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Electroforesis: electroforesis en papel de protenas sricas

Isaac Tnez Fiana
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de Crdoba, Avda. Menndez Pidal s/n, 14004-Crdoba

RESUMEN

La electroforesis consiste en la separacin de partculas aprovechando su traslado mediante la aplicacin de campos elctricos. La capacidad de movimiento de las diferentes molculas depende de la intensidad del campo aplicado, su carga y su peso molecular. Existen diferentes tipos, que se engloban en dos: libre o de frente mvil y de zona. El objetivo ser clarificar los conceptos con ella relacionados, la metodologa y prctica de la electroforesis en papel, as como su relevancia en el estudio de las protenas sricas. Palabras Clave: acetato de celulosa, electroforesis, movilidad electrofortica, protenas sricas. Abreviaturas empleadas. PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida; SDSPAGE: electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida; SDS: dodecil sulfato sdico

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS Se denomina electroforesis al transporte de partculas en un campo elctrico. Cualquier in o molcula cargada elctricamente migrar cuando se someta a la accin de un campo elctrico. A un pH determinado, muchas molculas biolgicas poseen carga elctrica, cuya magnitud depende del pH y composicin del medio en que se encuentren. Con tcnicas electroforticas, es posible separar los diferentes componentes de una mezcla de aminocidos, protenas, cidos nucleicos y otras biomolculas cargadas. En el laboratorio clnico, la aplicacin ms importante de la electroforesis es la separacin de protenas presentes en el suero, orina y otros fluidos biolgicos como el lquido cefalorraqudeo y el lquido sinovial. El objetivo principal de la prctica estar dirigido a la comprensin e identificacin de conceptos fsicos tericos relacionados con este tipo de tcnicas, as como la descripcin de las mismas y su uso. 1.2. Movilidad electrofortica Si se aplica un campo elctrico a una mezcla de molculas cargadas, stas migrarn al electrodo de polaridad opuesta. Cuando una molcula de carga q se encuentra en un campo elctrico de magnitud E, la fuerza que provoca la
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aceleracin de la partcula ser qE. Dicha fuerza se ver contrarrestada por la resistencia friccional f dando una velocidad resultante v, de forma que: qE = fv Aplicando las leyes de Stokes para una molcula esfrica de radio r que se mueva a travs de un medio de viscosidad n, se cumple: f= 6 nr A partir de las anteriores expresiones se obtiene: qE= 6nrv La movilidad electrofortica V de una molcula se define como la migracin por unidad de campo de fuerza, de modo que: V=v/E=q/f= q/6 nr Por tanto, la movilidad electrofortica depende de la carga de las partculas y del coeficiente de friccin f, que es dependiente del tamao de la molcula, de su forma y de la viscosidad del medio. 1.3. Tipos de electroforesis 1.3.1. Electroforesis de frente mvil o libre Las sustancias a separar se introducen en un tubo en forma de U, disueltas en un tampn de pH y fuerza inica adecuados. Se colocan dos electrodos en sendos brazos del dispositivo, entre los que se crea un campo elctrico, provocando que las molculas de protena cargadas emigren hacia los electrodos de polaridad opuesta. Las diferentes protenas se desplazan a velocidades diferentes de acuerdo con sus cargas y coeficientes de friccin respectivos, formndose nubes (o frentes) que se desplazan en la disolucin tampn. Este desplazamiento puede seguirse con diversos sistemas pticos que ponen de manifiesto las sustancias segn se van separando. Para impedir la mezcla por conveccin de las protenas que emigran se necesita un sofisticado aparato y a su vez se precisa el empleo de muestras muy grandes. Esta es la razn por la que la electroforesis de frente mvil ha sido sustituida por la electroforesis de zona. 1.3.2. Electroforesis de zona En esta tcnica, la muestra est obligada a desplazarse sobre un soporte slido de papel, celulosa o gel. La pequea cantidad necesaria de muestra permite que las molculas migren en discretas zonas o bandas. La electroforesis zonal de biomolculas cargadas, generalmente se lleva a cabo en una disolucin estabilizada con un medio que sirve de soporte. Electroforesis en papel

La muestra se aplica sobre una tira de papel de filtro humedecido con una
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disolucin tampn, bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel, dependiendo de las sustancias a separar y del pH del tampn. Los extremos de la tira se sumergen en dos recipientes separados que contienen la disolucin tampn y en los que se hallan colocados los electrodos. Se conectan los electrodos a una fuente de tensin continua y se aplica una diferencia de potencial durante el tiempo adecuado. Al aplicar una corriente directa, las molculas cargadas de la mezcla emigran hacia los electrodos de polaridad opuesta formando bandas en el papel. La velocidad de emigracin de una molcula, depende preferentemente de su carga. Completada la electroforesis, se desconecta la fuente de tensin y se secan las tiras sobre una superficie, limpia, seca y lisa (cristal, azulejo, etc...). El revelado se realiza empleando los mismos mtodos que los utilizados en cromatografa sobre papel, mediante la accin de los colorantes adecuados. La electroforesis y la cromatografa en papel tienen ciertas similitudes. Sin embargo, mientras que la electroforesis separa las molculas fundamentalmente en funcin de su carga, la cromatografa lo hace en base a una amplia gama de caractersticas (ejemplos, solubilidad en la cromatografa de reparto, polaridad en la de adsorcin, carga en la de intercambio inico, etc.). La electroforesis en papel se emplea principalmente en la separacin de sustancias de bajo peso molecular como aminocidos y pptidos. La difusin que se produce puede disminuirse aumentando la diferencia de potencial entre los electrodos con lo que se reduce el tiempo de desarrollo. Este tipo de electroforesis se denomina de alto voltaje. El revelador para localizar las sustancias sera la ninhidrina en el caso de pptidos y aminocidos. Las electroforesis en papel tambin pueden hacerse en tiras de acetato de celulosa, que son qumicamente ms homogneas y tienen la ventaja de ser transparentes, con lo que las sustancias a separar, una vez teidas o reveladas, pueden cuantificarse por densitometra. Es muy til en los laboratorios clnicos por su fcil manipulacin y su rpido desarrollo. La principal aplicacin es la separacin de protenas del suero, conocindose el resultado como proteinograma. Las fracciones proteicas del suero que se separan mediante este tipo de electroforesis son la albmina y las globulinas 1, 2, y . El acetato de celulosa se utiliza tambin para separ lipoprotenas. El resultado obtenido se denomina lipidograma. Las fracciones lipoproteicas son denominadas , pre- y . El tampn ms usado es el veronal, a pH 8,6. La separacin se realiza de forma anloga a la de protenas y se produce en unos 30 minutos. Las lipoprotenas, una vez separadas, se localizan tindolas con colorantes que se unen a la fraccin lipdica, como Negro Sudn o Ciba 7B Fat Red. Electroforesis anlogas a las de protenas y lipoprotenas, utilizando como soporte el acetato de celulosa, se han aplicado tambin para la separacin de isoenzimas de la lactato deshidrogenasa y la creatn-quinasa. Electroforesis en gel
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Un gel es un estado intermedio entre el slido y el lquido. Este tipo de electroforesis se halla entre los mtodos ms resolutivos y convenientes empleados en la separacin de macromolculas. Los geles de uso ms generalizado son: poliacrilamida y agarosa. stos poseen poros de diferentes dimensiones moleculares que delimitan la velocidad de traslado y molculas trasladadas durante el proceso electrofortico. De esta forma, la separacin no se produce slo por las diferentes cargas de las molculas, sino tambin por las diferencias de tamao. Los geles estn formados por un reticulado de polmeros (constituyendo una red enmaraada) y el lquido intersticial en el que se encuentra inmerso esta red. Existe una gran variedad de tipos de electroforesis en gel, que se pueden agrupar en dos categoras: Electroforesis en gel en una dimensin (continuo o discontinuo) o PAGE-nativa o SDS-PAGE o Isoelectroenfoque Electroforesis en gel en dos dimesiones (bidimensional) Segn las aplicaciones u objetivos que se pretendan conseguir en una prctica o experimento, se utilizar un tipo u otro de electroforesis en gel. Los geles discontinuos mejoran la resolucin de la electroforesis pues se consigue agudizar las bandas en gran medida por el uso de esta tcnica conocida como electroforesis a pH discontinuo que precisa de dos geles y dos tampones diferentes. La PAGE-nativa se utiliza para separar protenas en condiciones no desnaturalizantes, por tanto, en funcin de la carga intrnseca de las mismas. La SDS-PAGE es muy til para calcular el peso molecular de una protena concreta ya que separa las protenas segn su tamao. El isoelectroenfoque es un tipo de PAGE en una dimensin que se basa en la separacin de molculas de acuerdo a sus diferentes puntos isoelctricos. La electroforesis en gel en dos dimensiones combina el isoelectroenfoque (primera dimensin) con la SDS-PAGE (segunda dimensin). Es una tcnica muy resolutiva, y el mejor mtodo analtico para separar protenas que existe hoy en da. 1.3.3. Electroforesis capilar Aunque la electroforesis en gel en sus diversas formas resulta un mtodo comn y efectivo para la separacin de molculas, el proceso de separacin puede durar varias horas, siendo difcil de cuantificar y automatizar. La tcnica aqu presentada se lleva a cabo en el interior de tubos capilares (1 10 m de dimetro). Estos capilares disipan el calor rpidamente permitiendo la aplicacin de campos elctricos elevados, reduciendo as los tiempos de separacin.

2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO

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2.1. Equipamiento Sistema de electroforesis. Fotodensitmetro. 2.2. Material Pipetas de 15 ml. Micropipetas o pipetas de pistn de 251000 l. Puntas desechables. Vasos de precipitado. Tiras de papel especial (Whatman 1, 3, etc.) de filtro o de acetato de celulosa, impregnadas en la solucin amortiguadora correspondiente. 2.3. Reactivos Agua destilada. Soluciones amortiguadoras. Colorantes. Decolorantes.

3. PROTOCOLO A REALIZAR 3.1. Electroforesis en papel 3.1.1. Se adaptan convenientemente a la cmara de electroforesis las tiras impregnadas con la solucin amortiguadora. 3.1.2. Se aplica la muestra. Se depositan de 1015 l en una fina banda en la zona del ctodo paralela a los polos de la cubeta electrofortica, para separar protenas del suero o de cualquier lquido biolgico (orina, lquido cefalorraqudeo, etc). 3.1.3. Se separan las diferentes fracciones mediante el paso de la corriente. La duracin depende de la intensidad y el voltaje suministrado. Se aplican 0,26 mA por cm de ancho de la tira. 3.1.4. Acabada la separacin, la tira se retira y seca en la estufa entre 60110C. 3.1.5. Se colorea sumergiendo la tira en la solucin colorante durante 5 min. El tiempo de coloracin vara segn el colorante empleado, oscilando entre 530 min. 3.1.6. Se lava 3 veces con una solucin de actico al 5%. 3.1.7. Se seca a temperatura ambiente. 3.1.8. Se decolora, retirando el exceso de colorante. Se deja slo el que ha sido fijado por las protenas.
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3.1.9. Se valora por fotodensitometra. Consiste en hacer pasar la tira por un haz de luz que es absorbida segn la cantidad de protena coloreada.

4. RESULTADOS ESPERADOS Las fracciones proteicas del suero que se separan por electroforesis en acetato de celulosa son la albmina y las globulinas 1, 2, y . En condiciones normales, los porcentajes de cada fraccin que se obtiene con el anlisis densitomtrico de las tiras, son los siguientes:
PROTENAS SRICAS Albmina Globulinas 1 Globulinas 2 Globulinas Globulinas % 53-67 2,5-5 7-13 9-14 10-21

5. DISCUSIN Y COMENTARIOS

6. BIBLIOGRAFA RECOMENDADA Gonzlez de Buitrago JM (1985): Electroforesis . En Gonzlez de Buitrago JM (eds): Tcnicas de Laboratorio Clnico, 1 ed. Editorial Alambra (Madrid, Espaa), pp. 117 125. Gonzlez de Buitrago JM (1998): Osmometra. Cromatografa. Electroforesis. Tcnicas electroqumicas. En Gonzlez de Buitrago JM, Arilla E, RodrguezSegade M, Snchez A (eds): Bioqumica Clnica, 1 ed. Editorial McGraw-Hill Interamericana(Madrid, Espaa), pp. 17 27. Vidal C (1988): Electroforesis. En Lozano JA, Tudelo J (eds): Prcticas de Bioqumica. Experimentacin y Simulacin, 1 ed. Editorial Sntesis (Madrid, Espaa), pp. 37 45.

ANEXO: MEDIOS, SOLUCIONES Y MATERIAL BIOLGICO EMPLEADO 1. Soluciones para la electroforesis 1.1. Tampn veronal/veronato sdico veronal/veronato sdico, pH 8,6
1 litro (g) 1,84 10,40 Hasta 1 litro 1 litro (g) 15,45 2,76 Hasta 1 litro

Veronal (cido dietilbarbitrico) Veronal sdico Agua destilada

1.2. Tampn acetato/veronal

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Acetato/veronal, pH 8,6 1 litro Veronal sdico 10 g Acetato sdico 6,5 g HCl 0,1 M 64,5 ml Agua destilada Hasta 1 litro

2. Soluciones de colorantes utilizados en las tinciones 2.1. Solucin de negro amido

Negro Amido Metanol cido actico Negro amido Agua destilada 1 litro 450 ml 100 ml 6,0 g 450 ml

2.2. Solucin de azul de bromofenol

Azul de bromofenol Metanol Bicloruro de Hg Azul de bromofenol 100 ml 100 ml A saturacin 100 mg

2.3. Solucin de azocarmin B

Azocarmin B 100 ml Azocarmin B Metanol (50%) cido actico 10 g 90 ml 10 ml