Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed.

Facultad de Química, UNAM. México.

Cuenta en placa de bacterias
OBJETIVOS • • Realizar adecuadamente la técnica de cuenta en placa para diversos grupos microbianos de importancia en alimentos. Interpretar adecuadamente los resultados de la cuenta en placa y sus implicaciones en la calidad del alimento.

GENERALIDADES Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la técnica comúnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta técnica no pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el medio de cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia de oxígeno, permiten seleccionar grupos de bacterias cuya presencia es importante en diferentes alimentos; por ejemplo, las bacterias mesofílicas aerobias, o mesófilos aerobios son un indicador general de la población que pueden estar presente en una muestra y, por lo tanto, de la higiene con que ha sido manejado el producto. Este grupo en particular, se determina en la mayor parte de los alimentos, pero para algunos productos, también es importante determinar la presencia de bacterias termofílicas, psicrofílicas y/o psicrotróficas para predecir la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento. La técnica básica es la misma, pero cambian las condiciones de incubación, medios de cultivo y algunos otros detalles, que se mencionan en la técnica. Si se modifican las condiciones de incubación o se somete la muestra a algún tratamiento previo, el método puede aplicarse también a la detección de otros grupos como anaerobios o esporulados, desde luego, con la adecuada selección de medios de cultivo. El método permite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de diversos factores por lo que es muy importante apegarse a la técnica y controlar cuidadosamente las condiciones. FUNDAMENTO La técnica se basa en contar las “unidades formadoras de colonias” o UFC presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio de cultivo de elección después de un cierto tiempo de incubación a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese microorganismo o microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC. Para que
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2ª ed. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. antes de ponerla en el medio de cultivo.Serrano y O. provista con termómetro calibrado a. B. UNAM 2 . UNAM. Pipetas Pasteur estériles a 8 a 12 cajas Petri estériles a Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química. estériles. placa de cristal cuadriculada y lente amplificador b. estériles. de acuerdo con las diluciones) a. se hacen las diluciones decimales necesarias de la muestra. las colonias puedan contarse de manera confiable. de acuerdo con las diluciones) a. 2009. con 90 mL de solución amortiguadora de fosfatos o agua peptonada a.Palao. con luz adecuada. México. • MATERIAL Y EQUIPO • • • • • • • • • • • Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1. NOTAS • El medio de cultivo no debe fundirse más de una vez. con 9 mL de solución amortiguadora de fosfatos o agua peptonada a. A.Camacho. no debe exceder de 20 minutos. • MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES • • • 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad.Giles. esta temperatura. Varillas de vidrio estériles (en escuadra o “L”) a. Registrador mecánico o electrónico b Microscopio óptico b Baño de agua con termómetro.0 ºC (para técnica de vertido en placa) a. 6 a 12 cajas de Petri con 20 mL c/u de agar tripotna-glucosa-extracto de levadura (agar cuenta estándar) estériles o el medio requerido en la técnica a. 4 a 6 tubos de ensayo de 16 x 150 con tapón de rosca.Velázquez. tenedor. 6 a 12 tubos de 22 x 175 con 20 mL c/u (o un matraz con 130 ó 250 mL) de agar triptona-glucosa-extracto de levadura (agar para cuenta estándar) fundido y mantenido en baño de agua a 45 ± 1. con algodón en el extremo superior (las necesarias. y debe mantenerse en baño de agua regulado a 45 ° durante el tiempo suficiente para que alcance C. Pipetas bacteriológicas de 1 mL. Contador de colonias de campo oscuro. Facultad de Química.0 ° a C Utensilios estériles (cuchillo. la técnica para realizar este procedimiento se describe en “Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análsis microbiológico”. hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente. cuchara. y hasta su utilización. A. M. pinzas) para tomar muestra a Pipetas bacteriológicas de 10 mL.. que mantenga la temperatura a 45 ± 1. M.0ºC. con algodón en el extremo superior (las necesarias.Ortegón.

M.Palao. M. México.. A.Velázquez. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos.Giles.Ortegón. A. • • Stomacher (homogeneizador peristáltico) a Bolsas estériles para stomacher a NOTAS a b Material necesario al inicio de la práctica Material necesario a las 24 y 48 horas de iniciada la práctica Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química. 2ª ed. Facultad de Química. 2009. B. UNAM.Camacho.Serrano y O. UNAM 3 .

México. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos.0 mL 1. Facultad de Química. B.0 mL 1. UNAM . A.0 mL de 1.Serrano y O.Velázquez. 2009.Palao.0 mL de solucion diluyente 10-2 10-3 10-4 Adicionar de 15 a 20 mL de agar triptona extracto de levadura fundido y enfriado a 45° en C Depositar 1. M. A. 2ª ed.0 mL de cada dilución en cajas de Petri estériles por duplicado Homogeneizar muestra y el mediante la agar Incubar las cajas en posición invertida A 37 ° por 24 a 48 h C Contar aquellas placas que tengan entre 25 a 250 colonias y reportar como UFC/g o mL de muestra 4 Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química.0 mL 10-1 Pesar 10 g de muestra en condiciones de asepsia Homogenizar con 90.Giles..Camacho.Ortegón. UNAM. CUENTA EN PLACA DE BACTERIAS Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9. M.

Giles. 1. cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. UNAM. A. 3. 2. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación y la adición de medio de cultivo se puedan realizar cómoda y libremente. Técnica de vertido en placa. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad. México.1 mL de la dilución correspondiente en cada caja. Para distribuir de manera homogénea.Velázquez. M. Incubar las cajas en posición invertida durante el tiempo y a la temperatura que se requiera. 2. Facultad de Química. mediante pipeta estéril. 1 mL de la dilución correspondiente en cada caja. extender el inóculo utilizando una varilla de vidrio estéril (en forma de escuadra o “L”) haciendo movimientos giratorios de manera perpendicular al medio de cultivo. sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr la completa incorporación del inóculo en el medio. B. mediante pipeta estéril. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. Técnica de extensión superficial en placa. Agregar de 18 a 20 mL del medio fundido y mantenido a 45 ° Para homogenizar. A.. 6 en el sentido de las manecillas del reloj. 0. 3. como se indica en el cuadro 1. 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante. 2ª ed. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la técnica de “Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico”.Ortegón. El tiempo transcurrido desde el momento en que la Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química. 1.Palao. 4. según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de inocular. PROCEDIMIENTO 1. Inocular por duplicado.Camacho.Serrano y O. UNAM 5 . izquierda. no debe exceder de 20 minutos. Distribuir las cajas con el medio estéril en la mesa de trabajo de manera que la inoculación se pueda realizar cómoda y libremente. mezclar mediante 6 movimientos de derecha a C. Dejar solidificar. 2009. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de inocular. M. cuidar que el inóculo se absorba antes de incubar (se recomienda un tiempo de espera aproximado de 10 minutos). 2. hasta lograr la completa incorporación del inóculo en el medio. Inocular por duplicado.

3. 4. Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química. Utilizar el registrador para contar las colonias. no debe exceder de 20 minutos. Después de la incubación. • estadísticos (considerar los duplicados y el mayor número posible de datos) y • funcionales (a falta de datos representativos. M. se recomienda confirmar por microscopía). 2ª ed. si se sospecha que es una colonia de este grupo de microorganismos. M. contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de mohos y levaduras. aplicar las reglas indicadas en RESULTADOS. Realizar microscopía para resolver los casos en los que no se puedan distinguir las colonias de las partículas pequeñas de alimento. RESULTADOS La selección de las cajas que se toman en cuenta para los cálculos es muy importante para la confiabilidad de los resultados. A.Velázquez. UNAM.Serrano y O. A. según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate. México. Incubar las cajas en posición invertida durante el tiempo y a la temperatura que se requiera. incluyendo las colonias puntiformes. 2009. muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se inocula en el medio de cultivo a las cajas.Ortegón. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. como se indica a continuación.Giles. CUADRO 1.Palao. Si hay desarrollo extendido o un número de colonias superior al del rango de sensibilidad del método. pero conviene enfatizar que la selección de cajas obedece a criterios: • lógicos (elegir las que están en rango).. a continuación se especifican las reglas generales para seleccionarlas. Condiciones de incubación para cuenta en placa de diferentes grupos Grupo Bacteriano Termofílicos Mesofílicos Psicrotróficos Psicrofílicos Temperatura 55 ± 2ºC 35 ± 2ºC 20 ± 2ºC 5 ± 2ºC Tiempo de Incubación 48 ± 2 h 48 ± 2 h de 3 a 5 días de 7 a 10 días 5. Facultad de Química. tomar los mejores disponibles). B. UNAM 6 .Camacho.

Una vez seleccionadas las cajas y hechos los promedios correspondientes. se promedian cada una con su duplicado (aunque el duplicado no lo sea). contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribución de colonias. A. 4. considerar que el fondo de una caja Petri de 100 mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador.Serrano y O. el segundo dígito se redondea al siguiente. que es el inverso y se redondea el número a 2 cifras significativas (o dígitos) y potencias de 10. 10. 8. Si en las placas no hay colonias (o no son características del grupo en estudio). Facultad de Química. se promedian los números y se multiplica por el inverso de la dilución. se consideran ambas y se promedian.5 en la dilución 10-3. A. Cuando una de las 2 placas de una dilución es representativa y la otra no. Si solamente pueden contarse algunos cuadros. por ejemplo si en una caja se cuantifican 199 UFC se reportará como 20 x 101 UFC. 2009. Cuando las 2 placas de una dilución contienen un número de colonias características dentro del rango de sensibilidad del método. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química. sin diluciones. 5. 7. 6. Se cuentan como una sola colonia: • Cadenas o pequeños grupos no separadas claramente entre sí. 2ª ed. Las reglas para seleccionar las cajas para los cálculos son las siguientes: 1.. Cuando el tercer dígito es 5 o superior. México. si en una caja se cuentan 312 UFC. B. 9. respectivamente. por ejemplo < 100 / g si la dilución más baja fue 10-2 ó < 1 / mL si la muestra se sembró directamente. UNAM 7 . se aplica el factor de dilución a cada una y luego se promedia nuevamente. Contar por ejemplo. UNAM. no se consideran ésta ni su duplicado.Giles. entre 25 y 250 UFC. Si no hay placas representativas pero hay alguna con un número menor de UFC. M. se omite dejando el número de 2 cifras significativas . Cuando hay placas representativas en 2 diluciones subsecuentes. se aplica el factor de dilución.Camacho. Cuando el tercer dígito del promedio es 4 o menor. porque el tercer dígito es 2 y se redondea al segundo dígito. el promedio es de 237.. se consideran las de la menor dilución y se agrega “valor estimado”. 2. M. que parecen ser causadas por la desintegración de un cúmulo de bacterias y que están separadas de otras colonias o cadenas. una cuarta parte o una mitad del área de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 ó 2.Palao. Se consideran “representativas“ las cajas que tienen un número de colonias dentro del rango de sensibilidad del método. Cuando el número de colonias por placa exceda de 250. Cuando hay una placa con crecimiento extendido. en este caso. 3.Velázquez. Agregar la leyenda "valor estimado".Ortegón. por lo que se reportará como 24 x 104 UFC. En el ejemplo 5 del cuadro 2. porque el tercer dígito es superior a 5. Por ejemplo. Se agrega la leyenda: “valor estimado”. reportar el resultado como: menos de un (grupo) en 10-x (la más baja utilizada). se debe reportar como 31 X 101.

Ortegón. en ese caso. A. México. M. ejemplifica la aplicación de estos lineamientos. A. UNAM 8 . Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química.Velázquez. se considera que las placas no son representativas y por lo tanto no se toman en cuenta. UNAM. 2009. M. con o sin inhibición de crecimiento.Palao. Se considera “crecimiento extendido” el que se presenta cuando las colonias abarcan más del 50 % de la superficie de la caja. El Cuadro 2.Camacho. Colonias como película en las orillas de la caja. B. consultarlo para seleccionar las cajas a considerar en los cálculos.Serrano y O. • • Colonias extendidas como película entre el fondo de la caja y el agar y que se diferencian claramente de otras. sobre la superficie del agar. Facultad de Química. 2ª ed. 11.Giles. y/o cuando la inhibición exceda el 25 % de la superficie de la caja. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos..

en este caso 10-2. A. aunque éste salga del rango (268).Serrano y O. CUADRO 2. Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química. Se ignora la dilución 10-4 por el crecimiento extendido. se promedian los datos de 10-3.pasa a 180 x 103 ó 18 x 104). M. aunque éstos salgan. Por otra parte se promedia datos de dilución 10-4 (= 27 x 104). 4 8 28 x 10 Se consideran las placas que están dentro del rango y se promedian con sus duplicados. 1 A B A Diluc iones 10-2 10-3 10-4 > 250 > 250 > 250 178 190 220 B A B A B A B A B A B A B > 250 18 14 > 250 > 250 > 250 > 250 0 0 > 250 > 250 > 250 > 250 138 2 0 > 250 > 250 240 235 0 0 240 268 216 262 28 0 0 512 495 34 Crecim extend. Ejemplos para el cálculo de resultados de cuenta en placa. aunque están fuera de rango. utilizando ensayos por duplicado. A. se redondea 237. / g o mL 18 x 104 Observaciones Si están dentro del rango.Camacho. 7 Se promedia el único dato que está dentro del rango (240). (Rango de sensibilidad: 25 a 250 colonias) Serie Ejemplo duplic. M.Ortegón. 10-2 . UNAM. aunque sea en cuadrantes o cuadrícula y se anota “valor estimado”. Se registra como “sensibilidad del método”. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 0 0 24 19 23 42 16 17 25 Resultado UFC.5 a 240. son los más cercanos. Facultad de Química. 10-3 (= 179 x 103.. Finalmente se promedian los resultados de ambas diluciones y se redondea el resultado final Se promedian datos de diluc. se promedian datos de 10-4 B > 250 235 26 se realizan los cálculos como en el ejemplo 2 Las cifras sombreadas son las que se consideran adecuadas para realizar los cálculos. Se anota “valor estimado” Se toma la más alta que se pueda contar. UNAM 9 6 < 100 valor estimado 25 x 104 . 2009. México.Palao. se promedian los datos de la dilución 10-3 (184 x 103 se redondea a 18 x 104) En este caso se promedian datos de diluc. B. 2 23 x 104 3 4 5 16 x 102 valor estimado 50 x 105 valor estimado 24 x 104 Se reporta como < 1 en la dilución más baja que se utilizó.Velázquez. 2ª ed. Finalmente se promedian los resultados de ambas diluciones 4 9 A > 250 215 20 23 x 10 Se promedian datos de 10-3 . con su duplicado.Giles.

P. México. Bienes y Servicios. anotando el tiempo y la temperatura correspondientes. Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. Secretaría de Salud.. Método para la cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. A.Palao. UNAM. México. Downs F. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Reportar como se indica a continuación. 10 UNAM . Washington. 2ª ed. Sustituir “mesofílicas” por termofílicas. Petran R. 9th ed. México. incluir en el reporte si el alimento cumple o no con la norma..M.cfsan. Bienes y Servicios. México. http://www.Giles.Ortegón.Velázquez. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. Swanson K. NOM-110-SSA1-1994. Arlington. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 53-67. según corresponda. 4th ed. Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.fda. (Eds. a _____ ºC: _______ UFC / g (ó / mL) de muestra. Si se analizó un alimento para el cual existe norma y existe especificación sobre el grupo estudiado. Norma Oficial Mexicana. (2001) “Culture Methods for Enumeration of Microorganisms”. psicrofílicas ó psicrotróficas. M.) APHA..H. Procedimiento para la Toma.Camacho. VA: AOAC. Secretaría de Salud.L. & Ito K. Facultad de Química.Serrano y O. 2009. Norma Oficial Mexicana. A.htmL Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Química.gov/~ebam/bam-1. BIBLIOGRAFÍA Secretaría de Salud. Hanlin J. Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico. Norma Oficial Mexicana. International Commission on Microbial Specifications of Foods (2005) “Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall 2nd ed. Bienes y Servicios. B. con potencias de 10: dos cifras significativas y Bacterias mesofílicas aerobias en placa en agar triptona extracto de levadura incubadas por ____ h. M. NOM-109-SSA1-1994. NOM-092-SSA1-1994.