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Practica 4 antibiograma

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UNIVERSIDAD ANÁHUAC MAYAB

Escuela de medicina

Laboratorio de Ecología Humana
Prof. Pedro R. Aquino Hernández

Practica No. 4 Determinación de la sensibilidad antibacteriana Método de Kirby-Bauer. Antibiograma.

Grupo 2B Daniel Sánchez López Nikita L. Tejero Tun Pablo Noh Flores

Miércoles 23 de Marzo de 2011

Marco Teórico. 8 Pág. Presentación de resultados.Laboratorio de Ecología Humana 23-Mar-11 ÍNDICE Resumen. Pág. 8 Pág. Objetivo. 7 Pág. Métodos y procedimientos. 3 Pág. Análisis y Discusión. Planteamiento del problema. 10 Pág. 3 Pág. Bibliografía. 10 2 . 7 Pág.

Se define CIM como la mínima concentración de antibiótico que en un período de tiempo predeterminado. tanto a nivel hospitalario como comunitario Pero la determinación de la sensibilidad a antimicrobianos no implica solo realizar un conjunto de técnicas y medir los resultados. lo cual implica hablar el mismo idioma. cada vez más involucran información proveniente de ambos lados: el paciente y el microorganismo. En el capítulo 34 se consideraron las características farmacocinéticas y farmacodinámicas para los principales grupos de antibióticos. Resumen. Métodos cuantitativos son aquellos procedimientos que permiten determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración bactericida mínima (CBM). Los parámetros que determinan los resultados de sensibilidad o resistencia. debe haber buena comunicación. finalmente fue colocado en la incubadora para esperar que el antibiótico reaccionara con la bacteri. Marco Teórico. Método de Kirby-Bauer. es capaz de inhibir el crecimiento in vitro de un inóculo bacteriano previamente estandarizado (concentración conocida de gérmenes). Dentro de los beneficios que presenta se encuentran: ‡ Dirigir la terapéutica una vez que el germen es conocido ‡ Generar una base de datos que permita seleccionar los antibióticos a utilizar en un tratamiento empírico (aquel en que no conocemos el agente causal) ‡ Desarrollar políticas de uso de antimicrobianos ‡ Vigilar la aparición de nuevos mecanismos de resistencia ‡ Detectar precozmente la diseminación epidémica de una cepa. las extendimos en el mismo y procedimos a colocarles el multisensidisco que contenía los antibióticos que se iban a probar en las bacterias. Clasificación Estos métodos pueden clasificarse en métodos cuantitativos y cualitativos. Entre el médico clínico que tiene en sus manos un paciente.Laboratorio de Ecología Humana 23-Mar-11 Determinación de la sensibilidad antibacteriana. y el microbiólogo que entre las suyas tiene las placas con el microorganismo responsable de una infección. las diferentes estrategias bacterianas de supervivencia. En este capítulo intentaremos desarrollar los diferentes métodos de estudio y las bases de la interpretación de los resultados obtenidos in vitro. y en el 35. es capaz de inducir la muerte in vitro del 99. El estudio de la sensibilidad bacteriana a los antibióticos es una de las funciones más importantes de los laboratorios de microbiología clínica.9% de una población bacteriana previamente 3 . Se define como CBM la mínima concentración de un antibiótico que en un período de tiempo predeterminado. Es necesario saber interpretar los mismos y darles el significado que realmente tienen. al dia siguiente continuamos con la medición de los diámetros de las zonas de inhibición que nos indican que tan efectivo es uno u otro antibiótico. Antibiograma. Despues de la explicación del profesor sobre el procedimiendo adecuado que se debía seguir. procedimos a colocar en el agar las bacterias que se nos indicaron.

como ser: ‡ pH: para cada lote debe ser controlado cuando se prepara el medio. Las placas que no se usan en el día pueden mantenerse en el refrigerador. y las que tienen 100 mm de diámetro deben llevar 25 a 30 ml. de manera que los resultados sean reproducibles y comparables. Estandarización Todos los métodos de estudio por nosotros utilizados. ya que no es lo mismo un microorganismo de crecimiento rápido que lento. Para esto se considera que aquellas placas de 150 mm de diámetro deben llevar 60 a 70 ml del medio.Laboratorio de Ecología Humana 23-Mar-11 estandarizada. están estandarizados por el National Commitee for Clinical Laboratory Standars (NCCLS). b) Los medios de cultivo para realizar las pruebas. también afecta los resultados de antibióticos como tetraciclinas. A pesar de estas cualidades. ‡ Cantidad de cationes divalentes: la variación de los cationes divalentes principalmente de Ca++ y Mg++. Métodos cualitativos (disco difusión) son aquellos procedimientos que permiten clasificar directamente a un microorganismo como sensible o resistente. produciendo alteraciones en las zonas de inhibición del crecimiento bacteriano en la placa. Si el pH es demasiado bajo ciertas drogas como aminoglucósidos. Dentro de los parámetros a estandarizar se encuentran los siguientes: a) El tipo de bacterias a estudiar. dilución en agar o E-test (marca comercial). son adecuados para la mayoría de las bacterias patógenas en lo que a requerimientos nutricionales se refiere y existen suficientes datos recopilados que avalan su uso en las pruebas de sensibilidad. mientras otras como las tetraciclinas parecerán tener mayor actividad. Describiremos aquí los métodos para el estudio de microorganismos no exigentes. aerobio o anaerobio. Las placas deberán estar húmedas pero no mostrar gotas de agua en la superficie. contienen bajo nivel de inhibidores de sulfonamidas. ‡ Efecto de la timina o timidina: los medios que contienen un exceso de timina o timidina pueden revertir los efectos inhibitorios de las sulfonamidas y triometoprim. La realización de estos procedimientos requiere la utilización de cepas de control de calidad con resultados conocidos. de crecimiento rápido. exigente o no exigente. El medio debe ser preparado según las indicaciones del fabricante. trimetoprim y tetraciclinas. aminoglucósidos. etc. de manera de saber si nuestra metodología se realizó en forma correcta. algunos parámetros del medio se deben controlar en cada lote de uso. De los medios disponibles se considera que tanto el agar como el caldo Mueller Hinton (MH) son los más apropiados para las pruebas de sensibilidad de rutina dado que muestran buena reproducibilidad entre los diferentes lotes comerciales. La determinación de la CIM puede realizarse por micro o macro dilución en caldo. capaces de crecer en aerobiosis. Si el pH es más alto se podrán esperar los resultados opuestos. ‡ Humedad: si existe un exceso de humedad en la superficie del agar las placas deben ser incubadas a 35°C durante 10 a 30 minutos antes de utilizarse. de 4 .2-7. salvo que sean envueltas en bolsas de plástico para evitar la desecación. El espesor del mismo debe oscilar entre 3 y 5 mm. aquellas con más de siete días de preparación no son adecuadas. quinolonas y macrólidos parecerán menos activas. El agar debe tener un pH 7. Luego de preparado debe esterilizarse y cuando llega a una temperatura aproximada de 50° C debe ser repartido en las placas de Petri. son baratos.4 a temperatura ambiente.

es uno de los métodos que el NCCLS recomienda para la determinación de la sensibilidad bacteriana a los antibióticos. los controles de calidad se realizan utilizando cepas conocidas.. Deben ser sacados una o dos horas antes de su uso. Tan pronto el disco impregnado en antibiótico se pone en contacto con la superficie húmeda del agar. d) La temperatura de incubación.Laboratorio de Ecología Humana 23-Mar-11 lo contrario deben controlarse con los organismos de referencia. lo cual altera la velocidad de crecimiento bacteriano y su viabilidad. Transcurridas 18 a 24 horas de incubación. Fundamento: el método de disco difusión consiste en depositar en la superficie de una placa de agar MH previamente inoculada con el microorganismo. especialmente si se sabe que este tipo de bacteria puede presentar resistencia a los antimicrobianos más habituales. El antibiograma por disco difusión basado en el trabajo de Bauer. estados de los medios. Kirby y colaboradores. ‡ Cuando a pesar de conocerse la sensibilidad del germen a drogas altamente efectivas. ‡ En estudios epidemiológicos. formándose un gradiente de concentración. tiempos. el filtro absorbe agua y el antibiótico difunde por el agar. A continuación destacaremos algunos de los métodos antes mencionados. es decir el operario puede controlar temperaturas. verificando si hay o no crecimiento de algún microorganismo contaminante. aunque hasta el momento no se halla descrito mecanismos de resistencia para dicho organismo. hisopos estériles. ‡ En el estudio de nuevos antibióticos. los discos pueden o no aparecer rodeados por una zona de inhibición de crecimiento bacteriano. su fecha de vencimiento si se trata de discos. aunque para la lectura de la meticilinorresistencia en S. estufa de 35°C. aureus debe incubarse 24 horas completas. Discos de antibióticos: los discos deben mantenerse en el freezer o en el refrigerador para mantener la actividad del antibiótico. que se caracteriza por ser fácilmente estandarizable y que está indicado para microorganismos no exigentes de crecimiento rápido. Partiendo de una muestra clínica siempre se debe realizar un cultivo puro para poder comenzar el estudio de la sensibilidad antibiótica. Método de disco difusión Este es un método cualitativo. Materiales: suero fisiológico estéril o caldo de cultivo estéril. Si bien estos parámetros pueden ser controlados físicamente. 5 . pinzas estériles o dispensador. Debemos fijarnos siempre en la fecha de vencimiento antes de usarlos. Debemos controlar la esterilidad de cada lote incubando al menos una de sus placas 24 hs o más a 35°C. gradillas. o su potencia si se trata de antibiótico como droga. Para esto se utiliza la técnica de aislamiento en placas que contengan un medio adecuado para la cepa en estudio (al cual además se le deben otorgar las condiciones atmosféricas específicas de esa cepa). descartador. c) El tiempo de incubación: la mayoría de los resultados deben leerse entre 18 y 20 horas. pyogenes a eritromicina en pacientes alérgicos a la penicilina). e) El estado de los antibióticos. discos de papel de filtro impregnados con los diferentes antibióticos. el paciente no puede recibir dicha medicación (sensibilidad de S. ansa bacteriológica. Indicaciones: el antibiograma está indicado en las siguientes situaciones: ‡ Se aísla una bacteria responsable de un proceso infeccioso y no puede predecirse su sensibilidad. etc.

porque de lo contrario pueden haber problemas en la realización de las lectu.Laboratorio de Ecología Humana 23-Mar-11 Patrón de turbidez: para estandarizar la densidad del inóculo se usa una suspensión de sulfato de bario como estándar de turbidez que corresponde a un 0.5 x 108 UFC/ml. 1. ‡ Dejar secar 3 a 5 minutos antes de colocar los discos. Medio: placas de agar MH. Para ello se miran ambos tubos al mismo tiempo contra un fondo blanco con una línea negra como contraste Este método es recomendado cuando el cultivo tiene más de 24 hs de incubación. como caldo MH. Este estándar debe agitarse antes de usar y ser comparado en forma visual con el inóculo preparado. de manera de embeberlo completamente. Las placas deben colocarse en forma invertida para que el agua condensada no caiga sobre el agar. 2. Ventajas: es un método sencillo. lo que cambiaría las condiciones del medio y por lo tanto no serviría para la lectura de los halos. barato y de fácil control y estandarización. Deben extremarse los cuidados en sembrar las placas de borde a borde. Los cultivos de caldo se dejan incubar a 35°C hasta que aparece una turbidez ligeramente visible (generalmente 2 a 5 hs). ‡ Sembrar la placa de MH de manera de obtener un crecimiento confluente. Para detectar la meticilinorresistencia las placas deben incubarse 24 hs completas. En las placas de 150 mm no se colocarán más de 12 discos. Una ventaja 6 . Se toma con un asa bacteriológica tres o cuatro colonias morfológicamente similares y se suspenden en el tubo hasta alcanzar una turbidez comparable a la solución de Mc Farland 0. Procedimiento (como preparar el inóculo): existen dos formas básicamente de cómo preparar el inóculo. Método de suspensión directa de colonias o Kirby-Bauer modificado: se colocan entre 4 y 5 ml de suero fisiológico estéril en un tubo de ensayo. Antes de retirarlo se debe escurrir sobre las paredes del tubo para retirar el exceso de líquido del mismo. Luego de preparado el patrón de turbidez se distribuye en tubos de ensayo (4 a 6 ml por cada tubo). La turbidez se ajusta con suero fisiológico estéril o caldo para obtener una turbidez visualmente comparable a la de un estándar preparado previamente (llamado 0. Estos deben ser colocados con dispensador o pinza estéril. Esta turbidez corresponde a 1. ‡ Colocar los discos. Deben estar a más de 15 mm del borde de la placa y deben distribuírse de manera de que no haya superposición de los halos de inhibición. Luego de preparado el inóculo bacteriano con la cepa en estudio se deben seguir los siguientes pasos: ‡ Introducir el hisopo estéril en el inóculo bacteriano preparado. Método del medio de cultivo líquido o de Kirby-Bauer: con un asa bacteriológica se tocan cuatro o cinco colonias bien aisladas del mismo tipo morfológico y se inocula en 4 a 5 ml de caldo apropiado. para lo cual se estría con el hisopo en forma paralela y bien compacta abarcando toda la superficie de la misma.5 de Mc Farland). Luego de estar sobre el agar se debe presionar los discos levemente para que queden adheridos al mismo. Estos deben ser guardados a temperatura ambiente y protegidos de la luz. y en las placas de 100 mm no es aconsejable colocar más de 6. ‡ Luego de colocados los discos las placas deben incubarse a 35ºC a 37°C en grupos no mayores a cinco placas durante 18 hs.ras. La densidad se corrobora con un espectrofotómetro.5. Luego se repite el procedimiento rotando la placa 60° en dos oportunidades más.5 del nefelómetro de McFarland.

7 . existen tablas proporcionadas por la NCCLS que según el diámetro del halo de inhibición de crecimiento bacteriano. Control de calidad Para proceder a la lectura de los antibiogramas debemos previamente asegurarnos que se cumpla un estricto control de calidad para supervisar la exactitud y fiabilidad de la metodología. para asi poder darle el mejor servicio de salud que podamos. b) inadecuada composición y espesor del medio. d) problemas con el tiempo o temperatura de incubación. sensibilidad y sensibilidad intermedia. La lectura se realiza a través de la medición de los halos de inhibición. Para llevar a cabo eficientemente este control de calidad al mismo tiempo que se realiza el procedimiento para la cepa en estudio.5 de la escala de Mc Farland). microorganismo exigente para el cual se puede hacer un agregado de sangre de oveja desfibrinada en una concentración al 5%. Se debe verificar que los diámetros de inhibición del crecimiento bacteriano de los discos de antibióticos entren dentro de los establecidos en las tablas. Se conocen y se han establecido los rangos de diámetros en el que debe estar la zona de inhibición de crecimiento bacteriano si las condiciones del procedimiento son las adecuadas. Las cepas control utilizadas serán las recomendadas por la NCCLS. c) alteraciones en más o en menos en el inóculo (patrón de turbidez 0. Estas cepas son denominadas ATCC. es que se le pueden realizar algunas modificaciones en cuanto a los requerimientos nutricionales para poder llevar a cabo el antibiograma con microorganismos exigentes o muy exigentes que necesitan más nutrientes que los que este medio les puede ofrecer. definen categorías de resistencia. MEDICIÓN DE LOS HALOS E INTERPRETACIÓN DE LOS MISMOS Luego de corroborar que las cepas ATCC se encuentran en rango procedemos a realizar la lectura de los antibiogramas. Estos datos se encuentran en tablas de la NCCLS. pneumoniae. Planteamiento del problema. de las cuales se sabe su patrón de resistencia o sensibilidad. Estas son cepas conocidas. Es muy importante como médicos conocer el mejor tratamiento disponible para nuestro paciente.Laboratorio de Ecología Humana 23-Mar-11 Adicional del método y específicamente del medio. Al igual que para las ATCC. una marca registrada (American Type Culture Collection). se realiza para una cepa control. Esto se realiza debido a que existe un gran número de variables que pueden afectar los resultados dentro de las que se destacan: a) actividad de los discos (cuidar que no estén vencidos o que pierdan su carga por almacenamiento incorrecto). de lo contrario podremos concluir que existe alguna variable que está cambiando las condiciones en que debe ser realizado el procedimiento. etc. Un ejemplo claro es S. Es por esto que esta prueba es muy útil a la hora de preescribir un medicamento ya que es una fuente confiable sobre la eficacia del mismo sobre la enfermedad u organismo al que queremos atacar con el fármaco. Muchas veces estos agregados generan cambios conocidos en los halos de inhibición del crecimiento bacteriano.

¿Cuáles fármacos inhiben el crecimiento de la colonia y en que medida?. ¿Cuál es el efecto que ejerce cada fármaco sobre el crecimiento de la colonia?. Objetivos. Partimos de un cultivo puro de 48 horas tomamos una colonia con el asa bacteriológica y la disolvemos en 1 ml de solución salina normal o en un medio con nutrientes como el BHI. 8 . contenida en un tubo de ensayo. Con el hisopo estéril tomamos una muestra. Finalmente incubar 24 horas a 37C y en posición invertida tras la incubación va a parecer toda la superficie llena de colonias y alrededor de cada disco aparecerá o no un halo de inhibición dependiendo si el germen es sensible hacia ese antibiótico.Laboratorio de Ecología Humana 23-Mar-11 -Se hizo una prueba de sensibilidad antibacteriana. 5. Materiales y y y y y Solución salina normal o medio de nutrientes Placas de agar Muller Hinton Mechero tipo Fisher Multisensidisco para Gram positivos y Gram negativos Pinzas Método: 1. Métodos y procedimiento. Utilizamos unas pinzas para poner los multidisco sobre el agar. ¿la colonia es resistente a algún fármaco? Con las preguntas anteriores se plantean las dudas generales sobre la eficacia antibacteriana de los 12 farmacos puestos a prueba. 3. puede aparecer un pequeño halo aun siendo resistente esto se debe a la alta concentración de antibiótico en el medio inmediato del disco. 6. observar el crecimiento bacteriano y medir los diámetros de las zonas de inhibición en mm. procurando quitar el exceso de líquido oprimiéndole con las paredes del tubo. 2. Después de 24 horas de incubación sacar las cajas de la estufa bacteriológica. Conocer el método más eficaz y usado actualmente en el ámbito de la medicina asi como reconocer la sensibilidad de ciertas bacterias hacia los antibióticos mas usados en el campo clínico. Con el hisopo extendemos bien el inoculo por toda la superficie de la placa del agar muller hinton 4. el tamaño del halo nos va a permitir conocer el grado de sensibilidad al antibiótico o si es resistente.

La Salmonella es resistente a dos de los doce fármacos: a la Ampicilina y a Cefalotina en los cules el alo de crecimiento fue nulo.-¿Qué se entiende por poder bactericida del suero? R= (PODER BACTERICIDA DEL SUERO) Es la mayor dilución de un ATB en el suero del paciente. es la concentración más baja de un antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo después de su incubación. 4.9). capaz de matar al inóculo en un 99. se define como la mínima concentración de antimicrobiano que elimina a más del 99. La concentración mínima inhibitoria es importante en diagnósticos de laboratorio para confirmar la resistencia de microorganismos a un agente antimicrobiano y además para monitorizar la actividad de los nuevos agentes antimicrobianos.-¿Qué es la concentración bactericida mínima (CBM)? R= La Concentración Mínima Bactericida (CMB).9% de los microorganismos viables después de un tiempo determinado de incubación (generalmente 24 horas) (8.¿Qué se entiende por concentración inhibitoria minima (CIM)? R=La Concentración mínima inhibitoria (CMI).Laboratorio de Ecología Humana 23-Mar-11 Presentación de resultados. 1. 3. capaz de inhibir el desarrollo visible de un microorganismo.9 % 9 . 2. en microbiología. AK AM LEV CF CTX CRO CL GE NET NF FEP SXT Amikacina Ampicilina Levofloxacina Cefalotina Cefotaxima Ceftriaxona Cloranfenicol Gentamicina Netilmicina Nitrofurantoina Cefepime Trimetropin sulfametoxazol 30 µg 10 µg 5 µg 30 µg 30 µg 30 µg 30 µg 10 µg 30 µg 300 µg 30 µg 25 µg Resistente ” 14 ” 13 ” 13 ” 14 ” 14 ” 13 ” 12 ” 12 ” 12 ” 14 ” 14 ” 10 Intermedio 15-16 14-16 14-16 15-17 15-22 14-20 13-17 13-14 13-14 15-16 15-17 11-15 Sensible • 17 • 17 • 17 • 18 • 23 • 21 • 18 • 15 • 15 • 17 • 18 • 16 17 mm 0 25 mm 0 30 mm 26 mm 20 mm 21 mm 17 mm 17 mm 28 mm 27 mm Sensible a 10 de los 12 antibioticos de los cuales el mas eficiente es el Levofloxacina ya que en pocas dosis causa un gran efecto inhibidor.-¿Qué es el poder inhibitorio del suero (PIS)? R= (PODER INHIBITORIO DEL SUERO) Es la mayor dilución de un ATB en el suero del paciente.. Preguntas de revisión.

Metodos de estudio de la sensibilidad antibiótica. Taroco. Bibliografía. V. en las cuales hay muchos factores involucrados. Esta especie de Salmonela no es suseptible a las betalactamasas. Según la pruebas del antibiograma la salmonella es resistente a la ampicilina y a la cefalotina siendo etas dos betalactamasas. Análisis y discusión. gracias a esta prueba se puede conocer con mayor seguridad el fármaco que actúa mejor sobre determinada bacteria para así dar un tratamiento adecuado a la hora de preinscribir algún fármaco para cierta patología.Laboratorio de Ecología Humana 23-Mar-11 5.-¿Qué se entiende por ³SISTEMA EXPERTO´ en microbiología? R= Los Sistemas expertos sirven para resolver cuestiones complejas. y donde se puede definir alguna regla que permita la toma de decisiones rápida. Seija. R. 10 . Al presentar una resistencia significativa este fármaco inhibió el crecimiento de la población de salmonela en el medio de cultivo. se necesita tener en cuenta una amplia base de datos históricos. Conclusiones En esta práctica logramos observar la efectividad de algunos fármacos sobre una cierta bacteria especifica (en este caso la shigella) colocando un multidisco de sensibilidad para hacer el antibiograma. Vignoli. y R. Uruguay.

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