SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

SEPARACIONES POR
CROMATOGRAFA
Conceptos generales.
Clasificacin de los mtodos cromatogrficos.
Separacin cromatogrfica
Esquema bsico de un cromatgrafo
Cromatografa lquida de alta resolucin. HPLC.
Cromatografa de gases

SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

Las fases cromatogrficas son dos:
*La fase mvil: que fluye a travs de una fase

estacionaria, arrastrando con ella a los

compuestos de la mezcla.
*La fase estacionaria: en la cual estn
retenidos los componentes de la muestra, y a
travs de la cual fluye la fase mvil
arrastrando a los mismos.

Cromatografa: tcnica

de separacin en la cual,
los componentes de la
muestra, se distribuyen
entre dos fases de
diferente naturaleza, como
consecuencia de la
variacin de velocidad que
se establece al ser
arrastrados por una fase
mvil, lquida o gaseosa, a
travs de una fase
estacionaria, slida o
lquida.

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La cromatografa fue originalmente descrita

por Tswett en 1906

Ide un mtodo para separar pigmentos de

las plantas utilizando un tubo de vidrio lleno

de CaCO3
Despus de aadir un extracto de las plantas
y lavarlo con un disolvente orgnico observ
que se separaban diferentes bandas
coloreadas en el interior de la columna.

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Los componentes de la muestras se

distribuyen en el interior del lecho

cromatogrfico al ser arrastrados por la fase
mvil
Las especies individuales quedan retenidas
en la fase estacionaria en funcin de las
interacciones que tienen lugar tales como:
Adsorcin superficial
Solubilidad
carga

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tiempo de retencin tR: tiempo

que tarda cada sustancia en

abandonar el sistema
cromatogrfico. Esta retencin se
ejerce en funcin de las
caractersticas moleculares de
cada compuesto.
Elucin: proceso por el cual
todos los solutos terminan por
abandonar la columna

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La aplicacin prctica de

la cromatografa consiste
en hacer pasar la fase
mvil a travs de la
columna cromatogrfica
que contiene la fase
estacionaria, donde estn
retenidos los solutos.

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el proceso cromatogrfico depende de una

constante de equilibrio:

KD =

n /V
n Vm
Cs
Vm
= s s = s
= k
Cm nm / Vm nm Vs
Vs

K =

tR t0
t0

tR= es el tiempo de retencin del soluto.

t0= es el tiempo de retencin de la fase mvil, o tiempo que
tarda la fase mvil en atravesar la columna cromatogrfica.

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CLASIFICACIN DE LOS MTODOS CROMATOGRFICOS

TIPO

F.ESTACIONARI

F. MVIL

INTERACCION

Adsorcin

Slido

lquido-gas

fuerzas V.W.

Cambio ionico

Resina

Lquido

f.elect.

Exclusin

Gel

lquido

tamao part.

Afinidad

Slido

lquido

interac bio.

Particin

Lquido

lquido-gas

solubilidad

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En cromatografa lquida podemos distinguir dos

modalidades bsicas:
Cromatografa en fase normal: fase mvil no polar y
la fase estacionaria es polar (gel de slice)
Cromatografa en fase invertida: fase mvil de
naturaleza polar y fase la estacionaria no polar
(cadena hidrocarbonada que puede ser :
*Cadena larga: C-18
*Cadena intermedia: C-8
*Cadena corta: C-2

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Tambin se pueden clasificar en funcin de

la forma en la que se lleve a cabo:

a) PLANA: La fase estacionaria se coloca

sobre una superficie plana

b) COLUMNA: se utiliza un tubo de vidrio
cilndrico como soporte de la fase
estacionaria y se hace pasar a travs de ella
la fase mvil.

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Tambin en cromatografa de particin hay

que establecer otra distincin segn sea la
retencin de la fase estacionaria lquida sobre
el slido soporte:

Convencional o clsica cuando la fase

estacionaria lquida est retenida por

adsorcin sobre el slido soporte
Fases ligadas cuando la fase estacionaria
lquida est retenida por un enlace qumico
sobre el slido soporte.

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Cromatografa Clsica:
Fase mvil
Cabeza de la
columna

Fracciones del eluido

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Modalidad Clsica.
Es un proceso lento
Es un proceso poco eficaz tanto por la

capacidad de separacin, como por el

nmero de solutos que se pueden separar.
Es una tcnica laboriosa
No proporciona directamente la composicin
de las fracciones
Solo se pueden separar muestras del orden
de gramos a mgr.

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Cromatografa Moderna:
Aumentar la eficacia de la separacin
Se reduce el tiempo de separacin
Permite acoplar un sistema de deteccin

continuo a la salida de la columna, (on line)

Permite separar sustancias que estn en el

orden de los g

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Hay dos teoras para explicar el proceso
cromatogrfico:
1. Teora clsica o esttica
2. Teora cintica o dinmica
Teora clsica o esttica: propuesta en 1941, en la cual
se asimila la columna cromatogrfica con una
columna de destilacin.
Teora cintica o dinmica: propuesta en 1956 por Van
Deemter, que considera el proceso dinmico de la
separcin.

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Teora clsica o esttica: se considera un sistema

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Dado que la separacin se produce como

esttico en equilibrio, en el cual el soluto recorre la

columna mediante una serie de equilibrios, cada uno
de los cuales se alcanza, en toda su extensin, en un
segmento o porcin de la columna, llamado plato
terico.
se supone que la columna cromatogrfica est
dividida en una serie de segmentos o platos tericos,
donde se producen un equilibrio de distribucin del
soluto entre la fase mvil y la estacionaria.
Af.mvil
Af. est

consecuencia de estas transferencias, la eficacia de

la columna depender del nmero de equilibrios que
tiene lugar en el interior de la columna durante la
elucin, es decir, depende del nmero de platos
tericos que tenga la columna, N.
Cuanto ms estrecho sea el plato terico, mayor
nmero de ellos habr para una longitud L de
columna, por tanto, la eficacia de la columna ser
inversamente proporcional a la altura equivalente del
plato terico:
AEPT= H=L/N

SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

Cuando los solutos viajan a travs de la columna

los picos se ensanchan, y mas cuanto mas larga es
la columna, por tanto para determinar si una
separacin es posible tenemos que tener en cuenta
dos factores:
1. La diferencia en la velocidad de migracin de los
solutos, que determina la posicin de los picos en
el cromatograma.
2. La velocidad finita que tarda en alcanzarse el
equilibrio en cada plato terico, que traer el
ensanchamiento en las bandas del cromatograma.

1.

2.

TEORA CINTICA O
DINMICA.
La eficacia de la columna
para separar los
componentes de la muestra
vendr dada por dos
factores:
La diferencia de la velocidad
de migracin de los solutos
de la mezcla, que origina la
separacin fsica entre los
picos
La velocidad que tarda en
alcanzarse el equilibrio en
cada plato terico que traer
consigo un ensanchamiento
del pico cromatiogrfico.

SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

El ensanchamiento de la banda depende de la

1.
2.
3.

velocidad de transferencia finita del soluto entre la

fase mvil y la fase estacionaria en cada plato
terico. Este ensanchamiento se debe a un avance
diferente de las molculas de un mismo soluto a
travs de la columna.
No todas las molculas de un mismo soluto fluyen
de igual forma en el mismo instante de tiempo, es
decir, no presentan un comportamiento ideal. Este
comportamiento no ideal se debe a tres factores:
difusin en remolino.
difusin longitudinal.
Resistencia a la transferencia de materia.

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DIFUSIN EN REMOLINO: Se debe a los distintos

caminos que toman las molculas del soluto al

atravesar la fase estacionaria. Aquellas partculas
de soluto que atraviesen canales ms amplios,
viajarn ms rpido con la fase mvil, y aquellas
que vayan por canales ms estrechos viajarn ms
lentamente.

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DIFUSIN LONGITUDINAL Este es un trmino mas

importante en cromatografa de gases. Se debe a que

las molculas del soluto se mueven en distintas
direcciones en la fase estacionaria debido a la
porosidad de las partculas que la forman. Esto hace
que algunas molculas del soluto salgan retrazadas
de la columna respecto a la mayora
Ensanchamiento de la cola del pico
cromatogrfico debido al arrastre de las
partculas

SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA DE
MATERIA: Se debe a que al pasar la fase mvil por
un canal entre las partculas de la fase estacionaria,
no todas las molculas del soluto se transfieren a
igual velocidad entre la fase mvil y la fase
estacionaria en cada plato terico
Si el comportamiento fuese ideal:
Cs = K D Cm

Cs = K D Cm x f (t )

SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

Podemos agrupar estos

efectos en una ecuacin

simple, que es la ecuacin de
Van Deepter:
H= A + B/u + C/u
Donde
H: altura equivalente del
plato terico
A: DIFUSIN EN
REMOLINO
B: DIFUSIN
LONGITUDINAL
C: RESISTENCIA A LA
TRANSFERENCIA DE
MATERIA
U : velocidad de la fase mvil

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modalidad isocrtica: condiciones experimentales

constantes, lo que significa composicin constante

de la fase mvil ( polaridad constante) lo que
equivale a temperatura constante en cromatografa
de gases (separacin isoterma)
En modalidad no isocrtica: variacin gradual
durante el proceso cromatogrfico
Dos parmetros fundamentales: la composicin de la
fase mvil ( c. lquida) y la temperatura de la columna
(c.gases). Vamos a representar estos dos
parmetros por la letra griega .

SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

Separacin de una mezcla:
resolucin de una columna cromatogrfica
capacidad que presenta para separar dos

componentes de una muestra, no siendo muy

diferentes las propiedades intrnsecas de los
mismos
dos posibilidades:
1.- modalidad isocrtica
2.- modalidad no isocrtica.

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valores de altos

favorece el paso de los

solutos a la fase mvil, con lo que se obtiene un
cromatograma con picos fuertemente solapados, que
tiene un factor de retencin o capacidad bajos.

SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

valores de bajos

los solutos con factores

de retencin bajos se obtienen bien separados, pero
los solutos fuertemente retenidos dan lugar a picos
achatados y mal definidos.

SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

En modalidad no isocrtica: variacin gradual

durante el proceso cromatogrfico del parmetro .
Cuando se trabaja en esta modalidad, se consigue
una mejor resolucin de los picos cromatogrficos.

SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

se varan las condiciones de para que los picos

que tiene un menor factor de capacidad, salgan en

un tiempo adecuado que permita su separacin. En
este caso se dice que se trabaja en gradiente.

SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

Tambin para mejorar la separacin cromatogrfica:

Reacciones de derivacin pre-columna: someter a los solutos a

una serie de reaccin para modificar las caractersticas

intrnsecas de los mismos de manera que se aumentan las
diferencias entre ellos y por tanto se consigue aumentar la
resolucin del sistema.

Mediante tcnicas de separacin previas a la columna: acoplar

Bomba

Depsito de fase
mvil

Inyector

Precolumna

columna

al sistema una tcnica de separacin previa puede ser una

extraccin o cromatografa de preparacin.

Mediante reacciones de derivatizacin post-columna: que

Detector
registro

consiste en aplicar algn tipo de reaccin selectiva a algunos

componentes de la muestra y sean sensibles al detector.

Regulador de
presin
Colector de
fracciones

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Recipiente de la fase mvil: de vidrio o plstico
capacidad de o 2 litros.
Fase mvil:
Fase normal, (fase estacionaria polar y fase mvil no
polar), los disolventes ms polares eluyen
rpidamente a los solutos que tengan mayor
tendencia a quedar retenidos.
En fase invertida, cuanto ms polar sea el disolvente,
menor es su poder de elusin, porque disuelve
menos a los solutos no polares
A la hora de separar se debe elegir, la fase mvil de
manera que se consiga la mejor separacin de los
solutos en un tiempo de anlisis adecuado.

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La bomba:
ofrecer un amplio rango de presiones de

trabajo

poder utilizarse con distintos caudales de

fase mvil,

originar un flujo de fase mvil libre de

pulsaciones,

ser qumicamente inertes, no reaccionar con

la fase mvil ni con los solutos, su interior es

de acero inoxidable o de tefln

SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

-SISTEMA DE INYECCIN

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LA COLUMNA

CROMATOGRFICA

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DETECTOR:
Las caractersticas que debe poseer un

detector son:
Altamente sensible a bajas concentraciones
de soluto
Debe ser universal
Alto rango de linealidad en la respuesta

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Todos los detectores

producen una seal que se

relaciona con la
concentracin de las
especies en disolucin
El tR nos sirve desde el punto
de vista cualitativo para
determinar la presencia de
una determinada sustancia
en la muestra
Se utiliza un estndar
interno para comparar los
tiempos de retensin y la
respuesta del detector con la
concentracin

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SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

En algunos casos,

podemos suponer que

la altura del pico es
proporcional a la
concentracin
Ventajas:
Rpidez de clculo;
simplicidad
Desventaja:
Reproducibilidad (la
altura es mas variable
que el rea)

SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

SEPARACIONES POR CROMATOGRAFA

Cromatografa lquida en

columna
La fase estacionaria
Slidos muy porosos con

capacidad adsorbente: Gel

de slice (SiO2); Almina
(Al2O3)
La superficie del gel de slice

interacciona con los

compuestos orgnicos
mediante interacciones de
carcter polar:

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Solutos poco polares

interaccionan con la
segunda capa de
disolvente

Solutos interaccionan
directamente con la
primera capa de
disolvente

Solutos mas polares

interaccionan con la
segunda capa de disolvente
desplazndolo

Solutos muy
polares
interaccionan
directamente
con la superficie
de la slice

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fase mvil: la fase mvil es una mezcla de

disolventes: ELUYENTE
la fase mvil fluye arrastrando los compuestos que
estn retenidos en la fase estacionaria.
En cromatografa de lquidos la naturaleza del
eluyente tiene una gran importancia
Eluyentes polares: Arrastran ms eficazmente los
compuestos mas retenidos en la fase estacionaria.
Arrastran ms rpidamente a los compuestos.
Eluyentes menos polares: Arrastran muy
lentamente a los compuestos.

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La slice cumple dos misiones en cromatografa de

lquidos:
Como fase estacionaria activa en cromatografa de

adsorcin. En este caso, se establece una

competencia entre las molculas del soluto y las
molculas de la fase mvil por ocupar los sitios
activos de la superficie de la slice (grupos silanol).
Puede actuar como slido soporte de la fase
estacionaria lquida en la cromatografa de particin.
En este caso, la porosidad en la superficie de la
slice retiene la fase estacionaria lquida.

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La serie eluotrpica: Mayor poder de elucin
hexano < tolueno < cloroformo < diclorometano <

acetona < acetato de etilo < etanol < metanol <

H2O

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Cromatografa de particin lquido-lquido.

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La fase estacionaria lquidas usadas, en fase normal son

fase mvil es un lquido, y la fase estacionaria es

un lquido retenido sobre un slido soporte.

Se puede llevar a cabo en la fase normal cuando la

fase mvil es no polar y la fase estacionaria es

fuertemente polar, o en las fases invertidas (fase
mvil polar y la fase estacionaria disolvente no
polar). Este tipo de cromatografa en fase inversa es
la que tiene ms aplicacin ya que muchas muestras
de inters actual tienen naturaleza hidroflica.

disolventes polares, que forman enlaces por puente de

hidrgeno, con los grupos silanol de la superficie de la slice.
*En la modalidad invertida, se usan fases mviles polares, y
fase estacionaria no polares como hidrocarburos.
Mayor aplicacin: cromatografa de particin de fases ligadas
en la que existe un anclaje qumico entre el slido soporte y la
fase estacionaria lquida.
Como fase estacionaria lquida se utilizan cadenas
hidrocarbonadas que pueden ser:
*Cadena larga: C-18
*Cadena intermedia: C-8
*Cadena corta: C-2

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Ventajas
Gran estabilidad de la fase estacionaria
No existen fuerzas de retencin elevada:
Permite una velocidad de muestreo alto.
No se producen procesos de retencin irreversibles y por tanto,
no hay deterioro de la columna.
El sistema cromatogrfico es simple: no se necesitan
precolumna para equilibrar las fases.
Tiene un gran campo de aplicacin:
Adems permite la separacin de compuestos con matrices
acuosas, permitiendo su aplicacin a campos de gran inters
como: qumico, farmacolgicos, industrial, medioambiental..

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