PREPARACIN DE INMUNGENOS Y ANTGENOS.

GENERALIDADES
Anteriormente el trmino antgeno era utilizado para denominar a todos aquellos
agentes capaces de estimular una respuesta inmune y adems de interaccionar
con los productos de sta (anticuerpos y linfocitos T sensibilizados).
Actualmente, se ha establecido que una sustancia puede o no tener dos
propiedades diferentes, una la inmunogenicidad y otra la antigenicidad.
Por tanto, se considera inmungeno a toda sustancia capaz de inducir respuesta
inmune al ser introducido a un individuo inmunocompetente. Estas sustancias
deben reunir ciertos requisitos para actuar como tales, entre estas caractersticas
se pueden mencionar:
- Ser reconocidas como extraas por el animal inmunizado,
- Su peso molecular, que generalmente es mayor a 10 kDa,
- De naturaleza qumica proteica o polisacrida,
- La rigidez estructural,
- La complejidad molecular,
- El volumen molecular,
- El contenido de grupos cargados y configuracin
- Su difusibilidad
El concepto antgeno designa nicamente a aquella sustancia que reacciona con
sus anticuerpos especficos.
Existen ciertas sustancias llamadas haptenos, que no renen todas las
condiciones de inmunogenicidad, que por s solas no inducen la respuesta
inmune, pero si lo hacen cuando son conjugadas a una protena acarreadora
(complejo haptnico).
La respuesta inmune de un animal a un inmungeno puede ser un fenmeno
totalmente natural, como sucede en el caso de infecciones causadas por
microorganismos, en estados de hipersensibilidad a distintos elementos del medio
ambiente, en las enfermedades autoinmunes o en aquellas ocasiones en que son
generadas para rechazar a una neoplasia.
Pero tambin la respuesta inmune puede ser inducida artificialmente en un
individuo mediante la aplicacin del inmungeno, como sucede en las
vacunaciones, en la hipersensibilidad a frmacos, en transplantes o a nivel
laboratorio en animales de experimentacin con diferentes fines tanto de
investigacin como de produccin de sueros inmunes.
En muchos de estos casos se requiere contar con los inmungenos preparados
adecuadamente y un esquema de inmunizacin ideal para lograr inducir la
respuesta inmune.

Entre los inmungenos y antgenos de mayor inters estn:

Bacterias
Virus
Hongos
Parsitos
Protenas u otros componentes purificados a partir de estos organismos como
las toxinas (toxoides).
Sueros heterlogos
Protenas animales heterlogas purificadas
Extractos vegetales
Protenas vegetales purificadas.
Clulas animales o vegetales
Componentes de clulas animales o vegetales purificadas
Complejos haptnicos
Las aplicaciones que tiene el conocimiento de la preparacin de estos productos
biolgicos es muy variada, de las cuales podemos mencionar:
Como antgenos:
Antgenos de bacterias, hongos, parsitos y virus para la determinacin de
anticuerpos en suero, lquido cefalorraqudeo, etc.; para el diagnstico de
enfermedades causadas por estos organismos.
Para el estudio de la composicin antignica de microorganismos.
En la investigacin de reacciones cruzadas entre individuos de diferente
especie.
En la determinacin de estructura, localizacin de determinantes antignicos
(eptopos), etc.
Como inmungenos:
Produccin de vacunas, ya sea constituidas por microorganismos completos o
por fracciones de estos, tanto para uso humano o veterinario.
Obtencin de sueros inmunes para uso diagnstico.
Preparacin de sueros inmunes para uso teraputico.
Produccin de sueros inmunes utilizados en control de alimentos y bebidas.
Obtencin de sueros inmunes de uso en Qumica Legal.
En investigacin para el estudio de la respuesta inmune
El objetivo de esta unidad es que el alumno vea ejemplificada la preparacin de
antgenos e inmungenos de diferente naturaleza.

I.

EXTRACTO DE TEJIDO MUSCULAR O PROTEINAS PLASMTICAS DE

ORIGEN HUMANO, EQUINO, BOVINO, PORCINO, DE POLLO, DE
PERRO, ETC.

MARCO TERICO
Los extractos de tejidos o las protenas plasmticas de animales son excelentes
inmungenos cuando son inyectados en otro individuo taxonmicamente alejado,
por lo que son utilizados en la inmunizacin de animales de laboratorio para
obtener sueros inmunes denominados antiespecie que pueden ser aplicados en
el campo del control de alimentos para determinar de que especie proceden las
carnes y sus derivados, en Qumica Forense para establecer el origen de una
mancha de sangre, en diagnstico para el anlisis de protenas o bien en las
pruebas de identidad de sueros de uso teraputico.
En el presente ejercicio se van a preparar extractos de tejido muscular o bien
suero, estriles que posteriormente sern utilizados en la inmunizacin de conejos
para obtener el correspondiente suero antiespecie.
I.1.1 PREPARACIN DE UN EXTRACTO DE TEJIDO
MATERIAL
1
Embudo de 6 cm de dimetro con tres capas de gasa.
2
Pipetas de 10 mL (1/10)
1
Disco de papel filtro de poro grueso (10 cm dim.)
1
Tijeras de punta recta.
1
Matraz Erlenmeyer de 125 mL.
1
Bistur.
1
Balanza granataria.
1
Licuadora con vaso de 250-500 mL.
40 g
60 mL

Tejido muscular de equino, pollo, perro, bovino, etc.

Solucin salina isotnica (SSI).

TCNICA
1.
Eliminar toda la grasa y aponeurosis del trozo de tejido muscular y cortarlo
en fragmentos de 0.5 a 1.0 cm.
2.
Pesar el tejido y pasarlo al vaso de la licuadora. Agregar SSI a tener una
proporcin de 1:2 (p/v) y triturar hasta que el tejido est perfectamente
homogeneizado.
3.
Pasar el tejido triturado al matraz Erlenmeyer y dejarlo en refrigeracin
durante toda la noche para extraer la mayor cantidad de protenas.
4.
Filtrar a travs de tres capas de gasa para eliminar las partculas gruesas
y en seguida por papel de poro grueso.
5.
Determinar la concentracin de protenas por el mtodo de Biuret.
6.
Esterilizar por filtracin. (Ver I.2, pag. 4).

I.1.2 PREPARACIN DE UN SUERO HETERLOGO

MATERIAL
1
Jeringa de 20 mL estril.
1
Aguja hipodrmica del No. 17 de 3 estril.
1
Aplicador de madera
2
Tubos de centrfuga de 50 mL de plstico.
1
Matraz Erlenmeyer de 100 mL.
1
Pipeta de 10 mL (1/10) con bulbo (propipeta).
40 mL
60 mL

Sangre de humano, equino, bovino, porcino, etc.

Solucin salina isotnica (SSI).

TCNICA
1.
Tomar por puncin venosa 40 mL de sangre ya sea de perro, caballo,
burro, cerdo, etc. y colocar 20 mL en cada uno de los tubos de centrfuga.
2.
Dejar coagular la sangre y con un aplicador de madera separar el cogulo
de las paredes del tubo. Centrifugar 30 minutos a 3000 r.p.m.
3.
Mediante la pipeta con bulbo, separar cuidadosamente el sobrenadante y
pasarlo al matraz Erlenmeyer.
4.
Determinar la concentracin de protenas por el mtodo de Biuret.
5.
Esterilizar por filtracin. (Ver I.2, pag. 7).
NOTA: Si en lugar de suero se utiliza plasma, es necesario coagularlo con
CaCl2 como se describe en el anexo I.A, para evitar la formacin de redes
de fibrina que interfieran durante la filtracin.
I.2

ESTERILIZACIN DEL EXTRACTO DE TEJIDO O DEL SUERO

MATERIAL
1
Equipo para filtracin estril. Constituido por: Filtro Seitz, matraz Kitasato
de 500 mL, manguera para vaco de 50 cm, material filtrante EKS-1 y
manguera de ltex de 10 cm.
2
Tubos de 16 x 150 mm con tioglicolato fluido.
2
Tubos de 16 x 150 mm con agar Sabouraud inclinados.
2
Pipetas de 10 mL (1/10) estriles.
2
Pipetas de 1.0 mL (1/10) estriles.
2
Frascos tipo vial de 10 mL con tapn estriles.
2
Mecheros
9 mL

Solucin salina isotnica (SSI) estril.

TCNICA
1.
Esterilizar el extracto de tejido o el suero por filtracin en filtro Seitz,
aplicando vaco ligero para que no se forme espuma.
2.
En condiciones de esterilidad, pasar 1.0 mL del filtrado a uno de los
frascos vial y el resto en el segundo frasco.

3.
4.

5.

Adicionar al primer frasco 9.0 mL de SSI estril y mezclar (dilucin 1:10).

Realizar la prueba de esterilidad mictica y bacteriana a cada producto
sembrando 0.1 mL en los tubos de tioglicolato y Sabouraud, incubando los
primeros a 32-35C, 48 h y los segundos a temperatura ambiente por lo
menos una semana.
Etiquetar y guardar el extracto o suero diluido y el concentrado en
refrigeracin hasta su empleo. Desechar cuando se observe turbidez, ya
que esto indica que hay desarrollo de contaminantes bacterianos.

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso

seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

II.

PREPARACIN DE PROTEINAS PURIFICADAS

ALBMINA SRICA HUMANA GLOBULINA HUMANA

MARCO TERICO
La mayora de las protenas animales y vegetales cumplen con los requisitos de
inmunogenicidad y por tanto se pueden utilizar como inmungenos en su forma
nativa, pero si se desea tener mayor especificidad en la respuesta inmunolgica,
es necesario purificarlas.
Los mtodos de purificacin dependen de las propiedades fisicoqumicas de cada
una de las protenas tales como su solubilidad, peso molecular, tamao, carga
elctrica, pI, etc., en la siguiente tabla se ejemplifican algunos de ellos:
BASADOS EN:
Diferencias de solubilidad:

Diferencias en carga
elctrica:
Diferencias en PM y
tamao:

MTODO
Precipitacin con sales neutras
Precipitacin con metales pesados
Precipitacin con solventes orgnicos
Precipitacin con cidos o bases (pI)
Electroforesis
Cromatografa de intercambio inico
Permeacin molecular
Ultracentrifugacin en gradiente

Estas prcticas se llevarn a cabo a partir de protenas purificadas comerciales y

el ejercicio consistir en la preparacin de soluciones estriles de stas con la
concentracin necesaria para la inmunizacin de conejos, para obtener los
correspondientes anticuerpos.
MATERIAL
2
Tubos de 16 X 150 estriles
2
Pipetas de 10 mL (1/10) estriles
4
Pipetas de 1 mL (1/10) estriles
2
Frascos tipo vial de 12 mL c/tapn estriles
2
Tubos de 16 x 150 mm con tioglicolato fluido.
2
Tubos de 16 x 150 mm con agar Sabouraud inclinados.
0.3 mL
25 mL

Albmina srica humana (ASH) comercial de 25% globulina humana

al 1% estriles.
Solucin salina isotnica (SSI) estril

TCNICA
TODO EL PROCESO SE REALIZA EN CONDICIONES DE ESTERILIDAD
1.
A partir de una solucin comercial estril de albmina srica humana
(ASH) de globulina humana purificadas cuya concentracin es de 25

2.
3.

4.

g/100 mL 1 g/100 mL preparar dos diluciones con solucin salina

isotnica estril:
Para ASH:
1:50 para tener una concentracin de 5 mg/mL
1:250 para tener una concentracin de 1 mg/mL
Para globulina humana:
1:2 para tener una concentracin de 5 mg/mL
1:10 para tener una concentracin de 1 mg/mL
Determinar la concentracin de protenas por el mtodo de Biuret.
Realizar la prueba de esterilidad mictica y bacteriana sembrando 0.1
mL en los tubos de tioglicolato y Sabouraud, incubando los primeros a 3235C, 48 h y los segundos a temperatura ambiente por lo menos una
semana.
Etiquetar y guardar en refrigeracin hasta su empleo. Desechar cuando se
observe turbidez, ya que esto indica que hay desarrollo de contaminantes
bacterianos.

III.

PREPARACIN DE ANTGENOS E INMUNGENOS CELULARES

GLBULOS ROJOS DE CARNERO

MARCO TERICO
Las clulas de origen animal o vegetal constituyen verdaderos mosaicos
antignicos debido a la compleja composicin de sus organelos.
La preparacin de antgenos e inmungenos celulares tiene varias aplicaciones,
entre las que se puede mencionar la produccin de anticuerpos especficos
usados como reactivos para la identificacin de alguna poblacin especfica de
clulas como en el caso de la tipificacin sangunea y la determinacin de
molculas de histocompatibilidad HLA (antgenos de los leucocitos humanos),
pero tambin se han utilizado para la investigacin de marcadores y receptores
celulares. Para estas aplicaciones, la elaboracin de anticuerpos monoclonales ha
cobrado mayor importancia.
En esta seccin se ejemplifica la preparacin de antgenos celulares con la
obtencin de eritrocitos de carnero lavados para su utilizacin inmediata en la
inmunizacin de conejos para as obtener el correspondiente suero inmune.
MATERIAL
1
Jeringa de 10 mL con aguja No. 20 estril
2
Tubos de centrfuga cnicos de 15 mL c/tapn estriles
1
Pipeta de 1 mL (1/10) estril
1
Pipeta de 5 mL (1/10) estril
2
Pipeta de 10 mL (1/10) estril
1
Equipo de succin constituido por: Matraz Kitasato de 500 mL adaptado
con tapn de hule No. 6 monohoradado, tubo de vidrio de 12 cm y 2
tramos de manguera para vaco de 30 cm.
1
Bulbo para pipeta
1
Frasco tipo vial de 10 mL con tapn estriles
2
Mecheros
Centrfuga con cabezal para tubos de 15 mL
3 mL
Solucin de Alsever estril
100 mL Solucin salina isotnica (SSI) estril
TCNICA

TODO EL PROCESO SE REALIZA EN CONDICIONES DE ESTERILIDAD

1.
2.

3.

Llenar la jeringa con 3 mL de la solucin de Alsever estril y puncionar la

vena yugular de un carnero y tomar 3 mL de sangre.
Quitar la aguja de la jeringa y vaciar la mezcla sangre-Alsever a un tubo
de centrfuga cnico de 15 mL estril dejndola resbalar por las paredes.
Tapar el tubo.
Centrifugar durante 15 min a 2500 rpm.

4.
5.

6.
7.
8.

Eliminar el sobrenadante utilizando el equipo de succin y la pipeta de 10

mL estril.
Lavar el paquete de eritrocitos 5 veces de la siguiente manera: Agregar 10
mL de SSI estril, resuspender los glbulos rojos perfectamente con una
pipeta estril adaptada con un bulbo. Tapar y centrifugar 10 min a 2500
rpm. Eliminar completamente el sobrenadante mediante el equipo de
succin.
Al trmino de los lavados, tomar 1.5 mL de paquete de eritrocitos con una
pipeta estril y pasarlos al frasco vial estril.
Agregar 13.5 mL de SSI estril para tener una suspensin al 10%, que es
como se va a utilizar para la inmunizacin del conejo. Tapar el frasco.
Esta suspensin deber conservarse en refrigeracin, entre 4 y 6 C hasta
el momento de emplearse y solo puede usarse durante 4 das, ya que el
envejecimiento desnaturaliza a los antgenos presentes en los eritrocitos.

IV.

PREPARACIN DE ANTGENOS E INMUNGENOS BACTERIANOS

Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Brucella abortus, Salmonella
9,12,d,Vi (serotipo Typhi).

MARCO TERICO
Las bacterias estn constituidas por un gran nmero de fracciones antignicas
diferentes, de aqu que se pueda utilizar como antgenos o inmungenos tanto las
clulas ntegras o sus fracciones aisladas; ya sea componentes somticos,
flagelares o capsulares, dependiendo del tipo de bacterias. Otras veces se
utilizan los productos del metabolismo de estos microorganismos como son las
toxinas.
No todas las bacterias tienen una estructura antignica similar. En algunas hay
predominio de componentes proteicos, en otras los carbohidratos constituyen los
Ag que permiten su diferenciacin; y en algunos casos particulares son
fosfoglucolpidos complejos.
Para ejemplificar la complejidad del mosaico antignico de las bacterias se
mencionarn las caractersticas de los principales antgenos de las
enterobacterias:
Antgenos somticos u O: Son lipopolisacridos que se encuentran formando
parte de la pared celular bacteriana, resisten temperaturas de 100C por tiempos
prolongados y no se destruyen con alcohol, ni con cidos diluidos. Corresponden a
la endotoxina de muchas enterobacterias entre ellas Salmonella y su especificidad
antignica reside en la parte oligosacrida.
Antgenos flagelares o H: Son componentes de naturaleza proteica localizados
en los flagelos de las bacterias, lbiles a temperaturas mayores de 60C y al
tratamiento con alcohol o cido.
Antgeno de virulencia o Vi: Es tambin superficial, de naturaleza glucolipdica
y difiere qumicamente del antgeno somtico O, se encuentra en algunas
especies del gnero Salmonella y en otras enterobacterias, es termolbil.
Antgenos capsulares o K: Se encuentran en las envolturas o cpsulas de
algunas bacterias, generalmente de naturaleza polisacrida que tienen secuencias
repetidas de dos o tres azcares, son termorresistentes.
Dentro de las aplicaciones ms importantes de los antgenos bacterianos est la
determinacin cuali y semicuantitativa de anticuerpos en muestras de suero
humano en el diagnstico de infecciones bacterianas y la titulacin de sueros
hiperinmunes de animales inmunizados, mediante reacciones antgeno-anticuerpo.
Como inmungenos, estas preparaciones son utilizadas en la formulacin de
vacunas tanto de uso humano como veterinario, as como en la inoculacin de

animales de laboratorio para la obtencin de sueros inmunes cuya aplicacin es

amplia en la identificacin de bacterias, tanto en muestras biolgicas de origen
humano para diagnstico, como en el control microbiolgico de alimentos y
productos farmacuticos.
Durante la preparacin de antgenos bacterianos es importante conocer el
fenmeno llamado variacin antignica el cual implica la prdida de antgenos o
cambios en la especificidad debido a envejecimiento del cultivo, infeccin por
bacterifagos o a otros factores que son lesivos para las bacterias.
Adems, cuando se trabaja con bacterias y en general con microorganismos se
debe tener en cuenta que existe antigenicidad cruzada entre especies diferentes,
hecho que cobra importancia cuando se hace tipificacin bacteriana o cuando se
obtienen sueros antibacterianos que obliga a someterlos a procesos de
purificacin para aumentar su especificidad.
Brevemente, los procedimientos ms relevantes para la obtencin de estos
preparados bacterianos involucran:
Contar con una cepa pura de la bacteria, propagarla en medios de cultivo
adecuados, que permitan la expresin de los componentes antignicos de inters,
atenuarla (disminucin de la virulencia) o inactivarla (perdida de viabilidad) segn
sea el caso, mediante mtodos que eviten la desnaturalizacin de los
componentes antignicos y, finalmente ajustar a una concentracin determinada,
que est en relacin a su uso.
La atenuacin de las bacterias puede llevarse a cabo mediante resiembras
sucesivas en condiciones poco favorables, aislamiento de los microorganismos de
casos de infecciones leves, etc.; mientras que para la inactivacin se cuenta con
mtodos fsicos (exposicin al calor), qumicos (tratamiento con formol o timerosal)
o combinaciones de estos; en el caso de las toxinas, son convertidas a toxoides
(pierden toxicidad pero no su composicin antignica tratndolas con
formaldehdo).
Durante la produccin de un antgeno o inmungeno bacteriano se deben llevar a
cabo una serie de controles que son ms o menos rigurosos segn sea el destino
del biolgico preparado, as una vacuna (principalmente de uso humano) requiere
de un mayor nmero y ms estrictas pruebas de control, muchas de ellas
reglamentadas o bien definidas en las farmacopeas.
Estas pruebas de control pueden ser biolgicas en donde se incluye: identidad,
pureza, inactivacin, toxicidad, atoxicidad, esterilidad bacteriana y mictica,
inocuidad, potencia, etc.; o bien qumicas como: pH, determinacin de
adyuvantes y conservadores, protenas totales, cloruros, slidos totales, humedad
residual, solubilidad, etc.

En los siguientes ejercicios se describe la preparacin de inmungenos a partir de

cepas de, E. coli, Sh. dysenteriae, B. abortus y S. typhi que sern utilizados en
la inoculacin de conejos para la obtencin de sueros inmunes antibacterianos.
E. coli: Tiene Ag O que han servido para identificar ms de 150 serotipos,
adems presenta Ag K que de acuerdo con su termorresistencia han sido
clasificados en: Ag A (estables a ms de 120C), Ag B (a 100C pierden su
inmunogenicidad pero no su antigenicidad) y Ag L (son destruidos a 100 C).
Sh. dysenteriae: No presenta flagelos, por lo tanto no tiene antgenos H, sin
embargo sus antgenos somticos O tienen un alto poder antignico y en base a
ellos se han descrito varios serotipos de los 4 grupos de Shigella.
Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi): Inicialmente el gnero Salmonella fue
clasificado por Kauffman-White en 5 grupos en base a sus antgenos somticos
O, que difieren qumicamente en cuanto a su composicin de azcares,
presencia de grupos acetilo sustituidos y enlaces glicosdicos alfa y beta.
Actualmente esta clasificacin se ha completado y se describen 9 grupos
denominados A, B, C, D, E, F ,G, H e I en donde se encuentran incluidos ms de
1020 serotipos diferentes. Adems, algunas cepas de Salmonella son mviles y
presentan flagelos y en base a sus antgenos flagelares o H se puede hacer una
clasificacin ms precisa de estos microorganismos.
B. abortus: Las seis especies del gnero Brucella son antignicamente similares,
siendo su lipopolisacrido y sus protenas de membrana externa (PME) los
antgenos ms importantes. Las PME estn clasificadas en tres grupos,
considerndose a las del grupo II como porinas.

IV.1 PROPAGACIN DE LAS CEPAS

CEPAS:
B. abortus
E. coli
Sh. dysenteriae
Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi)
Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) de gran movilidad para obtencin
de Ag H

MEDIOS DE CULTIVO:
1
Medio para el desarrollo de la cepa: Tubo de 16 x 150 mm con 7 mL de
medio.
1
Medio de propagacin: matraz Erlenmeyer de 1000 mL conteniendo 350
mL de medio.
CEPA

B. abortus
E. coli
Sh. dysenteriae
Salmonella 9,12,d,Vi
(serotipo Typhi) Ag O
Salmonella 9,12,d,Vi
(serotipo Typhi) Ag H

MEDIO PARA EL
DESARROLLO DE LA
CEPA
Caldo triptosa

MEDIO DE
PROPAGACION
Agar triptosa

Agar BHI inclinado

Agar BHI inclinado
Veal-infusion

Agar BHI
Agar BHI
Agar Veal-infusion

Veal-infusion

Veal-infusion

MATERIAL
1
Asa bacteriolgica
2
Mecheros
1
Juego de colorantes para Gram.
2
Portaobjetos.
Microscopio.
15 mL Solucin salina isotnica (SSI) estril (Exclusivo para E. coli y Sh.
dysenteriae).
500 mL Solucin salina isotnica (SSI) formolada al 0.6% estril. (Exclusivo para
Ag H de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi)).
TCNICA
IV.1.1 ANTIGENOS OK-L DE Escherichia coli.
IV.1.2 ANTIGENOS DE Shigella dysenteriae.
1.

Sembrar el tubo del medio para desarrollo de la cepa con un cultivo puro
de E. coli o de Sh. dysenteriae e incubar 24-48 h a 37C.

2.

3.

4.

5.
6.
7.

Con la pipeta adaptada con un bulbo de hule agregar 8 mL de SSI estril

al cultivo anterior y levantar el desarrollo, expeliendo y absorbiendo varias
veces.
Verificar la pureza del cultivo mediante tincin de Gram. Debe observarse
slo bacilos Gram negativos. Si la prueba es satisfactoria continuar con el
paso No.4, de lo contrario desechar el cultivo.
Pasar la suspensin bacteriana al matraz que contiene el medio de
propagacin, extender el inculo por toda la superficie e incubar el
matraz 18-24 horas a 37C.
Adicionar 15 mL de SSI estril y desprender todo el desarrollo bacteriano
dando al matraz movimientos de rotacin suaves.
Comprobar la pureza del cultivo realizando una tincin de Gram.
Si hay algn tipo de contaminante desechar el cultivo y si la prueba es
satisfactoria continuar con el paso No. 1a. del PROCEDIMIENTO COMN
PARA LA PREPARACIN DE ANTGENOS BACTERIANOS, (IV.2, pag.
18).

IV.1.3 ANTGENOS TOTALES DE B. abortus.

IV.1.4 ANTGENO SOMATICO (O) DE Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi).
IV.1.5 ANTIGENO FLAGELAR (H) DE Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi).
1.

2.

3.

4.

5.

Sembrar el tubo del medio para desarrollo de la cepa con un inculo

abundante de la cepa de B. abortus o Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo
Typhi) e incubar 24-48 h 18-24 h, respectivamente a 37C.
Verificar la pureza del cultivo mediante una tincin de Gram. Debern
observarse nicamente cocos Gram negativos en el caso de Brucella y
bacilos Gram negativos en el caso de Salmonella. Si hay algn tipo de
contaminante desechar la cepa y si la prueba es satisfactoria continuar
con el paso No. 3.
Pasar 8-10 mL del cultivo al matraz del medio de propagacin, extender
el inculo en toda la superficie en el caso de tratarse de medio slido, o
agitar el matraz para incorporar perfectamente si el medio es lquido.
Incubar el matraz 18-24 h a 37C.
Comprobar la pureza del cultivo realizando una tincin de Gram. Para los
cultivos en medio slido primero adicionar 15 mL de SSI estril y
desprender todo el desarrollo bacteriano dando al matraz movimientos de
rotacin suaves.
Si hay algn tipo de contaminante desechar el cultivo y si la prueba es
satisfactoria continuar en el caso de B. abortus y Ag O de Salmonella
9,12,d,Vi (serotipo Typhi) desde el paso No. 1a. del PROCEDIMIENTO
COMN PARA LA PREPARACIN DE ANTGENOS BACTERIANOS,
(IV.2, pag. 18) y para el Ag H de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi)
a partir del paso 1b.

IV.2 PROCEDIMIENTO COMUN PARA TODOS LOS ANTIGENOS

BACTERIANOS.
MEDIOS DE CULTIVO:
1
Medios para prueba de esterilidad bacteriana: Tubos de 16 x 150 mm
con 12 mL de tioglicolato fluido.
1
Medios para prueba de esterilidad mictica: Tubos de 16 x 150 mm con
7 mL de agar Sabouraud inclinados.
1
Medios para prueba de viabilidad: Tubos de 16 x 150 mm con 7 mL de
medio.

ANTIGENO
B. abortus
E. coli
Sh. dysenteriae
Salmonella 9,12,d,Vi
(serotipo Typhi) Ag O
Salmonella 9,12,d,Vi
(serotipo Typhi) Ag H

MEDIO PARA PRUEBA DE

VIABILIDAD
Agar triptosa inclinado
Agar BHI inclinado
Agar BHI inclinado
Agar Veal-infusion inclinado
Agar Veal-infusion inclinado

MATERIAL
1
Equipo de succin estril. Constituido por: Frasco de centrfuga de 250
mL, tapn del No. 6 bihoradado, tubo de vidrio de 10 cm con filtro de
gasa, tubo de vidrio de 12 cm en ngulo de 90 con trampa de aire, tubo
de vidrio de 35 cm con un extremo angosto, tres perlas de vidrio y tramo
de manguera para vaco de 50 cm.
2
Frascos tipo vial de 50 mL con tapn estriles.
2
Pipetas de 1 mL (1/10) estriles.
3
Pipetas de 10 mL (1/10) estriles.
1
Bulbo de hule para pipetas de 10 mL (propipeta).
1
Tapn de hule del No. 6 estril.
1
Asa bacteriolgica.
2
Mecheros.
1
Juego de colorantes para Gram.
1
Termmetro de 0 a 100C.
1
Charola de peltre para desechar material contaminado.
4
Portaobjetos.
Microscopio.
Centrfuga con cabezal para frascos de 250 mL.
Nefelmetro Klett Summerson con filtro verde y celdas.
Incubadora a 37 C.

Bao de agua de temperatura controlada.

25 mL Solucin salina isotnica (SSI) estril.
100 mL SSI fenolada o SSI formolada: Es SSI estril, adicionada de fenol al 0.5%
de formol al 0.3%.
TCNICA
1a.
Antgenos de E. coli, Sh. dysenteriae, B. abortus y Ag O de
Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi):
Cosecha: Por medio del equipo de succin y empleando un vaco leve
extraer la suspensin bacteriana.
Sustituir el sistema de succin por un tapn de hule sin horadar y proceder
a llevar a cabo la inactivacin.
Inactivacin: Colocar el frasco de centrfuga en el bao de agua a: 5556C, 2 h para B. abortus, E. coli y Sh. dysenteriae y bao de agua
hirviente, 2.5 h para el antgeno O de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo
Typhi); agitando de vez en cuando.
Prueba de viabilidad: Sembrar 0.2 mL de la suspensin calentada en el
medio de cultivo indicado para cada bacteria, extendiendo el inculo
perfectamente en toda la superficie e incubar a 37C, 48-72 h. Al cabo de
este tiempo no debe haber desarrollo de colonias, en caso contrario
deber hacerse un tincin de Gram y observar si no se trata de
contaminacin y si no es as , calentar por 1 hora ms ya que los
microorganismos estn todava vivos. Despus del segundo calentamiento
repetir la prueba de viabilidad.
Continuar con el paso No. 2.
1b.

Antgeno H de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi):

Inactivacin: Adicionar un volumen igual al que ocupa el cultivo de SSI
formolada al 0.6% y dejar a temperatura ambiente durante varios das.
Prueba de viabilidad: Para el 4 5 da probar si ya se destruy la
viabilidad de los microorganismos, sembrando 0.2 mL de la suspensin
perfectamente agitada en un tubo con agar Veal-infusion inclinado,
extendiendo el inculo perfectamente en toda la superficie del medio e
incubar a 37C, 24-48 h. Si todava hay crecimiento deber hacerse un
tincin de Gram y observar si no se trata de contaminacin, y si no es as,
se dejar transcurrir 3 a 4 das ms y se repite la prueba de viabilidad. La
prueba es satisfactoria cuando ya no se obtiene desarrollo.
Cosecha: dejar reposar la mezcla de un da para otro y evitando que se
resuspenda, eliminar la mayor cantidad posible de sobrenadante utilizando
un sifn estril y decantar el sedimento a 1 2 frascos de centrfuga de
250 mL, estriles.

2.

3.

4.

Centrifugar la suspensin 30 min a 3000 r.p.m., eliminar el sobrenadante y

resuspender el paquete celular en aproximadamente. 20-25 mL de SSI
fenolada al 0.5% estril (para B. abortus, E. coli y Sh. dysenteriae) SSI
formolada al 0.3% estril (para los antgenos O y H de Salmonella
9,12,d,Vi (serotipo Typhi)).
Preparar una dilucin 1:10 de la suspensin directamente en la celda del
nefelmetro y determinar las unidades Klett en el aparato, leyendo contra
SSI fenolada o formolada como blanco. Tomando en cuenta el factor de
dilucin e interpolando en la curva de Mc Farland (ver anexo I.C)
determinar la concentracin de bacterias/mL. La lectura tambin se puede
realizar en un colormetro, leyendo a 540 nm, en donde 0.3 unidades de
absorbancia equivalen a 1 X 109 microorganismos/mL.
Ajustar la concentracin de una alcuota de la suspensin a 109
microorganismos/mL adicionando la cantidad necesaria de SSI fenolada o
formolada, para obtener el volumen suficiente para realizar el esquema de
inmunizacin (15 mL aprox.). Aplicar la siguiente frmula:
Concentracin que se tiene - 1 = Volumen de diluyente que se debe agregar
Concentracin que se desea
por cada mL de la suspensin concentrada

5.
6.

Envasar en frascos vial tanto la suspensin concentrada como la diluida

y rotular adecuadamente.
Realizar la prueba de esterilidad mictica y bacteriana a cada producto
sembrando 0.1 mL de las suspensiones en los tubos de tioglicolato y
Sabouraud, incubando los primeros a 32-35C, 48 h y los segundos a
temperatura ambiente por lo menos una semana. Si el resultado de la
prueba es satisfactorio, las suspensiones se conservan en refrigeracin
hasta su uso.