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Perfil lipdico
Isaac Tnez Fiana1, Aurora Galvn Cejudo2
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Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Avda. Menndez Pidal s/n, 14071Crdoba, 2Campus de Rabanales, Edif. Severo Ochoa 14071-Crdoba

RESUMEN La cuantificacin de colesterol y triglicridos en suero es un procedimiento analtico bsico en el diagnstico y seguimiento de enfermedades metablicas, primarias o secundarias. Altos niveles de colesterol se asocian a riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares. En esta prctica se realizar la determinacin en suero de colesterol total, colesterol-HDL y triglicridos. Palabras claves: colesterol, lipoprotenas, triglicridos Abreviaturas: 4-AP: 4-amino fenazona, CHE: colesterol estearasa, CHOD: colesterol oxidasa, GK: Glicerol Kinasa, GPOD: Glicerolfosfato oxidasa, HDL: lipoprotenas de alta densidad, LDL: lipoprotenas de baja densidad, POD: peroxidasa, VLDL: liproprotenas de muy baja densidad

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS El perfil lipdico lo constituye la cuantificacin analtica de una serie de lpidos que son transportados en la sangre por los diferentes tipos de lipoprotenas plasmticas. La determinacin de estos parmetros es un procedimiento analtico bsico para el diagnstico y seguimiento de enfermedades metablicas, primarias o secundarias. Entre estos parmetros analticos que se pueden determinar estn: el colesterol total, el colesterol transportado por las LDL, el colesterol transportado por las HDL, los triglicridos totales, ciertas apoprotenas particulares etc. Altos niveles de colesterol se asocian a riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares, en especial aquel unido a las LDL (colesterol malo). El colesterol de las HDL (colesterol bueno), puesto que representa aquella fraccin de colesterol que se transporta al hgado para su metabilizacin y excrecin por va biliar, no se asocia con riesgo de enfermedad. Los objetivos de la prctica son la determinacin en suero de colesterol total, HDL-Colesterol y triglicridos, para lo que se utilizarn kits comerciales.

1.1. Determinacin de colesterol total

Para la determinacin de colesterol total se utilizan reactivos comerciales que incluyen las enzimas y sustratos necesarios para la cuantificacin de todas las formas de colesterol presentes en el suero (Kit comercial de LinearChemicals). Las reacciones que tienen lugar son:
Esteres de colesterol + H2O CHE Colesterol + Ac. Grasos

Colesterol + O2 + H2O

CHOD Colestenona + H2O2 POD Quinona + H2O

H2O2 + Fenol + 4-AP

1. Una colesterol estearasa (CHE) hidroliza los steres de colesterol a colesterol mas cidos grasos libre. 2. A continuacin una colesterol oxidasa (CHOD) oxida todo el colesterol a colestenona y perxido de hidrgeno. 3. El perxido de hidrgeno es sustrato de una peroxidasa (POD) que junto con 4-amino fenazona (4-AP) da lugar a la formacin de una quinona roja. La quinona formada es proporcional a la concentracin de colesterol en la muestra.

1.2. Determinacin de HDL-colesterol Para la determinacin del colesterol presente en las principales lipoprotenas que lo contienen como HDL (lipoprotenas de alta densidad) y LDL (lipoprotenas de baja densidad), es necesario: Primero, la separacin selectiva de la lipoprotena correspondiente con agentes precipitantes. Segundo, la cuantificacin del colesterol presente en dicha lipoprotena como se indic anteriormente. Entre estos reactivos precipitantes estn el cido fosfotungstico y magnesio que precipitan a las LDL y VLDL (lipoprotenas de muy baja densidad) mientras que las HDL permanecen en solucin.

1.3. Determinacin de triglicridos Para la determinacin de triglicridos en suero se utilizan reactivos comerciales (Kit comercial de LinearChemicals) que incluyen las enzimas y sustratos necesarios para la cuantificacin por espectrofotometra visible. Las reacciones que tienen lugar son:
Triglicridos + H2O Lipasa 2 Glicerol + Ac. Grasos

Glicerol + ATP

GK GPOD

Glicerol-3-P + ADP

Glicerol-3-P + O2

Dihidroxiacetona + H2O2

H2O2 + p-clorofenol + 4-AP

POD Quinona + H2O

1. Una lipasa hidroliza los triglicridos dando glicerol mas cidos grasos libre. 2. El glicerol formado es sustrato de una glicerol quinasa que en presencia de ATP lo fosforila a glicerol 3P. 3. El glicerol 3P es oxidado a dihidroxiacetona por una glicerol fosfato oxidasa dando tambin perxido de hidrgeno. 4. El perxido de hidrgeno junto con los cromgenos p-clorofenol y 4-AP son sustrato de una peroxidasa para formar una quinona roja cuantificable a 505 nm. La quinona formada es proporcional a la concentracin de triglicridos presente en la muestra.

2. LISTADO DE MATERIAL NECESARIO Tubos de ensayo Pipetas automticas Espectrofotmetro Suero Estndar de colesterol (200 mg/dl) Reactivo de trabajo para el colesterol Reactivo precipitante Estndar de triglicridos (200 mg/dl) Reactivo de trabajo para triglicridos

3. PROTOCOLOS A REALIZAR 3.1. Determinacin de colesterol total Disponer de tubos de ensayo rotulados como blanco, estandar y muestra. La muestra se refiere al suero a valorar y se colocan tantos tubos muestras como sueros se quieran valorar. Pipetear los componentes indicados en la Tabla I, aadiendo en ltimo lugar el reactivo de trabajo de colesterol. Tabla I. Protocolo para la cuantificacin de colesterol total Blanco 2 ml
3

Etandar de colesterol Suero React. de trabajo

Estandar 20 l 2 ml

Muestra 20 l 2 ml

Mezclar e Incubar 5 min a 37C ( 10 min a temperatura ambiente). Leer la absorbancia a 505 nm. Calcula la concentracin de colesterol total de cada una de las muestras de suero del suguiente modo:
Amuestra mg/dl = Aestandard x Conc. estandard

3.2. Determinacin de HDL-colesterol 1. Mezclar 1 ml del suero con 0,1 ml del reactivo precipitante. Incubar 10 min a temperatura ambiente y centrifugar durante 20 min a 4000 rpm ( 2 min a 12000 rpm). 2. La determinacin de HDL-colesterol se realiza con 40 l del sobrenadante como se indica en la Tabla II y utilizando el reactivo indicado en la determinacin de colesterol total 3. Pipetear los componentes indicados en la Tabla II, aadiendo en ltimo lugar el reactivo de trabajo de colesterol. Tabla II. Protocolo para la cuantificacin de colesterol de las HDL Blanco 40 l 2 ml Estandar 20 l 20 l 2 ml Muestra 40 l 2 ml

Etandar Sobrenadante H2O React. de trabajo

Mezclar e Incubar 5 min a 37C ( 10 min a temperatura ambiente). Leer la absorbancia a 505 nm. Calcula la concentracin de colesterol de las HDL del siguiente modo: Abs. Muestra x 320 = mg/dl HDL-colesterol (505 nm)

3.2. Determinacin de triglicridos

Disponer de tubos de ensayo rotulados como blanco, estandar y muestra. La muestra se refiere al suero a valorar y se colocan tantos tubos muestras como sueros se quieran valorar. Pipetear los componentes indicados en la Tabla III, aadiendo en ltimo lugar el reactivo de trabajo de triglicridos.

Etandar Muestra React. de trabajo

Blanco 2 ml

Estandar 20 l 2 ml

Muestra 20 l 2 ml

Mezclar e Incubar a 37C 4 min ( 10 min a temperatura ambiente). Leer la absorbancia a 505 nm.

Clculos
Amuestra mg/dl = Aestandard x Conc. estandard

4. RESULTADOS ESPERADOS Los resultados esperados son aquellos que se indican a continuacin y se corresponden con los valores de referencia encontrados en la poblacin sana y que varan segn sexo y edad 4.1. Colesterol total Hasta 30 aos: 120-215 mg/dl 30- 39 aos: 135-240 mg/dl 40-49 aos: 140-280 mg/dl 50- 59 aos: 145-295 mg/dl 4.2. Colesterol-HDL Hombre > 55 mg/dl Mujer > 65 mg/dl 4.3. Triglicridos 36-165 mg/dl

5. DISCUSIN Y COMENTARIOS Adems de la cuantificacin de estos tres parmetros en la prctica el alumno deber presentar un esquema de: - Las principales lipoprotenas.
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Principales dislipemias (tipos, causas, parmetros bioqumicas y riesgos). Qu otras determinacines analticas se pueden realizar para valoracin de las dislipemias.

6. BIBLIOGRAFA DOcon Navaza C, Garca-Saavedra MJ, Vicente Garca JC (1999): Fundamentos y Tcnicas de Anlisis Bioqumico, Anlisis de Muestras Biolgicas. Editorial Paraninfo, Madrid. Gonzlez de Buitrago JM, Arilla Ferreiro E, Rodrguez-Sedade M, Snchez Pozo A (1998): Bioqumica Clnica . Editorial McGraw-Hill.-Interamericana, Madrid. Informacin detallada a cerca de los productos analticos de Linear Chemical SL lo encontrar en htp:// www.linear.es

ANEXO SOLUCIONES Estndar de colesterol: 200 mg/dl Reactivo de trabajo de colesterol que se prepara segn las indicaciones del fabricante y que contiene: 300 U/l de colesterol estearasa, 300 U/l de colesterol oxidasa, 1250 U/l de peroxidasa, 0,4 mmol/l de 4-AP, 26 mmol/l de fenol en tampn pipes 90 mM, pH 6,9 Reactivo precipitante: 14 mmol/l ac. fosfotungstico y 2 mmol/l MgCl2 Estndar de triglicridos: 200 mg/dl Reactivo de trabajo de triglicridos que se prepara segn las indicaciones del fabricante y que contiene: 150000 U/l de lipasa, 500 U/l de GK, 2500 U/l de GPO, 440 U/l de peroxidasa, 0,1 mmol/l de 4-AP, 0,126 mmol/l de fenol en t mmol/l de ATP, 2 mmol/l de p-clorofenol en tampn 50 mM pH 7,5.

MATERIAL BIOLGICO Suero, estable 6 das a 2-8C.