R.

Jover

Integracin bioqumica y bioqumica clnica. Tema 7

Tema 7. Epigentica: modificaciones de la estructura de la cromatina y de la expresin gnica.

En el siglo XXI, la definicin ms comn del trmino epigentica es el estudio de cambios heredables en la funcin gnica que se producen sin un cambio en la secuencia del ADN Existen cerca de 2 metros de ADN en el interior de un ncleo de unas pocas micras. Estamos intentando entender los mecanismos que permiten el acceso al ADN dado el minsculo volumen del ncleo. Gunter Reuter (Alemania) Recurriendo a un smil informtico, el disco duro es como el ADN, y los programas de software son como el epigenoma. Es posible acceder a cierta informacin del disco duro con la utilizacin de los programas del ordenador. Pero existen ciertas reas protegidas por contraseas y otras no (abiertas). Jrn Walter (Alemania) Una de las diferencias entre la expresin gnica en humanos y en la mayora de organismos procariticos es la activacin e inactivacin especfica de algunos genes en las clulas diferenciadas.

1. Nucleosomas, Cromatina y Cromosomas

La condensacin del ADN puede ser resumido en los siguientes puntos: 1. El nucleosoma consta de: una parte central o ncleo (core en ingls) y una regin de enlace o de unin (linker en ingls) que mantiene unidos a los nucleosomas adyacentes. 2. El core o partcula central se compone de 147 bp de DNA enrollado alrededor de un octmero de protenas formado por dos copias de cada una de las histonas H3, H4, H2A y H2B. 3. Los nucleosomas estn unidos por un DNA de enlace que vara de 10 a 90 bp dependiendo de la especie y tejido considerado. En esta regin se une la histona de enlace H1. 4. Los nucleosomas se encuentran separados de manera regular a lo largo del genoma, produciendo una fibra de cromatina de 10-11 nm de dimetro que presenta la forma de un collar de cuentas. 5. La cromatina se condensa an ms enrollndose en una fibra de 30 nm en forma de solenoide con unos seis nucleosomas por vuelta. En la imagen vemos un corte transversal con el que observamos como se distribuyen los nucleosomas. 6. La fibra de 30 nm puede formar bucles de DNA, cada uno conteniendo aproximadamente 60.000 pb, los cuales estn fijados al andamio cromosmico (matriz nuclear) durante la interfase. Existe una regulacin del metabolismo dependiente de la epigentica: el control de la expresin gentica por la modificacin de la estructura de la cromatina. El estudio de estos cambios en las funciones de los genes no se producen por el cambio de la secuencia gentica sino por el grado de empaquetamiento de la cadena. Una persona puede tener la misma secuencia, sin mutaciones ni ninguna modificacin, y tener diversas diferencias como podra ser los niveles de una determinada protena. No tienen por que ser iguales aunque la informacin sea la misma.

R. Jover

Integracin bioqumica y bioqumica clnica. Tema 7

2. Cromatina y cromosomas
Para formar los cromosomas en metafase hay procesos adicionales de compactacin, hasta una compactacin un factor de 10.000 veces mayor. Los genes individuales siempre terminan localizados en los mismos sitios. Durante la profase se produce un plegamiento adicional de la fibra de 30nm en dominios, en forma de bucle para formar una fibra de 300nm. Los bucles se adhieren a un andamio de protenas distintas de las histonas. Los bucles de solenoides de la interfase se vuelven a enrollar para dar lugar a supersolenoides con un dimetro de 700 nm que constituyen las fibras de los cromosomas metafsicos. Finalmente se confeccionan los cromosomas en metafase con un tamao de 1400nm. La cromatina se pliega an ms y origina el cromosoma con compactacin mxima que se observa en la metafase. Cada uno consta de dos cromtides.

R. Jover

Integracin bioqumica y bioqumica clnica. Tema 7

3. Histonas del ncleo o core

Las clulas eucariotas contienen cinco histonas abundantes: H1, H2A, H2B, H3 y H4. Las histonas H2A, H2B, H3 y H4 son las histonas centrales y forman el ncleo de protenas alrededor del cual se enrosca el DNA nuclesmico. La histona H1 no es parte de la partcula nucleosmica central, sino que se une al DNA. Las histonas H1 son protenas ms grandes (20kd) de carcter ms bsico y ms especficas de especie y tejido. Caractersticas de las histonas H2A, H2B, H3 y H4: 1. Las histonas son protenas bsicas, debido a su alto contenido en arginina y lisina (+). Tienen un contenido elevado en aminocidos de carga positiva. 2. Estn muy conservadas evolutivamente. 3. Son protenas pequeas (11- 15 Kda). 4. Una regin conservada que est en toda histona central es el dominio de pliegue histnico. Est formado por tres regiones helicoidales alfa separadas por dos asas cortas no estructuradas. El pliegue media la formacin de heterodmeros cabeza-concola de pares de histonas especficos.

5. Presentan colas N-terminales. Las colas N-t de las histonas son blanco de modificaciones posttraduccionales.

Las histonas se diversifican an ms mediante algunas modificaciones post-translacionales de algunos aminocidos, como reacciones de acetilacin, fosforilacin, ADP-ribosilacin o metilacin.

R. Jover

Integracin bioqumica y bioqumica clnica. Tema 7 Las colas N-t de las histonas son blanco de modificaciones post-traduccionales

Las acetilaciones, fosforilaciones y metilaciones de aminocidos de las colas N-t influyen en la compactacin de la cromatina y en la expresin (transcripcin) de los genes eucariotas

4. Nucleosomas
Estructuras Acetilacin en forma dede disco compuestas por dos unidades de Lisinas en Histonas Descompactacin de la cromatina cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4 y una cadena de ADN 5 16 20 8 12 Ac or Me de 146 pares de bases que se enrollan alrededor de Ac Ac Ac Ac este octmero de histonas. En contacto con elAc-S-G-R-Gsurco+menor del ADN. K -G-GK -G-L-GK -G-G-A-K-R-H-R-K-V-L-R-DH4 N-terminal + + + + + + + + + Los nucleosomas incorporan una molcula de histona H1 que 27 4 9 23 interacciona con ambos extremos del ADN a la entrada y 14 a la 18 Ac or Me Me Ac Ac Ac Ac salida del nucleosoma paraH3 formar el cromatosoma. N-terminal A-R-T- K-Q-T-A-R-K-S-T-G-G-K-A-P-R-K-Q-L-A-T-K-A-A-R-K-S-A-P+ + + + + + + El armado de un nucleosoma se inicia con la formacin de+ un + tetrmero H3-H4 que se unir al DNA bicatenario. Este tetrmero La fuerza de unin recluta dos copias del dmero de las histonas al H2A-H2B para completar el armado del nucleosoma. DNA se puede
modular mediante la acetilacin de las lisinas (K) en los extremos N-t de las histonas

5. Modificacin histnica
Las modificaciones histnicas alteran la funcin del nucleosoma. La acetilacin y la fosforilacn actan para reducir la carga positiva general de las colas histnicas. Esta prdida de carga positiva reduce la afinidad de las colas por la columna de nucletidos de DNA.

5.1 Acetilacin y desacetilacin

En la acetilacin de histonas los grupos acetilo se adhieren a las lisinas cargadas positivamente en las colas de histona; la desacetilacin es la eliminacin de los grupos acetilo. Cuando se acetilan las colas de histona de un nucleosoma se neutralizan sus cargas positivas y no pueden unirse a los nucleosomas vecinos. La acetilacin de las colas de histonas promueve la relajacin de la estructura proteica. Cuando los cromosomas se encuentran muy acetilados el ADN se hace accesible para la transcripcin.

R. Jover

Integracin bioqumica y bioqumica clnica. Tema 7

Las histonas que constituyen el octmero tienen numerosos residuos de lisina, que gracias a su cadena lateral cargada positivamente pueden interaccionar con las cargas negativas de las uniones fisfodister del DNA. La modificacin de estas remplaza la carga positiva de un grupo acetilo neutral y debilita la interaccin electrosttica entre el octmero y el DNA. Este proceso es reversible por lo que la cromatina puede relajar o condensar su estructura. Por lo tanto, las modificaciones mediante la acetilacin en una cadena de ADN se pueden dar mediante: Deacetilacin Como se ha mencionado la deacetilacin es reversible. Los factores represores de la transcripcin reclutan complejos de protenas corepresoras poseen actividad histona desacetilasa. histonas cercanas se desacetilan, las Lys carga + y la cromatina se compacta y la expresin del gen se silencia mendiante compactacin de la cromatina.

proceso

que Las ganan la

Hiperacetilacin Se puede dar la hiperacetilacin de colas N-terminales histonas dirigida por activador. El de unin al DNA del activador interacta con secuencias activadoras especficas en direccin 5 de los que regula. Los factores activadores

de dominio

de

genes la

R. Jover

Integracin bioqumica y bioqumica clnica. Tema 7

transcripcin reclutan complejos de coactivadores con actividad histona acetil transferasa. Las histonas cercanas se acetilan, las Lys pierden carga +, la cromatina se relaja, los promotores quedan accesibles y la transcripcin se activa.

Transcripcin
Teniendo en cuenta las modificaciones epigenticas, la secuencia de acontecimiento que conducen a la transcripcin es la siguiente: Un factor de transcripcin se une al DNA. Un co-activador con actividad histona acetil transferasa se une al factor de transcripcin. Las histonas vecinas son acetiladas y la compactacin del nucleosoma disminuye. El complejo remodelador de la cromatina desliza o reordena los nucleosomas adyacentes dejando ms DNA libre y permitiendo el acceso de ms factores de transcripcin. Factores de transcripcin adicionales se unen a la regin de DNA desnudo. La RNA polimerasa II se une. La iniciacin requiere una seal positiva de varios factores de activacin hasta la RNA pol II a travs de complejo mediador.

Adems de relajar a los nucleosomas mediante acetilacin es necesario desplazarlos, remodelarlos o disgregarlos. Este proceso es realizado por los Chromatine Remodelling Complexes (ATPasas de remodelacin) y requiere energa en forma de ATP. Pueden deslizar al nucleosoma para alejarlo de secuencias que deben transcribirse o bien pueden remodelar al nucleosoma a un estado ms laxo (menos compactado) para facilitar acceso al DNA que contiene. Estos complejos se unen a los nucleosomas ms que al DNA Hay dos familias: Los complejos Swi/Snf que consisten en 8-12 protenas y que puede tanto deslizar como remodelar nucleosomas, o disgregar y fusionar dos nucleosomas en uno nuevo ms relajado. Los complejos ISWI que consisten de 2 a 6 protenas que nicamente puede deslizar nucleosomas.

R. Jover

Integracin bioqumica y bioqumica clnica. Tema 7

Metilacin de las histonas

Adems de la acetilacin reversible, las colas de histonas en la cromatina pueden sufrir metilaciones irreversibles (se han descubierto enzimas que desmetilan por lo que se ha cuestionado este concepto pero s se acepta que los efectos de la metilacin son bastaste prolongados). Se dan modificaciones covalentes mediante la metilacin de residuos de lisina de las regiones N-terminal e las histonas H3 y H4.

Se da un efecto opuesto a la acetilacin, esta era favorable a la transcripcin mientras que en la metilacin se produce un refuerzo en la unin de histonas y ADN por lo que no ser favorable que se de la trascripcin. Es necesaria la actuacin de la histona metil transferasa para que se de la metilacin. En una misma zona podemos encontrar tanto acetilacin como metilaciones. Ser la cantidad de cada una de ellas la que condicionar el estado de condensacin del ADN.

La metilacin no se da nicamente en las histonas, el DNA tambin se ve modificado mediante esta.

Metilacin del DNA

La metilacin del DNA consiste en la incorporacin de un grupo metilo en la posicin 5 de la citosina, en el dinucletido CpG. Los eucariotas superiores (animales) metilan hasta un 10% de sus citosinas. Esta metilacin es como una marca o seal para regular la expresin gnica, particularmente la de los genes relacionados con desarrollo y diferenciacin tisular. La metilacin silencia la expresin gnica. Los genes constitutivos que se expresan en todos los tejidos no muestran metilacin. Por el contrario, los genes especficos de un tejido nicamente permanecen NO metilados en dicho tejido, permitiendo as una expresin tejido-selectiva. La metilacin del DNA humano se da mediante la formacin de 5-metilcitosina a partir de citosina en la secuencia CG en ambas cadenas.

R. Jover

Integracin bioqumica y bioqumica clnica. Tema 7

La metilacin produce siempre el silenciamiento de los genes. Se da en el ADN y en las histonas y ambas producen el mismo efecto, influye en la compactacin de la cromatina: condensacin y represin gnica.

La secuencia que reconocen las enzimas que metilan al DNA (metilasas) son muy cortas compuestas por 5CpG3. Pueden encontrarse aisaldas o en conjunto formando muchas repeticiones de esta secuencia, las llamas islas de CpG. Las Islas CpG son regiones genmicas ricas en el dinucletido CpG. El 50-60% de las islas CpG se encuentran en promotores, cerca del sitio de inicio de la transcripcin en la mayora de los genes constitutivos y en numerosos genes especficos de tejido y de desarrollo (genes eucariotas). Las islas CpG NO estn metiladas en los promotores de los genes constitutivos. Pero s aparecen metiladas en genes de desarrollo, en el adulto, y en genes especficos de un tejido, en otro tejido; lo que lleva al silenciamiento gnico en estos casos. Durante el desarrollo del embrin se tienen que inhibir y reactivar muchos genes continuamente. Aunque sea por unas pocas horas deben metilarse para que no se de su expresin. Algunos genes si se reactivan pueden ser inhibidos unas vez finalizado del desarrollo. Las clulas cancerosas muestran hiper-metilaciones y patrones de metilacin anormales, determinados. Existen genes que evitan que las clulas se desarrollen a clulas cancergenas: los genes supresores de tumores. Si este gen es metilizado se produce el desarrollo de un cncer.

En la imagen podramos resumir todos los mtodos de activacin e inactivacin gentica estudiados hasta ahora en este tema.

R. Jover

Integracin bioqumica y bioqumica clnica. Tema 7

Se muestran las enzimas que controlan la metilacin del DNA en eucariotas:

(No ha mencionado nada durante la clase y en los libros no queda nada claro la accin de estos enzimas, pero el esquema no es complicado simplemente es ver las tres enzimas que participan desmetilando, manteniendo la metilacin y produciendo metilacin de novo).

Mecanismo de metilacin del DNA

silenciamiento

tras

Una vez el gen es metilado los grupos metilo de las citosinas se proyectan en el surco mayor del DNA e impiden la unin de factores de transcripcin. Las secuencias metiladas son reconocidas por las Methylcytosine Binding Proteins (MeCPs). Las MeCPs son reconocidas a su vez por histonadesacetilasas que eliminan grupos acetilo de las histonas (H4). Esto causa la condensacin del DNA hasta su forma de heterocromatina que no es accesible a la transcripcin. Los genes de esa regin del DNA quedan silenciados.

Cuando se metila el ADN se da una gran compactacin que puede ser observada a microscopia electrnica. Existirn dos tipos de densidad: una densidad mayor que se compondr por la cromatina condensada formado la herterocromatina y una densidad menos, de la eucromatina, que formar aquellos genes favorables a ser transcritos.

R. Jover

Integracin bioqumica y bioqumica clnica. Tema 7

Funciones de la metilacin del DNA

Silenciamiento transcripcional. Un ejemplo seran los genes del desarrollo en los adultos. Expresiones de genes especficos en cada tejido. Como la hipometilacin de los genes especficos del hgado y la hipermetilacin en los tejidos extrahepticos. Impronta genmica. Inactivacin de X. Todos los genes en X se inactivan pero los genes que son necesarios se encuentran el otro cromosoma X. Por lo que existe siempre doble copia de su contenido gentico en las mujeres mientras que en los hombres solamente existe una. Proteccin del genoma de la trasposicin. Es decir que impide que una secuencia de ADN pueda moverse a diferentes partes del genoma de una clula modificando as el ADN colindante.

Impronta genmica
Fenmeno gentico por el cual ciertos genes son expresados de un modo especfico que depende del sexo del progenitor. Los procesos de metilacin juegan un papel importante en la impronta genmica. En la gran mayora de los genes de los autosomas, la expresin de ambos alelos sucede simultneamente. Sin embargo, la expresin de una pequea proporcin de los genes (<1%) depende de slo uno de los alelos. La otra copia o alelo es silenciado por metilacin del DNA Como el alelo no silenciado es funcionalmente haploide se elimina la proteccin que confiere ser diploide contra mutaciones recesivas. Un ejemplo de enfermedades genticas humanas relacionadas con la impronta son el sndrome de Angelman y el sndrome de PraderWilli, ambos ligados a la misma regin del cromosoma 15 . Una mutacin ser dominante si se encuentra en los genes provenientes del hombre. Muchas mutaciones son recesivas, no expresan una enfermedad.

10