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27 Métodos para La Cuantificación de Proteínas PDF
27 Métodos para La Cuantificación de Proteínas PDF
280
=1 mL/mg cm
205
=31 mL/mg cm
Protena (mg/mL) =(1.55A
280
0.76A
260
)
Protena (mg/mL) =(A
235
A
280
)/2.51
Protena (mg/mL) =(A
224
A
236
)/0.6
Protena (g/mL) =144(A
215
A
225)
Mtodos Derivados
Colorimtricos
Biuret 1000-10000
545
=0.06 mL/mg cm
Lowry 25-100 a 500 nm
2-30 a 660 nm
1-2 a 750 nm
Usar curva estndar
Bradford 1-15
595
=81 mL/mg cm
BCA 0.5- 10 Usar curva estndar
Mtodos Derivados
Fluorimtricos
o-ftalaldehido 1-5
excitacin
a 340 nm
emisin
a 475 nm
Usar curva estndar
Tabla II. Principales mtodos para la cuantificacin de protenas, principales ventaja e
inconvenientes
Mtodo Ventajas Inconvenientes
Mtodos de
Absorcin
No se pierden las
muestras
Interfieren muchos compuestos que absorben
en el UV
Mtodos Derivados
Colorimtricos
Biuret Bastante especfico para
protenas
Muestra pocas
interferencias
Es barato
Tiene poca sensibilidad
Lowry Tiene bastante
sensibilidad
No todas las protenas reaccionan igual
Mustra muchas interferencias como
detergentes no inicos, sulfato amnico etc.
Bradford Muy sensible Muestra interferencias con detergentes
BCA Es el mtodo mas sensible
Es el que muestra menos
interferencias
Mtodos Derivados
Fluorimtricos
o-ftalaldehido Muy sensible La interferencia de aminas contaminantes en
la muestra
No todas las muestras reaccionan igual
2
1.2. Mtodo de Biuret
Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu
2+
y los
grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu
2+
se acompleja con
4 NH. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad
de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de
manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy
baja y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados
muy concentrados (por ejemplo en suero).
1.3. Mtodo de Bradford
Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambin
Serva Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos
formas una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para
formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor
que el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato
y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que
interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.
1.4. Mtodo de BCA
El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz de formar un
complejo prpura intenso con inones Cu
1+
en medio alcalino. Este reactivo
forma la base de un mtodo analtico capaz de monitorizar el in cuproso
producido en una reaccin entre las protenas con Cu
2+
en medio alcalino
(reaccin de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromforo proporciona un
mtodo para la cuantificacin de protenas que es sencillo, rpido, muy
sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros
mtodos.
OH
-
Protena + Cu
2+
Cu
1+
Cu
1+
+BCA complejo prpura BCA- Cu
1+
1.5. Objetivos
Con esta prctica se pretende introducir al alumno en los diferentes
mtodos para la cuantificacin de protenas: su fundamento, sus ventajas e
inconvenientes. Se utilizarn tres mtodos (Biuret, Bradford y BCA), para cada
uno de ellos se realizar una curva estndar, se determinar el coeficiente de
extincin, el rango de sensibilidad, y se realizar la cuantificacin de dos
muestras problemas.
2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO
Tubos de ensayo
Pipetas de automticas regulables de 20-100 l y de 200-1000 l
3
Espectofotmetro
Agua destilada
Soluciones estndar de protena
Reactivo de Biuret
Reactivo de Bradford
Reactivo de BCA
3. PROTOCOLO A REALIZAR
3.1. Mtodo de Biuret
Aadir 1 ml del reactivo de biuret a los tubos estndar y muestras problemas
preparadas como se indica en la Tabla III.
Dejar a temperatura ambiente y leer la Absorbancia a 545 nm frente al
blanco. El color es estable 1 hora.
Tabla III. Protocolo tipo para la cuantificacin de protenas por el mtodo de Biuret
Reactivos Resultados
Tubos Estndar
(20 mg/ml)
H
2
O
R. Biuret
A
545
nm [protena]
Blanco 0 l 100 l 1 ml
1 25 l 75 l 1 ml
2 50 l 50 l 1 ml
3 75 l 25 l 1 ml
4 100 l 0 l 1 ml
Muestras
M1 100 l 0 l 1 ml
M2 100 l 0 l 1 ml
- Representa la curva estndar.
- Calcula el coeficiente de extincin.
- Calcula las concentraciones de protenas de las muestras M1 y M2.
3.2. Mtodo de Bradford
Aadir 1 ml del reactivo de Bradford a los tubos estndar y muestras
problemas preparadas como se indica en la Tabla IV.
Dejar a temperatura ambiente y leer Absorbancia a 595 nm frente al
blanco. El color es estable 1 hora.
Tabla IV. Protocolo tipo para la cuantificacin de protenas por el mtodo de Bradford
Reactivos Resultados
Tubos Estndar
(0,5 mg/ml)
H
2
O
R. Bradford
A
595
nm [protena]
Blanco 0 l 100 l 1 ml
1 25 l 75 l 1 ml
2 50 l 50 l 1 ml
3 75 l 25 l 1 ml
4 100 l 0 l 1 ml
Muestras
M1 100 l 0 l 1 ml
M2 100 l 0 l 1 ml
4
- Representa la curva estndar.
- Calcula el coeficiente de extincin.
- Calcula las concentraciones de protenas de las muestras M1 y M2.
3.3. Mtodo de BCA
Aadir 1 ml del reactivo de trabajo de BCA a los tubos estndar y
muestras problemas preparadas como se indica en la Tabla V.
Incubar 10 min a 60 C y leer Absorbancia a 562 nm frente al blanco.
Tabla V. Protocolo estndar para la cuantificacin de protenas por el mtodo de BCA
Reactivos Resultados
Tubos Estndar
(0,1 mg/ml)
H
2
O
R. BCA
A
562
nm [protena]
Blanco 0 l 100 l 1 ml
1 25 l 75 l 1 ml
2 50 l 50 l 1 ml
3 75 l 25 l 1 ml
4 100 l 0 l 1 ml
Muestras
M1 100 l 0 l 1 ml
M2 100 l 0 l 1 ml
- Representa la curva estndar.
- Calcula el coeficiente de extincin.
- Calcula las concentraciones de protenas de las muestras M1 y M2.
3.4. Compuestos que interfieren en la determinacin de protenas
Repetir las curvas estndar para cada uno de los tres mtodos pero
incluyendo se pueden incluir :
10 l de 1M EDTA ,
10 l de Tritn X-100,
10 l de SDS 20%
Determinar cmo estos compuestos afectan a la cuantificacin de
protenas por uno u otro mtodo.
4. RESULTADOS ESPERADOS
El mtodo de Biuret (poco sensible) permitir cuantificar la cantidad de
protenas en la muestra M1 pero no en la M2. Por el contrario los mtodos mas
sensibles (Bradford y BCA) permitirn cuantificar la muestra M2, pero la M1 se
saldr de rango. Para poder cuantificar la muestra M1 hara falta hacer
diluciones de la misma.
5. EJERCICIOS, DISCUSIN Y COMENTARIOS
- Qu mtodo es el ms sensible?, y el menos sensible?.
- Qu problemas tienes para determinar la concentracin de
protenas de las muestras M1 o M2. con cada una de estos
mtodos?. Cmo lo resolveras?.
- Discute tus resultados de acuerdo con los datos de la Tabla VI .
5
- Decide qu mtodo de determinacin de protenas elegiras para la
cuantificacin de protenas en: suero, orina, LCR, durante una
purificacin enzimtica, en un extracto bacteriano concentrado, en
preparaciones de membranas plasmticas solubilizadas con SDS, en
preparaciones de membranas mitocondriales solubilizadas con Tritn
X-100.
Tabla VI. Algunos compuestos que interfiren en la determinacin de protenas
Compuesto Interferencia en el Mtodo de
BCA
Interferencia en el Mtodo de
Lowry
50 mM EDTA Si Si
4 M Cloruro de guanidina N0 Si
1% Triton X-100 No Si
40% Sacarosa No Si
20% Sulfato amnico Si Si
3% Sulfato amnico No Si
ANEXO 1: REACTIVOS
Reactivo de Biuret
Reactivo preparado del siguiente modo. Disolver 3,8 g de CuSO
4
.5H
2
O y
6,7 g NaEDTA en 700 ml de H
2
O. Mientras se agita aadir 200 ml de
NaOH 5N y luego 1g de KI como estabilizante. Guardar en frasco de
plstico.
Reactivo de Bradford
Reactivo preparado del siguiente modo: mezclar 10 mg de Comassie
Blue G-250 con 10 ml de fosfrico al 88% y 4,7 ml de etanol absoluto.
Aadir H
2
O hasta 100 ml. Filtrar a travs de papel de filtro y guardar en
la oscuridad.
Reactivo de BCA
Reactivo preparado del siguiente modo.
Reactivo A: BCA 1%, Na
2
CO
3
2%, tartrato sdico 0,16%, NaOH
0,4% y NaHCO
3
0,95%. Ajustar a pH 11,25 con NaOH.
Reactivo B: CuSO
4
al 4%
Reactivo de trabajo: mezclar 100 volmenes de A con 2
volmenes de B.
Soluciones estndar de protenas
Seroalbmina bovina 20 mg/ml
Seroalbmina bovina 0,5 mg/ml
Seroalbmina bovina 0,1 mg/ml
Muestras M1 y M2
La muestra M1 debe tener una concentracin de protenas entre
10 20 mg/ml
La muestra M2 debe tener una concentracin de protenas entre
0,1- 0,5 mg/ml
6
6. BIBLIOGRAFA
Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal Biochem. 72: 248-254.
Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ , Klenk DC (1985): Measurement of protein
using bicinchoninic acid. Anal Biochem 150: 76-85.
Suelter CH (1985): A Practical guide to enzymology, Editorial, J ohn Wiley &
Sons, New York.
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