todas las clulas del organismo. Tal efecto obliga al organismo a
mantener sistemas muy eficientes de regulacin para evitar una posible sobresaturacin
de glucosa celular.
En los mecanismos de control homeosttico de glucosa estn implicadas las
principales vas metablicas de los carbohidratos, de hecho estas vas son las que
mantienen el equilibrio y son:
La gluclisis considerada como la va degradativa principal de la glucosa.
La glucognesis que genera al glucgeno como principal fuente almacenable de glucosa.
La glucogenlisis mecanismo por el glucgeno puede en caso necesario convertirse en
glucosa.
La gluconeognesis donde se puede formar glucosa cuando las necesidades de la
misma llegan a estados crticos.
Todas estas vas presentan sistemas muy complejos de autorregulacin enzimtico
y de regulacin hormonal que determinar sincrona, actividad e inhibicin de cualquier
cambio en la concentracin de glucosa intra y extracelular.
Con este experimento nos disponemos a comprobar mediante el uso racional de
animales de laboratorio, las implicaciones que diferentes hormonas del organismo tienen
sobre las vas metablicas que mantienen el control homeosttico de la glucosa
extracelular.
Podemos considerar una hiptesis general donde determinamos: si las hormonas
insulina y adrenalina estn directamente relacionadas con la regulacin del control
homeosttico de la glucosa, entonces, modificando la concentracin de tales hormonas en
el organismo se genera un desequilibrio en la concentracin de glucosa extracelular. Esto
nos lleva a dos hiptesis ms concretas que nos indican:
I. Si la insulina tiene un efecto principalmente inductor en la
captacin de glucosa por parte de las clulas y de la
degradacin glucoltica y el almacenamiento glucognico de la
31
glucosa, entonces, aumentando la concentracin de insulina circulante, se generar un
efecto hipoglicmico a la vez que se mantendr la concentracin mxima de glucgeno
heptico en un animal de laboratorio con una concentracin de glucosa extracelular
mantenida constantemente alta.
II. Si la adrenalina tiene un efecto primario
inductor de la movilizacin de la glucosa a travs de
membranas celulares por su efecto activador de la
glucogenlisis, entonces aumentando la concentracin de
esta hormona se generar un efecto hiperglicemiante
primario y adems disminuir notablemente la
concentracin de glucgeno heptico en un animal de
laboratorio donde se mantiene la concentracin de
glucosa extracelular constantemente alta.
METODOLOGA
Se requiere un lote de 4 ratas adultas, sanas y con un
peso promedio de 400 gr con el siguiente tratamiento previo:
GRUPO I: Administracin subcutnea de una dosis de 1.0

unidad de insulina NPH (de accin intermedia) los primeros
cinco 5 das y 1.0 unidad de insulina de accin rpida los ltimos dos das. La segunda
administracin al siguiente da enseguida de la explicacin de la prctica. La tercera ser
al tercer da, una hora antes de la realizacin de la prctica.
martes
1 u Insulina
de accin
intermedia
mircoles
jueves
viernes
sbado
1u
1u
1u
1u
Insulina
Insulina
Insulina
Insulina
de accin de accin de accin de accin
intermedia intermedia intermedia intermedia
domingo
1u
Insulina
de accin
rpida
lunes
1u
Insulina de
accin
rpida
GRUPO AR: Administrar por va subcutnea 1.0 U/Kg. de insulina de Accin

Rpida una hora antes de la prctica
GRUPO A: Administracin intramuscular de una dosis de 0.01 mg/ml de adrenalina
media hora antes del experimento.
GRUPO T: Lote de ratas testigo sin tratamiento hormonal.
Nota: A los tres lotes de ratas se les administrar una dieta rica en carbohidratos, grasas y
lpidos en una cantidad de 20 gr de purina por da y 100 ml de solucin de dextrosa el
5.0%. (se refrigerar la solucin que no se est utilizando).
32
COLECCIN DE MUESTRAS
Extraccin de Glucgeno:
1.- Sacrificar a la rata con ter o cloroformo procurando no excitarla demasiado.
2.- Extraer rpidamente el hgado, pesarlo y colocarlo en un recipiente fro.
3.- Cortarlo en trozos pequeos.
4.- Colocar los trozos en un mortero previamente sumergido en hielo al cual se le agrega
cido tricloroactico al 10% en una proporcin de 2.0 ml por gramo de tejido y 0.5 gr de
arena lavada. Triturar el hgado hasta formar una pasta homognea.
5.- Centrifugar durante 5 minutos 2000 rpm.
6.- Recuperar el sobrenadante en un tubo de ensaye grande y medir el volumen.
7.- Aadir dos volmenes de alcohol al 95% por volumen de sobrenadante recuperado.
Agitar lentamente hasta que el glucgeno flocule.
8.- Centrifugar a 2000 rpm durante 5 minutos.
9.- Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado con 5.0 ml de agua destilada.
10- Aplicar la prueba del lugol, de Fehling y de Molish a la muestra obtenida.
Cuantificacin de Glucosa Sangunea:

1.- Extraer el mayor volumen posible de sangre de la rata con una jeringa desechable de
3.0 cc, procurando no causar hemlisis a la muestra.
2.- Introducir la sangre en un tubo y deje reposar durante 5 minutos.
3.- Centrifugar la sangre por 10 min. a 2000 rpm.
4.- Separe el suero y aplicar el siguiente anlisis:
TUBO
Agua destilada
Solucin
patrn
glucosa
Suero problema
Reactivo de glucosa
de
BLANCO
0.02 ml
PATRN
-----
PROBLEMA
-----
-----
0.02 ml
-----
----2.0 ml
----2.0 ml
0.02 ml
2.0 ml
Mezclar cada tubo y dejar reposar por 10 minutos.

Leer la absorbancia de la muestra y el patrn a 505 nm ajustando a cero de absorbancia
con el blanco.
Hacer el siguiente clculo:
Abs. problema
Glucosa srica = ---------------------- X [ patrn ] =
Abs. Patrn
mg/dl
33
LPIDOS
Concepto.
Los lpidos son biomolculas orgnicas formadas bsicamente por carbono e
hidrgeno y generalmente tambin oxgeno; pero en porcentajes mucho ms bajos.
Adems pueden contener tambin fsforo, nitrgeno y azufre .
Son un grupo de sustancias muy heterogneas que slo tienen en comn estas dos
caractersticas:
* Son insolubles en agua
* Son solubles en disolventes orgnicos, como ter, cloroformo, benceno, etc.
Clasificacin de los cidos Grasos.
Lpidos Simples
-Grasas neutras
-Ceras
Grasas compuestas
- Fosfolpidos
-Glucolpidos
-Lipoprotenas
Esteroles
Sustancias que acompaan a los lpidos
-Colesterol y sus esteres
-Esteroides
-Acidos biliares
-Vitamina K
-Carotenoides
CIDOS GRASOS
Los cidos grasos son molculas formadas por una larga cadena hidrocarbonada de
tipo lineal, y con un nmero par de tomos de carbono. Tienen en un extremo de la cadena
un grupo carboxilo (-COOH).
34
Se conocen unos 70 cidos grasos que se pueden clasificar en dos grupos:
Los cidos grasos saturados slo tienen enlaces simples entre los tomos de
carbono. Son ejemplos de este tipo de cidos el mirstico (14C);el palmtico (16C) y el
esterico (18C) .
Los cidos grasos insaturados tienen uno o varios enlaces dobles en su cadena y
sus molculas presentan codos, con cambios de direccin en los lugares dnde aparece
un doble enlace. Son ejemplos el olico (18C, un doble enlace) y el linoleco (18C y dos
dobles enlaces).
PROPIEDADES DE LOS CIDOS GRASOS

Solubilidad. Los cidos grasos poseen una zona hidrfila, el grupo carboxilo (COOH) y una zona lipfila, la cadena hidrocarbonada que presenta grupos metileno (-CH2) y grupos metilo (-CH3) terminales.
Por eso las molculas de los cidos grasos son anfipticas, pues por una parte, la
cadena aliftica es apolar y por tanto, soluble en disolventes orgnicos (lipfila), y por otra,
el grupo carboxilo es polar y soluble en agua (hidrfilo). Desde el punto de vista qumico,
los cidos grasos son capaces de formar enlaces ster con los grupos alcohol de otras
molculas.
Cuando estos enlaces se hidrolizan con un lcali, se rompen y se obtienen las sales
de los cidos grasos correspondientes, denominados jabones, mediante un proceso
denominado saponificacin.
35
FUNCIONES DE LOS LPIDOS

Los lpidos desempean cuatro tipos de funciones:
Funcin de reserva. Son la principal reserva energtica del organismo. Un gramo de

grasa produce 9.4 kilocaloras en las reacciones metablicas de oxidacin, mientras que
protenas y glcidos slo producen 4.1 kilocalora/gr.
Funcin estructural. Forman las bicapas lipdicas de las membranas. Recubren rganos
y le dan consistencia, o protegen mecnicamente como el tejido adiposo de pies y manos.
Funcin biocatalizadora. En este papel los lpidos favorecen o facilitan las reacciones
qumicas que se producen en los seres vivos. Cumplen esta funcin las vitaminas lipdicas,
las hormonas esteroideas y las prostaglandinas.
Funcin transportadora. El transporte de lpidos desde el intestino hasta su lugar de
destino se rabiza mediante su emulsin gracias a los cidos biliares y a los proteolpidos.
36
EXTRACCIN DE LPIDOS
INTRODUCCIN
A diferencias de las protenas los cidos nucleicos y los polisacridos, los
lpidos no son polmeros. Se trata de molculas bastante pequeas que presentan
una fuerte tendencia a asociarse mediante fuerzas no covalentes. Generalmente
se caracterizan por el tipo de estructura que consiste en una cabeza hidrfila
polar, conectada a una cola hidrocarbonada hidrfoba no polar.
Los lpidos son substancias insolubles en solventes polares como el agua
(o parcialmente solubles) compuestas de cidos grasos.
Los cidos grasos son los lpidos ms sencillos los cuales son tambin
componentes de otros lpidos ms complejos.
En esta prctica se utilizar la yema de huevo para realizar la extraccin de
lpidos, por lo que se describe la composicin lipidica de dicha yema.
Yema de huevo sin clara
cido palmtico (16C)
6.500mg
cido esterico (18C)
2.200mg
cido oleico (18C)
12.9g
cido linoleico (18C)
2.450mg
cido linolnico (18C)
220mg
cido araquidnico (20C) 375mg
Colesterol
1.260mg
MATERIAL
Una yema de huevo
Pipetas de 10ml
Vasos de precipitado
Varilla de vidrio
Papel filtro
Matraz kitasato
Vortex
Bomba de vaco
Cloroformo
Solucin de cloruro de potasio

Reactivo de bismuto
Reactivo de ninhidrina
Metanol
PROCEDIMIENTO
Extraccin de Lpidos.
Separar la yema del huevo colocarla en un matraz, agitarla con una varilla
37
de vidrio para romper la membrana. Agregar al matraz 10ml de cloroformo y 10ml
de metanol, agitar en el vortex durante 10min, hasta homogenizar la mezcla.
Despus filtrar al vaci, despus al filtrado se coloca en un tubo de ensayo
y se le agrega 10ml de solucin de cloruro de potasio y se deja reposar durante
10min. Se formaran dos capas en el tubo, un precipitado de color amarillo, el cual
contiene los lpidos de la yema.
Cromatografa:
Como fase mvil se utilizar la siguiente mezcla:
Cloroformo
65ml
Metanol
25ml
cido actico
8ml
Agua destilada
4ml
Como fase estacionaria se utilizar silica gel.
Para realizar la cromatografa se toman unas gotas del precipitado amarillo
formado en el tubo de ensayo y se colocan sobre la placa de slice gel, se deja
secar y se revela con: el reactivo de bismuto, reactivo de nihinidrina.
RESULTADOS Y CONCLUSIONES
Reportar los resultados de la cromatografa , explicar por que se da el
corrimiento de los lpidos en sobre la fase mvil, que reacciones se da entre los
lpidos y los reveladores.
DETERMINACION DE COLESTEROL SERICO

INTRODUCCIN
Las concentraciones plasmticas de lpidos tienden a aumentar lentamente
con la edad. Este efecto es muy claro e importante en el caso de fosfolpidos y
colesterol. Los cidos grasos normales, muestran una relacin inversa con la
edad. Esto puede deberse a mayores exigencias anablicas y cifras ms altas de
hormona del crecimiento en los nios pequeos. El colesterol plasmtico tiende a
disminuir tambin en loa ancianos.
38
Colesterol
(3-hidroxi-5,6-colesteno)
El colesterol es un alcohol esteroide, sus propiedades como alcohol

dependen del grupo OH, y la cadena lateral de hidrocarburo, unida al tomo de
carbono 17, le confieren sus caracteres de lpido, como solubilidad en ter,
cloroformo, etc. Cualquier clula del organismo, prcticamente, puede producir
colesterol a partir de compuestos simples de dos carbonos (acetato). El
hgado, corteza suprarrenal, ovarios y testculos as como el epitelio intestinal,
son focos especialmente activos en la sntesis de colesterol.
La corteza suprarrenal, los ovarios y los testculos, utilizan el colesterol y
sus esteres para producir hormonas esteroideas. Adems de sintetizar
colesterol, el hgado tambin lo esterifica, transformando parte de el en cido
clico, que excreta con la bilis (un poco menos de 1g/da). Aunque el
organismo sintetiza muy fcilmente colesterol, su destruccin es mucho ms
problemtica.
El transporte y la excrecin de colesterol se aceleran por efecto de los
estrgenos; al respecto, la testosterona parece carecer de accin, o tener un
efecto opuesto.
Normalmente, casi un 70% del colesterol plasmtico esta esterificado, ms
del 50% con cido linoleico, y casi todo el resto con cido oleico; el 30% restante
del total se presenta como colesterol libre. Cuantitativamente, despus de los
fosfolpidos, el colesterol es el lpido ms importante del plasma. En trminos
generales, la relacin entre fosfolpidos y colesterol es bastante constante, salvo
en las enfermedades graves del hepatocito, que se acompaan de disminucin
espectacular de los esteres de colesterol.
El colesterol es el material fundamental para la formacin de muchas otras
molculas derivadas de los esteroides, como la vitamina D. Aunque el colesterol
es esencial para la vida humana se le atribuye la formacin de placas en las
paredes de las arterias (proceso llamado arterosclerosis), que puede provocar
tarde o temprano una obstruccin. Este efecto es de particular importancia en las
arterias que aporten sangre al corazn. El bloqueo de las mismas produce daos
cardiacos que con frecuencia provocan la muerte a consecuencia de un ataque al
corazn.
39
FUNDAMENTO
El cido paratoluensulfnico en medio actico reacciona con el colesterol
para formar un complejo que con anhdrido actico y cido sulfrico concentrado,
se vuelve de color verde, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de
colesterol presente.
METODOLOGA
Reactivos
Suero no
hemolizado
Solucin patrn
Agua destilada
Reactivo de
colesterol
problema
patrn
blanco
0.05ml
-------
-------
---------------
0.05ml
--------
------0.05ml
2.0ml
2.0ml
2.0ml
Mezclar y dejar que se lleve a cabo la reaccin durante 20min, y aadir en

forma directa sobre la superficie del lquido 0.2ml de H 2SO4 concentrado. Dejar 5
min y leer a 640nm.
Sustituir en la siguiente frmula =

para obtener los mg/dl.
Abs problema
Abs patrn
[estndar]=
Valores normales 120-190mg/dl

RESULTADOS
40
METABOLISMO
PROTEICO
INTRODUCCIN
Las protenas son macromolculas formadas por unidades bsicas
llamadas aminocidos, los cuales poseen en su estructura un grupo amino que los
caracteriza, y un esqueleto hidrocarbonado. Las protenas animales estn
constituidas por veinte aminocidos diferentes, los cuales son necesarios para la
sntesis de protenas corporales y otros compuestos nitrogenados.
En nuestro organismo las protenas estn siendo continuamente
degradadas y resintetizadas. El proceso de intercambio de aminocidos entre los
diferentes rganos y la permanente sntesis y degradacin es conocido como
recambio proteico. Los procesos oxidativos y ciclos metablicos especficos de los
aminocidos dan origen a productos nitrogenados residuales que son
principalmente eliminados a travs de la va renal. El nitrgeno es adems
eliminado por prdidas fecales y otras vas (sudor, piel y anexos), estas prdidas
de nitrgeno deben ser compensadas por el aporte proteico de la dieta.
El mecanismo ms importante de eliminacin de nitrgeno es a travs de la
orina, traducido en la excrecin de urea (nitrgeno ureico), y otros compuestos
nitrogenados tales como amonio, cido rico, creatinina y aminocidos. La
cuantificacin de las prdidas proteicas es un elemento importante durante la
enfermedad puesto que las prdidas por vas no habituales (drenajes, fstulas,
etc.) Pueden estar aumentadas, o bien la tolerancia a las protenas puede ser
limitada, de esta forma la medicin de los requerimientos proteicos de cada
paciente es importante para su adecuada nutricin.
La determinacin de nitrgeno ureico se puede hacer mediante la medicin
de actividad de la ureasa en suero sanguneo, que es una enzima que hidroliza la
urea rindiendo ion amonio y CO2. De esta manera multiplicando los valores de
nitrgeno por su factor estequiometrico 2.14 obtenemos los valores de urea serica,
y evaluar el funcionamiento fisiolgico de los procesos de eliminacin de
nitrgeno.
La urea es la principal forma de eliminacin de nitrgeno a travs de los
riones excretndola por medio de la orina. Esta urea procedente del suero
sanguneo y alimentada por el hgado que es el rgano que realiza el ciclo de la
urea.
La serie de reacciones que forman urea es conocido como el ciclo de la urea o
el ciclo de krebs-henseleit, el amonio proviene de la glutamina en exceso por
accin enzimatica de la glutaminasa rindiendo tambin glutamato.
41
Como ya se mencion el nitrgeno se puede eliminar por medio de la

creatinina. La creatinina es sintetizada en hgado por metilacin del
guanidoacetato usando sam como donador del grupo metilo el guanidoacetato
es formado en el rin por los aminocidos arginina y glicina.
42
La creatinina es usado como almacn de un enlace fosfato de alta energa.

Un grupo fosfato es transferido a la creatinina, generando creatin fosfato, por
accin de la enzima creatin fosfocinasa, la reaccin es reversible de tal manera
que cuando se requiera energa la creatina fosfato transfiere su enlace de alta
energa a el adp. La creatinina y la creatininfosfato son encontradas en
msculo, cerebro y sangre la cantidad de creatinina producida esta relacionada
con la masa muscular y se mantiene constante da con da. La creatinina es
secretada por los riones y en funcin a el nivel de excrecin de ella se mide el
funcionamiento del rin.
DETERMINACIN DE UREA Y CREATININA SRICA

OBJETIVO:
Al finalizar esta prctica, el alumno deber tener los fundamentos para
poder interpretar desde el punto de vista clnico, los resultados obtenidos de la
cuantificacin de urea y creatinina de una muestra de suero de un paciente.
PRERREQUISITOS:
1.- Describir los puntos principales del ciclo de la urea.
2.- Describir los mecanismos de produccin de la creatinina.
3.- Identificar los principales tejidos productores de urea y creatinina
43
4.- Explicar las razones de la produccin de estos dos metabolitos por el humano.
5.- Cul es la funcin de la urea en el organismo?
6- Por qu los niveles de urea se elevan en el caso de la insuficiencia renal
severa?
7.- Cmo estn los niveles de urea durante el embarazo y porque?
INTRODUCCIN:
La urea es el principal producto de
excrecin, proveniente del catabolismo de las
protenas, el cual se origina a partir de los
grupos amino de los aminocidos. Esta va, es el
principal medio de excrecin de nitrgeno por el
organismo. La urea es sintetizada en el hgado
por medio del ciclo de la urea(descrito en 1932
por Sir Hans Krebs y Kurt Henseleit) tambin
llamado ciclo de la ornitina, cuya funcin
fundamental es convertir el amoniaco y el bixido de carbono en urea.
La urea es el producto final del metabolismo proteico; sintetizada por el
hgado, transferida al torrente circulatorio y excretada por el rin.
El nitrgeno ureico sanguneo (BUN) esta elevado en toda lesin renal, que
perturbe su funcin excretora. L a urea tambin se eleva en casos de azoemia
prerrenal (elevacin de los productos nitrogenados del metabolismo orgnico POR
CAUSAS NO RENALES), que depende un bajo volumen plasmtico circulante,
como ocurre en la hemorragia masiva, deshidratacin, hipotensin o choque.
Est tambin elevada en los casos que cursen con catabolia protenica
elevada, acompaada de baja eliminacin renal.
Cuando los niveles de urea pasan de 214 mg/100 ml., aparecen depresin
mental, somnolencia y desequilibrio hidroelectroltico, y si los niveles siguen
aumentando, aparecer el coma urmico.
Los niveles bajos de urea se observan en embarazo, hidratacin excesiva,
hepatopatas graves y mal nutricin.
La creatinina se forma en los msculos a
partir del fosfato de creatina. Un 2% de esta
sustancia se convierte diariamente en esta
sustancia. Es excretada por los riones, y en
pequea cantidad por las heces. La creatinina
libre que aparece en la sangre y orina no vuelve a
ser utilizada. Esta se excreta en la orina de
manera constante. En condiciones fisiolgicas
normales a partir de la creatina en cantidades
constantes. La creatinina normal del suero no se
modifica ni con la dieta, edad, sexo, catabolia
protenica ni ejercicio. Sin embargo, con una ingesta proteica sustancial, que
incluye una cantidad considerable de carne y con ejercicios intensos durante
largos perodos, se han observado en sujetos jvenes sanos, excreciones
urinarias de creatinina del orden del 2.5 a 2.7 g/24 hrs., pero con niveles
sanguneos normales; por lo tanto, se deduce que los niveles
44
sanguneos de creatinina en los sujetos normales son ms constantes que los
niveles en la orina.
La cifra normal esta comprendida entre 0.5 y 1.2 mg/100 ml de suero o
plasma, y es proporcional a la masa muscular, por lo que en la mujer los niveles
normales son ms bajos(0.5 a 1.0 mg/100ml). sus aumentos generalmente van
parejos con los de la urea, aunque la creatinina tarda ms en subir.
Cuando en la insuficiencia renal con uremia se encuentran cifras mayores
de 5 mg/100 ml., el pronstico es mortal a corto plazo. Esta considerablemente
elevada en las nefrosis por txicos.
Se observa tambin cifras altas en los casos de obstruccin urinaria, las que
se normalizan al ceder la obstruccin.
METODOLOGA:
Experimento No. 1.
Cuantificacin de urea srica.
REACTIVOS
BLANCO
PATRN o ESTANDAR
PROBLEMA
Diacetil monoxima
1.5 ml.
1.5 ml.
1.5 ml.
Agua
0.05 ml
------------Solucin patrn
------0.05 ml
------Problema
---------------0.05 ml
Reactivo cido
1.5 ml
1.5 ml
1.5 ml
Mezclar y calentar en bao a ebullicin durante 15 minutos. Enfriar al chorro de
agua y leer ajustando con el blanco de reactivos a 520 nm.
CLCULOS:
Urea = Absorbancia del problema X concentracin del patrn = mg/dl
Urea = Nitrgeno ureico x 2.14 = mg/dl
Nitrgeno ureico = Urea / 2.14 = mg/dl
Valores normales:
Nitrgeno ureico de 10 a 18 mg/dl
Urea de 22 a 40 mg/ml.
Experimento No. 2.
Determinacin de Creatinina.
El cido sulfrico reacciona con el tungstato de sodio para formar el cido

tngstico el cual precipita a las protenas que son separadas por filtracin o
centrifugacin.
45
REACTIVOS
BLANCO
ESTANDAR
PROBLEMA
AGUA DESTILADA
0.5 ml.
ST. CREATININA
0.5 ml
SUERO
--------------------------------0.5 ml.
AC. PICRICO
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
SOLUCIN
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
AMORTIGUADORA
Tomar primera lectura a 490 nm inmediatamente despus de adicionar los reactivos
Reposar a Temp. ambiente por 10 min. y leer a 490 nm. Segunda lectura
CALCULOS:
[Creatinina] = Abs. del problema(lectura 2- lectura 1) x concentracin del patrn = mg/dl
Abs. del patrn (lectura 2- lectura 1)
Valores normales:
Varones: de 0.7 a 1-2 mg/dl
Mujeres: de 0.5 a 1.0 mg/dl
CUANTIFICACIN DE PROTENAS SRICAS

OBJETIVO:
Conocer y practicar dos tcnicas de cuantificacin de protenas del
suero y analizar los resultados en relacin a posibles anormalidades desde el
punto de vista metablico.
PRERREQUISITOS:
1.- Analizar el fundamento qumico de la reaccin de Biuret.
2.- Conocer el perfil protenico del suero.
3.- Analizar clnicamente el trmino protenas totales.
4.- Analice la estructura de la albmina y explique como esta protena funciona en
el transporte de diferentes tipos de metabolitos por la circulacin sangunea.
5.- Mencione las funciones de las globulinas.
INTRODUCCIN:
Una de las fracciones orgnicas ms importantes de la sangre es la de las
protenas, tanto por su contenido porcentual como por las funciones que realizan.
El contenido total de protenas del plasma es normalmente del orden de 5.7 a 8.0
g/dl. Las protenas sricas constituyen la mayor parte de los slidos del plasma y
46
son una mezcla compleja de protenas simples y conjugadas como glucoprotenas
y lipoprotenas.
Las protenas del plasma estn constituidas en tres grupos principales:
Albmina, globulinas y fibringeno. El fibringeno normalmente constituye del 4 al
6 % de las protenas plasmticas, es producido por el hgado y tiene importancia
fundamental para la coagulacin de la sangre.
La albmina es la principal protena del suero; se halla tambin en los
espacios extravasculares, linfa y otros lquidos biolgicos como el amnitico, bilis,
jugo gstrico, etc. Se encuentra en la orina de pacientes con enfermedades
renales y es uno de los componentes principales del lquido del edema. Las dos
funciones principales de la albmina plasmtica son: El mantenimiento de la
presin coloidosmtica (que es una de las fuerzas termodinmicas que mantienen
una perfusin constante en la circulacin capilar) y el transporte de algunos
metabolitos tales como bilirrubinas, aminocidos, cidos grasos, enzimas,
medicamentos, etc. La albmina es sintetizada por las clulas hepticas en una
cantidad de 12 a 14 g/da.
Las globulinas se dividen en tres grupos principales: globulinas alfa, beta y
gamma. Las globulinas alfa y beta ejercen diversas funciones en la circulacin
tales como transporte de metabolitos y de iones metlicos. Las globulinas gamma
actan en la actividad inmunolgica ya que constituyen las inmunoglobulinas que
resisten a la infeccin. La mayor parte de las globulinas alfa y beta son de origen
heptico pero las gamma se pueden sintetizar en hgado y tejido linftico.
El hgado es el centro principal de protenas plasmticas. La formacin de
albmina y fibringeno parece estar limitada al hgado; aproximadamente el 80%
de las globulinas se fabrican en el hgado, incluyendo las lipoprotenas. El principal
papel del hgado en la sntesis protenica del plasma se refleja en la disminucin
notable de albmina y fibringeno que tiene un lugar en tejido heptico daado,
como se observa en pacientes con cirrosis o a consecuencia de una
hepatotectoma experimental.
Existen una gran cantidad de compuestos qumicos entre los cuales se
incluyen a las drogas y los frmacos que afectan la integridad metablica de los
hepatocitos. Algunos de ellos afectan la capacidad de sntesis de metabolitos
como la albmina y en la mayora de los casos el efecto es tan drstico que puede
llegar a ser letal. Dentro de los compuestos que han sido catalogados como
hepato-txicos estn el cloroformo, el dinitrofenol, la clorpromazida, el fluoruracilo
y la tetraciclina. Esta ltima afecta al hgado de una manera proporcional a la
concentracin que se administra. En pacientes desnutridos la tetraciclina es
hepatotxica a dosis mayores de 3 g/da y su efecto comienza a las 48 hrs. de
administrarse esta dosis.
Si la tetraciclina es un antibitico que a dosis mayores de 3 g/da disminuye
el metabolismo del hepatocito y la albmina se sintetiza
47
nicamente en el hgado, entonces, es factible encontrar bajos niveles de
albmina srica en un individuo que ha sido tratado con altas dosis de este
antibitico.
CUANTIFICACION DE PROTEINAS TOTALES
REACTIVOS
BLANCO
PATRON
PROBLEMA
Reactivo de Biuret
2.5 ml.
2.5 ml.
2.5 ml.
Suero
no
------------0.1 ml
hemolizado
Solucin patrn
------0.1 ml
------Solucin
salina
0.1 ml
-------------0.89-0.9%)
Agitar los tubos y dejar reposar durante 15 minutos.
Medir la absorbancia del patrn y del problema ajustando a cero con el blanco a
550 nm
Protenas totales = Absorbancia del problema x concentracin del patrn = g/dl
CUANTIFICACION DE ALBMINA
REACTIVOS
BLANCO
PATRON
PROBLEMA
Reactivo verde de
bromocresol
Suero no
hemolizado
Solucin patrn
Solucin salina
3 ml.
3 ml.
3 ml.
--------
--------
0.01 ml
------0.01 ml
0.01 ml.
-------
----------------
Mezclar y dejar reposar los tubos durante 10 min. a temperatura ambiente. Medir
la absorbancia del problema y el patrn ajustando a cero con el blanco a 640 nm.
CALCULOS:
ALBMINA = Absorbancia del problema x concentracin del patrn = g/dl
PROTEINAS TOTALES ALBMINA = GLOBULINAS
48
CIDO RICO
SUMARIO Y EXPLICACIN
El cido rico del suero es el producto final del metabolismo de las purinas
en los tejidos y es eliminado a travs de los riones por filtracin celular. Altos
niveles de cido rico son el resultado de enfermedades como Leucemia,
Policitema, la ingestin de comidas ricas en ncleo-protenas (por ejemplo hgado
y rin) o cuando la funcin renal esta deteriorada. La gota resulta del deposito de
cido rico en las articulaciones.
El cido rico ha sido ensayado por una variedad de procedimientos
incluyendo la reduccin del cido fosfotngstico (2), por medicin directa a 293 nm
antes y despus del tratamiento con Uricasa (3), reduccin frrica (4) y mtodos
enzimticos colorimtricos utilizando Uricasa. El procedimiento Uricasa cido rico
Eagle es un mtodo enzimtico que utiliza la copulacin del 4 aminoantipirina 3-5
dicloro-2-hidroxibencenosulfonato peroxido de hidrogeno en presencia de
peroxidasa para formar un complejo coloreado que se lee a 520 nanmetros.
PRINCIPIO
El cido rico es oxidado por la Uricasa en Alantona y Peroxido de
Hidrogeno. DHBS+4 amincantipirina + peroxido de hidrogeno, en presencia de
peroxidasa forma un compuesto coloreado que se mide a 520 nm. La intensidad
del color es directamente proporcional a la cantidad de cido rico en la muestra.
INSTRUMENTOS
Utilice un espectrofotmetro o colormetro calibrado a 520 nm. (Intervalo
aceptable 500 540 nm.) Para su uso en instrumentos automatizados consulte el
manual de aplicaciones.
RECOLECCION DE LA MUESTRA
PRECAUCIONES
1. Se recomienda el uso de suero no hemolizado
2. Muestras lipmicas requieren blanco de suero
3. Recoleccin de orina por 24 horas, puede ser utilizada.
ALMACEN DE LA MUESTRA
El cido rico permanece estable en el suero por 7 das a temperatura de
2-8 grados centgrados y por 6 meses en congelacin
SUSTANCIAS INTERFERENTES
Las muestras lipmicas requieren blanco de suero, la bilirrubina y el cido
49
ascrbico pueden causar niveles bajos falsos.
PROCEDIMIENTO
MATERIAL PROPORCIONADO
Reactivo de Uricasa y Uricasa cido rico calibrador.
MATERIAL REQUERIDO, PERO NO SUMINISTRADO
1. Pipetores de 0.05 ml. y 1.0 ml.
2. Incubadora capaz de mantener 37 grados centgrados
3. Cronometro, tubos de cultivo y soporte.
CONDICIONES DE LA REACCION
Longitud de Onda
Seleccin de Filtros
Tipo de Reaccin
Temperatura de Incub.
Tiempo de Incub.
Volumen muestra
Volumen reactivo
Volumen total
Normal bajo
Normal alto
Valor de calibrador
520 nm
500 550 nm
Punto Final
37 grados centgrados
5 minutos
0.025 ml
1.0 ml
1.025 ml
1.5 mg/dl
7.0 mg/dl
5.0 mg/dl
PROCEDIMIENTO
1. Coloque 1.0 ml del reactivo de Uricasa dentro de los tubos etiquetados como:
blanco de reactivos, calibrador, control, muestra 1, etc.
2. Precaliente tubos a 37 grados centigrados por 5 minutos
3. Aada 0.025 ml de muestra a los tubos respectivos
4. Incube los tubos a 37 grados centigrados por 5 minutos
Ajuste el instrumento a cero de absorbancia a 520 nm usando blanco de reactivos.
Lea y registre los valores de absorbancia para cada muestra.
NOTA
Para instrumentos de lectura directa ajuste a cero con el blanco de reactivo
y con el calibrador ajuste la mezcla del valor del calibrador. Lea las
concentraciones del problema directamente.
ESTABILIDAD DE LA REACCION FINAL
Lea las muestras 10 minutos despus de desarrollado el color
CALIBRACION
El calibrador del cido rico Uricasa es proporcionado. Consulte los valores
asignados en la etiqueta. No es necesario hacer curva de calibracin, la linealidad
del procedimiento se extiende hasta 25 mg/dl. Valores por arriba
50
de 25 mg/dl debern ser diluidos 1:1 con solucin salina y reensayados; el
resultado se multiplica por dos.
CONTROL DE CALIDAD
La variedad de estos resultados deber ser monitoreada de rutina, usando
materiales de control de calidad apropiados (normal y anormal) analizados de
igual manera que los problemas.
CLCULOS DE RESULTADOS
La siguiente ecuacin es usada para determinar la concentracin de la
muestra desconocida.
PROBLEMA(mg/dl) =
ABS PROBLEMA x CONC. CALIBRADOR
ABS. CALIBRADOR
VALORES NORMALES
HOMBRES
MUJERES
ORINA
3.5 7.0 mg/dl

2.5 6.0 mg/dl
250 750 mg/dl
51
ANEXOS
PROTENAS
Estas son macromolculas compuestas por carbono, hidrgeno, oxgeno y
nitrgeno. La mayora tambin contienen azufre y fsforo. Las mismas estn
formadas por la unin de varios aminocidos, unidos mediante enlaces peptdicos.
El orden y disposicin de los aminocidos en una protena depende del cdigo
gentico, ADN, de la persona.
Las protenas constituyen alrededor del 50% del peso seco de los tejidos y no
existe proceso biolgico alguno que no dependa de la participacin de este tipo de
sustancias.
Las funciones principales de las protenas son:
Ser esenciales para el crecimiento. Las grasas y carbohidratos no las pueden
sustituir, por no contener nitrgeno. Proporcionan los aminocidos esenciales
fundamentales para la sntesis tisular. Son materia prima para la formacin de los
jugos digestivos, hormonas, protenas plasmticas, hemoglobina, vitaminas y
enzimas. Funcionan como amortiguadores, ayudando a mantener la reaccin de
diversos medios como el plasma. Actan como catalizadores biolgicos
acelerando la velocidad de las reacciones qumicas del metabolismo. Son las
enzimas. Actan como transporte de gases como oxgeno y dixido de carbono en
sangre. (hemoglobina). Actan como defensa, los anticuerpos son protenas de
defensa natural contra infecciones o agentes extraos. Permiten el movimiento
celular a travs de la miosina y actina (protenas contrctiles musculares).
Resistencia. El colgeno es la principal protena integrante de los tejidos de
sostn.
Las protenas son clasificables segn su estructura qumica en:
Protenas simples: Producen solo aminocidos al ser hidrolizados. Albminas y
globulinas: Son solubles en agua y soluciones salinas diluidas (ej.: lactoalbumina
de la leche). Glutelinas y prolaninas: Son solubles en cidos y lcalis, se
encuentran en cereales fundamentalmente el trigo. El gluten se forma a partir de
una mezcla de gluteninas y gliadinas con agua.
Albuminoides: Son insolubles en agua, son fibrosas, incluyen la queratina del
cabello, el colgeno del tejido conectivo y la fibrina del coagulo sanguneo.
Protenas conjugadas: Son las que contienen partes no proteicas. Ej.:
nucleoprotenas.
Protenas derivadas: Son producto de la hidrlisis.
En el metabolismo, el principal producto final de las protenas es el amonaco
(NH3) que luego se convierte en urea (NH2)2CO2 en el hgado y se excreta a
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travs de la orina.
AMINOCIDOS
Los aminocidos son biomolculas formadas por (C) Carbono, (H)
Hidrogeno, (O) Oxgeno y (S) Azufre. Estos, son la nica fuente aprovechable de
nitrgeno para el ser humano, adems son elementos fundamentales para la
sntesis de las protenas, y son precursores de otros compuestos nitrogenados.
Se dividen en esenciales y no esenciales.
Los esenciales: son aquellos que no pueden ser sintetizados en el
organismo, y por ende deben incorporarse en la dieta mediante ingesta.
Se los puede listar en los siguientes: Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina,
Metionina, Fenilalanina, Treonina, Triptofano y Valina
Los no esenciales: son aquellos que son sintetizados en el organismo.
Estos son: Alanina, Arginina, Asparragina, Aspartico, Cisteina, Cistina, Glutmico,
Glutamina, Glicina, Hidroxiprolina, Prolina, Serina y Tirosina.
LPIDOS
Las grasas, tambin llamadas lpidos, conjuntamente con los carbohidratos
representan la mayor fuente de energa para el organismo.
Como en el caso de las protenas, existen grasas esenciales y no
esenciales.
Las esenciales son aquellas que el organismo no puede sintetizar, y son: el cido
linoleico y el linolnico, aunque normalmente no se encuentran ausentes del
organismo ya que estn contenidos en carnes, fiambres, pescados, huevos, etc.
Bioqumicamente, las grasas son sustancias apolares y por ello son
insolubles en agua. Esta apolaridad se debe a que sus molculas tienen muchos
tomos de carbono e hidrgeno unidos de modo covalente puro y por lo tanto no
forman dipolos que interacten con el agua. Podemos concluir que los lpidos son
excelentes aislantes y separadores. Las grasas estn formadas por cidos grasos.
En trminos generales llamamos aceites a los triglicridos de origen
vegetal, y corresponden a derivados que contienen cidos grasos insaturados
predominantemente por lo que son lquidos a temperatura ambiente. (aceites
vegetales de cocina, y en los pescados, ver cuadro)
Para el caso de las grasas, estas estn compuestas por triglicridos de
origen animal constituidos por cidos grasos saturados, slidos a temperatura
ambiente. (manteca, grasa, piel de pollo, en general: en lcteos, carnes,
53
chocolate, palta y coco).
Las grasas cumplen varias funciones:

-Energticamente, las grasas constituyen una verdadera reserva energtica, ya
que brindan 9 KCal (Kilocaloras) por gramo.
-Plsticamente, tienen una funcin dado que forman parte de todas las
membranas celulares y de la vaina de mielina de los nervios, por lo que podemos
decir que se encuentra en todos los rganos y tejidos. Aislante, actan como
excelente separador dada su apolaridad.
-Transportan protenas liposolubles.
-Dan sabor y textura a los alimentos.
Las cidos grasos insaturados son importantes como proteccin contra la
ateroesclerosis (vulgarmente arteriosclerosis) y contra el envejecimiento de la piel.
Estos vienen dados en los aceites de girasol, maz, soja, algodn y avena.
Siempre que se somete al calor a estos aceites, ocurre el proceso conocido como
hidrogenacin, cambiando su configuracin a aceite saturado, por lo que su
exceso es nocivo para la salud. (generando la aparicin de ateromas ateroesclerosis). La ateroesclerosis consiste en la formacin de placas de ateroma
que tapan la luz de las arterias.
Los cidos grasos, componentes ms importantes de las grasas, son
sustancias qumicamente lineales saturadas e insaturadas, con la funcin
carboxilo. Qumicamente, son cidos orgnicos de ms de seis carbonos de largo.
Para los cidos grasos, segn su cantidad de carbonos en la molcula,
cambia el punto de fusin. A mayor cantidad de carbonos, aumenta su punto de
fusin, y viceversa. As mismo, la presencia de enlaces dobles reduce el punto de
fusin. En idntica cantidad de carbonos a temperatura ambiente, los cidos
grasos insaturados son lquidos, y los saturados son slidos.
Los cidos grasos insaturados son el Oleico, Linoleico, Araquidnico, EPA y
DHA, y en el uso cotidiano vienen en los aceites de origen vegetal, en pescados y
mariscos (con los Omega 3).
Los saturados son el Actico, Butrico, Caprico, Caprlico, Cprico,
Laurico, Miristico, Palmtico, y Estearico y en la vida cotidiana vienen dadas en las
grasas animales, y en algunos vegetales como el chocolate, la palta y el coco.
Los esteroides son substancias tetracclicas y su representante ms
conocido es el colesterol. Adems del colesterol, un grupo importante de
hormonas y las sales biliares tienen esta estructura esteroide, ya que derivan del
colesterol.
54
Los cidos grasos ms conocidos son los Omega 3 y los Omega 6, en particular
por sus caractersticas hacia el control del colesterol.
GRASAS
Bsicamente, las grasas estn compuestas por cidos grasos, molculas
constituidas por una unin de tomos de carbono, hidrgeno y oxgeno. Pero, no
todas las uniones son iguales y, justamente por ello se dividen en: saturados e
insaturados (estos ltimos a su vez se subdividen en monoinsaturados y
poliinsaturados). Actualmente se sugiere que del total de grasas que se
consuman, la tercera parte, sean poliinsaturadas, la tercera monoinsaturadas y el
tercio restante saturadas (stas ltimas no deben superar el 10% de las caloras
de la dieta). A continuacin las analizaremos por separado:
cidos Grasos Saturados Qumicamente, todos los tomos de carbono
(menos el tomo terminal) estn unidos a dos tomos de hidrgeno, es decir, que
estn saturados de hidrgeno. Este tipo de grasas provienen del reino animal
excepto el aceite de coco y el de cacao- y son slidas a temperatura ambiente. Su
consumo est. relacionado con un aumento del colesterol sanguneo y con la
aparicin de enfermedades cardiovasculares.
cidos Grasos Insaturados Dentro de esta clasificacin entran los cidos
monoinsaturados y los poliinsaturados. Estos provienen en general del reino
vegetal (a excepcin del pescado que es muy rico en poliinsaturados) son lquidos
a la temperatura ambiente y su consumo est asociada con mayores niveles de
colesterol bueno.
Cul es la diferencia entre los dos tipos de cidos insaturados?

cidos Monoinsaturados. En estos cidos los 2 tomos de carbono
situados de forma consecutiva estn unidos a un solo tomo de hidrgeno. Con lo
cual al ser insaturados son capaces de fijar ms hidrgeno. Segn los
nutricionistas, el consumo de grasas monoinsaturadas debe representar entre el
13 y el 23 % de las grasas ingeridas. El mejor representante de esta familia es el
cido oleico, presente principalmente en el aceite de oliva (54 a 80%).
Esto lo convierte en el aceite ms adecuado para las frituras por dos
motivos fundamentales:
1,- Porque es el ms resistente a la descomposicin qumica que provocan las
altas temperaturas.
2.- Porque es menos absorbido por la superficie de los alimentos que se fren en
l, lo que aumenta la digestibilidad de stos y disminuye su valor calrico final.
cidos Poliinsaturados. Este cido posee dos o ms pares de tomos de
carbono insaturados y cuenta con el beneficio de disminuir el colesterol total y la
concentracin de LDL (colesterol malo). Pero estas grasas tienen
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el inconveniente de que se oxidan con facilidad, interviniendo en procesos de
formacin de radicales libres que son nocivos para la salud. Aunque el organismo
puede inactivar tales procesos por medio de sustancias antioxidantes, no es
prudente abusar de las grasas poliinsaturadas.
Por esta razn, se recomienda que su consumo sea de 3 a 7% del total de
la grasa, sin sobrepasar nunca el 10%. El cido graso poliinsaturado ms
frecuente es el cido linoleico presente en altas proporciones en el aceite de
girasol y en el de uva.
56

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