Laboratorio 4:

Tincin de microorganismos
Biol 3725L

Repaso de diluciones
1 ml

0.1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

9 ml
1 / 10
10-1

99 ml
1 / 100
10-3

9 .9ml
0.1/ 10
1/ 100
10-5

9 ml
1/10
10-6

9 ml
1/10
10-7

1 ml

1 ml

0.1 ml

1 ml

Cuntas colonias viables

tengo?
1. Escojo el plato que tenga
entre 25 250 UFC.
2. Utilizo la frmula de:
UFC * (1/factor de
dilucin)

10-8

TMTC

10-6

265 UFC

10-7

25 UFC

2 UFC

Reportar datos:
1. Placas con estriado: obtuvo o no colonias discretas
2. Dilucin en serie: reporte UFC/mL para las tres placas
utilizadas en su sub-grupo (incluya los clculos)

Objetivos
Conocer el mecanismo bsico y ventajas de una
tincin.
Aprender conceptos bsicos relacionados a:

Proceso de preparacin de un frotis

Tincin Gram
Tincin cido-Resistente
Tincin de Esporas
Tincin de Cpsula (negativa).

Identificar caractersticas en las bacterias en estudio

en base a las diferentes tinciones.

Tinciones de microorganismos
Tincin Gram (prctica)
Tincin de Cpsulas - Tincin Negativa (prctica)
Tincin de Esporas (prctica)
Tincin cido-Resistente (teora)
Tincin de flagelos (teora)

Morfologa y agrupacin de
bacterias
Ya se han discutido mtodos
de clasificacin por morfologa
y medios de cultivo.
Ahora utilizaremos tinciones
con el fin de poder seguir
caracterizando a las bacterias.

Espiroquetas
Coco
Bacilo

Morfologa y agrupacin de bacterias:

Tincin
La tincin es una de las tcnicas ms utilizadas en los
laboratorios de microbiologa para clasificar microorganismos.
El tinte es un compuesto orgnico que le da contraste a la
clula.
cromgeno (solvente orgnico que le provee las
propiedades de color)
auxcromo (grupo qumico que se ioniza con el cromgeno
y forma sales que se pegan a las fibras y tejidos).
La adhesin del tinte va a depender de la carga que posea.

Tincin

Tipos de Tinciones
Simple
Tamao, arreglo
y forma
Un solo tinte
Directa
Tie bacteria
Negativa
tie el fondo
pero no a la
bacteria

Diferencial
Separar y clasificar
los microorganismos
observados de
acuerdo a sus
caractersticas
Ms de un tinte

Ejemplos:
Tincin Gram y cido
resistente

Especfica
Para identificar
estructuras:
Ejemplos: Tincin
de flagelos,
cpsulas y esporas.

Tincin simple: un solo tinte , afinidad por carga con componentes

de la superficie de la clula
Ejemplo : azul de metileno
(+)

(-)

(-) (-)
(-)

(-)

(-)

(-)
methylene blue

(-)

(-)
(-)

(-)

(-)
(-) (-)

Tincin diferencial: permite detectar tipos distintos de clulas

Azul-Violeta

Rojo

Pasos de la
Tincin Gram
Cristal violeta (1
minuto)
Lavar con agua (Streptococcus sp.)
Yodo (1 minuto)
Lavar con agua
Alcohol etlico al
95% (20 segundos)
Lavar con agua
Safranina (1 minuto)
Lavar con agua
Secar con bibolous
paper

Gram+= azul-violeta,
Gram = rojo

(Escherichia coli)
Desventajas de tcnicas de
tincin:

requieren fijar la muestra

con calor: (clulas mueren)
calor + qumicos pueden
distorsionar la forma original
de las clulas

Tincin Gram
Tinte primario- Cristal Violeta (CV), tie la bacteria
color violeta.
Agente mordante- Yodo, forma un complejo insoluble
con CV. Ayuda a adherir el tinte a la clula. Ayuda a
resistir la decoloracin.
Agente decolorizante- alcohol etlico al 95%, sirve
como solvente de lpidos y agente deshidratante de
protenas. Remueve el cristal violeta.
Contratinte- Safranina, tie de rojo la bacteria.

Resultados - Tincin Gram

Gram Negativo

Gram Positivo

Su pared celular contiene una

capa gruesa de
peptidoglicano

Gram +

Reaccin se basa en la
diferencia en la composicin
qumica de la pared bacteriana.

Gram Su pared celular contiene una

capa fina de peptidoglicano

Pared celular procariota

Peptidoglicano: polmero de dos azcares modificadas (N-acetil glucosamina
y N-acetil cido murmico ) y tetrapptidos
enlace , 1-4

G = N-acetil glucosamina
M = N-acetil cido murmico (murena)

tetrapptido (4 amino cidos)

Pared celular procariota

G
G

M
M

G
G

G
G

M
M

M
M

G
G

G
G

M
M

M
M

G
G

G
G

M
M

G
G

M
M

Tincin Gram
Fundamento
Membrana externa de las Gram
es soluble en solventes orgnicos como el alcohol
la capa de peptidoglicano es demasiado delgada como para
retener el complejo cristal violeta/yodo que se form
por lo que va perdindose el color azul-violeta.

Las Gram + no tienen su capa susceptible a la accin

de solventes orgnicos
se deshidratan los poros y se cierran
retenindose el complejo cristal violeta/yodo y por
consiguiente el color azul-violeta.

Preparacin de la muestra para

proceso de Tincin
Preparacin de frotis:
Limpiar la laminilla con papel de
lentes.
Prepara el frotis
Medio lquido- solo se coloca una
porcin del cultivo con el loop en
la laminilla.
Medio slido- se coloca una gotita
de agua destilada en la laminilla y
se diluye la porcin de cultivo en
ella. Se esparce bien.
Secar a temperatura ambiente
Fijacin por calor

Tincin Gram
Laminilla

Control positivo
Gram + (Bacillus cereus)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Desconocido

Control negativo
Gram (E. coli)

Cubrir frotis con tinte cristal violeta (1 minuto).

Enjuague con agua destilada para remover el exceso de tinte.
Cubrir frotis con yodo (1 minuto).
Enjuague con agua destilada.
Enjuague la laminilla con alcohol etlico 95% (no exceder los 30 seg).
Enjuague la laminilla con agua destilada.
Cubrir frotis con tinte safranina (1 minuto).
Enjuague con agua destilada para remover el exceso de tinte.
Secar laminillas con papel bibulous para remover el exceso de agua.

Secuencia de reacciones

Tincin de Cpsulas
Cpsula- estructura gelatinosa secretada por algunas
bacterias
capas de polisacridos o protenas que revisten el exterior
de un bacteria
Funcin: adherencia y formacin de biopelculas (capas de
crecimiento bacteriano) y proteccin contra fagocitosis
(macrfagos, sistema inmunolgico)

La cpsula se compone de polisacridos, glicoprotenas

y polipptidos.
La mayora de las cpsulas estn compuestas de
polisacridos, por lo que son solubles en agua.

Tincin de Cpsulas

cpsula

Tincin de Cpsulas

Tinte primario- Cristal Violeta 1%- tie todo el frotis color oscuro

Decolorante y Contratinte- Sulfato de Cobre 20%-se usa para enjuagar el

tinte primario

No se enjuaga con agua porque la cpsula es soluble en agua funcin de decolorante

El CuSO4 es absorbido en el material de la cpsula que ha sido
decolorada - funcin de contratinte.
La cpsula aparece azul clara en un fondo oscuro.

Tincin de Cpsulas
Preparacin de un frotis cargado (heavy).
Dejar secar a temperatura ambiente.
Cristal violeta 1% (5-7 minutos).
Enjuagar con CuSO4
Secar con bibulous paper

Cryptococccus laurentii

Tincin de Cpsulas
Tincin simple-negativa
La tincin se logra mediante una mezcla del tinte y el cultivo
de bacteria.
El tinte utilizado es India Ink (Se puede utilizar tambin

eosina o nigrosina).
Se le conoce como efecto de cielo estrellado.

Efecto de Cielo estrellado

Tincin de Cpsulas
Tincin simple-negativa

 Clula vegetativa- forma metablicamente activa = bacterias.

Esporas- forma metablicamente inactiva y altamente
resistente.
Los miembros del gnero anaerobio Clostridium y del gnero
aerobio Bacillus pueden existir metablicamente activos o
inactivos.

Formacin de esporas como

mtodo de sobrevivencia
En condiciones
ambientales hostiles
ocurre esporognesis la
cual forma la endospora.
En condiciones
ambientales favorables,
ocurre germinacin, lo cual
forma la clula vegetativa
(bacteria).

Formacin de esporas como

mtodo de sobrevivencia

Endosporas
La esporognesis y la germinacin no son medios de
reproduccin, son mecanismos de supervivencia de
la clula.
La composicin qumica de la bacteria la hace
resistente a:

Calor extremo o excesivo

Congelacin
Radiacin
Desecacin
Agentes qumicos

Tincin de Esporas
Tinte primario- Verde Malaquita, requiere calor para la
penetracin de este tinte.
Agente decolorante- Agua, remueve el exceso de tinte, decolora la
clula vegetativa.
Contratinte- Safranina, tie las clulas vegetativas.
Note: De obtener una coloracin roja al final del proceso de tincin
observando bajo el microscopio, solo se puede determinar que se
tienen clulas vegetativas. No se puede concluir que es Gram -, eso
sera otro procedimiento a realizar si se quisiera determinar si es
Gram + o -.

Tincin de Esporas
Parrilla de
metal

Beaker
Agua

Laminilla con
frotis
1. Cubrir frotis con tinte verde malaquita y
permita que el colorante humee, pero no
hierva.
2. Espere 5 minutos. Si durante los 5 minutos
el tinte se seca aada ms tinte.
3. Enjuague la laminilla con agua destilada.
4. Coloque tinte safranina (30 seg).

Hot Plate

5. Seque la laminilla en papel bibulous.

6. Observe y dibuje la coloracin, morfologa y
arreglo de las bacterias bajo el microscopio.

Resultado

Bacillus cereus
Espora (color
verde)
Clula vegetativa (color rojo)

Tincin cido-Resistente
Las familias Mycobacteriae
y Nocardiaceae son cido
resistente.
Los microorganismos cidoresistentes se caracterizan
por tener una pared celular
gruesa de cera (lipoidal) que
contiene cido miclico.

Tincin cido-Resistente
Tinte primario- Carbolfucsina-tinte rojo fenlico (5%).
Puede penetrar la pared celular de las micobacterias.
Agente decolorizante- alcohol cido
(3% HCl +95% alcohol etlico).
Contratinte-Azul de metileno- se utiliza para teir de azul
las bacterias que quedaron incoloras.
Los organismos que son decolorados por el alcohol cido
no son cido resistente.
Azules: no son cido resistentes (no tienen cido miclico en la
pared)

Tincin cido-Resistente

Mycobacterium tuberculosis
Observar laminillas!!!

Tincin de flagelos
Tipo de tincin en la que se pueden visualizar el (los) flagelo(s).
Utiliza 2 tintes:
cido tnico (agente mordante: engruesa los flagelos)
Rosalina (colorante que los define)

Mobiluncus spp.

Resumen resultados de tinciones

Tincin Gram (estructura de pared celular)

Tincin de esporas

Tincin de cpsula

Recapitulacin
Cul es la diferencia entre una tincin simple y una
diferencial?
Qu tipo de tincin es la Gram?
Cul es el fundamento?
Reactivos utilizados en la tincin Gram
Qu otro tipo de tinciones puede mencionar?
Cuales son algunas limitaciones de las tinciones?