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RESUMEN
1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
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teoría se consideran inertes, pueden generar diferentes procesos de adsorción,
por lo que la separación ocurrirá también, en parte, debido a la interacción entre
las moléculas a separar con dicho soporte, la cual actuaría como fuerza de
frenado. La fase estacionaria se forma suspendiendo o embebiendo el soporte
con el solvente adecuado; éste recubre las partículas del soporte y es retenido
por adsorción y/o capilaridad. El espacio entre las partículas del soporte será
utilizado por la fase móvil para su desplazamiento. Debemos de tener en cuenta
que como fase móvil se suelen utilizar solventes hidrófobos cuando haya que
separar compuestos no polares y solventes acuosos cuando haya que separar
sustancias polares. Por su parte, la fase estacionaria, que debe ser al menos
parcialmente inmiscible con la móvil, suele ser por lo general hidrofílica, aunque
también pueden utilizarse compuestos hidrófobos.
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no son visibles, se pueden revelar mediante técnicas analíticas concretas. Se
determina la posición de cada mancha relativa al frente alcanzado por el
solvente, calculándose el correspondiente valor de Rf. La detección de los
compuestos una vez realizada la cromatografía se puede llevar a cabo en base a
sus propiedades espectroscópicas, fluorimétricas, haciéndolos reaccionar con
reactivos específicos, radioisotópicamente, etc. La identificación de tales
compuestos se suele realizar comparando sus Rf con los de compuestos de
referencia (patrones) de naturaleza química conocida. Alternativamente, los
diferentes compuestos, una vez localizada su posición por un método no
destructivo, pueden eluirse de la placa raspando las zonas correspondientes y
extrayendo el polvo obtenido con un solvente adecuado.
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Hay una amplia gama de métodos colorimétricos que permiten la
determinación cuali- y cuantitativa de aminoácidos. Aunque son métodos muy
generales, algunos de ellos permiten discriminar entre diferentes tipos de estos
compuestos. Así, hay métodos de determinación de aminoácidos con el grupo
amino libre (método de la ninhidrina), de aminoácidos con núcleos aromáticos
(reacción xantoproteica), de los que poseen un grupo indólico (triptófano;
reacción con el ácido glioxílico), un anillo fenólico (tirosina; reacción de Millon),
de aminoácidos azufrados (cisteina; reacción con nitroprusiato sódico). En todos
los métodos, el aminoácido reacciona con otro compuesto formando derivados
coloreados que se pueden determinar cuantitativamente por espectroscopía
visible.
1.5. Objetivos
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i) Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina sobre gel de
sílice.
ii) Revelado de los aminoácidos mediante la reacción coloreada con la
ninhidrina.
iii) Cálculo del valor de Rf para cada uno de los aminoácidos. Justificación de
las diferencias en Rf de los distintos aminoácidos.
iv) Identificación de la naturaleza de aminoácidos desconocidos.
2.1. Equipamiento
Secador de pelo.
Placa de silicagel para cromatografía en capa fina.
Agitador de tubos.
Tanque cromatográfico.
2.2. Material
2.3. Reactivos
Glutamato.
Glicina.
Lisina.
Prolina.
Leucina.
Solución problema de aminoácidos.
Etanol.
Hidróxido amónico.
Ninhidrina.
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Figura 2. Material empleado en la práctica.
3. PROTOCOLO A REALIZAR
ADVERTENCIAS: No hay que tocar la parte del silica gel de la placa con las
manos, ya que la contaminaríamos con aminoácidos procedentes de nuestras
manos. No utilizar nunca bolígrafo ni rotulador. No horadar la placa cuando la
marquéis.
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En cada punto (identificados con el nombre de cada uno de los aminoácidos)
se aplicarán tres gotas de la solución de aminoácidos y solución problema (un
aminoácido en cada punto y en el último la solución problema). Se utiliza un
capilar para aplicar la muestra gota a gota (hacerlo con mucho cuidado). Se seca
con un secador de pelo después de haber aplicado cada gota. Se marca con
lápiz, y en el extremo opuesto de la placa, algún indicativo del grupo que realiza
la cromatografía.
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Figura 4. Desarrollo de la práctica.
4. RESULTADOS
Figura 5. Esquema de los resultados de una cromatografía en capa fina y cálculo del Rf.
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Tabla 1. Distancia recorrida por cada uno de los aminoácidos y cálculo del Rf
Aminoácido Distancia recorrida Rf
(cm)
Glutamato
Glicina
Lisina
Prolina
Leucina
5. DISCUSIÓN Y COMENTARIOS
Se deben justificar las diferencias en los valores de Rf para cada uno de los
aminoácidos, así como las formas de la mancha, tipo de color e intensidad. A
partir de la estructura química hay que relacionar el mayor o menor valor de Rf
con la mayor o menor solubilidad en las fases estacionaria y móvil.
6. BIBLIOGRAFÍA COMENTADA
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ANEXO 1: SOLUCIONES
Solución de aminoácido al 1 %
100 ml
Aminoácido 1g
n-Propanol 10 ml
Agua destilada Hasta 100 ml
2. Solución de eluyente
Solución de eluyente
200 mL
Etanol 210 mL
Solución de hidróxido amónico 90 mL
Solución de ninhidrina
100 ml
Ninhidrina 0,2 g
Agua detilada Hasta 100 ml
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