RECUENTO DEL NMERO DE BACTERIAS

T. de la Rubia y J. Martnez
OBJETIVOS
El alumno aprender a:
1. Utilizar correctamente pipetas y micropipetas
decimales seriadas de una suspensin de bacterias

preparando

diluciones

2. Determinar la concentracin bacterias viables (entendidas como unidades

vormadoras de colonias) en una muestra

Contenido:
I

INTRODUCCIN

II MTODOS
III RESULTADOS
IV AUTOEVALUACIN

I.
INTRODUCCIN
En diversos estudios microbiolgicos (como anlisis de alimentos, de agua de
bebida, de productos farmacuticos o del medioambiente entre otros), se requiere
conocer el nmero de microorganismos presentes en un material con objeto de
determinar su calidad. El procedimiento es esencialmente el mismo que para la
medida del crecimiento de las poblaciones de bacterias
El crecimiento de poblaciones microbianas puede determinarse mediante mtodos
de medida de la masa total celular, que generalmente es directamente
proporcional al nmero de clulas, (mtodos de determinacin del peso, de la
actividad del cultivo o mtodos turbidimtricos) o por la determinacin del nmero
de clulas.
Encontrar informacin ms completa sobre medidas del crecimiento de bacterias
en los apuntes on line del Profesor D. E. Iaez
1. Principales
mtodos de
El nmero de bacterias de una muestra puede
recuento del
determinarse directamente por recuento del nmero total
nmero bacterias
de clulas o indirectamente por la estimacin del nmero
en una muestra
ms probable, por filtracin o por el recuento de viables
en placa (Clulas capaces de dividirse sobre o dentro de
un medio slido, tambin se refieren como unidades
formadoras de colonias UFC).
1.1.Recuento
directo de bacterias
al microscopio

Es una tcnica para determinar o recontar el nmero total

de organismos de una muestra: Se utilizan cmaras de
recuento (Cmara de Petroff-Hauser) y visualizacin al
microscopio. Es un mtodo rpido del nmero total de
clulas de una muestra pero no distingue entre viables o
no viables.

1.2.Recuento
directo con
contadores
electrnicos

Se utiliza el contador Coulter recuenta el nmero de

clulas suspendidas en un lquido, a su paso por un orificio
por donde fluye la corriente elctrica. Se puede
determinar a su vez el tamao de las clulas pero
tampoco distingue entre viables, muertas o partculas.

1.3. Recuento en
filtros de
membrana

2. Mtodos de
recuento de
bacterias viables en
placa

En este mtodo el recuento se realiza por filtracin de un

volumen de la muestra a travs de un filtro de membrana
de tamao adecuado para retener a las bacterias (0.220.45 m). Una vez filtrada la muestra, el filtro se coloca
sobre un medio de cultivo slido y se incuba. El recuento
del nmero de colonias formadas sobre el filtro determina
el nmero total de bacterias en la muestra filtrada. Es un
mtodo til cuando el nmero de bacterias presentes en la
muestra es muy bajo. Se utiliza con frecuencia para
determinar el nmero de bacterias en agua.
Estos mtodos ofrecen la ventaja de cuantificar solo a las
bacterias viables presentes en una muestra. Implican la
dilucin seriada de la muestra en agua, caldo o solucin
salina, la inoculacin de la dilucin en medio de cultivo
slido y la incubacin durante 24-48 horas a la
temperatura apropiada y en placa son mtodos de
estimacin de bacterias viables en trmino de unidades
formadoras de colonias (UFCs).
El nmero de unidades formadoras de colonias de una
suspensin bacteriana puede determinarse mediante dos
tcnicas:

2.1. Recuento en
placa por siembra
en profundidad.

Consiste en aadir medio de cultivo fundido y enfriado a

50C sobre placa de Petri que contiene una cantidad
determinada de la muestra diluida. Se tapa la placa y se
rota para mezclar la muestra en el agar. Cuando el agar
solidifica se incuban las placas. Las colonias se desarrollan
tanto dentro del agar como en la superficie. Es un mtodo
generalmente utilizado para el recuento de
microorganismos anaerobios facultativos o microaerofilos.

2.2.Recuento en
placa por siembra
en superficie

Consiste en la siembra de un volumen conocido de la

dilucin de la muestra sobre la superficie de un medio de
cultivo en placa Petri. En este mtodo todas las colonias
crecen sobre la superficie del medio. Generalmente se
utiliza esta tcnica para el recuento de bacterias aerobias.

II. MTODOS

RECUENTO
DEL
NMERO
DE
BACTERIAS VIABLES MEDIANTE EL
MTODO DE DILUCIN Y SIEMBRA
EN PLACA

1.Material necesario

Cultivo de Escherichia coli de

24 horas en caldo de tripticasa soja
(TSB)

6 placas de TSA
6 tubos de ensayo con 4.5
ml de solucin salina 0.9% estriles.

Puntas de pipetas estriles

de 1 ml

Pipeta automtica de 1ml

Esptula de Driglasky de
acero

Placa con alcohol

2. Tcnica de recuento en placa por siembra en superficie.

2.1. Obtencin de diluciones seriadas del cultivo.
Marcar los 6 tubos de solucin salina con
las diluciones 10-1, 10-2,.10-6

Utilizando la pipeta de 1 ml con punta

estril, transferir aspticamente 0.5 ml del
cultivo de E. coli a un primer tubo de
solucin salina estril de 4.5 ml. (dilucin
10-1).
Retirar la punta y echarla al
contenedor.

Mezclar la suspensin
durante unos segundos

con

un

vortex

Con una nueva punta de pipeta estril,

transferir 0.5 ml al siguiente tubo de
dilucin (dilucin 10-2). Retirar la punta y
echarla al contenedor.

Repetir el paso anterior hasta obtener la

dilucin 10-6.
2.2.Siembra en placa
Marcar las placas con las tres ltimas
diluciones 10-4, 10-5, 10-6 (2 placas por
dilucin). Comprobar que la superficie de
las placas est bien seca.

Cambiar el volumen de la pipeta a 0.1 ml.

Tomar una punta de pipeta estril y
transferir 0.1 ml de cada una de las tres
ltimas diluciones a placas de TSA

Esterilizar la esptula de Driglasky

impregnndola en alcohol, escurrir el
exceso de alcohol y pasar por la llama del
mechero.

Sembrar la dilucin sobre la superficie de

la placa rotando y esparciendo la muestra
en todas las direcciones.

Incubar las placas en posicin invertida a

37C durante 24-48 horas.
III.

RESULTADOS

2.3.Recuento de las colonias

Tras la incubacin, se observan las colonias
bacterianas sobre la superficie del agar.
Cada colonia representa a una unidad
formadora de colonia (UFC). Usualmente
una UFC se corresponde con una clula
viable.

Seleccionar las placas de la dilucin que

haya producido un nmero de colonias
comprendido entre 30-300 y contar el
nmero de colonias presentes.

En el ejemplo: 125 colonias

UFC/ml= 125 x10 x10 = 125 x 10

6

2.4. Resultados

10-1

El resultado debe expresarse como UFC/ml

para ello se multiplica el promedio del n
de colonias obtenido por el inverso de la
dilucin final de la muestra.

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

IV. AUTOEVALUACIN:
1. Si transferimos 0.1 ml de una muestra a 99.9 ml de solucin salina estril.
Cul es la dilucin obtenida?
a. 10-1
b. 10-2
c. 10-3
2. De un cultivo de Escherichia coli se hacen diluciones seriadas aadiendo 10
ml en 90 ml de solucin salina estril. Se siembran 0.1 ml de cada dilucin
en placas de agar nutritivo que se incuban a 37C durante 24 horas. Tras la
incubacin, los resultados del recuento de colonias fue el siguiente:

Dilucin

Promedio del N de colonias

10-4

> 1000

10-5

660

10-6

250

10-7

Cul es el recuento de UFC/ml de la muestra?

a. 2.5 x 106
b. 25 x 107
c. 25 x 108
3. Cual es el nmero de bacterias por ml del siguiente cultivo?

a.

480 x 10 5

b.

6.3 x 10

c. 63 x 10

Los nmeros corresponden a volmenes o a nmero de colonias crecidas en

cada placa