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Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Rompimiento celular

Sergio Huerta Ochoa


UAM-Iztapalapa

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Productos Extracelulares
-Antibiticos -Enzimas extracelulares -Muchos polisacridos -Mayora de aminocidos

Productos Intracelulares
-Mayora de protenas modificadas genticamente -Lpidos -Algunos antibiticos

Esteroides
(Se extraen sin romper)

Biomasa

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Esquema de la pared celular de clulas procariotas Procariotes Gram
(E. coli produce la mayora de las protenas recombinantes)

Membrana externa
(Protenas y lipopolisacridos)
8 nm 8 nm

Fuerza mecnica

Polipptidoglucanos Espacio Periplasmtico


(Protenas)

Membrana de plasma

Permeabilidad

Procariotes Gram +
Polipptidoglucanos Espacio Periplasmtico
(Protenas)

Membrana de plasma
(Fosfolpidos, protenas dispersas, iones metlicos)

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Tomado de Advances in product release strategies and impact on bioprocess design (2009) Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell

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Fermentacin Cosecha de clulas Rompimiento Celular
Etapas primarias de recuperacin Centrifugacin, filtracin con vaco, filtracin con membranas

Homogenizacin, molienda, lisis (enzimtica o qumica)

Remocin de restos celulares Concentracin y/o fraccionamiento Operaciones de alta resolucin Operaciones finales Producto

Centrifugacin, filtracin con vaco, filtracin con membranas

Precipitacin, extraccin, filtracin con membranas, evaporacin

Cromatografa, cristalizacin

Adaptado de: Sanchez-Ruiz, 1989 Studies on cell disruption and cell debris removal in downstream processing

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Ruptura Celular de Saccharomyces cerevisiae

Antes de la ruptura celular

Despus de 2 pasos a 1000 bar dando un rompimiento celular de 95%

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Equipo de ruptura

Industria Alimentaria
(Homogenizacin de la leche)

Aplicacin en Industria de la Pintura


(Reduccin de Pigmentos)

Industria Biotecnolgica

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Mtodo Tcnica Principio Estrs sobre el producto
Suave

Costo

Ejemplo

Qumico

Choque osmtico

Ruptura osmtica de la membrana

Barato

Ruptura de clulas de sangre

Digestin enzimtica Solubilizacin Disolucin de lpidos Tratamiento alcalino

Rompimiento por digestin de la pared celular Detergentes solubilizan la membrana celular Solventes orgnicos se disuelven en la pared celular y la desestabilizan La saponificacin de lpidos solubiliza la membrana Clulas cortadas en una licuadora Ruptura celular por molido con abrasivos Clulas rotas con cavitacin ultrasnica Se hace pasar clulas por un pequeo orificio y se rompen por estrs Se aplastan las clulas entre el vidrio y perlas de acero

Suave Suave Moderado

Caro Moderadocaro Barato

Micrococcus lysodeikticus tratado con lisozima de huevo Sales biliares actuando sobre E.coli Ruptura de levadura con tolueno

Fuerte Moderado Moderado Fuerte

Barato Moderado Barato Caro Suspensin de clulas a pequea escala Tejido animal y clulas

Mecnico

Homogenizacin (tipo navaja) Molido Ultrasonicacin

Homogenizacin (tipo orificio)

Fuerte

Moderado

Tratamiento a gran escala de suspensin de clulas excepto bacterias

Rompimiento en molino de perlas

Fuerte

Barato

Tratamiento a gran escala de suspensin de clulas y clulas de plantas

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Dificultad de la ruptura

Esporas Cocos gram Levaduras Clulas vegetales Bacilos gram + Bacilos gram - y cocos Micelios Clulas animales

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Eleccin del mtodo de ruptura

Naturaleza de la fuente de la enzima Escala de la operacin Velocidad del mtodo de extraccin Estabilidad del enzima Pureza requerida Costo del proceso

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Factores que inactivan las enzimas durante su aislamiento Factor inactivante
Calor Fro Proteasa Productos oxidacin de fenoles Oxidacin Dilucin protena Prdida de estabilidad Inhibidores especficos Metales pesados Cambio de fase

Fuente de enzima
Cualquiera Cualquiera Mayora Plantas y hongos Cualquiera Cualquiera Cualquiera Plantas y bacterias Cualquiera Cualquiera

Frecuencia
Universal Raro Comn Bastante comn Comn Bastante comn Bastante comn Raro Raro Comn

Modo de contrarrestarlo
Enfriamiento Calentamiento Inhibidores de proteasas o fro Agentes reductores Agentes reductores Concentracin rpida Restauracin de ese factor Separacin del inhibidor Agentes quelantes Mnima agitacin

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Choque osmtico 1. Suspensin de clulas en solucin tamponada hipertnica (sacarosa 20%) 2. Equilibrio osmtico 3. Centrifugacin: concentracin de las clulas 4. Resuspensin en agua (4C) 5. Ruptura celular por entrada de agua en el interior celular

Mayor sensibilidad en GRAM (GRAM + alta presin osmtica interna) Ventajas: Extraccin de enzimas del espacio periplasmtico, simplificacin de los procesos de purificacin NO a gran escala: Grandes volmenes de medio (400 L/10 kg pasta celular) Elevado nmero de pasos de centrifugacin Necesidad de refrigeracin

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Tratamiento con lisozima + EDTA Digestin de las paredes celulares por ruptura de los enlances beta-(1.4) glicosdicos entre el cido N-acetilmurmico (NAM) y la N-acetilglucosamina (NAG) del mucopptido

Mayor susceptibilidad GRAM + Combinacin con EDTA: quelante del Ca2+ Otros policationes: GRAM +: quitosano, hidroglutamato, polilisina, antiobiticos GRAM -: lipasas, fosfolipasas, policationes Hongos/levaduras: quitinasa/glucanasas Necesidad de choque osmtico No empleo a gran escala: Alto precio de la lisozima Eliminacin de lisozima tras extraccin

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Tratamiento con detergentes Permeabilizacin de clulas por solubilizacin de protenas de membrana, debido a apertura de poros Tipos: 1. Inicos: provoca desnaturalizacin proteica Aninicos: Lauril sulfato sdico, colato sdico, SDS Catinicos: Bromuro de cetil-trimetil-amonio

2. No inicos: preservan estructura nativa e interacciones de la enzima Tween, Spam, Triton

Inconvenientes: Precipitacin de protenas Necesidad de eliminacin (cromatografa, ultrafiltracin)

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Tratamiento con lcalis Tratamiento de las clulas con soluciones alcalinas (KOH, NaOH, pH 11.5-12.5; 20-30 min) Hidrlisis de la pared celular Ventajas: Simpleza, barato Fcil aplicacin a gran escala Desventajas: Tratamiento fuerte, es un ejemplo extremo de la solubilizacin (Saponificacin de lpidos que se convierten a detergentes) No selectivo Aplicacin SLO si las enzimas a aislar son estables a pH alcalino

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Disolventes orgnicos

Mtodo tradicional de ataque ( tolueno).

No se usan a gran escala.

Inconvenientes:
Precio Toxicidad Desnaturalizacin de protenas Inflamabilidad

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Homogeneizacin con abrasivos Mortero + abrasivo (cristal, albmina, kieselgurh) Dispositivos de funcionamiento continuo: Agitador Mickle (agitador vibratorio) Dyno-mill (agitador de discos giratorios)

Efectividad depende de: Tipo y concentracin de abrasivo Tipo, concentracin y edad de las clulas: levaduras >bacterias Velocidad de agitacin Cantidad y flujo a travs de la cmara Temperatura Dispositivo de discos

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Sonicacin Aplicacin de frecuencia superiores a 20 kHz Aparicin de reas de compresin/enrarecimiento/cavidades colapso de cavidades ondas de choque dao celular Aplicacin continua o discontinua Eficacia dependiente de: Tipo de microorganismo: diversidad Gram ->Gram + Bacilos > Cocos pH Temperatura Fuerza inica del medio Tiempo de exposicin Densidad de la clula Uso a pequea escal, NO a gran escala: Elevados requerimientos de energa Dificultad de transmisin de la energa Problemas de disipacin del calor producido

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Congelacin/Descongelacin

Formacin y fusin de cristales de hielo

liberacin de protenas

Combinacin con otros mtodos: congelacin de sedimentos bacterianos Ventajas: Simplicidad Bajas temperaturas de trabajo

NO a gran escala: Elevado tiempo de tratamiento Resistencia de algunos microorganismos Sensibilidad de las enzimas a congelacin/descongelacin

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Cizalla lquida Paso de la suspensin de clulas a elevada presin (>55MPa) a travs de un orificio estrecho Homogeneizador de Manto-Gaulin Mecanismo: Ruptura celular por cada brusca de presin y choque

Modos de uso: Paso nico, series de reciclaje, reciclaje continuo con eliminacin de sustancia Efectividad depende de: Tipo de microorganismos: GRAM -> GRAM + Historia de la materia de partida: Condiciones de crecimiento (fase estacionaria > fase exponencial) Congelacin/descongelacin

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Cizalla slida

Paso de clulas congeladas (-20 C) a travs de orificio Mecanismo: Agitacin en presencia de abrasivo (cristales de hielo) + ruptura por cizalla lquida Fuerzas de cizalla: paso a travs de orificio + desgarro por cristales de hielo No produce la desnaturalizacin de las enzimas NO a gran escala: Manejo complicado y costoso

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Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular
(Tejeda y col., 1995, Bioseparaciones) Choque osmtico: El clculo del gradiente de presin se basa en el equilibrio qumico

P e P i = R T ci
Molino de Perlas (operacin intermitente): El rompimiento celular con perlas agitadas a altas velocidades sigue una cintica de primer orden. El balance de masa de protena liberada puede ser expresado mediante la ecuacin:

VM

dR = k (Rm R )VM dt
ln Rm Rm R
k

Integrando y re-arreglando

Rm ln = kt Rm R

Ejemplo 5.2

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Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular
Eficiencia de los Molinos de Perlas (operacin continua): El nmero de etapas de un molino de perlas obtenido mediante experimentos de pulsos, puede ser empleado para calcular la eficiencia esperada del rompimiento. El balance de masa de protena liberada (clulas rotas) considerando que el molino consta de N etapas tipo tanque perfectamente agitado en serie y que el rompimiento sigue una cintica de primer orden puede ser expresado mediante la ecuacin:

Vm dR1 V = FR1 + k (Rm R1 ) m dt


Expresando la ecuacin en funcin de un tiempo adimensional e integrando obtenemos

kVm R1 F = Rm 1 + kVm F

Eficiencia de la etapa !!!

Re-arreglando y generalizando para N etapas, tenemos:

Rm kV = 1 + m Rm R F

Ejemplo 5.3

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Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular
Homogeneizador de alta presin: La desintegracin celular en un homogeneizador de alta presin a una presin fija puede ser descrita mediante una cintica de primer orden respecto al nmero de pasos, de tal manera que:

dR = k ' (Rm R ) d
Integrando obtenemos la ecuacin:
ln Rm = k' Rm R

Se ha determinado experimentalmente que la constante k tiene una dependencia con la presin de la siguiente forma:

k ' = k" P a
Combinando las ecuaciones anteriores se tiene:

Rm ln = k" P a Rm R

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Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular
Microflidizador: En el caso del microfluidizador la cintica de rompimiento presenta una cierta dependencia no lineal con el nmero de pasos expresada mediante la ecuacin:

ln

Rm = k" Rm R

Pa

Ejemplo 5.4

Donde b es un exponente que vara con el tipo de clula y toma valores entre 0.28 y 1

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Chang and Su, 2006
Kinetic model for simultaneous cell disruption and aqueous two-phase extraction

A = Am[1 exp(kt)]

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La Ruptura celular, cuando se estn procesando cientos o miles de litros de material, represanta un reto diferente a la ruptura celular a nivel laboratorio Factores claves son: Eficiencia y reproducibilidad A nivel Industrial slo se emplean los molinos de perlas agitados y los homogeneizadores a alta presin. El diseo de los molinos est basado en ecuaciones empricas y en experimentos piloto.

GEA Liquid Processing cell rupture skid for biologic cell lysing. The homogenizer feature the high efficiency sharp profile rupture valve type R which enable cell disruption at lower pressures