Ctedra Microbiologa Agrcola

1
UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE ROS
FACULTAD DE
CIENCIAS AGROPECUARIAS

Unidad Temtica 3

Crecimiento Bacteriano
Benintende, Silvia y Sanchez, Cecilia

Introduccin
En un sistema biolgico se define al crecimiento como el aumento ordenado de las
estructuras y los constituyentes celulares de un organismo. Segn ello, el aumento de la
masa celular producido por acumulacin de productos de reserva (glucgeno, poli-
hidroxibutirato) no constituyen crecimiento.
Se puede considerar como crecimiento al incremento de clulas individuales por un lado,
y por otro lado se puede considerar al crecimiento del nmero de clulas (proliferacin de
la poblacin).
En lo que se refiere al crecimiento de clulas individuales, este consiste en el aumento
del tamao y peso de las clulas que precede a la divisin celular. Esta divisin trae
aparejada un aumento en el nmero de clulas (proliferacin de la poblacin).
Las bacterias se dividen por fisin binaria, a travs de la una cual clula madre al
alcanzar un determinado volumen se divide dando dos clulas hijas. El proceso de fisin
binaria consiste en la autoduplicacin del material hereditario seguido de la reparticin en
las dos clulas hijas, las que se separan por estrangulamiento de la membrana celular y
formacin de la pared celular (Fig. 1).



Fig. 1. Divisin binaria de clulas procariotas. 1 El cromosoma circular est unido a un punto de
la membrana plasmtica 2El cromosoma se duplica. Las dos copias estn fijas a la membrana en
puntos cercanos 3 La clula se alarga, se agrega nueva membrana plasmtica entre los puntos
de unin 4 La membrana plasmtica crece hacia el interior5 La clula original se ha dividido en
Ctedra Microbiologa Agrcola
2
UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE ROS
FACULTAD DE
CIENCIAS AGROPECUARIAS
dos clulas hijas. La imagen corresponde al corte transversal de una clula procariota durante la
fisin binaria en una etapa similar a la fase 4 descripta.

Basado en el concepto que una clula se divide dando dos clulas hijas, y stas a su vez
se vuelven a dividir dando dos clulas cada una de ellas, se presenta en el siguiente
cuadro la proliferacin de una poblacin de clulas a partir de una sola, con un tiempo de
generacin de 30 minutos.
Tiempo
(horas)
Nmero
de clulas
Log.10 (nmero
de clulas)
0 1 0
0.5 2 0.301
91 4 0.602
1.5 8 0.903
2 16 1.204
2.5 32 1.505
3 64 1.806
3.5 128 2.107
4 256 2.408
4.5 512 2.709
5 1024 3.010
. . .
. . .
10 1.048.576 6.021
Al graficar en un sistema de coordenadas el tiempo (abscisas) y el nmero de clulas
(ordenadas) se obtiene una grfica como la que se muestra en el siguiente esquema:
0
500
1000
1500
2000
2500
0 1 2 3 4 5 6
tiempo (hs)
N

l
u
l
a
s

Fig. 2. Velocidades de proliferacin en escala aritmtica.

Como se observa en la grfica la curva aumenta su pendiente. Frecuentemente es til
transformar los datos de nmero de clulas a su logaritmo decimal ( graficar el nmero
de clulas versus el tiempo transcurrido en una grfica semilogartmica). Se obtiene as
una grfica en la que la relacin es lineal.
Ctedra Microbiologa Agrcola
3
UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE ROS
FACULTAD DE
CIENCIAS AGROPECUARIAS
1
10
100
1000
10000
0 1 2 3 4 5 6
tiempo (hs)
N

l
u
l
a
s



Se conoce como tiempo de duplicacin generacional al tiempo en que tarda una
poblacin en duplicar su nmero. sta ltima grfica permite fcilmente encontrar el
tiempo de duplicacin para la poblacin estudiada.
Es frecuente que a partir de mediciones de crecimiento a intervalos conocidos y
graficando estos datos se calcule el tiempo de duplicacin de una poblacin.
Los tiempos de duplicacin varan segn el microorganismo del que se trate. Por ejemplo:
Eschericha coli 0,35 hs
Rhizobium meliloti 1,8 hs
Nitrobacter sp aproximadamente 20 hs
El estudio grfico del crecimiento es muy til, pero a veces es conveniente conocer la
expresin matemtica que representa este crecimiento exponencial


=

0
.
(t to).
Donde:
: nmero de clulas o masa microbiana al tiempo t

0
:nmero de clulas o masa microbiana en el momento inicial (t
0
)
:constante que da idea de la velocidad instantnea del crecimiento
t-t
0
:tiempo transcurrido entre la medicin inicial y la final


Ciclo normal del crecimiento
Las poblaciones microbianas raramente mantienen un crecimiento exponencial
prolongado. Si ello ocurriera en poco tiempo la tierra estara tapada de una masa
microbiana mayor que la de la tierra misma.
El crecimiento est normalmente limitado por el agotamiento de nutrientes o por la
acumulacin de productos del mismo metabolismo microbiano, que les son txicos a la
poblacin.
La consecuencia es que el crecimiento al cabo de un cierto tiempo llega a disminuir hasta
detenerse.
En la figura 4 se presenta la grfica de una curva tpica de crecimiento bacteriana.
Como se puede observar, en la grfica se ha relacionado el tiempo transcurrido con el
logaritmo del nmero de clulas bacterianas. Cuando se realiza este tipo de grficas se
obtiene una lnea recta, sin embargo en esta slo un sector (fase exponencial)
corresponde a una recta.


Fig. 3. Velocidades de proliferacin en escala logartmica.
Ctedra Microbiologa Agrcola
4
UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE ROS
FACULTAD DE
CIENCIAS AGROPECUARIAS

Es posible distinguir cuatro fases:
1) fase de latencia o de retardo
2) fase exponencial
3) fase estacionaria
4) fase de muerte
En la fase de latencia existe un aparente reposo en el que las clulas sintetizan las
enzimas necesarias para la actividad metablica que deben llevar adelante.
Cuando se hacen mediciones del nmero de clulas en distintos tiempos dentro de esta
fase, el valor no cambia sustancialmente. En cambio, interiormente las clulas trabajan
activamente adaptando el equipo enzimtico al medio de cultivo. La bacteria se prepara
para hacer uso de los nutrientes que este medio le aporta, por lo tanto es la fase de
adaptacin al medio, con aumento de la masa celular pero no del nmero de clulas. La
edad del inculo va a influir en el tiempo de latencia en el medio fresco debido a la
acumulacin de materiales txicos y a la falta de nutrientes esenciales dentro de la clula
durante el crecimiento anterior. En general, inculos viejos alargan la fase de latencia.


Fig. 4 Curva de proliferacin tpica de una poblacin bacteriana


Pasado este perodo, el cultivo entra en la denominada fase de crecimiento
exponencial, donde la velocidad de crecimiento es mxima.
La velocidad de crecimiento que alcanza un cultivo, depende del tipo de microorganismo
que se trate y diversos factores ambientales como son la temperatura, el pH, oxigenacin,
etc.
La velocidad de crecimiento comenzar a disminuir hasta hacerse nula cuando alcance la
fase estacionaria, ya que cambios en la composicin y concentracin de nutrientes entre
el cultivo del inculo y el medio fresco pueden desencadenar el control y la regulacin de
la actividad enzimtica.
Esta fase se presenta por agotamiento del suministro de algn nutriente esencial o por
acumulacin de productos metablicos que sean txicos. Tambin puede ser por la
disminucin de la oxigenacin o cambios en las condiciones de pH del medio de cultivo
(acidificacin o alcalinizacin):
En esta fase se equilibran el nmero de clulas nuevas con el nmero de clulas que
mueren.
Por ltimo, el cultivo entra en la fase de muerte, en la que el nmero de clulas que
mueren se va haciendo mayor.
Ctedra Microbiologa Agrcola
5
UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE ROS
FACULTAD DE
CIENCIAS AGROPECUARIAS
La pendiente de esta fase puede ser ms o menos pronunciada de acuerdo al tipo de
microorganismo de que se trate. Suelen presentarse pendientes menos bruscas cuando el
microorganismo presenta alguna forma de resistencia (esporas, glicocalix).


Mtodos de medicin del crecimiento
El crecimiento se evala haciendo mediciones sucesivas en tiempos determinados de la
poblacin en estudio. En cada momento se evala cual es la poblacin en ese instante.
Existen diversas formas de evaluar una poblacin bacteriana.

a. Conteo microscpico directo
Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente disponible
en un laboratorio de microbiologa, ya que consiste en contar con un microscopio la
cantidad de clulas presentes en un volumen determinado.
Para estos recuentos se utilizan generalmente cmaras de recuentos ( cmara de Petroff
Hauser, cmara de Neubaver Fig. 5-). Una de las mayores ventajas del recuento
microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los
objetos contados
La muestra puede utilizarse tal cual, (leche, o cultivos puros en medio lquido), o puede
prepararse una dilucin.

Fig. 5 Cmara de Neubaver


Para hacer el conteo se procede de la siguiente manera. Si se posee una cmara dividida
en 25 cuadrados. El rea de los 25 cuadrados es conocida, como tambin el volumen de
muestra que esta rea admite.
Contando el nmero de bacterias presentes en los cuadrados (o algunos de ellos) se
puede conocer cuanto hay en volumen conocido. Suponiendo 50 bacterias en 25
cuadrados, y sabiendo que los 25 cuadrados corresponden a 0,02 mm
3
.

50 bacterias _______ 0,02 mm
3

x
=
_______ 1000 mm
3
(1 cm
3
)

x
=
1000 mm
3
* 50 bacterias
0,02 mm
3

x = 2.500.000 bact./mL = 2,5.10
6
bact./mL





Ctedra Microbiologa Agrcola
6
UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE ROS
FACULTAD DE
CIENCIAS AGROPECUARIAS

Ventajas del mtodo Desventajas del mtodo
Es rpido La cantidad de muestra analizada es poca
Los frotis se pueden guardar Provoca cansancio del operador
Las exigencias de equipo son
mnimas
Slo sirve para muestras con cargas superiores a
10.000 por mL.
Se pueden observar las
diferentes morfologas de los
microorganismos.
Es difcil distinguir los microorganismos de las
partculas de muestra
Una inadecuada distribucin de la muestra sobre la
superficie del portaobjetos puede ocasionar serios
errores
Es empleado para recuento
de poblaciones microbianas
de suelo
Es difcil diferenciar los microorganismos viables de
los no viables

b. Conteo de clulas viables
El mtodo se basa en la consideracin que el crecimiento implica el aumento de los
microorganismos capaces de formar colonias.
Este mtodo puede hacerse con medios slidos o lquidos. El mtodo ms
frecuentemente empleado es el conteo en placas (medios slidos) formando colonias.
Por lo tanto se determinan por este mtodo slo las clulas microbianas VIABLES en las
condiciones de trabajo (nutrientes, atmsfera, temperatura).
Para ello se siembra una cantidad conocida de la suspensin bacteriana cuyo nmero se
desea conocer. En un medio slido cada bacteria se multiplicar formando una colonia
visible a simple vista que puede ser contada. Como las colonias pueden originarse tanto
de una clula como de un grupo de clulas, se utiliza el trmino: UNIDADES
FORMADORAS DE COLONIAS (u.f.c.), y esto puede constituir una desventaja ya que si
dos bacterias no se separan darn una sola colonia, subestimando de esta forma el
nmero de microorganismos en la suspensin. Adems, a los efectos de que todas las
clulas que queden en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que
los errores del mtodo sean menores, se establece que las condiciones ptimas de
conteo se dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias.
Algunas bacterias son difciles de contar en medios slidos (Nitritadores) y se requiere de
conteos en medios lquidos. Para ello se recurre a la tcnica de determinacin del
nmero ms probable (NMP) de microorganismos. Se basa en la determinacin de la
presencia o ausencia de un determinado tipo de microorganismo (en funcin de que
crezcan o de que produzcan determinada reaccin en el medio o no), en diferentes
cantidades de muestra.
Para poder determinar el NMP de microorganismo se debe diluir hasta tener una densidad
que sea menor a 1 clula por cada mililitro de diluyente. Por ejemplo, para hacer
diluciones hasta obtener 3 clulas en 5 ml se siembra 1 ml en cada uno de 5 tubos con
medio lquido adecuado, esperando que en 3 tubos haya crecimiento de microorganismos
y en 2 no ( si las clulas no se distribuyen 1 en cada ml se pueden obtener otros
resultados: 2 positivos y 3 negativos, o 1 positivo y 4 negativos). Los resultados posibles
son al azar.
La interpretacin de los resultados, se hace en base a una distribucin estadstica, y en
general se emplean tablas preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se
siembra en cada serie de tubos, teniendo en cuenta la dilucin en la se observa
proliferacin de microorganismos.

Ctedra Microbiologa Agrcola
7
UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE ROS
FACULTAD DE
CIENCIAS AGROPECUARIAS
Este mtodo se emplea recuentos microbianos de Nitratadores por la dificultad que
presentan para ser visualizadas las colonias en medios slidos. Tambin es til para
determinar cargas microbianas bajas, menores de 10 por gramo, pero puede igualmente
emplearse para cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas. Se prefiere adems
este mtodo cuando los microorganismos son de lento crecimiento, o cuando han sido
sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecacin, etc.).


c. Medicin de la densidad bacteriana
Es una tcnica en la que se mide la masa de microorganismos en una suspensin. Para
ello se utiliza un espectrofotmetro y se mide la cantidad de luz que atraviesa en una
suspensin de microorganismos, en comparacin con un blanco que es el medio
esterilizado y sin sembrar. Cuanto mayor es el nmero de clulas en suspensin, tanto
menor es el porcentaje de luz que atraviesa el medio.
Para relacionar la transmitancia con al densidad bacteriana se requiere de hacer curvas
patrn de densidad conocidas.
A= k x W
A: Absorbancia k: constante W: masa celular



d. Otros mtodos de recuento
Determinacin de ATP: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa
de una poblacin bacteriana. Se considera que la proporcin de ATP encontrado en una
muestra es proporcional con la presencia de clulas vivas
Recuento electrnico: Los contadores electrnicos permiten realizar recuentos de
bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y
microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos constan de electrodos
que miden la resistencia elctrica del sistema. Un volumen fijo de una suspensin
bacteriana es forzado a pasar desde un compartimiento al otro a travs del pequeo
conducto. Cuando pasa un microorganismo, la resistencia al pasaje de una corriente
elctrica se incrementa debido a que la conductividad de la clula es menor que la del
medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos y contados. Este tipo de
recuento presenta algunos inconvenientes. No pueden medirse soluciones muy
concentradas de microorganismos, debido a que el pasaje de ms de una clula en un
breve perodo de tiempo va a ser tomado como una clula ms grande, y es comn la
obstruccin del orificio por microorganismos muy grandes.


Ctedra Microbiologa Agrcola
8
UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE ROS
FACULTAD DE
CIENCIAS AGROPECUARIAS

Bibliografa
Brock, T. & M. Madigan. 1993. MICROBIOLOGA. 6
ta
Edicin. Prentice Hall
Hispanoamrica S. A. Mxico.
Ranea, F. 2002. http://www.microbiologia.com.ar/fisiologia/crecimiento.html