Práctica 2
Electroforesis de proteínas.
La técnica de electroforesis se basa en el movimiento de las partículas cargadas en un campo eléctrico
hacia el electrodo de carga opuesta. Si colocamos un par de electrodos y aplicamos una diferencia de
potencial entre ellos, las moléculas cargadas negativamente (aniones) migrarán hacia el polo positivo y
las moléculas cargadas positivamente (cationes) migrarán hacia el polo negativo. Las moléculas sin
carga no se ven afectadas.
La electroforesis es un método muy utilizado para separar proteínas. Los aminoácidos que las
componen pueden llevar carga eléctrica, variable en función de su grado de ionización, lo cual es
función a su vez del pH. Las diferentes proteínas tendrán diverso número de cargas y diferente peso
molecular, por lo que migrarán a velocidades diferentes en un campo eléctrico.
El movimiento de las partículas depende no sólo de su carga, si no también del potencial del campo
(voltaje aplicado), peso y tamaño de la partícula, e incluso de la distancia entre los electrodos,
temperatura y tiempo. La velocidad de un ión se define como la velocidad a la que éste se desplaza en
un gradiente de voltaje 1 volt/cm y se puede expresar como:
M : movilidad de la partícula
E
(1) M = *q E: intensidad del campo eléctrico= Voltaje aplicado
f
q: carga de la partícula
f: coeficiente de fricción, depende del medio y del peso molecular, PM, de la partícula:
En el caso de las proteínas, su carga neta a un pH determinado depende, en principio, de su punto
isoeléctrico y cumple la relación:
q = pI − pH
* ( pI − pH )
k k
M = *q =
Pm Pm
Por tanto, la ecuación anterior (1) se puede reescribir como:
k E
=
Pm f
En nuestro caso vamos a utilizar como medio para la electroforesis una tira de gel de acetato de
celulosa (CELLOGELR) en el que debido a presentar un bajo coeficiente de fricción, la movilidad
viene determinada fundamentalmente por la carga neta de las proteínas. Pero esta tira va a estar
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empapada en disolución tampón de veronal, que cierra el circuito eléctrico entre las dos cámaras con
los electrodos. El tampón de veronal tiene la misión de establecer ese contacto eléctrico, y de efectuar
la electroforesis a un pH determinado y constante, en nuestro caso 9,5. A ese pH tan básico, todas las
proteínas del suero presentan carga negativa. Por tanto en nuestro caso, las proteínas se van a separar
en función del peso y tamaño de la partícula.
Este tipo de electroforesis se utiliza frecuentemente en análisis clínicos para determinar
proteinogramas, lipidogramas o isoenzimas y en bioquímica para comprobar la pureza de los
compuestos.
Protocolo:
Materiales:
- Tiras de cellogel Muestra:
- Cubetas de electroforesis Suero sanguíneo.
- Fuente de tensión contínua
- Aplicadores
Reactivos:
- Tampón Veronal Sódico (Tris 0,05 M, glicina 0,15 M) pH 9,5.
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- Baño colorante: 0,5 g Negro amido 10 B en 45 ml de metanol, 45 ml de agua y 10 ml de
ácido acético.
- Baño decolorante: 47,5 ml de metanol, 47,5 ml de agua y 5 ml de ácido acético.
Procedimiento:
1- Sumergir las tiras en el tampón durante 5 minutos.
2- Eliminar exceso de tampón entre dos hojas de papel de filtro.
3- Extender las tiras sobre el puente de la cubeta (que ya contiene el tampón). La superficie
adecuada para la electroforesis tiene que ir dirigida hacia arriba. Para reconocerlo, las tiras
tienen un ángulo cortado. La superficie adecuada se reconoce poniendo la tira con ángulo
cortado hacia abajo y a la derecha. Conviene operar con rapidez para evitar evaporaciones.
4- Aplicar las muestras con el aplicador ATOM. Tapar la cubeta. Conectar la corriente eléctrica.
200 V, 30 min.
5- Coloración: colocar las tiras en bandejas y cubrir con la solución colorante durante 10
minutos.
6- Decoloración: recoger el colorante (se puede reciclar) y lavar las tiras con agua para eliminar
el exceso de colorante. Lavar 3 ó 4 veces con la solución decolorante hasta que la tira quede
blanca y se vean las tiras de proteínas.
En este momento se apreciarán las diversas fracciones separadas en bandas. Dibujarlas e intentar
identificarlas.
Preguntas.
1. ¿En qué consiste la electroforesis de proteínas?
2. ¿Qué factores afectan a la movilidad de las proteínas durante la electroforesis?
3. ¿Cuál de los factores anteriores es afectado por el pH?
4. Explica las diferencias entre la electroforesis de proteínas en presencia de SDS (dodecil sulfato
sódico) e isoelectroenfoque.
5. ¿En qué se asemejan la electroforesis de DNA y la de proteínas en PAGE-SDS?l
