Medios de Cultivos

Cabronio 5.
Medios de Cultivo
y
Pruebas Bioqumicas
Medios
de
Cultivo
INTRODUCCIN
Uno de los sistemas ms importantes para

la identificacin de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias
alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio.
El material alimenticio en el que crecen los

microorganismos es el Medio de Cultivo y
el crecimiento de los microorganismos es
el Cultivo.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial

debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de
humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de
acidez o alcalinidad.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de

medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua
hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones
no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por
aquellas que crecen en l.
Medios de Cultivo
Clasificacin de los medios de cultivo basndose en su
composicin qumica
A.- Medios sintticos o qumicamente definidos. Llevan fuente de carbono,
fuente de nitrgeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca), otros
elementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella
abortus) pero siempre a concentraciones conocidas.
B.- Medios complejos o de composicin indefinida. Estos medios llevan

ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusin de cerebro,
extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero sin
saber con exactitud la composicin cualitativa ni cuantitativa de estos
nutrientes.
C.- Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con

aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados
microorganismos (particularmente hetertrofos exigentes).
Ejemplo: adiccin de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.
D.- Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseo el crecimiento
especfico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de
gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una poblacin
microbiana mixta.
Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para auttrofos; adicionando

cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram. (+); utilizando maltosa como
nica fuente de carbono slo crecern los que usen maltosa.
E.- Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la

discriminacin de microorganismos de una mezcla por sus propiedades
diferenciales de crecimiento en dichos medios.
Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolticos de no hemolticos; McConkey

diferencia lactosa (+) de lactosa (-).
F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento

ptimo ya que el crecimiento rpido y prolfico suele ocasionar la muerte
rpida de las clulas.
Ejemplo: al aadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen
cidos, acidificndose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa
en los medios de mantenimiento.
Agar-Agar
Agar Nutritivo
Medio de cultivo utilizado para propsitos generales, para el aislamiento de
microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos
nutritivos.
Su uso est descrito en muchos procedimientos para el anlisis de
alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.
Frmula (en gramos por litro)
Instrucciones
Pluripeptona
5.0
Extracto de carne
3.0
Cloruro de sodio
8.0
Agar
15.0
pH final: 7.3
Suspender 31 g de polvo por litro de agua

destilada. Mezclar y dejar reposar 5
minutos. Calentar suavemente agitando y
hervir 1 o 2 minutos hasta su disolucin.
Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15
minutos.
0.2
Fundamento
Es un medio usado para el cultivo de
microorganismos poco exigentes en sus
requerimientos
nutricionales.
No
contiene
inhibidores del desarrollo bacteriano.
La pluripeptona es la fuente de carbono y
nitrgeno para el desarrollo bacteriano.
El agregado de cloruro de sodio permite el
enriquecimiento con sangre de carnero u otras
sustancias
para
facilitar
el
cultivo
de
microorganismos exigentes.
Caractersticas del medio: mbar claro

a medio ligeramente opalescente.
Xanthomonas campestris
Base Agar Gelosa Sangre

Medio para propsitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos
microorganismos. Con la adicin de sangre, el medio es til tanto para el
aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios
nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, como
para la observacin de reacciones de hemlisis.
Tambin, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para
preparar el medio agar chocolate.

Infusin de msculo de corazn
375.0
Peptona
10.0
Cloruro de sodio
5.0
Agar
15.0
pH final: 7.3
0.2
Fundamento
La infusin de msculo de corazn y la
peptona, otorgan al medio un alto valor
nutritivo, que permite el crecimiento de
una gran variedad de microorganismos,
an de aquellos nutricionalmente
exigentes.
El cloruro de sodio mantiene el balance
osmtico.
El agregado de sangre al medio de
cultivo, en concentracin final de 5-10
%, aporta nutrientes para el crecimiento
bacteriano,
y
permite
detectar
hemlisis.
Caractersticas del medio

Medio preparado: mbar.
Medio preparado con 5% de sangre
de carnero: rojo cereza.
E.M.B. Agar
Este medio es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram
negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el
desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.
Peptona
10.0
Lactosa
5.0
Sacarosa
5.0
Fosfato dipotsico
2.0
Agar
Eosina
Azul de metileno
13.5
0.4
0.065
Instrucciones
Suspender 36 g del polvo en un litro
de agua destilada. Reposar 5 minutos;
mezclar, calentando a ebullicin
durante 1 o 2 minutos hasta su
disolucin. Esterilizar en autoclave a
no ms de 121 C durante 15 minutos.
Enfriar a 45 C y distribuir agitando
suavemente.
pH final: 7.2
0.2
Fundamento
Este medio combina las frmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para
obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y
otras especies de bacilos Gram negativos.
La diferenciacin entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y
aquellos que son incapaces de hacerlo, est dada por los indicadores eosina y
azul de metileno; stos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram
positivas.
Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un caracterstico
brillo metlico.
Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o
rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras.
Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes
Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y

transparentes,
La siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en

C. albicans
Mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden

dar colonias de color azul lavanda. esto puede ocurrir aunque las
cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello
se debe a la incorporacin de azul de metileno a sus membranas.
En este medio se obtiene adems, un buen desarrollo de especies de
Salmonella y Shigella.
Resultados
Microorganismos
Tipo de Colonia
Escherichia coli
Verdosas con brillo metlico y centro negro

azulado
Klebsiella pneumoniae
Mucosas, rosa prpura, confluentes
Proteus mirabilis
Incoloras
Enterococcus faecalis
Incoloras, pequeas, puntiformes
Shigella flexneri
Incoloras
Salmonella typhimurium
Incoloras
Mac Conkey Agar

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil
desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias
que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas
las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.
Peptona
Pluripeptona
Lactosa
Instrucciones
17.0
3.0
10.0
Mezcla de sales biliares
1.5
Cloruro de sodio
5.0
Agar
13.5
Rojo neutro
0.03
Cristal violeta
0.001
Suspender 50 g del polvo por litro de

agua destilada. Reposar 5 minutos y
mezclar hasta uniformar. Calentar
suavemente y hervir 1 a 2 minutos
hasta disolver. Esterilizar en autoclave
a 121 C durante 15 minutos.
pH final: 7.1
0.2
Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el
desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla
de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el
desarrollo
de
gran
parte
de
la
flora
Gram
positiva.
Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia.
Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en
las colonias, y la precipitacin de las sales biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.
Resultados
Microorganismos
Colonias
Escherichia coli
Rojas con halo turbio
Rosadas mucosas
Incoloras, transparentes
Shigella flexneri
Proteus mirabilis
Diminutas, incoloras, opacas

Medio preparado: rojo prpura
Estafilococo 110 Agar

Es un medio selectivo para el aislamiento y diferenciacin presuntiva de
estafilococos, en base a la produccinde pigmentos, la fermentacin de
manitol y la hidrlisis de gelatina, a partir de alimentos y otras muestras.
Extracto de levadura
2.5
Triptena
10.0
Gelatina
30.0
Lactosa
2.0
D-Manitol
10.0
Cloruro de sodio
75.0
Fosfato dipotsico
Agar
Instrucciones
5.0
Suspender 149 g del medio en un

litro de agua destilada. Reposar 5
minutos y mezclar calentando a
ebullicin durante 1 o 2 minutos.
Esterilizar en autoclave durante 15
minutos a 121 C. Verter en placas y
mezclar para dispersar el
precipitado.
15.0
pH final: 7.0
0.2
Fundamento
Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicacin
alimentaria, y para su aislamiento, pueden usarse distintos medios slidos
selectivos: Baird Parker Medio, Manitol Salado Agar, o Estafilococo Medio
110.
En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la triptena aportan los
nutrientes para el desarrollo de microorganismos. La gelatina es el sustrato de
la enzima gelatinasa. La lactosa y el manitol son los hidratos de carbono
fermentables. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentracin, para
inhibir el desarrollo de la flora acompaante excepto Staphylococcus spp.,
logrndose as un medio selectivo para el desarrollo de estos
microorganismos.
Las ventajas de este medio por sobre los otros mencionados anteriormente,
es que permite, en la misma placa, obtener pruebas de identificacin
presuntiva de especie como ser: desarrollo de pigmentos, fermentacin de
manitol e hidrlisis de la gelatina.
Resultados
Observar las caractersticas de las colonias y realizar las pruebas de
identificacin de microorganismos.
1-Fermentacin de manitol: agregar unas gotas de prpura de
bromocresol a las zonas donde se encuentran las colonias sospechosas y
en una zona de la placa donde no hay desarrollo bacteriano. Comparar el
color desarrollado entre estas dos zonas.
Prueba positiva: cambio de color del indicador del medio en la zona de
crecimiento bacteriano. El medio sin desarrollo de microorganismos
permanece sin cambio.
Prueba negativa: no hay diferencias de color entre las zonas de crecimiento
bacteriano y la zona sin inocular.
2-Hidrlisis de la gelatina: cubrir la placa 5 ml de una solucin saturada de sulfato de

amonio y colocar en estufa, a 35-37 C, en aerobiosis durante 10 minutos.
Positiva: halo transparente alrededor de las colonias.
Negativa: ausencia de halo transparente alrededor de las colonias.
Resultados
Microorganismo
Pigmento
Fermentacin de
manitol
Hidrlisis de
la gelatina
Prueba de la
coagulasa
S. aureus
S. aureus
S. epidermidis

Medio preparado: mbar claro, opalescente con precipitado.
Sal y Manitol Agar

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y
diferenciacin de estafilococos.
Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patognicos a partir
de muestras clnicas, alimentos, productos cosmticos y otros materiales
de importancia sanitaria.
Tambin, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halfilas
de Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio
Marino, etc.), aunque algunas especies pueden no desarrollar.
Extracto de carne
Instrucciones
1.0
Pluripeptona
10.0
d-Manitol
10.0
Cloruro de sodio
75.0
Agar
15.0
Rojo de fenol
0.025
Suspender 111 g de polvo por litro de

mezclar calentando a ebullicin
durante 1 o 2 minutos. Distribuir y
esterilizar en autoclave a 118-121 C
durante 15 minutos.
pH final: 7.4
0.2
Fundamento
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina.
Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio;
las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante.
Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una
zona roja o prpura. Las colonias sospechosas, se repicarn en un medio sin exceso
de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente

de carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono
fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentracin) es el
agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompaante, y el rojo fenol
es el indicador de pH.
Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y

fermentan el manitol, producen cidos, con lo que se modifica el pH del
medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo.
Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no
fermentar el manitol.
Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan
como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color.
Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias
rojas, rodeadas de una zona del mismo color o prpura.
Resultados
Microorganismos
Crecimiento
Caractersticas de las colonias
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Excelente
Amarilla
Staphylococcus epidermidis ATCC

14990
Bueno
Roja
Escherichia coli ATCC 25922
Inhibido
Inhibido
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
Inhibido
Inhibido

Medio preparado: rojo
Salmonella Shigella Agar

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas
especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los
cuales se sospeche su presencia.
Instrucciones
Pluripeptona
5.0
Extracto de carne
5.0
Lactosa
10.0
Mezcla de sales biliares
8.5
Citrato de sodio
8.5
Tiosulfato de sodio
8.5
Citrato frrico
1.0
Agar
Verde brillante
Rojo neutro
13.5
Suspender 60 g del polvo por litro de

mezclar hasta homogeneizar.
Calentar a ebullicin durante 2 o 3
minutos. NO ESTERILIZAR EN
AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50 C y
distribuir unos 20 ml por placa.
Secar la superficie del medio unos
minutos en la estufa.
0.00033
0.025
pH final: 7.0
0.2
Fundamento
Es
un
medio
de
cultivo
selectivo
y
diferencial.
La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el
desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayora de los coliformes y el
desarrollo invasor del Proteus spp.
Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido
sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio.
Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar,
acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obtenindose
colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.
Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa,
crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes.
La produccin de cido sulfhdrico se evidencia como colonias con centro negro
debido a la formacin de sulfuro de hierro.
Resultados
Microorganismos
Colonias
Transparentes, centro negro
Shigella flexneri
Incoloras
Shigella sonnei
Incoloras
Proteus mirabilis
Transparentes, centro negro
Escherichia coli
Rosadas a rojas
Rosadas cremosas y mucosas
Incoloras, de muy escaso

crecimiento

Medio preparado: rojo naranja.
A. Klebsiella pneumoniae. Acid + Lac +

B. Escherichia coli .Acid + Lac +
C: Salmonella sp..H2S
D: Proteus mirabilis H2S
E: Pseudomona aeruginosa
Mueller Hinton Agar

Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de
sensibilidad a los antimicrobianos. Adems es til con el agregado de sangre
para el cultivo y aislamiento de microorganismos nutricionalmente exigentes.
Infusin de carne
300.0
Peptona cida de casena
17.5
Almidn
1.5
Agar
15.0
Instrucciones
Suspender 37 g del medio deshidratado

en un litro de agua destilada. Dejar
embeber de 10 a 15 minutos. Calentar
con agitacin frecuente y hervir durante
1 minuto. Esterilizar a 121 C durante 15
minutos. Enfriar a 45 -50 C y distribuir a
cajas de Petri (o agregar los
suplementos que se desee) hasta un
nivel de 4 mm sobre una superficie
horizontal (25-30 ml en placas de 9 cm
de dimetro).
pH final: 7.3
0.1
Fundamento
El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), recomend su uso en
forma rutinaria para la realizacin del antibiograma en medio slido, debido
a una serie de factores :
presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad,
su contenido en inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina es
bajo,
la mayora de los patgenos crece satisfactoriamente
Cuando se suplementa con sangre de carnero al 5%, es til para realizar las
pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos en especies de estreptococos.
Resultados
Consultar en la seccin prueba de sensibilidad a los antimicrobianos, la
metodologa apropiada.

Chromobacterium violaceum
Pseudomona aeruginosa
Streptococcus pyogenes
Cerebro Corazn Infusin

Medio lquido adecuado para el enriquecimiento y cultivo de bacterias
aerobias y anaerobias, de microorganismos exigentes como estreptococos,
neumococos y otros microorganismos de difcil desarrollo.
Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 100 g/ml de amicacina, se utiliza
este medio para el cultivo de hongos patgenos.
Infusin de cerebro de ternera
200.0
Infusin corazn vacuno
250.0
Peptona
10.0
Cloruro de sodio
5.0
Glucosa
2.0
Fosfato disdico
2.5
Instrucciones
Suspender 37 g del polvo en un litro de
agua destilada. Calentar a ebullicin
hasta disolver completamente.
Esterilizar en autoclave a 121 C durante
15 minutos. Los tubos que no se usen
inmediatamente debern calentarse en
un bao hirviendo para la eliminacin
del oxgeno retenido. Enfriar
rpidamente sin agitar.
pH final: 7.4
0.2
Fundamento
Es un medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado desarrollo
microbiano. La infusin de cerebro de ternera, la infusin de corazn vacuno y
la peptona, son la fuente de carbono, nitrgeno, y vitaminas.
La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio mantiene
el balance osmtico y el fosfato disdico otorga capacidad buffer.
Los nutrientes de este caldo son muy apropiados para los hemocultivos, ya
que en esta infusin desarrollan todas las especies de estreptococos excepto
los tiol y piridoxal dependientes.
Los estafilococos que crecen en esta infusin suelen dar mejores reacciones
en la prueba de la coagulasa.
Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 100 g/ml de amicacina, se inhibe la
flora bacteriana cuando se utiliza este medio para el cultivo de hongos
patgenos.
Resultados
Examinar los tubos para evaluar el crecimiento por turbiedad. Cuando sea
necesario, subcultivar en medios slidos apropiados y realizar la identificacin
bioqumica.
Microorganismos
Crecimiento
Neisseria meningitidis
Bueno a excelente
Neisseria gonorrhoeae
Bueno a excelente
Streptococcus pyogenes
Bueno a excelente
Streptococcus pneumoniae
Bueno a excelente

Medio preparado: mbar claro, sin precipitado.
: uninoculated tube
: Neisseria meningitidis
: Strepcococcus pyogenes
Tetrationato Caldo.
Medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella
spp. a partir de heces, orina, alimentos y otros materiales de importancia
sanitaria.

Peptona
5.0
Sales biliares
1.0
Carbonato de calcio
10.0
Tiosulfato de sodio
30.0
pH final: 8.4
0.2
Solucin iodo iodurada

Iodo
6.0
Ioduro de potasio
5.0
Agua
20.0
Instrucciones
Suspender 46 g del polvo en 1 litro de
agua destilada. Mezclar vigorosamente y
llevar a ebullicin. Enfriar a 45 C o
menos. Agregar 20 ml de solucin
iodurada. Mezclar y distribuir 10 ml por
tubo, en tubos estriles. No debe
calentarse luego de agregar la solucin
iodada. El medio base puede mantenerse
a 4 C , dura varios meses, pero una vez
agregada la solucin iodada debe usarse
en el mismo da.
Fundamento
El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para
el desarrollo bacteriano, y carbonato de sodio que neutraliza y absorbe
metabolitos txicos.
La selectividad est dada por la presencia de tiosulfato de sodio, tetrationato
(generado en el medio por el agregado de la solucin iodo-iodurada) y sales
biliares, los cuales permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzima
tetrationato reductasa, como ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de la
flora acompaante.
Para evitar la proliferacin de especies de Proteus spp., se recomienda agregar
40 mg/l de Novobiocina, antes de la solucin iodada
Resultados
Microorganismos
Crecimiento
Salmonella typhi
Escaso
Bueno-excelente
Salmonella enteritidis
Bueno-excelente
Escherichia coli
Escaso

Medio preparado: suspensin blanco lechosa.
Stuart Medio de Transporte

Medio destinado a la recoleccin, transporte y preservacin de muestras
clnicas aptas para exmenes bacteriolgicos. Es til para mantener la
viabilidad de gonococos y de otros microorganismos de difcil desarrollo.

Tioglicolato de sodio
Glicerofosfato de sodio
0.9
10.0
Cloruro de calcio
0.1
Azul de metileno
0.002
Agar
3.0
Instrucciones
Suspender 14,1 g del polvo por litro de
agua destilada. Reposar 5 minutos.
Calentar a ebullicin hasta disolucin
total. Distribuir en tubos con cierre a
rosca (para evitar oxidacin)
llenndolos hasta 2/3 del tubo.
Esterilizar 15 minutos a 121C.
Dejar solidificar en posicin vertical.
pH final: 7.4
0.2
Fundamento
Medio semislido, no nutritivo.
Contiene tioglicolato de sodio, el cual provee un ambiente reducido y es til
para suprimir cambios oxidativos en el medio de transporte, y azul de
metileno, que es el indicador de oxido reduccin.
De esta manera se favorece la viabilidad de los microorganismos durante su
envo al laboratorio. Cooper encontr que usando hisopos impregnados con
carbn bacteriolgico se recuperan en forma exitosa numerosos patgenos
entricos y respiratorios.
Resultados
Los tubos con medio de transporte

se subcultivan en medios slidos
apropiados segn la muestra y el
microorganismo que se quiera
aislar. Luego de la incubacin, debe
haber escasa o nula reduccin de la
viabilidad de los microorganismos.

Medio
preparado:
ligeramente
opalescente con tonalidad azul
dependiendo
del
grado
de
oxidacin.
Pruebas
Bioqumicas
INTRODUCCIN
Con frecuencia, la identidad de una especie requiere que se conozca de
manera detallada su actividad bioqumica, porque otras caractersticas no
son suficientemente distintivas o diferenciales.
En el laboratorio disponemos de numerosas tcnicas para la

caracterizacin bioqumica de una especie.
Adems de los productos finales de los procesos metablicos, tambin
se necesita conocer con detalle como se producen estos cambios, como
ocurren paso a paso las reacciones qumicas, cules enzimas
intervienen, cuales son los productos intermediarios adems de que se
deben reconstruir las secuencias de las reacciones bioqumicas que
tienen lugar dentro de la clula.
En general el microorganismo se cultiva en medios que contienen una
sustancia nutritiva especfica o sustrato y despus de la incubacin del
cultivo se examina para ver los cambios qumicos que hayan ocurrido.
Enterotube II
Kligler Hierro Agar

Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiologa de alimentos
para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin
de glucosa y lactosa, y a la produccin de cido sulfhdrico.
Peptona de carne
13.0
Cloruro de sodio
5.0
Lactosa
10.0
Tripteina
10.0
Glucosa
1.0
Citrato de hierro y amonio
0.5
Tiosulfato de sodio
0.3
Rojo de fenol
Agar
0.025
Instrucciones
Suspender 54.8 g del polvo por litro de

agua destilada. Mezclar bien y calentar
con agitacin frecuente, hervir 1 o 2
minutos hasta disolucin total. Llenar
hasta la tercera parte de los tubos de
ensayo. Esterilizar a 121 C por 15
minutos. Enfriar en pico de flauta
profundo.
15.0
pH final: 7.3
0.2
Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona de carne y la triptena, aportan los
nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.
La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables.
El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de
cido sulfhdrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe
3+, los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro
de hierro, de color negro.
El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el
balance osmtico. El agar es el agente solidificante.
Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan

por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en
medio cido.
El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que
reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro
de hierro de color negro.
Resultados
1-Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo
solamente fermenta la glucosa.
2-Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo
fermenta glucosa, y lactosa.
3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no
fermentador de azcares.
4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el
microorganismo produce gas.
5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido
sulfhdrico.
Caractersticas del
medio
TSI Agar
Medio universalmente empleado para la diferenciacin de
enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa,
lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.
Extracto de carne
Pluripeptona
Cloruro de sodio
Instrucciones
3.0
20.0
5.0
Lactosa
10.0
Sacarosa
10.0
Glucosa
1.0
Sulfato de hierro y amonio
0.2
Tiosulfato de sodio
0.2
Rojo de fenol
0.025
Agar
13.0
Suspender 62,5 g del polvo por litro

de agua destilada. Mezclar bien y
calentar con agitacin frecuente,
hervir 1 o 2 minutos hasta disolucin
total. Llenar hasta la tercera parte de
los tubos de ensayo. Esterilizar a
121 C por 15 minutos. Enfriar en pico
de flauta profundo.
pH final: 7.3
0.2
Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona,
aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.
La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono
fermentables.
El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de
cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones
Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen
sulfuro de hierro, de color negro.
El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene
el balance osmtico.
Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan

por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en
medio cido.
El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que
reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro
de hierro de color negro.

Resultados
Lisina Hierro Agar

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente
Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y
en la produccin de cido sulfhdrico.
Peptona de gelatina
5.0
3.0
Glucosa
1.0
Lisina
10.0
Citrato de hierro y amonio
0.5
Tiosulfato de sodio
0.04
Prpura de bromocresol
0.02
Agar
15.0
Instrucciones
Suspender 35 g del medio
deshidratado en un litro de agua
destilada. Dejar embeber unos 15
minutos. Calentar cuidadosamente,
agitando con frecuencia y hervir
durante un minuto hasta la disolucin
completa. Distribuir y esterilizar a
121 C durante 15 minutos. Enfriar en
pico de flauta dejando un fondo
vertical apto para la puncin.
pH final: 6.7
0.2
Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los
nutrientes para el desarrollo bacteriano.
La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato
utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa.
El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la
produccin de cido sulfhdrico.
El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a
pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza
el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta.
La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es
necesario que la glucosa sea previamente fermentada.
Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son

fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de
cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color
violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.
La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del
medio debido a la formacin de sulfuro de hierro.
Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de
Morganella, desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el
cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo
en la superficie del medio.
Resultados
1- Decarboxilacin de la lisina:
-Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.
-Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.
2-Desaminacin de la lisina:
Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del gnero
Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp.
3-Produccin de cido sulfhdrico:
-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente
lmite del pico y fondo)

Medio preparado: color violeta.
en
el
Microorganismos
Color en el pico de flauta
Color en la base del tubo
Ennegrecimiento
del medio
Proteus mirabilis
Rojo
Amarillo
Negativo
Prpura
Prpura
Positivo
Salmonella enteritidis
Prpura
Prpura
Positivo
Providencia spp.
Rojo
Amarillo
Negativo
Citrobacter freundii
Prpura
Amarillo
Positivo
Morganella spp.
Rojo
Amarillo
Negativo
Edwarsiella spp.
Prpura
Prpura
Positivo
Prpura
Prpura
Negativo
Escherichia coli
Prpura
Prpura
Negativo
MIO Medio
Medio usado para la identificacin de Enterobacteriaceae en base a su movilidad,
actividad de ornitina decarboxilasa y produccin de indol.

Dextrosa
1.0
3.0
Peptona
10.0
Triptena
10.0
Clorhidrato de L-ornitina
5.0
Agar
2.0
Prpura de bromocresol
Instrucciones
Suspender 31 g del polvo en un

litro de agua destilada. Calentar
a ebullicin hasta completa
disolucin. Distribuir en tubos y
esterilizar 15 minutos a 121 C.
0.02
pH final: 6.5
0.2
Fundamento
Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de
extracto de levadura, peptona y triptena.
Adems, la triptena aporta grandes cantidades de triptofano, sustrato de la

enzima triptofanasa, para la realizacin de la prueba del indol.
La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato
para la deteccin de la enzima ornitina decarboxilasa, el prpura de
bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color prpura
y en medio cido es amarillo.
Por su composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo:
movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol.
La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento

que difunde mas all de la lnea de inoculacin.
La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio.
Debido a la fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo una
condicin cida y originando que el indicador de pH prpura de bromocresol
vire al amarillo.
La presencia de acidez, otorga condiciones ptimas para la actividad de la
enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente.
Por decarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del
indicador hacia el color prpura.
El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que
contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de
agregar unas gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich, indica un resultado
positivo.
Resultados
1-Movilidad:
-Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas all de la

lnea de siembra.
-Resultado negativo: crecimiento solamente en la lnea de siembra.
2-Ornitina decarboxilasa:
-Resultado positivo: color prpura.
-Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color
violceo en la superficie del medio.
3-Prueba del indol:
La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y
la prueba de ornitina.
-Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.
-Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloroamarillento.

Medio preparado: prpura transparente a ligeramente opalescente.
SIM Medio
Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol

y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros
de la familia Enterobacteriaceae.
Instrucciones
Triptena
20.0
Peptona
6.1
Sulfato de hierro y amonio
0.2
Tiosulfato de sodio
0.2
Agar
3.5
Suspender 30 g del polvo por litro de agua

destilada. Mezclar hasta disolver; calentar
agitando y hervir durante un minuto. Distribuir
unos 4 ml en tubos de hemlisis y esterilizar
en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
Solidificar en posicin vertical.
pH final: 7.3
0.2
Fundamento
El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y
particularmente de la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias
para formar indol.
En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa.
El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac s o de
Erlich, para originar un compuesto de color rojo.
Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que
producen alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas
productoras de sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado
negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se
mantenga a un pH mayor a 7.2.
Resultados
Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas
all de la lnea de siembra.
Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente en la lnea
de siembra.
Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la lnea de
siembra o en todo el medio.
Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el
reactivo de Kovac s o de Erlich.
Cepas indol negativas: sin cambio de color.

Urea
Medio utilizado para la identificacin de microorganismos, en base a la
actividad uresica. Es particularmente til para diferenciar Proteus spp.
de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae.
Urea
20.0
Fosfato monopotsico
9.1
Fosfato disdico
9.5
0.1
Rojo fenol
Instrucciones
Suspender 3, 87 g del medio

deshidratado por cada 100 ml de
agua destilada. Disolver sin calentar
y esterilizar por filtracin. Distribuir
en tubos pequeos estriles, entre
0,5 y 2 ml.
0.01
pH final: 6.8 0.2
Fundamento
Este medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajo
contenido de nutrientes y alta capacidad buffer.
El extracto de levadura es la nica fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y
cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano.
Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el
indicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa.
Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrogeno

proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amonaco y dixido de
carbono. Estos productos metablicos alcalinizan el medio, haciendo virar el
indicador
rojo
fenol
del
amarillo
al
rojo.
Su uso, se recomienda para diferenciar Proteus spp. de otros gneros.
Medio preparado: anaranjado.
Urea1 Uninoculated Control,

2 Proteus Vulgaris,
3 E. coli
Simmons Citrato Agar

Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la
capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y energa.

Citrato de sodio
2.0
Cloruro de sodio
5.0
Fosfato dipotsico
1.0
Fosfato monoamnico
1.0
Sulfato de magnesio
0.2
Azul de bromotimol
0.08
Agar
15.0
Instrucciones
Suspender 24,2 g del medio
deshidratado por litro de agua destilada.
Dejar reposar 5 minutos y mezclar
calentando a ebullicin durante 1 o 2
minutos. Distribuir en tubos y esterilizar
en autoclave a 121 C durante 15
minutos. Enfriar en posicin inclinada.
pH final: 6.9
0.2
Fundamento
En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y

el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son
necesarios para el desarrollo bacteriano.
Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor
enzimtico.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el
indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino.
El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de

utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica
fuente de nitrgeno, con la consiguiente produccin de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de

citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento
del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en
presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser
utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos
alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin
de citrato permeasa.
Resultados
-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.
-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay
desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.
Microorganismo
Citrato permeasa
Color del medio
Positivo
Azul
S. typhimurium
Positivo
Azul
E. coli
Negativo
Verde
S. flexneri
Negativo
Verde

Medio preparado: verde.
Gracias!

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Uno de los sistemas ms importantes para

El material alimenticio en el que crecen los

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial

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B.- Medios complejos o de composicin indefinida. Estos medios llevan

C.- Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con

Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para auttrofos; adicionando

E.- Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la

Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolticos de no hemolticos; McConkey

F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento

Suspender 31 g de polvo por litro de agua

Caractersticas del medio: mbar claro

Base Agar Gelosa Sangre

Frmula (en gramos por litro)

Caractersticas del medio

Frmula (en gramos por litro)

Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes

Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y

La siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en

Mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden

Verdosas con brillo metlico y centro negro

Mucosas, rosa prpura, confluentes

Incoloras, pequeas, puntiformes

Caractersticas del medio

Mac Conkey Agar

Mezcla de sales biliares

Suspender 50 g del polvo por litro de

Rojas con halo turbio

Diminutas, incoloras, opacas

Caractersticas del medio

Estafilococo 110 Agar

Suspender 149 g del medio en un

2-Hidrlisis de la gelatina: cubrir la placa 5 ml de una solucin saturada de sulfato de

Caractersticas del medio

Sal y Manitol Agar

Suspender 111 g de polvo por litro de

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente

Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y

Caractersticas de las colonias

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Staphylococcus epidermidis ATCC

Escherichia coli ATCC 25922

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

Caractersticas del medio

Salmonella Shigella Agar

Mezcla de sales biliares

Suspender 60 g del polvo por litro de

Transparentes, centro negro

Transparentes, centro negro

Rosadas cremosas y mucosas

Incoloras, de muy escaso

Caractersticas del medio

A. Klebsiella pneumoniae. Acid + Lac +

Mueller Hinton Agar

Frmula (en gramos por litro)

Peptona cida de casena

Suspender 37 g del medio deshidratado

Caractersticas del medio

Cerebro Corazn Infusin

Infusin corazn vacuno

Caractersticas del medio

Frmula (en gramos por litro)