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ANLISIS DE LECHE Y PRODUCTOS LCTEOS OBJETIVO. Determinar las principales pruebas de plataforma en una muestra de leche comercial. INTRODUCCIN. Las pruebas de plataforma especficamente en lcteos sirven como criterio en la determinacin de la calidad de la leche y el resultado se traduce en el precio al cual se esta pagando la leche. El nmero de pruebas de plataforma en la leche es muy variado. Sin embargo, entre ms pruebas se realicen mayor ser la informacin disponible y por lo tanto el criterio tendr que ser ms acertado para el destino de esa leche. Un factor importante en la realizacin de las pruebas de plataforma es el tiempo, la disponibilidad de informacin es determinante para establecer si la leche se acepta, se rechaza o se llega a un arreglo con el productor en el precio, en el caso de ser necesario. El reporte de las pruebas de plataforma debe informar a primera vista sobre las caractersticas de la leche como son: acidez, contenido graso, temperatura, slidos totales, peso especfico, pruebas de alcohol, antibiticos, carbonatos, perxidos, etc. Una manera de distinguir una prueba de plataforma de una que no la es, es que el tiempo en que se obtiene la informacin debe ser rpida y confiable adems de no rebasar ms de 2 horas que es el tiempo aproximado en que tarda en descargarse una pipa de 15.000 litros. Existe una prueba que no es de plataforma propiamente dicha ya que la pasteurizacin regularmente se lleva a cabo dentro de las instalaciones de la planta y que sin embargo proporciona informacin acerca de un proceso de vital importancia para una empresa que se dedica al procesamiento de leche, como lo es la pasteurizacin. El proceso de pasteurizacin se realiza para eliminar microorganismos coliformes, en el caso de ser deficiente la calidad del producto final no podr asegurarse. PREPARACION DE LA MUESTRA Llevar la muestra de leche a aproximadamente 20C y mezclar por trasvase a otro recipiente limpio, repitiendo la operacin hasta asegurar una muestra homognea. Si no se han dispersado los grumos de crema, entibiar la leche en un bao de agua a aprox. 38C y mezclar hasta homogeneidad. Enfriar a 20C antes de medir un volumen para analizar (AOAC 16020, 1984). Se recomienda la agitacin de la muestra previamente a cada anlisis, aunque se trate de la misma muestra. EVALUACIN SENSORIAL Caracteres organolpticos: olor, color, sabor, aspecto, presencia de sedimento. La leche fresca obtenida en circunstancias normales, es de color blanco completamente opaca, de olor dbil y sabor suave, pastoso y dbilmente azucarado. intenso,

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DENSIDAD Se puede determinar con picnmetro, balanza hidrosttica o lactodensmetro, a 20C Pesar en balanza analtica un picnmetro vaco. Llenar el picnmetro con agua destilada y pesar nuevamente. Llenar el picnmetro con la muestra y pesar de nuevo. Calcular el valor correspondiente a la densidad de la muestra segn indicaciones del docente. Reportar resultados. D: (Wm Wv) / (Wa Wv) D: densidad Wm: Peso del picnmetro con muestra Wv: Peso del picnmetro vacio Wa: Peso del picnmetro con agua PH Y TEMPERATURA La determinacin del pH se realiza por lectura directa introduciendo el electrodo de un pHmetro, previamente ajustado con tampones de pH conocido 4,00 y 7,00, en la leche, la cual debe ser calentada y homogeneizada a 40C para dispersar la materia grasa y posteriormente enfriada a 20C. PRUEBA DE ALCOHOL Materiales Alcohol etlico al 70% Pipetas graduadas de 2 5 ml Tubos de Ensayo Gradilla Muestra de leche

Procedimiento Tomar 2ml de leche y depositar en un tubo de ensayo. Agregar 2ml de Alcohol al 70%, e invertir el tubo 1 o 2 veces. Observar la formacin de grumos pequeos o grandes y reportar el resultado como positivo a la prueba de alcohol; en caso contrario, reportar como negativo. Es una prueba que no da mucha confiabilidad, pues los mismos componentes de la leche (sales) actan como tampn y de esta manera una leche negativa a la prueba del alcohol puede ser positiva a la prueba de la ebullicin. Interpretacin La prueba es positiva si se observan partculas de cuajada en la pared del tubo de ensayo. Esta leche no podr ser esterilizada.

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ACIDEZ TITULABLE La acidez titulable de la leche es el resultado de una valoracin cido-base en la que un volumen de leche es llevado al punto de viraje de un indicador de pH que suele ser la fenolftalena (punto de viraje pH = 8,3) utilizando para ello una disolucin alcalina (hidrxido sdico). En la acidez de valoracin estamos determinando la suma de la acidez natural de la leche (casenas, sustancias minerales - cidos orgnicos y fosfatos) y la acidez desarrollada (cidos orgnicos generados a partir de la lactosa por crecimiento microbiano). Materiales Vasos de precipitados de 25 mL Bureta Pipetas Pasteur Pipetas de 10 mL

Reactivos - Disolucin de hidrxido sdico 0,1 N - Disolucin de fenolftalena al 1% en etanol Procedimiento Tomar 9 ml de leche de leche cruda y colocarlos en un vaso de precipitado de 100 ml. Adicionar de 3 a 4 gotas de fenolftalena Titular con hidrxido de sodio 0.1N, suspender la adicin de hidrxido de sodio hasta que se presente una coloracin rosa, anotar el gasto. Realizar la misma determinacin para la leche pasteurizada. Hacer los clculos de acuerdo a la siguiente ecuacin: % Acidez (como Ac. Lctico) = (A x B x C) x (100) D Donde: A = cantidad en mililitros de la solucin de NaOH. B = normalidad de la solucin de NaOH. C = peso equivalente expresado en gramos del cido predominante del producto (cido lctico, peso equivalente = 90 g). D = peso de la muestra en miligramos.

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PRUEBA DE LA REDUCTASA (leche fresca) Trabajar en condiciones de esterilidad y evitar la exposicin a la luz solar. Esta prueba se utiliza para determinar la calidad de una leche fresca. Reactivos y equipos. Bao Mara Tubos de ensayo 16 x 150mms Tapones de caucho Azul de Metileno 5 mg en 100ml de agua destilada estril (conservarlo en frasco oscuro) y en nevera. - Pipetas de 1 ml. estriles - Pipetas de 10 ml. estriles Procedimiento La muestra tomada aspticamente se coloca en el tubo de ensayo hasta la marca. Se agrega 10 ml de leche y 1ml de la solucin de azul de metileno, se tapa y se mezcla invirtiendo el tubo dos veces, se lleva al bao mara a 37C. El nivel de agua en el bao debe exceder al de la leche en el tubo. Se hacen las lecturas a los 20 minutos de incubacin, luego con intervalos de una hora y a las 5 horas, con los datos del tiempo se hacen las lecturas de la calidad bacteriolgica de la leche. Segn los datos obtenidos, las leches pueden clasificarse en 4 grupos: Leche de primera calidad: No decolora el azul de metileno en 5 horas y media, lo que equivale a menos de 500.000 microorganismos por ml. Leche de Calidad Media: Se mantiene coloreada durante dos horas, pero se decolora dentro de las 5 horas y media, lo que equivale a un nmero de 500.000 4000.000 de microorganismos por ml. Leche Mala: Se mantiene coloreada por 20 minutos, pero se decolora dentro de 2 horas lo que equivale a un numero de 4 millones hasta 20 millones de microorganismos por ml. Leche muy Mala: Se decolora en menos de 20 minutos lo que corresponde a ms de 20 millones por ml de microorganismos. La reductasa tiene que ver con la concentracin de microorganismos en la leche. El poder reductor de la leche debe atribuirse a las enzimas o fermentos de las clulas (microorganismos) que pululan en su masa. Para medir el poder de la reductasa se recurre al azul de metileno, por tener esta tintura y ventaja de no combinarse con la casena de la leche y de ser fcil absorbible por las clulas.

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PRUEBA DE EBULLICIN Materiales Pipetas Gradillas Tubos de Ensayo Estufa o mechero Muestra de leche

Mtodo Tomar 2ml de leche y depositar en un tubo de ensayo. Llevar al calor hasta ebullir. Observar si se presenta coagulacin de la muestra y reportar el resultado como positiva a la ebullicin. Esta prueba permite apreciar la aptitud de la leche a la industrializacin. Se basa en el hecho de que el calor acta como catalizador de la precipitacin de la casena por la formacin de cido lctico debido a la degradacin de la lactosa. DETERMINACIN DE PESO ESPECFICO. Antes de efectuar la prueba se revuelve bien la leche. Se llena una probeta de 250 ml limpia y seca con la muestra hasta el ras con la leche cuidando que no presente burbujas en la superficie. El densmetro previamente limpio se toma por la parte superior (vstago). Se introduce en la probeta y se gira el instrumento sin rozar las paredes de la misma. Cuando se estabiliza se toma la lectura a la altura de la flecha. Luego, se mide la temperatura del lquido. La lectura se corrige si es necesario. El lactodensmetro mide el intervalo de 1.020 hasta 1.040, pero en la escala aparece slo el 20 y el 40, o sea, la segunda y tercera cifras a la derecha del punto decimal. Si la escala marca 30.1, la densidad de la leche ser de 1.0301. Por cada 0.5 C por encima de los 20 C, se suma 0.0001 a la lectura. Por cada 0.5 C menos de los 20 C, se resta la misma cantidad a la lectura. Reportar resultados. REFRACTOMETRA Determinar la temperatura a una muestra de leche y ajustar la temperatura de calibracin del refractmetro. Llevar dos o tres gotas de leche al prisma del refractmetro. Realizar la lectura del ndice de refraccin. Reportar resultados

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DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE GRASA. (MTODO DE GERBER) La determinacin de la grasa en la leche se realiza mediante la tcnica volumtrica de Gerber empleando el butirmetro de Gerber segn el mtodo oficial de anlisis de leche y productos lcteos. Materiales Centrfuga Gerber Pipetas de 11 mL. Pipetas de 10 mL para el H2SO4. Pipetas de 1 mL para el alcohol isoamlico. Butirmetros Gerber, tapones y vstago de ajuste. Guantes. Gradilla.

Reactivos - cido sulfrico 90-91%. - Alcohol isoamlico. Procedimiento Tomar 10 ml de cido sulfrico y colocarlos en un butirometro para leche, cuidando que resbale suavemente por las paredes, adicionar lentamente 11 ml de leche cruda y colocarlos en el butirometro cuidando que el contacto con el cido no sea brusco, ya que tiende a calentarse, finalmente se adiciona 1 ml de alcohol isoamlico (o amlico). Colocar el tapn de hule con ayuda del perno y mezcle su contenido, hasta completa disolucin del coagulo, invirtiendo varias veces, con cuidado, a fin de evitar que el tapn se proyecte hacia fuera. Es necesario tomar el butirometro con un guante de asbesto, ya que este se calienta. Coloque los butirometros en la centrifuga con el tapn en la parte ms baja. Centrifugue por 5 minutos a 1000.1200 r.p.m. Llevar a Bao Mara a 65C durante 5 minutos, con la tapa invertida. Realizar la lectura del contenido de grasa (%)sobre la escala del butirometro. Reportar resultados SOLIDOS NO GRASOS (SNG) Determinar el porcentaje de SNG mediante el empleo de la regla respectiva. Realizar el clculo anterior aplicando la formula de Richmond. Reportar los resultados. % SNG: 250 (D 1) + 0.2 X G + 0.14 SNG: Slidos no Grasos D: Densidad G: Porcentaje de Grasa

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EXTRACTO SECO TOTAL Tarar un cristalizador bien limpio y seco de dimetro no menor de 5 cm con 10-15 g de arena calcinada. Agregar 5 ml de leche con pipeta aforada, calentar a bao Mara 10-15 min. Llevar luego a estufa a 98-100C hasta peso constante (aprox. 3 h). Enfriar en desecador, pesar rpidamente y expresar el resultado como % de slidos totales (p/v). (AOAC 16032, 1984, modificado). El contenido del extracto seco debe ser igual o superior a 85 g/l EXTRACTO SECO NO GRASO Se obtiene por diferencia entre el valor de extracto seco total y el valor de materia grasa. EXTRACTO SECO: DISCO DE ACKERMANN La determinacin de los slidos totales de la leche de forma directa (desecacin en estufa a 100C) es un procedimiento demasiado lento para usarse rutinariamente y decidir soluciones a la hora de estandarizar la composicin de la leche que va a ser utilizada para elaborar un producto lcteo. Esto ha llevado al desarrollo de modelos matemticos predictivos a partir de otras determinaciones ms rpidas. Uno de ellos es el disco de Ackermann. Consiste en 3 discos superpuestos, uno mvil central que indica la densidad de la leche y dos fijos: uno indica el contenido graso y el otro el extracto seco total de la leche. As conociendo la densidad y el contenido graso de la leche podremos calcular su extracto seco total.

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PRUEBA DE LA FOSFATASA ALCALINA La destruccin de la fosfatasa alcalina de la leche (enzima presente de forma natural en la misma) requiere temperaturas superiores a tratamientos ms drsticos que los necesarios para destruir a Mycobacterium tuberculosis, el ms termorresistente de los grmenes patgenos (formas vegetativas) que se encuentran en la leche. La determinacin de la eficacia de la pasterizacin (o la prueba de que una leche ha sido bien pasterizada) puede constatarse por tanto poniendo de manifiesto la no existencia de esta enzima. La fosfatasa escinde los fosfatos. Si acta sobre un fosfato no coloreado ligado a otro compuesto que presenta en su forma libre una coloracin ms o menos intensa, el color aparecido y la velocidad de aparicin sern proporcionales a la actividad fosfatasa. Material Bao de agua a 37C Tubos de ensayo Pipetas de 10 mL Tapones de plstico o goma para los tubos Varillas de vidrio Agitador de tubos

Reactivos Kit Lactognost, integrado por 3 componentes: Lactognost I Lactognost II Lactognost III

Procedimiento Se colocan en un tubo de ensayo 10 mL de agua destilada Se le aade una pastilla de Lactognost I y otra de Lactognost II, se tapa el tubo y se agita hasta la completa disolucin, en caso de ser necesario para la mejor disolucin se utilizar una varilla de vidrio. A continuacin, aadimos 1 mL de la leche problema en el tubo de ensayo, homogeneizamos e incubamos durante una hora en un bao termostatizado a 37C. Seguidamente, a cada tubo de ensayo aadimos una cucharadita dosificadora rasa de Lactognost III, homogeneizamos e incubamos diez minutos a la misma temperatura comprobando el resultado: - Color marrn: prueba negativa ausencia de fosfatasa alcalina. - Color verde: prueba dbilmente positiva presencia de vestigios de enzima. - Color azul: prueba positiva presencia de enzima.

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DETERMINACION DE PROTEINAS Se pueden emplear el mtodo de Kjeldahl (N x factor 6.38) o el mtodo de Bradford sobre las protenas precipitadas con cido tricloroactico (TCA 12%) y neutralizadas y diludas en solucin alcalina. Otra alternativa es emplear el mtodo de Nitrgeno lcali lbil descripto a continuacin: Determinacin de protenas en leche por destilacin directa. Mtodo de Kofranyi o del Nitrgeno lcali lbil. (1950. Milchwissenschafts, 51-54 Vol. 2). Es un mtodo rpido basado en la liberacin de amonaco cuando la leche es calentada a ebullicin en solucin alcalina. La mayor parte del amonaco liberado proviene de la rpida hidrlisis de glutamina y asparagina. Procedimiento: colocar en un baln Kjeldahl 10 ml de leche, 20 ml de BaCl 2 10 % (usar propipeta) y 70 ml de NaOH 32%. Destilar durante 6 min (exactamente medidos a partir del inicio de la ebullicin), recogiendo sobre 100 ml de BO3H3 2 %. Titular el destilado con SO4H2 0.1N, usando como indicador 6 a 8 gotas de una solucin 0.016 % de rojo de metilo y 0.083 % de verde de bromocresol en alcohol. Calcular el porcentaje de protena (p/p) utilizando una curva de calibracin que relaciona el % protenas con los ml de SO4H2 0.1N gastados. Curva de calibracin: se obtiene siguiendo el procedimiento anterior pero con muestras de leche con contenidos de protena conocidos. Para obtener las distintas muestras de leche se parte de una leche entera a la que se le midi el % de protenas por el mtodo de Kjeldhal; con esta leche se hacen diluciones o se agrega casena para obtener las concentraciones proteicas deseadas. El contenido de protenas que cubra el rango de la curva de calibracin, debe ser de 1 a 4 % (p/v). NOTA: Actualmente los anlisis en leche se realizan siguiendo la metodologa especificada en las normas IDF, de la Federacin Internacional de Lechera (FIL). Para la determinacin del contenido de protenas se utiliza el mtodo de Kjeldhal, utilizando cido brico para recoger el destilado. Determinacin de lactosa: mtodo de Fehling-Causse-Bonnans Colocar en un matraz de 100 ml, 10 ml de leche exactamente medidos, diluir con 60-80 ml de agua destilada, agregar 5 ml del reactivo de Courtonne (subacetato de plomo al 30 %), agitar enrgicamente y llevar a 100 ml con agua destilada; homegeneizar y filtrar por papel. En el lquido filtrado valorar la lactosa por el mtodo de Fehling-Causse-Bonnans. Considerar las siguientes equivalencias al efectuar los clculos: 50 mg glucosa ~ 66 mg lactosa anhidra ~ 69.5 mg lactosa hidratada NOTA: La determinacin de lactosa segn la AOAC tambin se puede realizar por mtodo espectrofotomtricos (16051, AOAC, 1984) o enzimticos (16059, AOAC, 1984).

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DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD PEROXIDASA (Prueba de Storchs) Fundamento La actividad de la enzima peroxidasa en la leche se utiliza para el control de la pasteurizacin. La enzima peroxidasa se mantiene activa tras el proceso de pasteurizacin baja (LTLT) de la leche, ponindose en evidencia su actividad por la aparicin de un color azul tras la reaccin. Sin embargo, cuando el mtodo de pasteurizacin aplicado a la leche es de mayor temperatura (pasteurizacin alta, HTST) se destruye la enzima, no apareciendo color en los 30 segundos siguientes al desarrollo de la reaccin. El mtodo es cualitativo y se basa en poner en evidencia la presencia de la enzima mediante el desarrollo de una reaccin colorimtrica. La enzima peroxidasa presente en la leche descompone el perxido de hidrgeno. El oxgeno atmico liberado oxida la 1,4 difenildiamina, incolora, que se convierte en indofenol prpura, dando una coloracin azulada que es proporcional a la concentracin de la enzima en la leche. Materiales - Tubos de ensayo. - Pipetas de 5 y 2 mL. Reactivos - Solucin de 1,4 fenilendiamina: disolver 2 g de fenilendiamina (C6H8N2) en agua caliente a 50C y diluir hasta 100 mL Conservar la solucin en un frasco de color marrn oscuro con tapn de vidrio y almacenar en un lugar fresco y al abrigo de la luz. Unos o dos das despus de la preparacin, la solucin de 1,4 difenilenamina forma sedimento, por lo que es necesario desecharla. - Solucin de perxido de hidrgeno: diluir 9 mL de perxido de hidrgeno al 30% en agua hasta 100 mL Aadir 1 mL de cido sulfrico concentrado por litro de solucin, como estabilizador. Esta solucin permanece estable durante un mes si se conserva en un lugar fresco y al abrigo de la luz, en un frasco con tapn de vidrio que impida el contacto con compuestos orgnicos. Procedimiento Introducir 5 mL de leche en un tubo de ensayo. Aadir 5 mL de la solucin de 1,4 fenilendiamina. Aadir dos gotas de la solucin de perxido de hidrgeno. Observar la coloracin dentro de los 30 segundos siguientes. Interpretacin Si aparece color azul en los 30 segundos siguientes a la mezcla de los reactivos, la reaccin es positiva existiendo actividad peroxidasa en la leche ensayada. Si no aparece color la reaccin es negativa, lo que nos indicara que la peroxidasa ha sido inactivada por el calentamiento. Si el color azul aparece ms de 30 segundos despus de la adicin de los reactivos a la leche, la reaccin no es especfica.

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PREPARACION DE YOGURT Preparar una mezcla de incubacin con 100 ml de leche y 5 ml de inculo. Fraccionar la mezcla en 8 tubos estriles, poniendo 5 ml exactos en cada tubo. Poner en un tubo de ensayo 5 ml de leche sin inocular como control. Incubar a 37 C durante 24 h. Valorar la acidez con NaOH 0.1N de uno de los tubos positivos. NOTA: El inculo bacteriano debe ser un cultivo fresco en fase estacionaria temprana, con 108 UFC/ml. El fermento para yogur debe tener una proporcin 1:1 de Streptococcus termophilus y Lactobacillus bulgaricus.

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TASA DE CLORUROS EN LECHE (MTODO DE MORH) La tasa de cloruros en leche es un valor bastante constante, entre 1,5 y 2 g/L de NaCl para la leche de vaca como valores normales y entre 1,2 y 2,7 g/L como extremos. Si dicha tasa sobrepasa el valor extremo, se sospechar de anomalas como existencia de mamitis o adicin de soluciones preparadas. FUNDAMENTO Los cloruros de la muestra se valoran con una solucin de nitrato de plata, empleando cromato potsico como indicador y expresando los resultados en NaCl. La plata tiene una gran afinidad por los cloruros, a los que se une formando cloruro de plata que es incoloro. Cuando todo el cloro est en forma de cloruro de plata, la plata reacciona con el cromato potsico formando cromato de plata que es de color mostaza rojizo. 2NO3Ag + CrO4K2 ----- 2KNO3 + CrO4Ag2 Este punto de viraje nos indica el momento en el que todo el cloro de la leche ha reaccionado con el nitrato de plata. As, conociendo la cantidad de ste que hemos utilizado hasta el viraje, calcularemos el cloro que haba en la leche. REACTIVOS - Nitrato de plata 0'1N: 1' 6988 g de nitrato de plata en 100 mL de agua. Esta solucin debe de conservarse en frasco oscuro y en la oscuridad. - Cromato potsico (CrO4K2) al 25%: 25 g en 100 mL de agua. PROCEDIMIENTO Aadir en un matraz 10 mL de leche, 40 mL de agua destilada y 15 gotas de cromato potsico y valorar con nitrato de plata hasta que la muestra se torne de color mostaza rojizo. CLCULO En 100 mL de NO3Ag 0'1N ------1' 6988 g de Ag En los mL gastados ------------- x g de Ag La reaccin de valoracin se produce equivalente a equivalente. El equivalente es el peso molecular en gramos dividido por la valencia. En este caso un equivalente a un mol. 169' 88 g de NO3Ag ------ 35' 5 g de Cl x g de Ag --------------- y g de Cl Estos gramos de cloruro estan en 10 mL de leche de la muestra, luego en 1 litro habr 100 veces ms (a = y x 100) El peso molecular del NaCl es 58'5, de ellos, 35'5 son de Cl. 58' 5 g de NaCl -----------35' 5 g de CL z g de NaCl ------------- a g de CL z = g de NaCl/litro de de leche

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OBSERVACIONES El viraje no se aprecia con claridad, por lo que conviene comparar con un patrn que contenga la leche, el agua y el cromato potsico. La reaccin se dificulta si la leche es cida ya que a bajo pH el NO3Ag reacciona muy mal. En este caso, aadir un poco de carbonato para neutralizar.

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