Tema 4.

Aminocidos y pptidos Bioqumica

49


TEMA 4

AMINOCIDOS Y PPTIDOS


1. Estructura y clasificacin de los aminocidos.
2. Propiedades cido-base de los aminocidos y pptidos
3. El enlace peptdico
4. Pptidos: hidrlisis y secuenciacin



1. Estructura y clasificacin de los aminocidos.

Como su nombre indica los aminocidos son compuestos que poseen un grupo
amino (-NH
2
) y un grupo cido (carboxlico -COOH) en su estructura. Los
aminocidos son los precursores de los pptidos y las protenas, y en ellos el grupo
amino y el grupo carboxilo, se encuentran unidos al mismo tomo de carbono,
conocido como carbono- (-aminocidos). La estructura general de los -
aminocidos (a excepcin de la prolina, que es cclica) se muestra en la Figura 1.















Como se puede apreciar, el carbono- (a excepcin de la glicina) es un carbono
quiral y como tal presenta dos enantimeros (L- y D-). Los 20 -aminocidos
Figura 1.

Estructura qumica de un aminocido. Estructura qumica en
el plano y estructura espacial. Enantimeros del aminocido
alanina.
Tema 4. Aminocidos y pptidos Bioqumica
50
presentes en las protenas son de la serie L- y en su representacin de Fischer
poseen el grupo amino hacia la izquierda. La diferencia entre los aminocidos viene
dada por el resto -R, o cadena lateral, unida al carbono-. Atendiendo a la
naturaleza del grupo -R los aa
s
pueden clasificarse en:

Neutros o apolares
Polares sin carga
Polares con carga negativa
Polares con carga positiva

La Figura 2 recoge las estructuras de los 20 L--aminocidos a pH fisiolgico.

Neutros o Apolares. Son 8 los aminocidos que se clasifican como poseedores de
cadenas laterales no polares. La alanina, valina, leucina e isoleucina, poseen
cadenas laterales de hidrocarburos alifticos. La metionina posee una cadena
lateral de ter tilico (C-S-C). La prolina es el nico aminocido cclico, pues el grupo
-R se cierra sobre el N del grupo -amino (realmente es un amina secundaria). Por
su parte, la fenilalanina y el triptfano contienen grupos aromticos.

Polares sin carga. Siete son los -aminocidos cuyo resto -R es polar pero sin
carga. La glicina posee la cadena ms simple, un tomo de hidrgeno. La serina y
la treonina son portadores de un grupo hidroxilo (-OH). La asparragina y la
glutamina, poseen cadenas laterales portadoras de un grupo amida, y por hidrlisis
dan lugar, respectivamente, a aspartato y glutamato, dos aminocidos con carga
negativa. La tirosina posee un grupo fenlico y la cistena debe su polaridad a la
presencia de un grupo tilico (-SH).

Polares con carga negativa. Existen dos -aminocidos cuyo resto polar posee
carga negativa a pH fisiolgico, debida a la presencia de un grupo carboxilo (-
COOH) , el cido glutmico y el cido asprtico.

Polares con carga positiva. Tres son los -aminocidos que poseen restos -R
cargados positivamente a pH fisiolgico. La lisina posee una cadena lateral de
butilamonio, la arginina presenta un grupo -R de guanidina y la histidina es
portadora de un grupo -R de imidazolio.
Tema 4. Aminocidos y pptidos Bioqumica
51







































APOLARES
Glicina (gly) Alanina (ala)
Valina (val)
Leucina (leu)
Metionina (met)
Isoleucina (ile)
Fenilalanina (phe)
Prolina (pro)
Triptfano (trp)

Serina (ser)
Treonina (thr)
( )
Cistena (cys)
asparragina (asn)
glutamina (gln)
Asprtato (asp)
( )
Glutamato (glu)
( )
lisina (lys)
arginina (arg)
Histidina (his)
Figura 2.

Estructura qumica de los L-aminocidos.
Tema 4. Aminocidos y pptidos Bioqumica
52

Esta clasificacin se ha realizado en base al grupo -R, pero es importante indicar
que a pH fisiolgico (pH 7,3), el grupo -amino se encuentra cargado positivamente
y el grupo -carboxilo lo est negativamente, por esta razn en la Figura 2 estos
grupos aparecen siempre cargados.

Dentro del conjunto de los aminocidos naturales, existen unos que pueden ser
sintetizados por las clulas humanas a partir de otras sustancias, pero tambin hay
aminocidos que debemos tomarlos en la dieta, ya que nuestras clulas no pueden
sintetizarlos o, cuando menos, no en cantidad suficiente para satisfacer la demanda
del organismo; se conocen con el nombre de aminocidos esenciales y son valina,
leucina, isoleucina, treonina, metionina, fenilalanina, triptfano y lisina.


cido Asprtico (Asp) D Cisterna Cys) C Isoleucina (IIe) I Serina (Ser) S
cido Glutmico (Glu)E Fenilalanina (Phe) F Leucina (Leu) L Tirosina (Tyr) Y
Alanina (Ala) A Glicina (Gly) G Lisina (Lys) K Treonina (Thr) T
Arginina (Arg) R Glutamina (Glu) Q Metionina (Met) M Triptfano (Trp) W
Asparagina (Asn) N Histidina (His) H Prolina (Pro) P Valina (Val) V


2. Propiedades cido-base de los aminocidos y los pptidos

El pH del medio en el que se encuentre el aminocido es esencial para determinar
sus propiedades cido-base, aspecto importante pues de ello dependen las
propiedades qumicas y la funcionalidad biolgica de los pptidos y protenas que
forman.

Las propiedades cido-base de un aminocido vienen determinadas por los grupos
protonables que posea. Un aminocido puede actuar bien como cido o como base
(sustancias anfteras), pudiendo tener hasta tres grupos con carcter cido-base: el
-amino, el -carboxilo y, en algunos casos, el resto -R. Lo importante es que estos
grupos poseen un carcter cido-base dbil, lo que hace que, dependiendo del pH,
el correspondiente equilibrio pueda desplazarse en un sentido o en otro (hacia la
forma protonada o hacia la desprotonada, Figura 3).
Tema 4. Aminocidos y pptidos Bioqumica
53












La expresin que regula la proporcin entre las formas protonada y desprotonada es:



Donde DP es la forma protonada y P es la forma desprotonada. Veamos como
afecta el pH a la valina. La val posee slo dos grupos protonables, el -amino y el -
carboxilo. A pH fisiolgico la valina presentara la siguiente estructura:









Tomemos los grupos por separado y veamos como les afecta el pH. El grupo -
amino presentara dos formas, una protonada (P) y cargada positivamente (-NH
3
+
),
y otra desprotonada (DP) y sin carga (-NH
2
), segn el siguiente equilibrio:



P
DP
pK pH
a
log + =
CH
COO NH
3
+
CH
CH
3
CH
3
-
( ) 8 log
2 3
= +
+ +
a a
K pK el donde H NH NH

Figura 3

Ionizacin de un L-aminocido.
Tema 4. Aminocidos y pptidos Bioqumica
54
si el pH aumenta, el equilibrio se desplaza hacia la derecha (dominando la forma con
carga 0) y si disminuye lo har hacia la izquierda (dominando la forma con carga +1).

Con el grupo -carboxilo ocurrira algo similar:


En funcin del pH, la proporcin de forma protonada (carga 0) o forma desprotonada
(carga -1) variar, respetando siempre la constante de ionizacin del grupo en
cuestin si la temperatura se mantiene constante.

Supongamos que estamos ahora a pH 1; en estas condiciones de elevada
concentracin de protones en el medio ambos equilibrios estaran desplazados en
un 100 % hacia las formas protonadas. Si aumentamos el pH los equilibrios
comenzaran a desplazarse hacia la derecha hasta llegar a un pH muy bsico,
momento en el que las formas dominantes (al 100 %) seran las desprotonadas.

Pero, qu ocurre a pHs intermedios?. Para ello debemos tener en cuenta la Ka de
cada equilibrio, o mejor dicho su pKa (que sera el -logKa). El grupo -amino de la
valina tiene un pK de 8, y esto quiere decir que a pH 8 el 50 % de los grupos amino
estarn protonados (si tenemos 100 molculas de valina, 50 tendrn el grupo amino
protonado y 50 lo tendrn desprotonado, al menos tericamente, segn se
desprende de la constante de ionizacin). Por su parte el grupo -carboxilo de la
valina, (pK = 2), estar protonado al 50 % cuando el pH del medio sea 2.

En general se asumen las siguientes consideraciones, para determinar el porcentaje
de protonacin de un grupo ionizable en un aminocido:
Si el pH < pK-1 el grupo esta al 100 % protonado
Si el pH > pK+1 el grupo est al 100 % desprotonado
Si el pH = pK el grupo est al 50 % protonado

Tomemos ahora un aminocido con tres grupos ionizables, el cido glutmico:






CH
COO NH
3
+
CH
2
CH
2
COO
-
(-carboxilo)
(-carboxilo)
-
(-amino)
( ) 2 log = +
+
a a
K pK el donde H COO COOH
Tema 4. Aminocidos y pptidos Bioqumica
55
que posee el grupo -amino, el -carboxilo y el -carboxilo. Los tres grupos
ionizables darn lugar a tres equilibrios cido-base distintos, cada uno con su
correspondiente pKa (2, 4 y 8 respectivamente). Para ver como afecta el pH a la
carga de cada grupo vamos a realizar la siguiente tabla, en la que ordenamos (de
menor a mayor pK) los grupos protonables y sus correspondientes valores de carga
en funcin del pH:

GRUPO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
-carboxilo
(pK=2)
0 -0,5 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1
-carboxilo
(pK=4)
0 0 0 -0,5 -1 -1 -1 -1 -1 -1
-amino
(pK=8)
+1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0,5 0 0
carga total +1 0,5 0 -0,5 -1 -1 -1 -1,5 -2 -2

1) a pH= 1, el pH es inferior en una unidad al pK del grupo -COOH, el cul
estar protonado al 100 %, luego su carga ser 0; y lo mismo le ocurrir al
grupo -COOH, protonado al 100 % y con carga 0. Por su parte, el grupo -
amino tambin estar protonado, aunque en este caso la carga del grupo es
+1.

2) a pH= 2, se produce coincidencia del pH con el pK del -COOH, por lo que
estar al 50 % protonado. Luego la carga ser -0,5 ; este pH es an dos
unidades inferior al pK del grupo -COOH, que seguir protonado (0), como
tambin le ocurrira al grupo -amino (+1). La carga total del glutmico sera
0,5.

3) a pH= 3, se ha superado en una unidad el pKa del -COOH, luego estar
desprotonado al 100 % y su carga ser -1 para valores superiores de pH. Los
otros dos grupos siguen estando protonados al 100 % (0 y +1,
respectivamente). Y la carga total ser cero.

4) a pH= 4, el pH coincide con el pKa del grupo -COOH y estar protonado
en un 50% (carga -0,5). El -COOH seguir desprotonado (0) y el -amino
protonado (+1). La carga total ser ahora -0,5.
Tema 4. Aminocidos y pptidos Bioqumica
56

5) a pH=5 el grupo -COOH estar al 100 % desprotonado y el resto de
grupos seguir igual, hasta llegar a pH= 8, donde el -amino estar
desprotonado al 50 % (0,5) , grupo que se desprotonar al 100 % a partir de
un pH= 9.

Como se puede apreciar en la tabla, la carga total del aminocido depende del pH
de la disolucin en que se encuentre.

Existe un pH al cual la carga neta del aminocido es cero (si lo colocamos en un
campo elctrico no se desplazar hacia ninguno de los polos). El pH al cul un
aminocido posee carga neta cero recibe el nombre de punto isoelctrico (pI), que
es la media aritmtica de los valores de pK
1
y pK
2
que delimitan la forma con carga
cero.

En la siguiente tabla pueden localizarse los aminocidos que, al igual que el cido
glutmico, poseen grupos R protonables.





















Tema 4. Aminocidos y pptidos Bioqumica
57
3. El enlace peptdico

Los aminocidos se encuentran unidos en los pptidos y las protenas mediante un
enlace amida (-CO-NH-):












Este enlace se forma por reaccin entre el grupo -COOH de un aminocido y el -
amino del siguiente (con prdida de una molcula de agua) y recibe el nombre de
enlace peptdico.



















Figura 4.

Estructura espacial del enlace peptdico. (a) Ilustracin del
carcter parcialmente doble del enlace peptdico. (b)
Configuracin del plano que conforman el enlace peptdico y
los carbonos extremos.

Tema 4. Aminocidos y pptidos Bioqumica
58

Entre los aos 1930-1940, Pauling y Corey, mediante el estudio de Rayos X de
cristales de aminocidos, dipptidos y triptidos, dilucidaron la estructura
tridimensional del enlace peptdico (Figura 4). As, descubrieron que la unin C-N del
enlace peptdico era ms corta que en la mayor parte de los dems enlaces C-N y
llegaron a la conclusin de que el enlace deba tener algn carcter de doble enlace,
por la aparicin de dos formas resonantes:

Luego dedujeron que los 4 tomos que rodeaban al enlace peptdico C-N (O, C,
C, H) estaban situados en el mismo plano, de tal manera que el oxgeno del grupo
carbonilo y el hidrgeno del N-H estaran en posicin trans. Esta ordenacin es
rgida, y es el resultado de la estabilizacin por resonancia de las formas
anteriormente citadas.












Partiendo de estos dos hechos, puede describirse el armazn de una cadena
polipeptdica como constituido por una serie de planos, con posibilidad de giro en los
C. De esta forma podemos escribir la estructura de un pptido como una sucesin
de planos en la que los grupos -R se van alternando (Figura 5).













Figura 5.

Estructura espacial de un pptido.
Secuencia ordenada de los planos de
enlace peptdico en el espacio. Los
grupos R se alternan por encima y
debajo del plano general de la
molcula.
Tema 4. Aminocidos y pptidos Bioqumica
59
4. Secuenciacin de un pptido

La posicin que ocupa cada aminocido dentro de la cadena polipeptdica, esto es la
secuencia, constituye el primer nivel estructural de las protenas, su estructura
primaria. La secuencia de un pptido tiene gran importancia porque entre otras
cosas condiciona los siguientes niveles estructurales.

La insulina bovina fue la primera protena que se secuenci completamente por
Sanger en 1953, lo que le vali el premio Nobel. La determinacin de la secuencia
de la insulina fue el resultado del trabajo de muchos cientficos durante 10 aos,
desde entonces se han secuenciado miles de protenas.

La secuencia de una protena, si conocemos el gen del que proviene, puede
obtenerse indirectamente, secuenciando dicho gen. Pero tambin puede hacerse la
secuenciacin qumica directa. Los pasos a seguir son:

Determinacin de la composicin del pptido por hidrlisis total y posterior
anlisis cromatogrfico.
Determinacin de los extremos C-terminal y N-terminal
Fragmentacin por hidrlisis selectiva
Secuenciacin: Degradacin de Edman

La determinacin de la composicin del pptido se realiza por hidrlisis total
presencia de HCl 6N, calentando a 100 C durante 10-24h, y en tubo al que se le ha
hecho el vaco. Tras el proceso se utiliza un sistema cromatogrfico que permita
separar y determinar cuntos y cules son los aminocidos que forman la cadena.

Hay distintos mtodos que permiten determinar el primer aminocido (Resto N-
terminal) o el ltimo (Resto C- terminal) de una cadena polipeptdica.

La determinacin del resto N-terminal, se puede realizar, entre otros mtodos,
mediante la Degradacin de Edman: en este proceso el pptido reacciona
con fenil isotiocianato que se une selectivamente al primer aminocido. A
continuacin se escinde con HF anhidro el aminocido marcado, separndolo
del resto selectivamente con un disolvente orgnico. Tras un tratamiento en
medio cido el compuesto resultante se determina cromatogrficamente
(Figura 6).

Tema 4. Aminocidos y pptidos Bioqumica
60
























Por otro lado, la determinacin del
resto C-terminal, se puede realizar
con Hidracina: este compuesto
reacciona con todos los enlaces
peptdicos del pptido, provocando
la hidrlisis de los mismos y dando
lugar a aminoacil-hidracinas con
todos los aminocidos excepto con
el ltimo (C-terminal), pudiendo
separarse del resto fcilmente y
determinarse con posterioridad su
naturaleza.


Figura 6.

Determinacin de la secuencia de un pptido. Hidrlisis total de la protena. (a).
Determinacin del primer aminocido utilizando 2,4-dinitrofluorobenceno (b) o
fenilisotiocianato (c). Este ltimo mtodo tambin se conoce como degradacin de
Edman y permite la secuenciacin del pptido.

Tema 4. Aminocidos y pptidos Bioqumica
61
La fragmentacin por hidrlisis parcial es necesaria porque por lo general no pueden
secuenciarse pptidos con ms de 20 o 30 aminocidos. Se realiza con reactivos
selectivos, en la mayora de los casos se utilizan proteasas, enzimas que hidrolizan
determinados enlaces peptdicos.

La tripsina hidroliza por la derecha de Arg , Lys
La quimotripsina hidroliza por la derecha de Phe, Trp, Tyr
La pepsina hidroliza por la izquierda de Phe, Trp, Tyr
La termolisina hidroliza por la izquierda de Val, Leu, Ile

El bromuro de ciangeno (BrCN) hidroliza por la derecha de la Met

La secuenciacin. Entre los distintos mtodos existentes, podemos citar la
degradacin de Edman, cuyo fundamento hemos visto en la determinacin del
extremo N-terminal. La aplicacin continuada de varios ciclos de la degradacin de
Edman me permite la secuenciacin de todo el pptido, siempre que este no tenga
ms de 20 o 30 aminocidos.

No obstante los actales requerimientos de secuenciacin de gran cantidad de
pptidos en poco tiempo, han dado origen al desarrollo de nuevos mtodos de
secuenciacin, desarrollados principalmente para afrontar proyectos como el del
proteoma humano. Entre estos mtodos podemos citar el MALDI MS y el ESI MS,
ambos basados en la espectrometra de masas.

La espectrometra de masas permite calcular la masa del compuesto analizado con
gran precisin. Esta tcnica se basa en que la desviacin que sufre una partcula
cargada al atravesar un campo magntico depende bsicamente de su carga y
masa. Si ionizamos las molculas, la mayora con carga +1, y las sometemos a un
barrido de campo magntico obtenemos un espectro de masas. Esta tcnica se
utilizaba con molculas en fase gaseosa lo que impeda su aplicacin a molculas
sensibles a la descomposicin por calor o por los tratamientos tradicionales
utilizados para pasar la muestra a fase gaseosa. En 1988 se desarrollaron dos
tcnicas que permiten evitar este problema.

La espectrometra de masas da mucha informacin sobre la masa molecular, la
presencia de cofactores, etc. Y adems puede utilizarse para secuenciar pequeas
cadenas de polipptidos, mediante una tcnica conocida como tanden MS, que
bsicamente consiste en dos epectrometros de masas en serie. La protena bajo
Tema 4. Aminocidos y pptidos Bioqumica
62
estudio se trata con proteasas para obtener una mezcla de pequeos pptidos. En el
primer espectrmetro la mezcla de pptidos se trata de forma que solo uno de los
pptidos es seleccionado para su posterior anlisis. El pptido seleccionado se
fragmenta en la cmara de colisin que se encuentra entre los dos espectrmetros
donde una pequea cantidad de gas noble (He o Ar) produce la fragmetacin del
pptido preferentemente por los enlaces peptdicos, como la cmara est al vaco y
no hay agua los productos son radicales. Los fragmentos son medidos en el
segundo espectrmetro. En un especto tpico los picos mayoritarios corresponden a
radicales que difieren en la masa de un aminocido particular. As puede deducirse
la secuencia. La nica ambigedad tiene lugar entre la leucina y la isoleucina que
tienen la misma masa molecular.

Este mtodo es rpido, requiere slo minsculas cantidades de muestra que pueden
ser extradas de una electroforesis bidimensional. Las grandes compaas como
Celera (particip en el proyecto genoma humano) disponen de sistemas
automatizados en que una gran cantidad de protenas se separan por electroforesis
bidimensional o HPLC, cada punto puede ser luego secuenciado por un
espectrmetro en tandem. Este mtodo podra usarse tambin para la secuenciacin
de DNA, pero los mtodos tradicionales son tan rpidos que no es rentable.

La figura muestra un tpico espectro realizado por espectrometra en tandem de un
pequeo pptido de 10 amincidos. La secuencia deducida de este pptido fue; Phe-
Pro-Gly-Gln-(Ile/Leu)-Asn-Ala-Asp-(Ile/Leu)-Arg.