Profesora T.

M JIMENA LE ROY
Un nanmetro es la millonsima parte de
un milmetro: 1nm = 10-9 metros.
Las muestras pueden ser obtenidas por:
Frotis
Aspiracin y/o lavado
puncin aspiracin con aguja fina
impronta
biopsia
puncin con trocar
autopsia.
1. Fijacin
2. Deshidratacin
Pasos a seguir
PROCESAMIENTO DEL TEJIDO
2. Deshidratacin
3. Inclusin
4. Corte
5. Coloracin
Puncin con aguja
FROTIS
Obtencin de la muestra
biopsia
Para fijar las muestras se emplean dos procedimiento:
FIJACIN POR INMERSIN :
muestra debe realizarse inmediatamente de ser extraida del ser vivo (biopsia)
o inmediatamente despus de la muerte (necropsia).
FIJACION POR PERFUSIN:
tcnica ideal para animales de experimentacin
Consolidar una disposicin
espacial existente creando
enlaces entre molculas enlaces entre molculas
vecinas que soporten la
manipulacin posterior.
Detener los procesos de autlisis.
Especialmente la accin de proteasas y
nucleasas
Conservar la cito-histoarquitectura de la
La fijacin debe
Conservar la cito-histoarquitectura de la
muestra similar a su estado in vivo.
Preparar al tejido para los procedimientos
posteriores
Agente Anti-microbiano
Laboratorio de Ciencias Morfolgicas
Universidad de Valparaso
Mtodos Fsicos
Mtodos Qumicos Mtodos Qumicos
Aplicacin de
calor
Microondas Microondas
Aplicacin de fro
MTODOS FSICOS DE FIJACIN
CONGELACIN
CO2
NITRGENO
REFRIGERACIN DIRECTA
Buena conservacin de la morfologa
Se conservan sustancias solubles en agua
Se conservan molculas pequeas
Permite post fijacin
REFRIGERACIN DIRECTA
A-70
CONGELACIN
Trozos pequeos
o Paso por isopentano
o Nitrgeno lquido
o Transporte a cmara fra
No es una fijacin propiamete No es una fijacin propiamete
No hay insolubizacin de protenas
Complementar con vapores de formol
CALOR
Coagulacin de protenas
Disolucin de lpidos
Baja conservacin del tejido
Conservacin de ncleos
Conservacin de microrganismos
Identificacin lpidos
Para biopsia contempornea
Es necesario congelar una biopsia
Para tcnicas de inmuno
fluorescencia
Para identificar enzimas
Algunas tcnicas argnticas
Identificacin lpidos
Estabilizacin de proteinas,
lipoprotenas, ac nucleicos y
mucosustancias mucosustancias
Producen dureza del tejido
Convierte citoplasma en un gel
insoluble
Conserva organelos
Mtodos Qumicos
Conserva organelos
Penetracin + lenta de medios de
inclusin
Convierte
citoplasma en un
gel insoluble
Formaldehdo
Mtodos Qumicos
Conserva organelos
Penetracin + lenta
de medios de
inclusin
Glutaraldehdo
Tetrxido de Os
Coagulacin de
prot.
Citoplasmticas
Destruccin o
Mtodos Qumicos
Destruccin o
distorsin de
organelos
mejor penetracin
de inclusin en
parafina
Coagulacin de
prot.
Citoplasmticas
Destruccin o
Etanol
Metanol, Acetona
Mtodos Qumicos
Destruccin o
distorsin de
organelos
mejor penetracin
de inclusin en
parafina
Metanol, Acetona
A. Tricloroactico
A. Pcrico
Cloruro mercurio
INMUNOHISTOQUIMICA
Patrn nuclear
INMUNOHISTOQUIMICA
Patrn extracelular
fijacin de matriz
Que induzca cambios los menores cambios
conformacionales en nuestro tejido
No enmascare estructuras
provoque la menor difusin,
Provoque la menor extraccin o desplazamiento de Provoque la menor extraccin o desplazamiento de
Permita la penetracin tinciones posteriores
Buena morfologa
Baja toxicidad,
Estabilidad en su almacenamiento
Sea econmico.
Cualidades de un fijador:
1.- Fijar la clulas antes que aparezcan fenmenos
post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.)
2.- Poseer alto poder de penetracin para fijacin correcta
en las capas profundas de la pieza en las capas profundas de la pieza
Cualidades de un fijador:
1.- Fijar la clulas antes que aparezcan fenmenos
post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.)
2.- Poseer alto poder de penetracin para fijacin correcta
en las capas profundas de la pieza
3.- Conservar los detalles estructurales que presentaban in vivo 3.- Conservar los detalles estructurales que presentaban in vivo
4.- Permitir el empleo de procedimientos necesarios para
su observacin ulterior
Cualidades de un fijador:
1.-Fijar la clulas antes de que aparezcan los fenmenos
post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.)
2.- Poseer alto poder de penetracin para fijacin correcta
en las capas profundas de la pieza
3.- Conservar los detalles estructurales que presentaban in vivo
4.- Permitir el empleo de procedimientos necesarios para
su observacin ulterior
5.- Impedir la desaparicin de los elementos solubles
durante o despus de ella.
6.- No provocar la produccin de estructuras artificiales.
Cualidades de un fijador:
1.-Fijar la clulas antes de que aparezcan los fenmenos
post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.)
2.- Poseer alto poder de penetracin para fijacin correcta
en las capas profundas de la pieza
3.- Conservar los detalles estructurales que presentaban in vivo
4.- Permitir el empleo de procedimientos necesarios para 4.- Permitir el empleo de procedimientos necesarios para
su observacin ulterior
5.-. Impedir la desaparicin de los elementos solubles
durante o despus de ella.
6.- No provocar la produccin de estructuras artificiales.
7.- No retraer excesivamente los tejidos
8.- No volverlos friables o quebradizos.
Laboratorio de ciencias Morfolgicas
Universidad de Valparaso
3.- Conservar detalles estructurales que presentaban in vivo
4.- Permitir uso de procedimientos necesarios para observacin ulterior
3.- Conservar detalles estructurales que presentaban in vivo
4.- Permitir uso de procedimientos necesarios para observacin ulterior
Laboratorio de Ciencias Morfolgicas
Universidad de Valparaso
Laboratorio de Ciencias Morfolgicas
Universidad de Valparaso
5.-. Impedir la solubizacin de los elementos durante o despus de ella.
5.-. Impedir la desaparicin de
los elementos solubles
durante o despus de ella.
Laboaratorio Ciencias Morfolgicas
Universidad de Valparaso
Laboaratorio Ciencias Morfolgicas
Universidad de Valparaso
Laboaratorio Ciencias Morfolgicas
Universidad de Valparaso
1.-Fijar la clulas antes de que aparezcan los fenmenos
post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.)
Temperatura / Tiempo de fijacin
Tamao de la muestra
Volumen de fijador
FIJADORES A BASE DE FORMOL
Formol neutro
Formol buffer
Histologa en general
Estudios histolgicos
Sistema nervioso
Formol buffer
Formol alcalino
Formol Ca etc
Impregnaciones argnticas
Tejido seo
Identificacin de fosfolpidos
protenas
Fijador de tipo coagulante, poco
penetrante.
Se emplea en mezclas fijadoras.
La ms usada es la mezcla de Bouin. La ms usada es la mezcla de Bouin.
Provee buena morfologa.
Su uso se recomienda para estudio de
inmunoglobulinas, filamentos intermedios
y hormonas.
CIDO PCRICO
Forma picratos:
Sales, unindose anin con grupos bsicos de protenas
Los picratos son solubles en agua
Se recomienda paso posterior en OH 80
El alcohol coagula finalmente picratos de las protenas
Hidroliza los cidos nucleicos
Fijaciones prolongadas destruyen el tejido
FIJADORES A BASE DE FORMOL Y C PCRICO
BOUIN
HOLLANDE
ALLEN
DUBOSQ BRASIL
GENDRE
ROSSMAN
BOUIN HOLLANDE ALLEN
ESTUDIOS TOPOGRFICOS ESTUDIOS TOPOGRFICOS
DA BUENAS COLORACIONES TRICRMICAS
HIDRATOS DE CARBONO EN GENERAL
ESTUDIOS CITOLGICOS
CONTRA INDICACIONES :
Tejidos hemorrgicos
BOUIN - HOLLANDE - ALLEN - DUBOSQ BRASIL
Tejidos hemorrgicos
Sistema nervioso
Reaccin de Feulgen
Dubosq Brasil Bouin alcohlico
Alcohol 80... 150 cc
Formol 60 cc.
AC. Actico glacial. 15 cc.
AC. Pcrico 1 gr. AC. Pcrico 1 gr.
Tiempo de fijacin de 4 a 24 horas
lavado posterior en alcohol de 80 3 horas.
DUBOSQ BRASIL
HISTOLOGIA EN GENERAL
MAS PENETRANTE QUE EL BOUIN
ESPECIAL PARA PUNCIONES
BIOPSIAS DE HGADO, RENALES Y TESTCULO
EN GENERAL PARA ESTRUCTURAS FINAS
GENDRE - ROSSMAN
HISTOLOGA DE POLISACRIDOS
IDEAL PARA GLICGENO
CIDO ACTICO y MEZCLAS FIJADORAS
No fija protenas
Coagula la cromatina nuclear
Usado en mezclas fijadoras
Un agenta oxidante transfiere tomos de oxgeno al sustrato.
el agente oxidante puede ser descrito como un agente oxigenante o un
agente de transferencia de tomos de oxgeno.
Algunos ejemplos son :
o anin permanganato MnO
4
-
o cromato CrO
4
-
o tetrxido de osmio, OsO
4
.
todos estos compuestos son xidos, ms concretamente polixidos.
En algunos casos, estos xidos pueden utilizarse como aceptores de
electrones, como en la reaccin de conversin de permanganato MnO
4
-
a
mangato MnO
4
2-
o El cido pcrico es explosivo en forma no hidratada.
o Cuando las soluciones que contengan cida sdica
sean eliminadas por desage lavaremos este
dejando correr mucha agua para evitar
que esta reaccione con el metal de las caeras
y lo haga explosivo.
Eliminacin de residuos
y lo haga explosivo.
La formalina debe eliminarse en recipientes
para ser destruda
o Las soluciones de mercurio DEBEN tienen su
propio contenedor:
Si se tiran por el desage se forman resistentes
amalgamas con el metal de las caeras.
FIJADORES A BASE DE ALCOHOL
ETANOL - METANOL - ACETONA - CARNOY ALFAC - METACARN
Histologa en general
citologa
glicgeno
Mucopolisacridos cidos
R.N.A.
FIJADORES A BASE DE ALCOHOL
ETANOL - METANOL - ACETONA - CARNOY - ALFAC
GLICGENO
ETANOL
PIGMENTOS
PROTENAS
SUSTANCIAS INORGNICAS
Altera morfologa de lpidos
SISTEMANERVIOSO
Poco penetrante
Fijador coagulante
Buena penetracin de inmunoreactivos
Puede inducir a cambios conformacionales Puede inducir a cambios conformacionales
Endurece los tejidos
Morfologa regular
Acetona
Histoqumica enzimtica
Altera morfologa
FIJADORES A BASE DE ALCOHOL
ETANOL - METANOL - ACETONA - CARNOY - ALFAC- METACARN
Altera morfologa de lpidos
Metanol
cido ribonucleico
FIJADORES A BASE DE ALCOHOL
ETANOL - METANOL - ACETONA - CARNOY - METHACARN - ALFAC
FRAGMENTOS TISULARES
BUEN FIJADOR NUCLEAR
CARNOY
BUEN FIJADOR NUCLEAR
CORPSCULOS DE NISSL
GLICGENO
Altera citoplasma
Produce lisis de glbulos rojos
R.N.A.
se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados
sangre,
mdula sea,
Ganglio
Alcohol metlico
Ganglio
bazo,
lquidos de puncin,
FIJACIN DE LOS HIDRATOS DE CARBONO
es necesario evitar que se disuelvan en agua:
extraer el agua mediante fijadores cuya avidez por
el agua sea mayor que ellos
ALCOHOL E tlico al 70%
ACETONA ACETONA
Tienen el inconveniente que retraen los tejido
y los endurecen para el procesamiento posterior.
CLORURO DE MERCURIO
HgCl2 + H2O HO Hg Cl + H+ + Cl-
Forma precipitado probablemente cloruro mercurioso Forma precipitado probablemente cloruro mercurioso
Que debe ser removido
Solucin de yodo
Tiosulfato de Sodio
Tiempos excesivos de fijacin provocan corrosion del tejido.
Poco penetrante. Se emplea en mezclas
fijadoras: ZENKER; FORMOL SUBLIMADO; B5,
etc.
Aditivo y coagulante
Excelente morfologa
B5 recomendado especialmente para la
fijacin de ganglios linfticos.
FIJ. A BASE DE METALES PESADOS
ZENKER - HELLY- FORMOL SUBLIMADO
Conserva morfologa
Conserva histologa
Tincin nuclear
rganos hematopoyticos
Necesario paso por alcohol yodado
No se recomienda para histoqumica
CONSERVA MORFOLOGA
HISTOLOGA FINA
CITOLOGA
FIJ. A BASE DE METALES PESADOS
ZENKER
CITOLOGA
Favorece tincin nuclear
FAVORECE TINCION FIBRAS COLGENAS
Recomendado para rganos hematopoyticos
Acenta tincin citoplasmtica con colorantes cidos
SUSA
ESPECIAL PARA GANGLIOS
(cloruro de mercurio)
ENDOMETRIO
ESTRUCTURAS FIBRILARES
AGENTE DESCALCIFICADOR
FIJADORES A BASE DE CROMO
ORTH - ZENKER - REGAUD
Tejidos cromafines
Citologa : mitocondrias, mitosis
Fosfolpidos
FIJ. a BASE DE TETRXIDO de Os
CITOLOGA
SISTEMA NERVIOSO
o cido smico
GRASAS NO SATURADAS
MICROSCOPA ELECTRNICA
Costo muy elevado
Reduccin rpida a luz
Vapores irritantes
ACIDO SMICO
se usa siempre como tetrxido de osmio (OsO4)
en solucin acuosa al 1 o 2%
disolucin demora de 6 a 12 horas, se conservar en oscuridad.
poco capacidad de penetracin por lo que el tejido ser de 2 a 3 mm. ` poco capacidad de penetracin por lo que el tejido ser de 2 a 3 mm. `
TIEMPO DE FIJACIN:
de 6 a 24 horas
lavar con abundantemente en agua.
Se reduce fcilmente con la luz y en contacto con impurezas,
por ello el material de vidrio usada debe necesita lavado qumico.
evitar sus vapores por lo que debe salvaguardar especialmente los ojos.
es el fijador ideal para microscopa electrnica.
pues se fija en los dobles enlaces de las
cadenas laterales de los lpidos de las
ACIDO SMICO
cadenas laterales de los lpidos de las
membranas plasmticas.
adems el Os es un metal opaco a los
electrones (sirve de tincin).
FIJACIN DE LOS LIPIDOS :
es necesario evitar su oxidacin
bloqueando los lugares donde existen enlaces
- CH=CH - CH=CH
mediante sustancias como tetrxido de Osmio
TETRXIDO DE OSMIO
Para la FIJACIN DE LOS LIPIDOS es necesario evitar su
oxidacin (o enranciamiento) bloqueando los lugares donde
existen enlaces - CH=CH -
ACIDO SMICO
Imprescindible para fijar mielina.
Permite coloraciones complementarias con hematoxilina, safranina, fucsina.
A BASE DE URANIO - CADMIO - COBALTO
CAJAL - AOYANA - DE FANO
Aparato reticular de Golgi
Escasa penetracin
JIMENA LE ROY B
TECNLOGO MDICO