Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed.

Facultad de Química, UNAM. México.

Cuenta en placa de bacterias
OBJETIVOS • • Realizar adecuadamente la técnica de cuenta en placa para diversos grupos microbianos de importancia en alimentos. Interpretar adecuadamente los resultados de la cuenta en placa y sus implicaciones en la calidad del alimento.

GENERALIDADES Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la técnica comúnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta técnica no pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el medio de cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia de oxígeno, permiten seleccionar grupos de bacterias cuya presencia es importante en diferentes alimentos; por ejemplo, las bacterias mesofílicas aerobias, o mesófilos aerobios son un indicador general de la población que pueden estar presente en una muestra y, por lo tanto, de la higiene con que ha sido manejado el producto. Este grupo en particular, se determina en la mayor parte de los alimentos, pero para algunos productos, también es importante determinar la presencia de bacterias termofílicas, psicrofílicas y/o psicrotróficas para predecir la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento. La técnica básica es la misma, pero cambian las condiciones de incubación, medios de cultivo y algunos otros detalles, que se mencionan en la técnica. Si se modifican las condiciones de incubación o se somete la muestra a algún tratamiento previo, el método puede aplicarse también a la detección de otros grupos como anaerobios o esporulados, desde luego, con la adecuada selección de medios de cultivo. El método permite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de diversos factores por lo que es muy importante apegarse a la técnica y controlar cuidadosamente las condiciones. FUNDAMENTO La técnica se basa en contar las “unidades formadoras de colonias” o UFC presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio de cultivo de elección después de un cierto tiempo de incubación a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese microorganismo o microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC. Para que
Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química, UNAM 1

4 a 6 tubos de ensayo de 16 x 150 con tapón de rosca.Giles. con luz adecuada.. de acuerdo con las diluciones) a. NOTAS • El medio de cultivo no debe fundirse más de una vez. de acuerdo con las diluciones) a. • MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES • • • 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad.Palao. UNAM 2 . Contador de colonias de campo oscuro. 6 a 12 cajas de Petri con 20 mL c/u de agar tripotna-glucosa-extracto de levadura (agar cuenta estándar) estériles o el medio requerido en la técnica a. M. la técnica para realizar este procedimiento se describe en “Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análsis microbiológico”. que mantenga la temperatura a 45 ± 1. B. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos.Camacho. con 9 mL de solución amortiguadora de fosfatos o agua peptonada a. antes de ponerla en el medio de cultivo. hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas.Serrano y O. placa de cristal cuadriculada y lente amplificador b. A. no debe exceder de 20 minutos. Registrador mecánico o electrónico b Microscopio óptico b Baño de agua con termómetro. M. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente. pinzas) para tomar muestra a Pipetas bacteriológicas de 10 mL. Facultad de Química.0 ºC (para técnica de vertido en placa) a. Pipetas bacteriológicas de 1 mL. • MATERIAL Y EQUIPO • • • • • • • • • • • Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1.Ortegón. las colonias puedan contarse de manera confiable. tenedor. 2009. provista con termómetro calibrado a. estériles.0 ° a C Utensilios estériles (cuchillo. se hacen las diluciones decimales necesarias de la muestra. 2ª ed. Pipetas Pasteur estériles a 8 a 12 cajas Petri estériles a Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química. A. UNAM. estériles. Varillas de vidrio estériles (en escuadra o “L”) a. y debe mantenerse en baño de agua regulado a 45 ° durante el tiempo suficiente para que alcance C. y hasta su utilización. esta temperatura. México. 6 a 12 tubos de 22 x 175 con 20 mL c/u (o un matraz con 130 ó 250 mL) de agar triptona-glucosa-extracto de levadura (agar para cuenta estándar) fundido y mantenido en baño de agua a 45 ± 1.0ºC.Velázquez. con algodón en el extremo superior (las necesarias. con 90 mL de solución amortiguadora de fosfatos o agua peptonada a. con algodón en el extremo superior (las necesarias. cuchara.

• • Stomacher (homogeneizador peristáltico) a Bolsas estériles para stomacher a NOTAS a b Material necesario al inicio de la práctica Material necesario a las 24 y 48 horas de iniciada la práctica Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química.Serrano y O. A. Facultad de Química.Ortegón. A.Giles.Camacho. M. M. México. B.Palao. 2ª ed. UNAM. 2009. UNAM 3 ..Velázquez. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos.

0 mL 1. CUENTA EN PLACA DE BACTERIAS Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 mL 10-1 Pesar 10 g de muestra en condiciones de asepsia Homogenizar con 90.0 mL 1.Giles. B. M.0 mL de solucion diluyente 10-2 10-3 10-4 Adicionar de 15 a 20 mL de agar triptona extracto de levadura fundido y enfriado a 45° en C Depositar 1.Camacho.. México.Velázquez. UNAM . A.0 mL de 1.Serrano y O. A.0 mL de cada dilución en cajas de Petri estériles por duplicado Homogeneizar muestra y el mediante la agar Incubar las cajas en posición invertida A 37 ° por 24 a 48 h C Contar aquellas placas que tengan entre 25 a 250 colonias y reportar como UFC/g o mL de muestra 4 Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química.Ortegón. M. Facultad de Química. 2ª ed.Palao. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2009. UNAM.

Inocular por duplicado.Velázquez. Para distribuir de manera homogénea. B. mediante pipeta estéril. 2009. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de inocular.Serrano y O. según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate. A. 1. PROCEDIMIENTO 1.1 mL de la dilución correspondiente en cada caja. 2.Palao. 6 en el sentido de las manecillas del reloj. 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación y la adición de medio de cultivo se puedan realizar cómoda y libremente. Técnica de vertido en placa. UNAM 5 . Inocular por duplicado. mediante pipeta estéril. M. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de inocular. Dejar solidificar. cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Incubar las cajas en posición invertida durante el tiempo y a la temperatura que se requiera. Técnica de extensión superficial en placa.Giles. 2. izquierda. Distribuir las cajas con el medio estéril en la mesa de trabajo de manera que la inoculación se pueda realizar cómoda y libremente. no debe exceder de 20 minutos. A. hasta lograr la completa incorporación del inóculo en el medio. 2. 3. 0. Facultad de Química. cuidar que el inóculo se absorba antes de incubar (se recomienda un tiempo de espera aproximado de 10 minutos). 3. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la técnica de “Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico”. México. El tiempo transcurrido desde el momento en que la Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química. extender el inóculo utilizando una varilla de vidrio estéril (en forma de escuadra o “L”) haciendo movimientos giratorios de manera perpendicular al medio de cultivo.Ortegón. M. sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr la completa incorporación del inóculo en el medio. 1 mL de la dilución correspondiente en cada caja.. 1.Camacho. UNAM. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad. 4. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas. 2ª ed. mezclar mediante 6 movimientos de derecha a C. como se indica en el cuadro 1. Agregar de 18 a 20 mL del medio fundido y mantenido a 45 ° Para homogenizar.

M. incluyendo las colonias puntiformes. tomar los mejores disponibles). si se sospecha que es una colonia de este grupo de microorganismos. A. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos.. Después de la incubación. RESULTADOS La selección de las cajas que se toman en cuenta para los cálculos es muy importante para la confiabilidad de los resultados. B. muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se inocula en el medio de cultivo a las cajas. Utilizar el registrador para contar las colonias. Condiciones de incubación para cuenta en placa de diferentes grupos Grupo Bacteriano Termofílicos Mesofílicos Psicrotróficos Psicrofílicos Temperatura 55 ± 2ºC 35 ± 2ºC 20 ± 2ºC 5 ± 2ºC Tiempo de Incubación 48 ± 2 h 48 ± 2 h de 3 a 5 días de 7 a 10 días 5.Camacho. a continuación se especifican las reglas generales para seleccionarlas. según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate. 2009.Velázquez. Incubar las cajas en posición invertida durante el tiempo y a la temperatura que se requiera.Serrano y O.Ortegón. Facultad de Química.Giles. 4. • estadísticos (considerar los duplicados y el mayor número posible de datos) y • funcionales (a falta de datos representativos. UNAM 6 . Realizar microscopía para resolver los casos en los que no se puedan distinguir las colonias de las partículas pequeñas de alimento. México.Palao. 2ª ed. A. contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de mohos y levaduras. UNAM. 3. aplicar las reglas indicadas en RESULTADOS. Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química. pero conviene enfatizar que la selección de cajas obedece a criterios: • lógicos (elegir las que están en rango). CUADRO 1. Si hay desarrollo extendido o un número de colonias superior al del rango de sensibilidad del método. como se indica a continuación. M. se recomienda confirmar por microscopía). Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad. no debe exceder de 20 minutos.

8. se promedian los números y se multiplica por el inverso de la dilución. UNAM. A. B. en este caso. Se consideran “representativas“ las cajas que tienen un número de colonias dentro del rango de sensibilidad del método. Cuando hay una placa con crecimiento extendido. Cuando las 2 placas de una dilución contienen un número de colonias características dentro del rango de sensibilidad del método. si en una caja se cuentan 312 UFC. Si en las placas no hay colonias (o no son características del grupo en estudio). En el ejemplo 5 del cuadro 2. reportar el resultado como: menos de un (grupo) en 10-x (la más baja utilizada). M. Por ejemplo. 7. 3. Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química. por ejemplo < 100 / g si la dilución más baja fue 10-2 ó < 1 / mL si la muestra se sembró directamente. porque el tercer dígito es 2 y se redondea al segundo dígito. se consideran ambas y se promedian.Ortegón. México.Camacho. porque el tercer dígito es superior a 5. 6. el segundo dígito se redondea al siguiente.Serrano y O. Agregar la leyenda "valor estimado". 10. Se cuentan como una sola colonia: • Cadenas o pequeños grupos no separadas claramente entre sí. 4. se aplica el factor de dilución. no se consideran ésta ni su duplicado. que es el inverso y se redondea el número a 2 cifras significativas (o dígitos) y potencias de 10. por ejemplo si en una caja se cuantifican 199 UFC se reportará como 20 x 101 UFC. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. sin diluciones. se consideran las de la menor dilución y se agrega “valor estimado”. respectivamente.5 en la dilución 10-3. se aplica el factor de dilución a cada una y luego se promedia nuevamente. 5. 2.Velázquez. que parecen ser causadas por la desintegración de un cúmulo de bacterias y que están separadas de otras colonias o cadenas. se omite dejando el número de 2 cifras significativas . Cuando una de las 2 placas de una dilución es representativa y la otra no. 9. UNAM 7 . A. se debe reportar como 31 X 101. Si solamente pueden contarse algunos cuadros. Si no hay placas representativas pero hay alguna con un número menor de UFC.Giles. Cuando el tercer dígito del promedio es 4 o menor... entre 25 y 250 UFC. M. considerar que el fondo de una caja Petri de 100 mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador. contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribución de colonias. Se agrega la leyenda: “valor estimado”. Cuando el número de colonias por placa exceda de 250. Cuando el tercer dígito es 5 o superior. Cuando hay placas representativas en 2 diluciones subsecuentes. se promedian cada una con su duplicado (aunque el duplicado no lo sea). Una vez seleccionadas las cajas y hechos los promedios correspondientes. Facultad de Química. Contar por ejemplo. 2ª ed. 2009.Palao. una cuarta parte o una mitad del área de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 ó 2. Las reglas para seleccionar las cajas para los cálculos son las siguientes: 1. el promedio es de 237. por lo que se reportará como 24 x 104 UFC.

Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química. México..Ortegón. A. Facultad de Química. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. y/o cuando la inhibición exceda el 25 % de la superficie de la caja.Velázquez. 2ª ed. UNAM 8 .Camacho. M. se considera que las placas no son representativas y por lo tanto no se toman en cuenta. ejemplifica la aplicación de estos lineamientos. 11. en ese caso. UNAM. B. Se considera “crecimiento extendido” el que se presenta cuando las colonias abarcan más del 50 % de la superficie de la caja. consultarlo para seleccionar las cajas a considerar en los cálculos. con o sin inhibición de crecimiento.Giles.Palao. M. A. El Cuadro 2. Colonias como película en las orillas de la caja. • • Colonias extendidas como película entre el fondo de la caja y el agar y que se diferencian claramente de otras. sobre la superficie del agar.Serrano y O. 2009.

CUADRO 2. Por otra parte se promedia datos de dilución 10-4 (= 27 x 104). 4 8 28 x 10 Se consideran las placas que están dentro del rango y se promedian con sus duplicados. 2ª ed. se promedian datos de 10-4 B > 250 235 26 se realizan los cálculos como en el ejemplo 2 Las cifras sombreadas son las que se consideran adecuadas para realizar los cálculos. 10-2 . aunque éste salga del rango (268). se redondea 237. Finalmente se promedian los resultados de ambas diluciones 4 9 A > 250 215 20 23 x 10 Se promedian datos de 10-3 . Facultad de Química.Giles. UNAM 9 6 < 100 valor estimado 25 x 104 . UNAM. aunque sea en cuadrantes o cuadrícula y se anota “valor estimado”. Ejemplos para el cálculo de resultados de cuenta en placa. M. Se registra como “sensibilidad del método”. M. en este caso 10-2. aunque éstos salgan.. 2009.Serrano y O. se promedian los datos de 10-3.Palao. utilizando ensayos por duplicado. 7 Se promedia el único dato que está dentro del rango (240). A. 1 A B A Diluc iones 10-2 10-3 10-4 > 250 > 250 > 250 178 190 220 B A B A B A B A B A B A B > 250 18 14 > 250 > 250 > 250 > 250 0 0 > 250 > 250 > 250 > 250 138 2 0 > 250 > 250 240 235 0 0 240 268 216 262 28 0 0 512 495 34 Crecim extend.5 a 240. / g o mL 18 x 104 Observaciones Si están dentro del rango. México.pasa a 180 x 103 ó 18 x 104). aunque están fuera de rango. Se anota “valor estimado” Se toma la más alta que se pueda contar. (Rango de sensibilidad: 25 a 250 colonias) Serie Ejemplo duplic. 10-3 (= 179 x 103. Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química. son los más cercanos.Camacho. B. se promedian los datos de la dilución 10-3 (184 x 103 se redondea a 18 x 104) En este caso se promedian datos de diluc. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos.Velázquez. 0 0 24 19 23 42 16 17 25 Resultado UFC. A. con su duplicado.Ortegón. Finalmente se promedian los resultados de ambas diluciones y se redondea el resultado final Se promedian datos de diluc. 2 23 x 104 3 4 5 16 x 102 valor estimado 50 x 105 valor estimado 24 x 104 Se reporta como < 1 en la dilución más baja que se utilizó. Se ignora la dilución 10-4 por el crecimiento extendido.

(Eds. 4th ed. Petran R. NOM-092-SSA1-1994. psicrofílicas ó psicrotróficas. Facultad de Química. según corresponda. Norma Oficial Mexicana. BIBLIOGRAFÍA Secretaría de Salud. A. NOM-109-SSA1-1994.cfsan.. México. Secretaría de Salud.. incluir en el reporte si el alimento cumple o no con la norma. B. A.Ortegón. Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico. Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico. International Commission on Microbial Specifications of Foods (2005) “Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall 2nd ed. México. 2009. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Reportar como se indica a continuación. NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios. M. UNAM. Sustituir “mesofílicas” por termofílicas. México.H.P. Método para la cuenta de Bacterias Aerobias en Placa.htmL Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química.Serrano y O. 10 UNAM .) APHA.. (2001) “Culture Methods for Enumeration of Microorganisms”. Hanlin J.fda.Velázquez.Camacho.Palao. Norma Oficial Mexicana. México.M. Swanson K. Downs F. con potencias de 10: dos cifras significativas y Bacterias mesofílicas aerobias en placa en agar triptona extracto de levadura incubadas por ____ h.gov/~ebam/bam-1. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. & Ito K. 53-67. Washington. Bienes y Servicios. Bienes y Servicios. Arlington. VA: AOAC.Giles. Secretaría de Salud. anotando el tiempo y la temperatura correspondientes.L. Si se analizó un alimento para el cual existe norma y existe especificación sobre el grupo estudiado. http://www. M. Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. Norma Oficial Mexicana. 9th ed. Procedimiento para la Toma. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. a _____ ºC: _______ UFC / g (ó / mL) de muestra. 2ª ed.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful