FORMULACIN DE UN PROTOTIPO DE BIOFERTILIZANTE CON BASE EN Rhizobium sp.

DIEGO MAURICIO RIVERA BOTA

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Departamento de Farmacia Maestra Ciencias Farmacuticas Bogot, Colombia 2012

FORMULACIN DE UN PROTOTIPO DE BIOFERTILIZANTE CON BASE EN Rhizobium sp.

DIEGO MAURICIO RIVERA BOTA

Tesis presentada como requisito para optar al ttulo de: Magster en Ciencias Farmacuticas

Director: M.Sc. Helber de Jess Barbosa Barbosa Codirector (a): Ph.D. Ruth Rebeca Bonilla Buitrago

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Departamento de Farmacia Maestra Ciencias Farmacuticas Bogot, Colombia 2012

Yo nunca he dudado de Dios ni de mis manos Maestro Antonio Bonilla

Agradecimientos
A Dios por permitirme tener la voluntad de seguir creciendo como persona y como profesional A mi hermosa familia por ser el motor de mi existencia y la alegra de mi vida. En cada momento se encuentran en mis pensamientos A mi amor Melissa Obando por ser lo ms lindo de mi vida, mi fortaleza y la persona que siempre ha estado en los momentos ms difciles de mi vida Al profesor Helber Barbosa Barbosa, por su acertada direccin de la investigacin y por siempre creer en mi y apoyarme en todos los sentidos A la Dra. Ruth Bonilla, por brindarme la oportunidad de seguir avanzando profesionalmente, por su confianza, afecto y su linda familia que siempre han estado conmigo ofrecindome su ms apreciado cario. A la Dra. Bibiana Vallejo por su valiosa asesora en la utilizacin de polmeros A Daniel Rojas, Andrs Moreno y Sergio Pardo por su apoyo incondicional, aprecio y ms sincera amistad convirtindose en personas valiosas en mi vida A las Dras. Gloria Patricia Barrera, Cecilia Merkis, Stella Castro y Eliana Bianucci por su valiosa asesora y disposicin en las microscopias electrnica de barrido y de transmisin. A Plinio Sabogal, Jeisson Manrique, Julio Lara y todas las personas de Colorcn-Colombia por su apoyo en el seguimiento de la investigacin y aporte de equipos, personal capacitado y excelente asistencia tcnica. A la Dra. Olga Luca Ortz de FMC Biopolymer por su contribucin con los polmeros para la investigacin A Ins Roldan y Lady Molano por su ayuda desinteresada, entrega y energa para el logro de este trabajo. Dios las proteja y las llene de mil bendiciones por el resto de su vida. Y a todas las personas integrantes del Laboratorio de Microbiologa de Suelos de Corpoica que de alguna manera estuvieron involucradas en el desarrollo de la investigacin y que en este momento se me escapan de mi mente.

Contenido
....................................................................................................................................................... ..... Pg.

Lista de figuras ...................................................................................................................................8 Lista de tablas ................................................................................................................................. 10 Lista de anexos ............................................................................................................................... 11 Lista de smbolos y abreviaturas .................................................................................................... 12 Resumen ......................................................................................................................................... 13 Introduccin ..................................................................................................................................... 15 Justificacin ..................................................................................................................................... 17 Captulo I. Objetivos ..................................................................................................................... 19

Objetivo General ...................................................................................................... 19 Objetivos especficos ............................................................................................... 19 Captulo II. Marco terico ............................................................................................................. 20

2.1 Importancia de la fijacin biolgica de nitrgeno (FBN) en leguminosas ............ 20 2.2 Simbiosis Rhizobium-leguminosas ..................................................................... 22 2.3. Proceso de nodulacin ...................................................................................... 25 2.4. Vehculos utilizados para la inmovilizacin de microorganismos ....................... 26 2.5 Formulaciones de inoculantes rizobianos ........................................................... 29

Captulo III. Materiales y mtodos .............................................................................................. 34

3.1 Localizacin del estudio ..................................................................................... 34 3.2 Microorganismo, medios y condiciones de cultivo ............................................... 34 3.3 Caracterizacin bioqumica e identificacin molecular de la cepa G58 ............... 34 3.4 Caracterizacin de las actividades de promocin de crecimiento vegetal de la cepa G58 ................................................................................................................. 37 3.5 Estudios de preformulacin ................................................................................ 38 3.6 Evaluacin en invernadero del efecto de los polmeros sobre la actividad biolgica en frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] ........................................... 40 3.7 Estudios de Formulacin .................................................................................... 41 3.8 Tcnicas microscpicas ..................................................................................... 42 3.9 Evaluacin en invernadero del efecto de los prototipos de formulacin slida sobre la actividad biolgica en frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] .............. 43 Captulo IV. Resultados y Discusin ......................................................................................... 45

4.1. Caracterizacin fenotpica, bioqumica y molecular de la cepa de Rhizobium sp., G58 ................................................................................................................... 45 4.2. Caracterizacin de las actividades de promocin de crecimiento vegetal .......... 47 4.3. Estudios de preformulacin ............................................................................... 48 4.4. Evaluacin en invernadero del efecto de los tres polmeros seleccionados sobre la actividad biolgica en frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] .............. 57 4.5. Evaluacin en invernadero del efecto de los prototipos de formulacin slidos sobre la actividad biolgica en frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] .............. 63 4.6. Evaluacin de diferentes propiedades de los prototipos .................................... 67 Conclusiones ................................................................................................................................... 73 Recomendaciones .......................................................................................................................... 74

Bibliografa ....................................................................................................................................... 75 Anexos ..............................................................................................Error! Marcador no definido.

Lista de figuras
Figura 1 Amplificacin del 16S rDNA de la cepa G58 mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%. C5B: Cepa de referencia y MP: Marcador de peso molecular 1000 kb plus. ... 43 Figura 2 rbol filogentico realizado mediante la amplificacin del 16S rDNA. La filogenia fue inferida por el mtodo de Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987) utilizando el software Mega 5 (Tamura et al., 2011). Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el parmetro de Kimura 2-mtodo (Kimura, 1980). Los nmeros en los nodos representan el porcentaje de bootstraping con 10000 repeticiones. La barra de escala =

0,02 sustituciones por sitio.............................................................................................................. 45 Figura 3 Efecto de diferentes variables (A. pH; B. Temperatura; C. Consumo de glucosa y produccin de protena; crecimiento en diferentes carbohidratos D. Manitol E. Glucosa F. Sacarosa ......................................................................................................................................... 47 Figura 4 Efecto de ocho polmeros sobre la viabilidad de la cepa G58 durante dos meses de evaluacin .................................................................................................................................. 52 Figura 5 De izquierda a derecha. A. Formacin de pelculas polimricas, B. Permeabilidad de los polmeros e C. Hinchamiento de los polmeros.............................................................. 54 Figura 6 Respuesta biolgica del frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp], mediante la implementacin de polmeros con la cepa de Rhizobium sp., G58. ............................................ 56 Figura 7 Anlisis de componentes principales de los tratamientos con polmeros. (A) Diagrama de dispersin del anlisis del experimento en invernadero con las componentes PC1 y PC2; (B) Diagrama de dispersin del anlisis del experimento en invernadero con las componentes PC1 y PC3; y (C) Diagrama de dispersin del anlisis del experimento en invernadero con las componentes PC2 y PC3. Tratamientos y relacin de smbolos: testigo absoluto (), medio YM (), YM + alginato 1 (), YM + alginato 2 (), HPMC (). Cada smbolo es el promedio de tres mediciones. ................................................................................. 60 Figura 8 Formulacin de prototipos slidos de biofertilizantes mediante lecho fluido y su respuesta biolgica en frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp]. ............................................ 61 Figura 9 Anlisis de componentes principales de los tratamientos con prototipos. (A) Diagrama de dispersin del anlisis del experimento en invernadero con las componentes PC1 y PC2; (B) Diagrama de dispersin del anlisis del experimento en invernadero con las componentes PC1 y PC3. (C) Diagrama de dispersin del anlisis del experimento en invernaderos con las componentes PC2 y PC3. Tratamientos y relacin de smbolos:

testigo absoluto (), medio YM lquido (), medio YM slido (), YM + HPMC (), YM + alginato 1 (), YM + alginato 2 (). Cada smbolo es el promedio de tres mediciones. ............ 64 Figura 10 A. Liberacin del principio activo (cepa Rhizobium sp., G58) y B. Porcentaje de degradacin de los prototipos de formulacin, durante 5 das de evaluacin............................. 67 Figura 11 A y B Microfotografa electrnica de barrido (R) Rhizobium sp. G58 superficie del pellets; C y D Microfotografa electrnica de transmisin de la cepa de Rhizobium sp.G58. Abreviaciones: Cuerpo de inclusin de PHB: Poli- - hidroxibutirato, PC: Pared celular, MC: Membrana celular, AC: cidocalcisomas, PF: Grnulos de polifosfato. C magnificacin 20000 x, escala de barras representa 0,5 m. D magdnificacin 10000 x, escala de barras representa 1,2 m.. ......................................................................................................................... 69

Lista de tablas
Tabla 1 Iniciadores utilizados para la secuenciacin del gen 16S rDNA de la cepa G58 .......... 35 Tabla 2 Tratamientos establecidos para determinar el efecto de los polmeros sobre la actividad biolgica en frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] .............................................. 39 Tabla 3 Tratamientos establecidos para determinar el efecto de los prototipos slidos sobre la actividad biolgica en frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] .......................................... 42 Tabla 4 Caracterizacin de los polmeros utilizados para la inmovilizacin de la cepa G58 .... 49 Tabla 5 Caracterizacin de propiedades adicionales de los mejores polmeros seleccionados .................................................................................................................................. 53 Tabla 6 Anlisis de componentes principales-ACP del efecto de los polmeros sobre la actividad simbitica del Rhizobium sp. y la planta de frjol cowpea. ............................................ 57 Tabla 7 Anlisis de correlacin entre las variables mediante componentes principales-ACP con los polemros ............................................................................................................................ 58 Tabla 8 Anlisis de componentes principales-ACP del efecto de los prototipos sobre la actividad simbitica del Rhizobium sp. y la planta de frjol cowpea. ............................................ 62 Tabla 9 Evaluacin de las capacidades de promocin de crecimiento en los prototipos de formulacin slidos.......................................................................................................................... 66

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Lista de anexos

Anexo 1 Medio de cultivo YMA (Vincent, 1970) ........................................................................... 93 Anexo 2 Solucin de Hoagland (Hoagland y Arnon, 1950) ......................................................... 93 Anexo 3 Curva patrn biomasa seca de la cepa G58 ................................................................. 94 Anexo 4 Curva patrn protena (Mtodo de Bradford)................................................................. 94 Anexo 5 Curva patrn azcares totales (Mtodo de Dubois) ...................................................... 94 Anexo 6 Curva patrn de fsforo (Mtodo fosfomolibdeno) ........................................................ 95 Anexo 7 Curva patrn compuestos indlicos (AIA)...................................................................... 95 Anexo 8 . Curva patrn de la actividad de reduccin de acetileno (ARA) para bacterias simbiticas ....................................................................................................................................... 96 Anexo 9 Anlisis multivariado de los polmeros sobre la actividad simbitica entre Rhizobium sp., G58 y el frjol cowpea ............................................................................................ 96 Anexo 10 Anlisis multivariado de los prototipos sobre la actividad simbitica entre Rhizobium sp., G58 y el frjol cowpea ........................................................................................... 98

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Lista de smbolos y abreviaturas

DNA RNA PCR NCBI FBN UFC AIA ARA DO USP PEG PVA PVP HPMC g ml min ng nm rpm mm

cido desoxiribonucleico cido ribonucleico Reaccin en cadena de la polimerasa Centro nacional de informacin biotecnolgica Fijacin biolgica de nitrgeno Unidades formadoras de colonia cido indol actico Actividad de reduccin de acetileno Densidad ptica Farmacopea de los estados unidos Polietilenglicol Alcohol polivinlico Polivinilpirrolidona Hidroxipropilmetilcelulosa Microgramo Mililitro Minuto Nanogramo Nanomol Revoluciones por minuto Milimetro

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Resumen
El desarrollo de nuevas formulaciones de rizobios con materiales polimricos mediante la aplicacin de tcnicas de recubrimiento, brinda grandes ventajas como la de controlar la liberacin del ingrediente activo, ofrecer proteccin frente a las condiciones ambientales; adems de permitir mantener viables las clulas microbianas sin la prdida de las capacidades metablicas y fisiolgicas. Por tal razn, se propuso desarrollar un prototipo de formulacin slido, utilizando polmeros como vehculo para evaluar su efecto sobre la actividad biolgica entre la simbiosis de Rhizobium sp. y frjol cowpea en invernadero. Se realizaron inicialmente diversos estudios para la caracterizacin molecular de la bacteria, as como los estudios de preformulacin para analizar la influencia de factores fisicoqumicos y el comportamiento de los polmeros sobre la bacteria. Se evidenci que la cepa G58, pertenece al gnero Rhizobium, lo anterior se realiz mediante la identificacin molecular a travs de la amplificacin del fragmento 16S rDNA presentando un 99% de similitud. A su vez, se demostr un amplio rango de tolerancia de la bacteria a diferentes pHs, temperatura y fuentes de carbono. De igual forma, se estableci mediante el test de Tukey (P<0,05) la influencia negativa del polietilenglicol, carbmero y alcohol polivinlico sobre la viabilidad celular del microorganismo; obteniendo mejores resultados cuando fueron empleados dos polmeros de alginato de sodio y la hidroxipropilmetilcelulosa. De un total de ocho polmeros estudiados slo los tres anteriormente citados fueron seleccionados y a los cuales se les determin la capacidad de formacin de pelcula, la permeabilidad y la capacidad de hinchamiento como aspectos adicionales en la caracterizacin de los materiales polimricos. Mediante la utilizacin de la tcnica de lecho fluidizado, se obtuvo los prototipos de formulaciones slidas y se cuantific las actividades de promocin de crecimiento sin presentar efectos negativos sobre sus capacidades biolgicas. Una vez realizados estos estudios, se procedi a evaluar mediante dos experimentos bajo invernadero el efecto de las preparaciones polimricas y los prototipos de formulacin slidos, sobre la actividad simbitica entre la cepa G58 y la planta de frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp]. Finalmente, los resultados obtenidos mediante un anlisis multivariado de componentes principales mostraron que la aplicacin de los polmeros bajo las dos presentaciones no presentaron efectos negativos sobre la actividad de fijacin biolgica de nitrgeno, mostrando mejores respuestas en los prototipos de formulaciones slidas, debido al proceso de recubrimiento, el cual permiti controlar la liberacin de la bacteria y cederla adecuadamente.

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Palabras clave: Rhizobium sp., Polmeros, Frjol Cowpea, Fijacin biolgica de nitrgeno, prototipos, recubrimiento

Abstract
Development of new formulations of rhizobia with polymeric materials by implementing coating techniques, provides great advantages because firstly controls the release of the active ingredient, offering protection against environmental conditions and likewise, allow to maintain viable microbial cells without loss of metabolic and physiological capabilities. For this reason, was proposed to develop a solid formulation prototype using polymers as vehicles to evaluate their effect on biological activity between the symbiosis Rhizobium sp.cowpea in the greenhouse. Was initially established several studies on molecular characterization of the bacteria and preformulation of studies to analyze the influence physicochemical factors and the behavior of polymers on the bacteria. It showed that strain G58, belongs to the genus Rhizobium sp., the above was performed by amplification of 16S rDNA fragment showing a 99% similarity. In turn, was demonstrated a wide range of tolerance of the bacterium at different pHs, temperature and carbon sources. Similarly, was established through the Tukey test (P <0.05) the negative influence of polyethylenglycol, carbomer and polyvinyl alcohol on cellular viability of the microorganism; showing better results when the two polymers used sodium alginate and hydroxypropylmethylcellulose. Therefore, from a total of eight polymers were selected these last three, to which they studied the ability of film formation, permeability and swelling as additional aspects in the characterization of polymeric materials. In addition to this, was obtained through the fluidized bed, the solid formulation prototypes, at them was quantified the growth promotion activities without submitting negative effects on their biological capabilities. Once these studies were conducted, proceeded to assess by greenhouse experiments two the effect of polymer preparations and solid formulation prototypes on the symbiotic activity between the G58 strain and the cowpea plant [Vigna unguiculata (L.) Walp]. Finally, the results obtained by multivariate analysis of principal components showed that the application of polymers in the two presentations had no negative effects on the activity of biological nitrogen fixation, showing responses better in the prototypes of solid formulations, due to the coating process, which allowed control the release of the bacteria and transfer it appropriately. Keywords: Rhizobium sp., Polymers, Cowpea bean, Biological nitrogen fixation, prototypes, coating.

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Introduccin
En los ltimos aos, a medida que la agricultura avanza hacia el sostenimiento de la alimentacin mundial mediante la implementacin de estrategias biotecnolgicas sostenibles, en Colombia se sigue empleando fertilizantes de sntesis qumica y agroqumicos para mantener una alta produccin agrcola, sin importar el gran deterioro ocasionado a los agroecosistemas, evidencindose esta problemtica principalmente en la capacidad productiva del suelo, productos agrcolas alterados, contaminacin de fuentes hdricas y problemas de salud presentados en la comunidad (Higa y Parr, 1994; Rojas y Moreno, 2008). Esta situacin ha generado la tendencia hacia el desarrollo de tecnologas que involucran el uso de diferentes microorganismos con potencial biofertilizante, enfocndose principalmente hacia los rizobios que tienen la habilidad de establecer simbiosis con plantas leguminosas contribuyendo en un alto porcentaje en la sustitucin de fertilizantes mediante un proceso de fijacin biolgica de nitrgeno (FBN). La aplicacin de stas tecnologas tendr un gran impacto medioambiental y social, gracias a la reduccin de costos de los fertilizantes nitrogenados de sntesis, equilibrio en el ecosistema y contribucin a mejores rendimientos en planta sin provocar deterioro de las capacidades productivas del suelo, lixiviacin y eutrofizacin de fuentes hdricas (Ben Rebah et al., 2007). El empleo de fertilizantes biolgicos ha crecido ostensiblemente en las dos ltimas dcadas segn lo reportado por Carvajal y Mera (2010). Por estas razones, la bsqueda de vehculos alternativos para la inmovilizacin de microorganismos ha sido objeto de intensa investigacin cientfica. Con el fin de aumentar la efectividad de los inoculantes, su eficiencia, reducir los costos de produccin y los impactos ambientales, los materiales polimricos han sido una alternativa para ser incluidos en las formulaciones, (Ben Rebah et al., 2007; Albareda et al., 2008; Dommergues et al., 1979; Jawson et al., 1989; Denardin y Freire, 2000; Schuh, 2005; Deaker et al., 2007), ya sea para transportar el ingrediente activo para protegerlo, en este caso particular el de formar parte de formulaciones de tipo rizobios (Dommergues et al., 1979; Denardin y Freire, 2000; Sarr et al., 2005; Bashan y Gonzales, 1999). Por lo tanto, los polmeros juegan un papel importante como vehculos en formulaciones basadas en microorganismos con potencial biofertilizante gracias a las propiedades que los rigen, aportando soluciones innovadoras y de avance tecnolgico que promuevan beneficios sostenibles a nuevas posibilidades de integracin de stas sustancias con sistemas biolgicos. Por tal razn, el objetivo de esta investigacin fue desarrollar un

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prototipo de formulacin, utilizando polmeros con la finalidad de estudiar nuevos soportes para inoculantes basados en rizobios y que permitan mejorar su utilizacin con el propsito de contribuir a la seguridad alimentaria.

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Justificacin
Son varias las especies de leguminosas comestibles que se siembran en Colombia, concentrndose principalmente en la Regin Andina y valles interandinos. Colombia es el primer pas productor de frjol en la Zona Andina, con cerca de 130.000 hectreas sembradas en el ao 2007. El aumento de la siembra de leguminosas ha incrementado en los ltimos tres aos, ocupando el primer lugar el frjol comn (Phaseolus vulgaris L), con 133.720 hectreas, mientras que en la Regin Caribe, la importancia se enfoca especialmente hacia el frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp], con 4.600 de hectreas sembradas (DNP 2010). Debido a la alta importacin del frjol, la demanda es ms alta que la oferta, por lo que se est incentivando la siembra de esa leguminosa en regiones tropicales (MADR, 2010). Se considera que los bajos contenidos de nitrgeno en los suelos de regiones tropicales es uno de los factores que influyen negativamente sobre la produccin forrajera. Adems de los elevados costos de los agroqumicos como fuente de nitrgeno, para lograr el mximo rendimiento de los cultivos, los cuales los hace menos viables en su uso (Cuesta-Muoz, 2005; Franco y Dbereiner, 1994). Cabe resaltar que de los nutrientes minerales, el nitrgeno es el de mayor costo, el que consume mayor energa en su produccin y distribucin; y potencialmente el ms contaminante, siendo el factor ms limitante en la ptima produccin de forraje. De igual manera, se ha evidenciado la baja eficiencia de utilizacin de las fuentes nitrogenadas de sntesis (12-74%) en cultivos tropicales, lo cual est asociado a elevada lixiviacin y desnitrificacin. Ante esta situacin se busca brindar soluciones aplicables a los problemas crticos que afectan la productividad del forraje mediante la utilizacin de microorganismos diazotrficos que contribuyan a la deficiencia de nitrgeno en el suelo. Basando las soluciones principalmente en una problemtica en la cual la fertilidad del suelo se ve afectada en relacin con la disponibilidad de nutrientes, donde la incorporacin de microorganismos simbiticos fijadores de nitrgeno con una aplicabilidad futura dentro de inoculantes biolgicos, se presenta como la solucin ms adecuada. El uso de fertilizantes biolgicos permitir la sostenibilidad de los sistemas agropecuarios, mitigando el efecto de la marcada estacionalidad en las precipitaciones de la zona, aumentando la captura de carbono, reduciendo la emisin de gases que generan el efecto invernadero, permitiendo la utilizacin de nuestra biodiversidad an inexplorada, disminuyendo los costos de produccin, evitando la fuga de divisas en la compra de agroqumicos y permitiendo que el sistema agropecuario de la regin Caribe sea ms

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competitivo, sostenible y que contribuyan a mitigar el cambio climtico del planeta (Acua et al., 2006). La tendencia mundial en la utilizacin de materiales biodegradables como los polmeros, constituye una alternativa prometedora, fundamentada en sus propiedades y

caractersticas que les permiten ser utilizados en el diseo de formulaciones de bioproductos con fines sostenibles. Por esta razn, el empleo de polmeros como estrategia de innovacin tecnolgica, encaminada al estudio del comportamiento de stos materiales con bacterias fijadoras de nitrgeno es de gran importancia para el pas.

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Captulo I. Objetivos

Objetivo General Formular un prototipo de biofertilizante con base en Rhizobium sp.

Objetivos especficos 1. Desarrollar estudios de preformulacin con el fin de seleccionar polmeros compatibles con Rhizobium sp. 2. Evaluar un prototipo de formulacin utilizando como vehculo los polmeros seleccionados con la bacteria Rhizobium sp. 3. Evaluar la eficacia del prototipo de formulacin sobre el frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] a nivel de invernadero.

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Captulo II. Marco terico

2.1 Importancia de la fijacin biolgica de nitrgeno (FBN) en leguminosas La FBN es el proceso que transforma el nitrgeno atmosfrico, que es inerte, en una forma biolgicamente til siendo la principal forma de entrada en ecosistemas desrticos (Zahran, 2001). Qumicamente, este es similar al proceso Haber-Bosch (N2 + 2H2 2NH3, 500C y 350 atm), que es el mtodo comercial de la produccin de amoniaco para fertilizantes nitrogenados, consumiendo una gran cantidad de energa, estimndose que se necesitan 1,5 Kg. de combustible por cada Kg. de nitrgeno fijado. Lo anterior implica un alto costo econmico (Ndakidemi et al., 2006) y as mismo, el suministro de forma sintetiza en la agricultura afecta considerablemente el suelo hacindose insostenible por su continuo uso reflejndose en bajos rendimientos en los cultivos (Mahecha, 2002; Angelini et al., 2011). El proceso de FBN es utilizado en la naturaleza por diferentes gneros bacterianos. Las plantas se benefician de este proceso cuando las bacterias mueren y liberan el nitrgeno al suelo cuando las bacterias viven en estrecha asociacin con las plantas (Willems, 2006). Resaltando principalmente esta asociacin simbitica, la cual se presenta en los cultivos de leguminosas. Estos microorganismos, denominados rizobios, viven en los ndulos de las plantas fijando el nitrgeno en forma de amonio, que es absorbido por las plantas (Herridge et al., 2008; Angelini et al., 2011). Si bien existe una amplia gama de organismos y asociaciones vegetales que son capaces de fijar N2 de la atmsfera, la relacin simbitica entre rizobios y leguminosas es responsable de contribuir con la mayor cantidad de nitrgeno fijado en especies agrcolas (Peoples et al., 1995; Chianu et al., 2010). Las leguminosas de grano contribuyen con ms de 20 millones de toneladas de N2 fijado a la agricultura de cada ao (Herridge et al., 2008). Por lo tanto, la importancia de la FBN como el principal mecanismo para el reciclaje de nitrgeno de la atmsfera a formas disponibles en la biosfera no puede ser exagerada. La fijacin de nitrgeno en la biosfera se estima en unos 275 millones de Tm. anuales, de los cuales 30 corresponden a causas naturales, 70 a fijacin industrial y 175 al proceso de fijacin biolgica (Burns y Hardy, 1975), haciendo parte microorganismos diazotrficos de vida libre, asimbiticos y simbiticos (Marn et al., 1999). Las entradas en los ecosistemas terrestres de FBN a partir de la relacin simbitica entre leguminosas y sus rizobios es de 70.000.000 toneladas de N2/ha/ao (Brockwell et al., 1995). Esta cantidad puede aumentarse en la medida que la poblacin mundial se incremente y las fuentes naturales que suplen los fertilizantes nitrogenados disminuyan.

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El empleo elevado de fertilizantes nitrogenados representa una carga medioambiental, que incluye la contaminacin del aire, la lluvia cida, contaminacin del agua por nitrato, as como eutrofizacin y reduccin de la biodiversidad (Socolow, 1999). Las grandes aplicaciones de fertilizantes nitrogenados para maximizar la produccin en los pases desarrollados slo exacerbarn estos problemas, mientras que en los pases subdesarrollados el alto costo y los problemas de distribucin continuarn siendo las limitantes. Esto indica que la fijacin biolgica del nitrgeno por microorganismos, especialmente los de tipo simbiticos, proporcionan una alternativa econmica, viable y ecolgicamente sana que pudiera contribuir a mitigar esta problemtica de forma sustentable (Sylvia et al., 2005). Aproximadamente el 80% del nitrgeno fijado biolgicamente en la agricultura, proviene de la simbiosis entre las leguminosas y las especies de Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Azorhizobium, Mesorhizobium y Allorhizobium (Vance, 1998). De esta unin se forma, a nivel radicular, un rgano llamado ndulo dentro del cual se transforma el nitrgeno (N2) del aire en amonio (NH4+), gracias a la accin de la enzima nitrogenasa (Baca et al., 2000), que es una forma asimilable por las plantas. Para el ao 2025 se espera que la poblacin mundial haya crecido hasta un 40% (Mannion, 1998). Teniendo en cuenta que aproximadamente 11g de nitrgeno se consumen por persona cada da (Frink et al., 1999) y que las leguminosas aportan hasta el 80% de las necesidades dietticas (Singh et al., 2003) en la mayor parte de los trpicos y subtrpicos, se necesitara para entonces un incremento desmesurado en la produccin agrcola mundial con el fin de disminuir la brecha entre poblacin humana y abastecimiento de protena (Rangel et al., 2004; Siddhuraju et al., 1996).

2.1.1 Frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] La familia leguminosae son una de las plantas ms cosmopolitas, debido a que alimenta la mayora de la poblacin mundial (Lewis et al., 2005; Singh et al., 2003). El frjol cowpea es una leguminosa originaria de frica, es un importante cultivo anual en las regiones tropicales y subtropicales (Duke, 1981; Singh et al., 2003; Steele et al., 1985), que contiene un abastecimiento significativo de protenas importante en la dieta alimenticia para la poblacin de pases en va de desarrollo (Ramakrishnan et al., 2005). Es uno de los cultivos ms extensamente adaptados, verstiles y nutritivos. Y se cultiva en cerca de 7 millones de hectreas en regiones clidas del mundo (Rachie, 1985).

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Es ampliamente cultivada en diferentes climas y regiones geogrficas de frica, Asia y Amrica (Ehlers y Hall, 1997) y juega un papel importante en la economa local y la agricultura sostenible. Presenta un amplio rango de hospederos de especies de rizobios comparada con otras especies vegetales. El cultivo es tolerante a la baja fertilidad, presentando altas tasas de fijacin de nitrgeno (Elowad y Hall, 1987). Segn la FAO (2001), el 64% de la produccin mundial de frijol en frica occidental se produce en aproximadamente 10 millones de hectreas, donde es esencial para restaurar la fertilidad del suelo en los sistemas de cultivo tradicionales. Sin embargo, la produccin de frijol en las zonas de sabana, y el Sahel de frica Occidental, en particular, es insuficiente para la seguridad alimentaria (Ehlers y Hall, 1997). Estos bajos rendimientos se comparan con los registrados en Amrica del Norte, en gran parte debido al dficit hdrico (Sarr et al., 2001) y baja disponibilidad de fsforo (Summerfield et al., 1974). Hoy en da, se hace ms sostenible y abarca mayor preferencia, realizar combinaciones entre leguminosas y gramneas, debido a que la base constitutiva se enfoca en mantener la fertilidad del suelo y la produccin de carne de rumiantes (Walzl et al., 2011). Para mejorar la calidad y el rendimiento del frjol cowpea, la inoculacin de rizobios seleccionados de la comunidad nativa con una alta capacidad de nodulacin y fijacin de nitrgeno, se convierte en una importante herramienta biotecnolgica (Kremer y Peterson, 1983; Zilli et al., 2004). La especie de leguminosa tiene un alto potencial como abono verde. Puede ser incorporado en el suelo de 8-10 semanas despus de la siembra, y puede proporcionar el equivalente de 80 kg/ha de N2 para un cultivo posterior. Las estimaciones de nitrgeno fijado de frjol a menudo van de 50 a ms de 100 kg/ha. As mismo, se puede obtener excelente heno y ensilado en particular, para la utilizacin en cultivos mixtos de sorgo, frijol y forraje mijo (Carvalho et al., 1998; Davis et al., 1991; Ehlers y Hall, 1997). Se adapta a una amplia gama de suelos de arenas a suelos arcillosos pesados, bien drenados, con una preferencia por suelos ms ligeros que permiten un buen enraizamiento. Crece as tambin en suelos de textura pesada fuertemente alcalinos. No tolera las inundaciones extendidas o la salinidad. Crece desde el nivel del mar hasta los 1500 msnm, dependiendo de la latitud (Carvalho et al., 1998; Davis et al., 1991; Ehlers y Hall, 1997).

2.2 Simbiosis Rhizobium-leguminosas La mayor parte del amonio del proceso de fijacin de nitrgeno es aportado por la simbiosis Rhizobium-leguminosa (Newton, 2000; Zahran, 1999; Long, 1989; Pawlowski et al., 1996;

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Fauvart y Michiels, 2008, Chang et al., 2009; Catherine et al., 2009, Herder y Parniske, 2009), que se inicia por la infeccin en leguminosas por bacterias (Rhizobium), lo que resulta en la formacin de ndulos de las races. Dentro de los ndulos, los rizobios se encuentran como bacteroides, que realizan la fijacin de nitrgeno: para hacer esto, obtienen fuentes de carbono y la energa de la planta, en forma de cidos dicarboxlicos (Vance, 2000; Poole y Allaway, 2000). Se ha pensado que los bacteroides simplemente proporcionan amonio a la planta. Sin embargo, se muestra que un proceso ms complejo ciclo de los aminocidos, es esencial para la fijacin simbitica de nitrgeno por Rhizobium sp., en los ndulos de guisantes. La planta proporciona los aminocidos para los bacteroides, que les permita cerrar su asimilacin de amonio. A cambio, los bacteroides actan como orgnulos de plantas para el ciclo de los aminocidos para la sntesis de asparagina. La dependencia mutua de este cambio evita la simbiosis de ser dominado por la planta, y proporciona una presin selectiva para la evolucin de la simbiosis (Lodwig et al., 2003). Las etapas iniciales en la formacin de ndulos requiere la expresin de genes de la nodulacin especfica (nod) de rizobios que conduce a la sntesis de un grupo de molculas de sealizacin que inducen la morfognesis de los ndulos. Dentro de los ndulos, la forma de fijacin de nitrgeno de rizobios, conocido como bacteroides, estn rodeadas por una membrana derivada del husped llamado membrana peribacteroidal (MPB), que controla el intercambio molecular entre el bacteroide y las leguminosas (Panter et al., 2000). A estos grupos de bacteroides rodeados por la MPB se les llama simbiosomas (Brewin, 2003). El factor nod (genes) de Rhizobium es el responsable de la iniciacin del ndulo que es un lipoquitooligosacrido (LCO) y juega un papel fundamental en la induccin de respuestas simbitica del desarrollo en las legumbres, que conduce a la formacin de ndulos en las races de las leguminosas (Spaink, 1996; Rolfe et al., 2003). En la simbiosis, la planta husped tiene la informacin gentica para la infeccin simbitica y para la nodulacin. El papel de la bacteria es slo el de disparar el proceso. Este proceso de asociacin simbitica centra su importancia en dos aspectos fundamentales de la relacin rizobio-planta: la preinfeccin o atraccin quimiotctica de la bacteria por la planta seguida de la induccin de cambios estructurales en los pelos radicales y la infeccin donde la bacteria entra en el pelo y forma canales, recubiertos por nuevo material de pared celular, que van ramificndose (Olivares y Barea, 1995). La simbiosis Rhizobiumleguminosa tiene una enorme importancia ecolgica y agronmica, y constituye una fuente importante de nitrgeno, y por lo tanto desempean un papel esencial en la estructura de los ecosistemas y la agricultura sostenible (Lindstrm et al., 2010).

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La relacin entre el nitrgeno absorbido desde el suelo y el proveniente de la simbiosis vara con la especie de leguminosa, las condiciones ambientales y las caractersticas genticas del microsimbionte (Shabaev et al., 1996). En primera instancia, mientras se genera el sistema nodular, la planta utiliza nitrgeno del suelo. Si hay mucho nitrgeno en el ambiente de la raz, el nmero de ndulos formados ser menor (Gonzlez, 2002). Las plantas absorben el nitrgeno del suelo en forma de nitrato o amonio, donde el exceso de nitrgeno en el suelo en forma de nitratos, tiene un efecto inhibitorio sobre la simbiosis en todos los pasos, desde la infeccin, formacin del ndulo y la fijacin de N2 (Fernndez, 2003). As, el aporte global por FBN para las leguminosas es menor en suelos bien provistos de nitrgeno que en aqullos en que el nutriente es deficitario (Gonzlez, 2002; Pietrarelli et al., 2008).

2.2.1 Generalidades de Rhizobium sp. La taxonoma de los rizobios, ha cambiado considerablemente en los ltimos 20 aos, con el gnero Rhizobium, un miembro de -Proteobacteria, ahora se divide en varios gneros. El estudio de plantas promiscuas hospederas, dispersas geogrficamente, ha sido fuente de muchas especies nuevas y se espera que se produzca muchos ms. Recientemente, una serie de aislamientos se han registrado en los ndulos de las leguminosas, con capacidad de fijacin de nitrgeno, pero filogenticamente se ubican fuera de los grupos tradicionales de rizobios en -proteobacterias. Nuevas lneas de simbiontes que presentan la fijacin de nitrgeno de leguminosas incluyen Blastobacter, Methylobacterium, Devosia, Ochrobactrum y Phyllobacterium en -proteobacterias y Burkholderia, Herbaspirrillum, Ralstonia y Cupriavidus en --proteobacteria (Willems, 2006; Lindstrm y MartnezRomero, 2007). De la filogenia del 16S rDNA, est claro que Rhizobium y Agrobacterium estn fuertemente relacionadas y sus especies estn entrelazadas (Young et al., 2003). Young et al. (2001) propusieron la transferencia de todos estos taxones de Rhizobium. Se plante unir a A. radiobacter y A. tumefaciens en R. radiobacter; mientras que A. rhizogenes en R.

rhizogenes. Por otra parte, A. rubi y A. vitis se transfieren a Rhizobium, como especies distintas y A. larrymoorei como R. larrymoorei (Young, 2004; Young et al., 2006). Desde la dcada de los 80, con la introduccin de caractersticas genticas (ADN-ADN y las hibridaciones ADN-rARN, catlogos rARN, secuenciacin del rADN) una mayor diversidad fue descubierta entre los rizobios y sus relaciones con otros grupos de bacterias se hizo evidente. Esto condujo a un aumento gradual en el nmero de gneros. En

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paralelo, tambin ha habido un aumento significativo en el nmero de especies validamente publicadas con 48 especies de rizobios reconocidas (Willems, 2006).

Descripcin microscpica y macroscpica: Bacilos de 0.5-1.0 X 1.2-3.0 m. Gram negativos. Mvil por flagelos pertricos. Las colonias son usualmente blancas o beige, circulares convexas, semitraslcidas u opacas, a veces mucoides, usualmente de 2-4 mm de dimetro dentro de 3-5 das de incubacin en medio YMA (Levadura-Manitol-SalesAgar). El crecimiento en un medio de carbohidratos es usualmente acompaado por abundante cantidad de exopolisacridos extracelulares. Desarrollan una pronunciada turbidez de 2 a 3 das en caldo aireado agitado (Kuykendall et al., 2005).

Metabolismo: Aerobios, su temperatura ptima de crecimiento se encuentra entre 25 y 30 C; algunas especies pueden crecer a temperaturas de 40 C. El pH ptimo de crecimiento est entre 6.0 y 7.0. Sin embargo, pueden predominar entre valores de 4.0 a 10.0. El tiempo de generacin de las cepas de Rhizobium sp. est entre 1.5-5.0 horas (Kuykendall et al., 2005). Es quimiorganohetertrofo, utiliza un amplio rango de carbohidratos y sales de cidos orgnicos como nica fuente de carbono, sin formacin de gas. No son capaces de metabolizar la celulosa y el almidn. Producen una reaccin cida en medio mineral que contenga sales y manitol u otros carbohidratos. Las sales de amonio, de nitrato y la mayora de los aminocidos pueden servir como fuente de nitrgeno. Algunas cepas requieren factores de crecimiento como biotina, pantotenato cido nicotnico. La peptona es pobremente utilizada mientras que la casena, el almidn y la quitina y el agar no son hidrolizados (Kuykendall et al., 2005).

2.3. Proceso de nodulacin Este proceso se caracteriza por la atraccin y reconocimiento entre la leguminosa y la bacteria. El Rhizobium entra a la planta a travs de los pelos radiculares, formando una estructura llamada hilo de infeccin (Masson-Boivin et al., 2009), e infecta intracelularmente a las clulas corticales de la raz. Una vez dentro de la clula, las bacterias se diferencian en bacteroides y comienza el proceso de la fijacin de nitrgeno (Giles et al., 2008). Durante los eventos iniciales de la interaccin, se expresan los genes de las nodulinas tempranas de la planta, que participan principalmente en el desarrollo o formacin del ndulo (Oldroyd et al., 2005). Cuando se da la unin de los rizobios a los pelos radicales, se

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induce un cambio en la direccin de crecimiento apical, generndose una deformacin y curvatura de los pelos radicales o curling donde quedan atrapadas las bacterias. Se forma un canal de infeccin por donde entran los rizobios al citoplasma de las clulas vegetales por un mecanismo similar a la endocitosis (Carlson et al., 1994). La simbiosis Rhizobium-leguminosa se inicia por los exudados de las races de plantas que soportan el crecimiento de rizobios y expresin de los genes de nodulacin. Entre estos elementos los flavonoides (por ejemplo: luteolina, narigenina y genistena) que especficamente interactan con protenas bacteriana NodD activando la expresin de los genes (nod), dando lugar a la formacin y secrecin de los factores de nodulacin (D'Haeze y Holsters, 2002). Los factores Nod estn constituidos por una estructura bsica que consiste en oligmeros de N-acetilglucosamida, unidos por un enlace 1-4, con diversas sustituciones; al interactuar con la planta, los factores Nod estimulan la divisin de las clulas vegetales induciendo el enroscamiento de los pelos radiculares, dando lugar a las estructuras conocidas como ndulos (Bordeleau y Prevost, 1994). Casi todos los rizobios tienen los genes nodABC en comn. NodC sintetiza los quitooligosacridos; NodB y NodA, la estructura base de deacetilato y N-acilato, respectivamente. Las modificaciones de la estructura de los factores nod depender de los genes de nodulacin de la cepa especfica que codifican las enzimas que sintetizan los precursores utilizados por transferasas (por ejemplo: nodH, nodPQ y nodL). Los genes nodIJ son los responsables de la secrecin de los factores nod. Las diferencias en la estructura de los factores nod juegan un papel importante en la especificidad del hospedador de cepas de rizobios (D'Haeze y Holsters, 2002)

2.4. Vehculos utilizados para la inmovilizacin de microorganismos El portador ms comn de inoculantes para leguminosas rizobios utilizados en todo el mundo es la turba (Denardin y Freire, 2000; Deaker et al., 2004). Este soporte presenta cualidades apropiadas, tales como una buena proteccin para las clulas bacterianas contra la desecacin y la toxicidad de la semilla y en el suelo. Sin embargo, presenta algunas desventajas como son: la composicin, variables fsicas y qumicas, que pueden influir en la uniformidad y la calidad de los productos (Halliday y Graham, 1978; Paczkowsky y Berryhill, 1979), gastos de preparacin, que consiste en la excavacin, el secado, la molienda, la neutralizacin, empaque y esterilizacin. Siendo, el proceso de esterilizacin por rayos gama () muy perjudicial, debido a que estos rayos chocan con los tomos de los materiales biolgicos, tales como protenas, lpidos, carbohidratos y cidos

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nucleicos, provocando que estos tomos se ionicen y reciban daos directos. Entre estos materiales biolgicos, el cido nucleico es el material ms sensible a la radiacin ionizante a pesar de presentar el 1% en los componentes celulares (1%). Y la ltima desventaja, es el rechazo por parte del agricultor a gran escala, debido principalmente a una mayor complejidad en la inoculacin y la abrasividad de la maquinaria de siembra. En algunos pases debido a polticas para la preservacin de las zonas de humedales, la explotacin de la turba es controlada prohibida (Temprano et al., 2002). El pH de la turba es otro factor importante en el crecimiento y mantenimiento celular. Las fuentes de turba utilizada para la produccin de inoculantes rizobianos son muy cidas, lo que hace que sea necesario para corregir el pH, emplear el carbonato de calcio o de magnesio (Deak et al., 2004; Daza et al., 2000). Garantizar el mantenimiento de la humedad entre 40 y 50% es esencial para la viabilidad celular y la proliferacin rizobianas y cuando la turba es previamente desecada a 100 C, la supervivencia de los rizobios se ve comprometida debido al secado del material. El autoclave la esterilizacin con radiacin gamma puede causar la produccin de sustancias txicas para las clulas rizobianas, la reduccin de la supervivencia celular, por lo tanto, la ineficacia de los inoculantes (Daza et al., 2000). Para evitar estos problemas se requiere medidas adicionales en la produccin de inoculantes, lo que eleva el costo del producto final. Varios materiales alternativos han sido objeto de evaluacin para este fin como son: los minerales (Daza et al., 2000), residuos industriales (Ben Rebah et al., 2002; Ben Rebah et al., 2007), sustratos orgnicos (Raja Sekar y Karmegam, 2010; Hashemimajd et al., 2004; Bachman y Metzger, 2008) polmeros naturales y sintticos (Denardin y Freire, 2000; Fernandes Jnior et al., 2009) e inoculantes lquidos (Tittabutr et al., 2007; Albareda et al., 2008). Para la cosecha de leguminosas los inoculantes lquidos se convierten en una de las opciones ms favorables para su aplicacin en grandes plantaciones con el fin de facilitar la siembra mecanizada (Lupway et al., 2005). Varios polmeros naturales (agar, agarosa, alginato y quitosan) y polmeros sintticos (poliacrilamida, poliuretano y polietilenglicol) han utilizado con xito para la inmovilizacin de clulas (Chen y Lin, 1994; Song et al., 2005). Sin embargo, cada polmero tiene sus inconvenientes, tales como la escasa resistencia mecnica y durabilidad, toxicidad para los microorganismos, de alto costo (Wu y Wisecarver, 1992). El polmero sinttico alcohol polivinlico-PVA, no presenta toxicidad en microorganismos y es un material econmico. Adems, tiene alta durabilidad en agua, lo que indica que el polmero es prometedor como un material de inmovilizacin de clulas, en este caso para el tratamiento biolgico de aguas residuales (Takei et al., 2011).

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La demanda de una alternativa a la turba resulta en un considerable trabajo experimental y hasta la produccin comercial de otros tipos de vehculos, tales como lquidos, liofilizado, granulados y varios tipos de gomas. Sin embargo, los resultados en campo han sido pobres en muchos casos, debido a la baja supervivencia durante el almacenamiento en la semilla cuando se siembra en condiciones de estrs en el suelo (Denardin y Freire, 2000). En pases como Brasil, no se restringe el uso de cualquier material como vehculo para inoculantes, siempre y cuando sean capaces de cumplir con las determinaciones tcnicas establecidas por el Ministerio de Agricultura, Ganadera y Abastecimiento MAPA (Zilli et al., 2010).

2.4.1 Exploracin de polmeros como alternativa a la formulacin de biofertilizantes de nueva generacin Las prcticas biotecnolgicas ofrecen una posible solucin, de manera responsable, para mejorar la produccin agrcola, atendiendo a las nuevas tendencias ambientales, impulsando el estudio de nuevas tecnologas, que permitan aumentar la produccin agrcola en el marco de una agricultura sostenible. Una alternativa interesante lo es entonces la implementacin de polmeros como nueva estrategia para la inmovilizacin de microorganismos con potencial biofertilizante. Desde el siglo pasado, el estudio de mezclas de polmeros ha recibido suficiente nfasis en el rea de ciencia de tecnologa de los polmeros; estas mezclas tienen numerosas aplicaciones en medicina, farmacia, industria del plstico, caucho, entre otros (Robeson, 1984). El desarrollo de mezclas de polmeros como materiales utilizables en muchas reas se vuelve una gran posibilidad para cumplir en un slo componente, diversas aplicaciones a un costo muy bajo (Soares y Oliveira, 2001). Koning et al. (1998) destacan la posibilidad de utilizar mezclas de polmeros, como una herramienta en el desarrollo de la ingeniera de materiales, desde la sntesis de nuevas molculas con propiedades de inters. Polmeros como la goma xantana y jata han mostrado prometedores efectos como vehculos en el transporte de microorganismos. Ambos son ampliamente utilizados como: estabilizantes, emulsionantes y espesantes en reas cosmticas, alimenticia, textiles, entre otras (Sutherland, 1986). Algunos polmeros como el alginato de sodio han sido probados como vehculos para la inoculacin de cepas de bacterias que promueven el crecimiento de las plantas, tales como Azospirillum (Bashan et al., 2002), pocos estudios han evaluado el uso de la matriz

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del polmero como un vehculo para la inmovilizacin de clulas rizobianas. En algunos pases como Nueva Zelanda, la polivinilpirrolidona (PVP) se utiliza como adhesivo para inoculantes microbianos en las semillas (Lloyd, 1983). Entre las mezclas de polmeros utilizados en las diversas reas de la industria, los polmeros biodegradables se destacan como materiales no contaminantes sobre el medio ambiente (Rosa et al., 2001). Mezclas a base de carboximetilcelulosa (CMC) y el almidn han sido estudiadas por Suvorov et al. (1999), obteniendo muy buenos resultados. La mayora de las mezclas de polmeros se encuentra parcial o totalmente inmiscibles, debido a su alto peso molecular, formando en su mayora mezclas heterogneas, mezclas en las que las caractersticas de los polmeros utilizados no siempre se cumplen (Koning et al., 1998). Como la mayora de las mezclas de polmeros son inmiscibles, la compatibilidad de la mezcla de polmero es de suma importancia para lograr la sinergia de las propiedades. Para lograr la compatibilidad de las mezclas de polmeros, se utilizan agentes compatibilizantes. Estos agentes son molculas que actan en la interfase de la mezcla, lo que permite una mayor interaccin, debido a su alta actividad con estos. Los agentes de compatibilizacin pueden ser polmeros, copolmeros molculas orgnicas de bajo peso molecular con un montn de grupos reactivos, por ejemplo, carboxilo e hidroxilo (Koning et al., 1998).

2.5 Formulaciones de inoculantes rizobianos La formulacin de inoculantes a partir de cepas de Rhizobium sp., es una tecnologa que puede lograr una alta productividad con la reduccin o la exclusin total de fertilizantes nitrogenados. Varios estudios han demostrado que la inoculacin de cepas seleccionadas de rizobios puede dar lugar a rendimientos iguales o superiores cuando se compara con la adicin de fertilizantes nitrogenados. Ferreira et al. (2000) demostraron, que la inoculacin del frijol comn (Phaseolus vulgaris L), con cinco cepas de Rhizobium tropici, mostr la productividad y el contenido de nitrgeno en las hojas y granos similares a los presentados por los tratamientos que recibieron fertilizante nitrogenado a la siembra y cobertura. En la actualidad, la gama de productos de inoculantes con diferentes modos de aplicacin estn disponibles. Los inoculantes comerciales de Rhizobium sp., deben tener un nmero adecuado de clulas activas, con frecuencia determinada por las regulaciones de cada pas (Soria et al., 2006).

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2.5.1 Formulaciones lquidas Una formulacin lquida es ideal, por la facilidad en su preparacin y manejo, adems su pureza puede confirmarse fcilmente. Las antiguas formulaciones de inoculante lquido se venan comercializando de manera espordica, debido a las dificultades que surgen en el mantenimiento de cultivos biolgicos de control despus de su preparacin y la obtencin de la licencia del fabricacin (Brockwell, 1982). Los fabricantes se propusieron superar el problema del deterioro de la concentracin del inculo, empleando la centrifugacin, colocndolo en recipientes de plstico para su congelacin y posterior transporte a los usuarios. Sin embargo, la corta vida til y la necesidad de almacenar a bajas temperaturas es una limitante para su uso (Stephens y Rask, 2000). Brockwell y Bottomley (1995) han reportado que los inoculantes lquidos envasados en botellas de dispensador, pueden ser usados como inoculantes de semillas para la entrega directa en la siembra de stas. Esta forma de inoculante lquido tiene ventajas para su almacenamiento, aferrndose fuertemente a la cubierta de la semilla sin necesidad de adhesivos, dando lugar a una buena nodulacin y fijacin de N2 comparables a lo que se podra obtener con inoculantes a base de turba. Por otra parte, varios compuestos han sido estudiados para la proteccin del inoculante, los cuales son adicionados con el fin de prolongar la supervivencia de los rizobios despus de la inoculacin. Por ejemplo, el polmero polivinilpirrolidona (PVP) que puede liberar compuestos txicos presentes en la cubierta de la semilla. Adems, tiene la capacidad de facilitar la unin de agua; sin embargo, su secado es lento despus de la aplicacin del inoculante en la semilla. El complejo FeEDTA y el glicerol son aadidos para complementar la fuente de hierro y carbono a los rizobios. Tambin, el glicerol puede proteger a las clulas sobre los efectos de la desecacin (Singleton et al., 2001). Las formulaciones lquidas son enriquecidas con el uso de aditivos tales como: el glicerol, goma arbiga polivinilpirrolidona. Estos aditivos pueden mejorar la calidad de los inoculantes en varios aspectos como: una mayor adherencia del mismo a la semilla, el producto se estabiliza e inactiva las toxinas solubles sobre la cubierta de la semilla y as mismo, aumenta la supervivencia de Rhizobium, despus de la exposicin a las condiciones ambientales. Las formulaciones lquidas son fciles de aplicar a las semillas, porque ellas pasan a travs de la maquinaria de siembra, mostrando mejores

rendimiento en campo, accesibles para los pequeos productores, debido a que se emplean materiales de bajo costo (Cuadrado et al., 2009).

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2.5.2 Formulaciones slidas

Liofilizados Los rizobios liofilizados, han demostrado ser capaces de mantener un alto nmero de clulas viables (por ejemplo 1 x 1012 UFC/g) hasta 24 meses (Herridge, 2008). Sin embargo, son productos ms costosos y el procedimiento de liofilizacin puede causar serios problemas, como la desnaturalizacin de las protenas sensibles y la muerte celular de algunos microorganismos. Existen varios tipos de aditivos, tales como azcares, que se han utilizado para tratar de proteger los daos causados por el proceso de secado mediante congelacin (Pereira et al., 2002). La liofilizacin es ampliamente usada para la conservacin de los microorganismos (Krumnow et al., 2009). El primer inoculante liofilizado fue producido por una empresa australiana por un corto perodo en el ao 1958 (Brockwell, 1982). McLeod y Roughley (1961), encontraron que los cultivos liofilizados podran proporcionar buena nodulacin en el campo, pero era probable que se limitara a las condiciones ambientales y la supervivencia de los rizobios liofilizados en las semillas (Vincent, 1962).

Microencapsulacin La encapsulacin de clulas vivas en un gel polimrico es una tecnologa bien establecida con grandes aplicaciones (Park y Chang, 2000). La matriz del gel permite que las clulas permanezcan viables durante un largo tiempo. Varios estudios han utilizado alginato como material de encapsulacin que permite formar microesferas de forma instantnea en presencia de cationes polivalentes que se unen a las unidades de cido gulurnico (Witter, 1996) en un slo paso con una adecuada resistencia mecnica. Por otra parte, las perlas de alginato formadas son capaces de atrapar un nmero suficiente de bacterias (Fenice et al., 2000; Zohar-Perez et al., 2002). El uso de clulas encapsuladas para aplicacin sobre el medio ambiente tiene varias ventajas sobre las formulaciones en donde las clulas se encuentra libres, presentando una mejor proteccin contra el estrs bitico (Smit et al., 1996) y abitico. Estas ventajas son: el efecto inhibidor de los compuestos txicos (Cassidy et al., 1997), mejor supervivencia y mayor actividad fisiolgica de la bacteria (Weir et al., 1995), suministro de aditivos nutricionales encapsulados (Trevor et al., 1993), aumento de la densidad celular y el crecimiento celular en diferentes zonas aerbica y anaerbica de la encapsulacin con el gel. Las nuevas tecnologas de encapsulacin presentan mejores posibilidades frente a la disyuntiva de otras

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formulaciones, como son: la estabilidad, la liberacin controlada, efectos sobre el medio ambiente, biodegradacin y rentabilidad. La encapsulacin de los rizobios en microesferas de Ca-alginato se ha propuesto como un procedimiento para aumentar la resistencia al calor ya la desecacin de las bacterias atrapadas (AbdelGadir y Alexander, 1997). En este sentido, las clulas

microbianas se ha demostrado que se mantienen fisiolgicamente activas despus de ser atrapado en los espacios intersticiales de este tipo de geles (Bashan, 1986). Esta matriz de gel permite que las clulas viables permanezcan y mantengan su actividad cataltica durante perodos ms prolongados (Young et al., 2006).

Recubrimiento mediante lecho fluidizado Este proceso hace parte de los mtodos fsicos empleados en la tcnica de microencapsulacin. El slido soporte utilizado en forma de pellets, es suspendido en una corriente de aire y posteriormente se atomiza una solucin del material de recubrimiento (Anal y Sinhg, 2007; Yez et al., 2006). Existen dos mtodos generales para preparar los pellets, uno de ellos consiste en el recubrimiento de grnulos que contienen el principio activo. Los ncleos pueden obtenerse, a partir del principio activo, reducindolo al tamao de partcula apropiado, slo o en mezcla con auxiliares y efectuando una granulacin, por los mtodos convencionales empleados. Una vez obtenidos los ncleos, se recubren con pelculas que controlan la liberacin del principio activo (Lieberman y Lachman, 1982; Guarnizo, 2001). El otro mtodo para la obtencin de los pellets es partiendo de la generacin de los ncleos. Para este caso, se utilizan como materiales de partida pequeos grnulos (semillas) de azcar o de otras sustancias inertes y se recubren con preparaciones adhesivas que contienen el principio activo disuelto o disperso. Con el fin de controlar la liberacin del principio activo, los pellets son recubiertos con capas del material polimrico (Lieberman y Lachman, 1982; Guarnizo, 2001), y dicho recubrimiento se puede efectuar tanto en bombos de recubrimiento como en equipos de lecho fluidizado. Para realizar un recubrimiento mediante lecho fluidizado, se utiliza un proceso conocido como secado por aspersin (spray-drying), que tiene una alta tasa de produccin y bajo costo de operacin; es una tecnologa muy conocida en la industria alimentaria y farmacutica (Wen-Chian et al., 2002). Es uno de los mtodos ms comunes para preparar complementos alimenticios estables y que ocupan pequeos volmenes (Potter, 1980). Adems, el secado por aspersin se utiliza para la preservacin y la concentracin

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de microorganismos (Fu y Etzel, 1995; Teixeira et al., 1995; To y Etzel, 1997a,b). Adems, el uso de secado por aspersin ha sido reportado por varios investigadores para preparar cultivos iniciadores que se utilizan para preparar productos lcteos fermentados o se utilizan como adyuvantes para mejorar el sabor del queso (Johnson y Etzel, 1993; Johnson et al., 1995; To y Etzel, 1997a,b). Diferentes estudios han sido reportados sobre la utilizacin de secado por aspersin por To y Etzel (1997b), Mary et al. (1993) y LiChari y Potter (1970), donde describen la supervivencia de Bradyrhizobium japonicum, Brevibacterium y Salmonella

respectivamente.

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Captulo III. Materiales y mtodos

3.1 Localizacin del estudio Los experimentos de actividad biolgica se llevaron a cabo en el Laboratorio de Microbiologa de Suelos y en los invernaderos del Centro de Biotecnologa y Bioindustria CBB-Corpoica (Mosquera). Los estudios de preformulacin y formulacin fueron realizados en el Laboratorio de Polmeros adscrito al grupo de investigacin en procesos de transformacin de materiales del Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia

3.2 Microorganismo, medios y condiciones de cultivo La cepa G58 presuntiva de Rhizobium sp. fue provista por la Coleccin de Microorganismos con Potencial Biofertilizante del Laboratorio de Microbiologa de Suelos de Corpoica. Esta fue aislada a partir de ndulos de la planta de frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] en suelos de la Guajira, Colombia (datos no publicados). La cepa fue mantenida y reactivada sobre medio de cultivo YM (composicin en g/L: manitol 10, extracto de levadura 0.5, K2HPO4 0.5, MgSO4 0.2, NaCl 0.1; pH 6.8) a 4C y 28C, respectivamente. Cuando se requiri cultivo slido se suplement el medio YM con 18 g/L de agar (YMA) y agitacin de 150 rpm. La descripcin macroscpica de la cepa se determin mediante el examen de clulas cultivadas segn los mtodos descritos por Somasegaran y Hoben (1994).

3.3 Caracterizacin bioqumica e identificacin molecular de la cepa G58

3.3.1 Identificacin bioqumica Las caractersticas bioqumicas de la bacteria se determinaron mediante el Kit API20NE (bioMrieux, Francia) que se utiliz de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La prueba de oxidasa se realiz empleando el test Bactident (Merck, USA). Los resultados del test API20NE fueron comparados contra la base de datos apiweb (bioMrieux, Francia). Las caractersticas microscpicas fueron analizadas mediante la tincin de Gram.

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3.3.2 Identificacin molecular mediante la amplificacin del 16S rDNA

Extraccin de ADN genmico La extraccin de ADN genmico (gADN) se realiz utilizando el Wizard kit (Promega Corporation, Madison, USA). El gADN extrado fue analizado de acuerdo a Sambrook y Russell (2001) y cuantificado mediante el uso de espectrofotometra (NanoDrop, Thermo Corporation).

Amplificacin del gen 16S Para la amplificacin del 16S rDNA se utiliz la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los cebadores 27F y 1492R descritos por Osborne et al. (2005). Cada reaccin de amplificacin tuvo un volumen final de 50 l. Las reacciones de amplificacin se realizaron en un Termociclador PTC 100 (MJ Research, USA). Los ciclos de amplificacin consistieron en una desnaturalizacin inicial a 94 C durante 3 min seguido por 30 ciclos de desnaturalizacin a 94 C durante 1 min, una etapa de anillamiento a 58 C durante 1 min y una etapa de extensin a 72 C durante 2 min. Finalmente, una ltima etapa de extensin a 72 C durante 5 minutos.

Purificacin del producto de amplificacin Para la purificacin de los fragmentos amplificados 32 l de producto de PCR se mezclaron con 0,1 volmenes de acetato de sodio 3M (pH 5,5) y 2,5 volmenes de etanol fro al 99,8%. La mezcla se incub a 20 C durante la noche. Posteriormente la mezcla fue centrifugada durante 30 minutos a 16.000 g a 4 C, donde el sobrenadante fue descartado. Se aadieron 300 l de etanol fro al 70% y la muestra se centrifug durante 10 min a 16.000g y 4 C, y nuevamente se descart el sobrenadante. El precipitado se mantuvo a temperatura ambiente hasta que se sec completamente y luego se resuspendi en 20 l de H2O para PCR (Sambrook et al., 1989). Secuenciacin de los fragmentos La secuenciacin del gen 16S rDNA de la cepa se llev a cabo en el Laboratorio de Genoma Embrapa Agrobiologa-Brasil empleando los cebadores descritos en la Tabla 1. Para la reaccin de secuenciacin se utilizaron 200 ng de los productos purificados de PCR, 1 l de cada cebador 5,0 mM, 4,0 l del kit "TE Dynamics Kit" (GE Healthcare) y agua ultrapura (ultraPURETM, Invitrogen Co) hasta un volumen final de 10 l. Las condiciones para la reaccin de secuenciacin fueron: 25 ciclos de desnaturalizacin anillamiento y extensin a 95 C durante 25 seg, 58 C durante 15 segundos, 60 C durante 1 minuto,

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respectivamente. Despus de marcar la reaccin, las muestras fueron precipitadas por adicin de 1,0 l de acetato de amonio 7,5 M y 27,5 l de etanol y se incubaron a 4 C durante la noche, despus de la incubacin se centrifug a 3000 g por 45 minutos a 4 C, el sobrenadante fue descartado y el pellet se lav con 100 l de etanol 70% y nuevamente centrifugado a 3000 g durante 10 min a 4 C. Las muestras fueron secadas al aire y se resuspendieron en 7,5 l de buffer de secuenciacin Mega BACE ("loading") y analizadas en un secuenciador automtico Mega BACE1000 (GE Healthcare). Las secuencias contiguas se reunieron a partir de las secuencias directas y reversas con los programas PHRED/PHRAP (Ewing et al., 1998; Ewing y Green, 1998) CAP3/CONSED (Gordon et al., 1998; Huang y Madan, 1999) en un entorno Linux para el sector de bioinformtica, Embrapa Agrobiologa.
Tabla 1. Iniciadores utilizados para la secuenciacin del gen 16S rDNA de la cepa G58 Iniciador 27f 1492R 362F 786F RU6 U3 U2 1110R Secuencia (5 3) Referencia Osborne et al., 2005 Osborne et al., 2005 Menna et al., 2006 Menna et al., 2006 Wang et al., 1996 Wang et al., 1996 Wang et al., 1996 Cho et al., 2006

AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG GGY TAC CTT GTT ACGA CTT CTC CTA CGG GAG GCA GCA GTT GGG CGA AAG CGT GGG GAG CAA ACA GG ATG GCT GTC GTC AGC TCG GWA TTA CCG CGG CKG CTG TGC TGC CTC CCG TAG GAG TTA GCA AGT AAG GAT ATG GGT

Las secuencias obtenidas fueron comparadas con otras en la base de datos de BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) del Centro Nacional de Informacin

Biotecnolgica NCBI. Para la construccin del rbol filogentico se utiliz la metodologa Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987), las secuencias de inters fueron extradas de la base de datos de BLAST y se alinearon con la funcin ClustalW del programa informtico MEGA 5 (Tamura et al., 2011).

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3.4 Caracterizacin de las actividades de promocin de crecimiento vegetal de la cepa G58 3.4.1 Fijacin Biolgica de nitrgeno Las races noduladas e inoculadas con la cepa G58, fueron evaluadas para determinar su capacidad de reduccin de acetileno. Posteriormente, las races fueron dispuestas en frascos hermticos a los cuales se les ajust una atmsfera constituida por 90% aire y 10% acetileno, el cual se incub durante 1 hora a 30 2 C (Hardy et al., 1968; Meghvansi et al., 2010).

Pasado el tiempo de incubacin, se midi la concentracin de etileno inyectando 1 ml de la atmsfera del frasco en un cromatgrafo de gases Perkin Elmer con detector de ionizacin de llama (FID) y una columna Poropak N 200/300 mesh de 6 pies y 3 mm de dimetro. La curva de calibracin se realiz empleando etileno puro grado cromatogrfico, la ecuacin Log10: Y= 0,145X + 0,548 con un R2= 0,997.

3.4.2 Cuantificacin de compuestos indlicos mediante la tcnica colorimtrica de salkowsky Despus de la fermentacin en oscuridad de la cepa G58 de Rhizobium sp. sobre medio Klactato durante 72 horas a 150 rpm, se centrifug la suspensin a 10000 rpm por 10 minutos. Se tom 1 ml del sobrenadante y se llev a reaccin con 1ml del reactivo de Salkowsky modificado (7.9 M H2SO4 y 12 g/L FeCl3), y se incub por 30 minutos en completa oscuridad. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado, el control correspondi a medio de cultivo no inoculado. Se determin la absorbancia de cada tubo en el espectrofotmetro (Genesy UV10, Thermo Corporation) a 540 nm, con los datos de absorbancia se obtuvo el promedio de las rplicas y se reemplazaron los datos en la ecuacin de la recta de la curva patrn. La produccin de ndoles totales fue expresada en g relativos de AIA /ml (Carreo-Lpez et al., 2000).

3.4.3 Cuantificacin de la capacidad de solubilizacin de fosfato mediante la tcnica de azul de fosfomolibdeno Una suspensin bacteriana estandarizada a DO600 = 0,500 en NaCl 0,85%, se uso para inocular el medio de cultivo lquido Pikovskaya empleando 10% del volumen final (Pikovskaya 1948), para el crecimiento de la cepa G58 durante 3 das a 150 rpm. Una alcuota de 1,0 ml de cada frasco se centrifug a 10000 rpm por 10 minutos y 500 l del

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sobrenadante se emple para anlisis (Fiske y Subbarow, 1925). La actividad enzimtica se determin mediante la tcnica de p-nitrofenil fosfato de acuerdo con la metodologa descrita por Tabatabai y Bremner (1969). El ensayo fue realizado por triplicado.

3.5 Estudios de preformulacin

3.5.1 Evaluacin del efecto de diferentes factores fisicoqumicos sobre el crecimiento de la cepa G58 Se estudi el efecto de diferentes pHs sobre el crecimiento de la cepa G58 en medio de cultivo YM bajo condiciones estndar (Somasegaran y Hoben, 1994). El rango de evaluacin de pH estuvo entre 4 9. El crecimiento se monitore, mediante espectrofotometra a 600 nm, despus de 40 horas de incubacin. Se evalu el efecto de la temperatura sobre el crecimiento de G58 evaluando temperaturas dentro del rango 28-43 C (Somasegaran y Hoben, 1994). Finalmente, se investig el efecto de tres fuentes de carbono (manitol, glucosa y sacarosa) a diferentes concentraciones sobre el crecimiento de la cepa G58. Para la determinacin de azcares totales en el medio de cultivo YM modificado con glucosa se realiz la tcnica descrita por Dubois et al. (1956). Estimando la cantidad de azcares espectrofotomtricamente a 492 nm empleando una curva patrn con glucosa como estndar, la cuantificacin de protenas se realiz siguiendo la metodologa descrita por Bradford (1976). Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

3.5.2 Seleccin y caracterizacin fisicoqumica de los polmeros Ocho materiales polimricos fueron seleccionados: dos alginatos de sodio de diferente peso molecular (FMC Biopolymer), hidroxipropilmetilcelulosa-HPMC (Colorcn), dos polmeros de polietilenglicol (PEG) de diferente peso molecular, alcohol polivinlico-PVA, polivinilpirrolidona-PVP y Carbmero 940 (Necardis S.A) (Jung et al., 1982; Deaker et al., 2005). Estos fueron caracterizados estimando el grado de viscosidad, dispersin, pH, aplicaciones biotecnolgicas, costos y disponibilidad de cada uno en la regin. Los materiales polimricos empleados cumplieron con las especificaciones establecidas por la USP.

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3.5.3 Seleccin de los polmeros con base en su efecto sobre la viabilidad celular El efecto de cada polmero sobre la viabilidad de la cepa G58 fue evaluado sobre medio de cultivo YMA suplementado con la cantidad adecuada de cada uno de ellos. Se evaluaron tres concentraciones de cada polmero a temperatura ambiente (18 2 C). Los materiales polimricos que presentaron mejores respuestas de compatibilidad con la bacteria expresada en UFC/ml, fueron seleccionados para su posterior evaluacin. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado

3.5.4 Determinacin de propiedades adicionales de formacin de pelcula, permeabilidad e hinchamiento de los tres polmeros compatibles con la cepa de Rhizobium sp., G58

Formacin de pelculas polimricas mediante la tcnica de casting

Las pelculas polimricas se obtuvieron, a partir de la dispersin de los polmeros (Alginato de sodio e Hidroxipropilmetilcelulosa) en agua destilada. Se utilizaron concentraciones de los polmeros en un orden del 0,5%. Lo anterior, se realiz en condiciones ambientales controladas y con 400 rpm de agitacin empleando un agitador mecnico marca (RZR 2020 Heildoph). La preparacin obtenida del polmero se agreg en moldes de vidrio de 15 x 15 cms de acuerdo a la metodologa de casting (Bajdik et al., 2005; Arvalo et al., 2010), la cual se dej secar en la estufa a una temperatura de 60 5 C.

Evaluacin de permeabilidad de los polmeros mediante el mtodo de agua

Se llev a cabo siguiendo el procedimiento de la ASTM E96-95 (ASTM, 1995), utilizando el Mtodo de Agua. Se colocaron las pelculas previamente obtenidas en moldes de vidrio y se colocaron 30 ml de agua destilada dentro del molde. Enseguida, al borde de la base del molde de vidrio se agreg parafina y se tap. Se pes por completo el molde de vidrio y la pelcula y se coloc en el desecador. La informacin fue tomada cada 12 horas, con el fin de realizar la medicin de permeabilidad bajo condiciones ambientales de temperatura y humedad controladas. Se registr el cambio de peso de este sistema a travs del tiempo.

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Prueba de Hinchamiento de los polmeros

Se colocaron pelculas polimricas de 2x2 mm de dimetro sobre mallas de acero, previamente pesadas y se realizaron las mediciones cada dos minutos en un buffer de fosfatos a pH 6,8, condiciones similares al pH del suelo de donde fue aislada la bacteria. Se calcul la cantidad de agua atrapada por la pelcula cada dos minutos. El grado de hinchamiento fue calculado a partir de la ecuacin (Li et al., 1998) donde (Wt) es el peso de la pelcula al tiempo (t) y (Wo) es el peso de la pelcula al tiempo cero.
ndice Hinchamiento = Wt Wo/Wo (1)

3.6 Evaluacin en invernadero del efecto de los polmeros sobre la actividad biolgica en frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp]

Se emplearon semillas de frjol cowpea [Vigna unguiculata (L). Walp] provenientes de la Estacin Experimental Motilonia de Corpoica (Codazzi, Cesar). Para su desinfeccin se sumergieron en etanol 70% durante 30 segundos, se lavaron tres veces con agua destilada estril; posteriormente, se colocaron en hipoclorito de sodio al 2% durante un minuto. Se enjuagaron 10 veces con agua destilada estril y se dejaron reposar por una hora en agua destilada estril para estimular la germinacin. Despus de este tiempo, se colocaron las semillas en cajas de petri sobre medio Agar agua (15 g/L), se recubrieron con papel de aluminio y se incubaron durante 4 das a 30 C. Las semillas pregerminadas, con aproximadamente 20 mm de raz emergente, fueron seleccionadas para los ensayos en invernadero.

Los experimentos en invernadero (condiciones controladas) fueron establecidos bajo un diseo experimental completamente al azar con cinco (5) tratamientos y 9 repeticiones, para un total de 45 unidades experimentales (Tabla 2). Se emple como sustrato vermiculita y arena en una relacin 2:1 (p/p), las cuales fueron tratadas mediante tres ciclos de esterilizacin en tres das diferentes a una temperatura de 121C a 15 PSI, durante 15 minutos.

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Tabla 2. Tratamientos establecidos para determinar el efecto de los polmeros sobre la actividad biolgica en frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp]

Tratamientos

Descripcin Sin inoculacin bacteriana Inoculacin Rhizobium sp., G58 (YM) Inoculacin lquida Rhizobium sp., G58 (YM) inmovilizada Inoculacin lquida Rhizobium sp., G58 (YM) inmovilizada Inoculacin lquida Rhizobium sp., G58 (YM) inmovilizada

T0: Testigo Absoluto T1: Control lquido YM T2: Polmero 1 T3: Polmero 2 T4: Polmero 3

Las plntulas de frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp], se inocularon con las suspensin bacteriana adecuadas (DO600 = 0,5) junto con el polmero seleccionado previamente a una relacin de 1ml inoculante/60g semilla, y sembradas en las materas. Al testigo absoluto se le adicion agua destilada estril en lugar de suspensin bacteriana. Las plantas fueron regadas cada dos das empleando la solucin nutritiva de Hoagland descrita por Hoagland y Arnon (1950).

Las variables de evaluacin fueron: longitud de raz, longitud de parte area, nmero de ndulos, biomasa de los ndulos, fijacin biolgica de nitrgeno (metodologa descrita anteriormente), peso fresco raz, peso fresco parte area, peso seco raz y peso seco parte area, despus de un periodo de 60 das bajo condiciones de invernadero a una temperatura de 30 2 C y una humedad relativa del 70%. El experimento fue regado con agua estril manteniendo capacidad de campo.

3.7 Estudios de Formulacin

3.7.1 Obtencin de los prototipos de formulacin slida mediante la tcnica de recubrimiento en lecho fluidizado

Se utiliz el equipo de lecho fluidizado de las instalaciones de Colorcn, sucursal Colombia. Los ensayos partieron de la utilizacin de pellets de azcar como soporte para el recubrimiento de la cepa G58. Se seleccionaron los tres polmeros con los mejores

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resultados en los ensayos de compatibilidad realizados previamente, fijando las concentraciones de los polmeros de acuerdo a las condiciones del proceso.

Para el proceso de recubrimiento, se utiliz una fermentacin lquida en YM de la cepa G58 durante 24 horas, para ello se ajust el inculo inicial a una DO600 = 0,500. Posteriormente, se realiz la determinacin de la biomasa producida por medio de la tcnica de recuento (Doyle et al., 2000) en placa como control inicial del proceso. Adicionalmente, se dispers el polmero mediante un agitador mecnico marca (RZR 2020 Heildoph), el cual fue mantenido a agitacin constante hasta completa dispersin. Lo anterior fue agregado a la fermentacin de la bacteria para su aspersin en el lecho fluidizado. Las condiciones del equipo, para el proceso fueron: un temperatura de entrada, TE 50 C; temperatura de salida, Ts 35 C; carga de pellets de sacarosa 500 g tamao de los pellets malla 18/20; carga de la fermentacin lquida, 500 ml; caudal de entrada, Qo 7 ml/min. Y se adecu mediante un sistema de atomizacin tipo bottom spray para la aspersin de la suspensin bacteriana.

Se analiz a los prototipos de formulacin despus de terminado el proceso de recubrimiento, las actividades de produccin de compuestos indlicos, solubilizacin de fsforo y fijacin biolgica de nitrgeno.

3.7.2 Perfil de degradacin y liberacin de los prototipos de formulacin slida

Se realizaron perfiles de degradacin del prototipo y liberacin del principio activo del prototipo en funcin del tiempo. Para ello, se dispuso de recipientes con suelo estril. Se agreg 10 g de cada uno de los prototipos slidos en un recipiente con 100 gramos de suelo bajo condiciones de esterilidad y se colocaron en un fitotrn a una temperatura de 30 2 C y una humedad relativa del 70%. Se establecieron cuatro tratamientos con tres repeticiones por da; para un total de 60 recipientes durante los cinco das de evaluacin.

3.8 Tcnicas microscpicas

3.8.1 Microscopa electrnica de Barrido (SEM) Mediante microscopa electrnica de barrido (FEI QUANTA 200) se realiz la visualizacin microscpica de la formulacin slida que present los mejores resultados en las 42

instalaciones de la Universidad Nacional de Colombia, para analizar la presencia de las clulas incorporadas en el recubrimiento mediante lecho fluidizado.

Se realiz el procesamiento de la muestra mediante la metalizacin en un Sputter SDC-050 de Marca (Balzers), en condiciones de prevaco (<10-1 torr) con argn como gas de ataque (plasma) sobre una placa (ctodo) de oro-paladio (8:2)). La pelcula se deposit sobre las muestras (nodo) a corriente de descarga de +/- 50mA y el espesor tpico fue de +/- 200 nm. La muestra ya procesada fue visualizada en diferentes campos mediante el microscopio de barrido permitiendo destacar la morfologa del material y dems propiedades de la misma.

3.8.2 Microscopa electrnica de Transmisin (TEM)

A partir de la muestra del prototipo de formulacin fue realizado el protocolo para la visualizacin de la bacteria, el cual se llev a cabo en el equipo (Hitachi HU-12A) de las instalaciones de la Fundacin Santa Fe de Bogot. La metodologa se realiz de acuerdo a lo descrito por (Bianucci et al., 2011). La muestra a evaluar consisti en el mejor prototipo obtenido mediante lecho fluidizado, el cual fue centrifugado durante 10 min a 10.000 rpm a 4 C. La muestra se fij por inmersin en glutaraldehdo al 2,5% en 0,1 M tampn Srensen (pH 7,4) a 4 C durante 2 horas, y postfijada en tetraxido de osmio al 1% durante 1 h. Luego la muestra se deshidrat en concentraciones ascendentes de etanol (50-100%) y se incluy en resina. La resina se polimeriz durante 24 horas a 60 C. Secciones ultradelgadas (grosor de 0,5 mm) se tieron con azul de toluidina. Secciones ultrafinas (espesor, 70 nm) fueron doblemente teidas con acetato de uranilo y citrato de plomo (Jurado et al., 2007).

3.9 Evaluacin en invernadero del efecto de los prototipos de formulacin slida sobre la actividad biolgica en frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp]

El procedimiento para los prototipos fue llevado a cabo de acuerdo a las mismas condiciones previamente descritas. Los experimentos en invernadero fueron establecidos bajo un diseo experimental completamente al azar con seis tratamientos y nueve repeticiones, para un total de 54 unidades experimentales (Tabla 3). El experimento se realiz como previamente fue descrito.

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Tabla 3. Tratamientos establecidos para determinar el efecto de los prototipos slidos sobre la actividad biolgica en frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp]

Tratamientos

Descripcin Sin inoculacin bacteriana Inoculacin Rhizobium sp., G58 (YM) Inoculacin slida Rhizobium sp., G58 (YM) Inoculacin slida Rhizobium sp., G58 (YM) Inoculacin slida Rhizobium sp., G58 (YM) Inoculacin slida Rhizobium sp., G58 (YM)

T0: Testigo Absoluto T1: Control lquido YM T2: Control Prototipo slido YM T3: Prototipo slido 1 T4: Prototipo slido 2 T5: Prototipo slido 3

Anlisis estadstico Los anlisis estadsticos empleados para la interpretacin de los datos a nivel de laboratorio se llevaron a cabo mediante un Anlisis de Varianza (ANOVA) y Test HSD Tukey, con un nivel de confianza del 95%. Los anlisis fueron realizados empleado el software SAS 9.0 para Windows. La tcnica de componentes principales se realiz empleando el software Xlstat 2011 para Windows.

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Captulo IV. Resultados y Discusin

4.1. Caracterizacin fenotpica, bioqumica y molecular de la cepa de Rhizobium sp., G58 Se realiz la caracterizacin fenotpica, bioqumica y molecular de la cepa G58 con el objetivo de establecer sus caractersticas fisiolgicas y morfolgicas, adems de su identidad filogentica. Despus de 72 h de incubacin sobre medio de cultivo YMA se observaron colonias de aproximadamente 5.0 mm de dimetro, con borde circular, liso, y convexo, y con formacin de moco blanco opaco. La reaccin de Gram fue negativa. La cepa G58 present reaccin positiva a la hidrlisis de esculina, actividad -galactosidasa y asimilacin de glucosa, arabinosa, manosa, manitol, N-acetyl-glucosamina, maltosa, cido mlico y gluconato, y actividad oxidasa. Adems, se present reaccin negativa para la asimilacin de la arginina, activdad gelatinasa, fermentacin de glucosa, actividad ureasa, y metabolismo del citrato, cido cprico y cido fenil actico. Los resultados obtenidos con respecto a la utilizacin de diferentes fuentes de carbono, reacciones enzimticas y procesos de fermentacin confirmaron que la cepa G58 est relacionada en 96.1% con el gnero Rhizobium perfil bioqumico 1467764- (Sadowsky y Graham, 1998). Con el objetivo de confirmar la identidad molecular de la cepa se realiz la amplificacin por PCR y se realiz la secuenciacin del fragmento mediante 16S rDNA. Los resultados mostraron que la cepa G58 amplific la banda del tamao esperado, aproximadamente 1500 pb (Figura 1).

MP

1650 pb 1000 pb

Figura 1. mplificacin del 16S rDNA de la cepa G58 mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%. C5B: Cepa de referencia y MP: Marcador de peso molecular 1000 kb plus.

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La secuenciacin del fragmento mostr que la cepa G58, se encuentra asociada con el gnero Rhizobium sp., con un 99% de identidad; lo cual es consistente a los resultados obtenidos mediante el test API 20 NE. Por otra parte, el anlisis de las secuencias obtenidas fue representado mediante la construccin de un rbol filogentico y 18 secuencias de referencias fueron utilizadas a partir del NCBI, de acuerdo a los porcentajes de similitud obtenidos en el anlisis realizado en BLAST (Figura 2). Sin embargo, para la identificacin a nivel de especie de la cepa en estudio; Gaunt et al. (2001) report la necesidad de utilizar diferentes cebadores como recA y atpD que permitan acercarse aun ms a la especie de Rhizobium sp. Por ejemplo, autores como Laguerre et al. (2001) compararon mediante anlisis filogentico la correlacin existente entre los genes nod, nif y la tcnica del 16s rRNA para una mejor clasificacin de los rizobios encontrando una mayor resolucin para la determinacin de especies en este gnero.

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Figura 2. rbol filogentico realizado mediante la amplificacin del 16S rARN. La filogenia fue inferida por el mtodo de Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987) utilizando el software Mega 5 (Tamura et al., 2011). Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el parmetro de Kimura 2mtodo (Kimura, 1980). Los nmeros en los nodos representan el porcentaje de bootstraping con 10000 repeticiones. La barra de escala = 0,02 sustituciones por sitio.

4.2. Caracterizacin de las actividades de promocin de crecimiento vegetal Posterior a la identificacin de la cepa G58, se realiz la caracterizacin de las actividades de promocin de crecimiento vegetal de la bacteria, para esto se evaluaron la capacidad para fijar nitrgeno atmosfrico en simbiosis con la planta husped, la capacidad para

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solubilizar fosfatos insolubles y para sintetizar compuestos tipo indol. Los resultados mostraron que, como era de esperarse, los ndulos formados a partir de la interaccin leguminosa-rizobio fueron activos y capaces de reducir acetileno a etileno empleando el test de reduccin de acetileno el cual proporciona un estimativo acerca de la capacidad de una bacteria diaztrofa para reducir el nitrgeno molecular del aire a dos molculas de amonio. Nuestros resultados mostraron que los ndulos fueron capaces de fijar 1135 1,07 C2H4 planta-1 h-. Figueiredo et al. (1999), reportaron actividades de reduccin de acetileno similares empleando cepas de Bradyrhizobium sp. nodulando Vigna unguiculata (L.) Walp donde los resultados del test de reduccin de acetileno mostraron una actividad aproximada de 1121 y 1756 nmol C2H4 planta-1 h-1. De la misma manera, se evalu la capacidad de las cepas para producir compuestos indlicos. Este tipo de sustancias han mostrado estar implicadas en la regulacin de diferentes etapas y procesos fisiolgicos en plantas. Los resultados evidenciaron una capacidad intrnseca de la cepa G58 para sintetizar este tipo de compuestos empleando L-triptfano como intermediario. La cepa G58 crecida sobre medio K-lactato report una produccin de 25,31 1,03 g/ml de indoles despus de tres das de incubacin, estos resultados son similares a los reportados por Ahemad y Khan (2011) quienes alcanzaron una produccin de 32 g ml1 de indoles para la cepa MRP1 de Rhizobium sp. Finalmente, se determin la capacidad bacteriana para hacer disponible el fsforo a partir de fuentes insolubles como el fosfato triclcico. La cepa G58 mostr una actividad de solubilizacin de 354.38 0.005 g PO4-3/ml despus de 3 das de incubacin. Esto representa una actividad solubilizadora importante puesto que autores como Collavino et al. (2010) obtuvieron actividades de solubilizacin de fsforo entre un rango de 100-300 g P ml1 para cepas de diversos gneros incluyendo algunos rizobios. Rodrguez y Fraga (1999) sugieren que los gneros bacterianos con mayor potencial para la solubilizacin de fsforo son Rhizobium, Pseudomonas y algunas cepas de Bacillus, lo que es acorde a nuestros resultados.

4.3. Estudios de preformulacin

4.3.1 Evaluacin del efecto de diferentes factores fisicoqumicos sobre el crecimiento de la cepa de G58

Se estim el efecto de diferentes agentes fisicoqumicos sobre el crecimiento de la cepa G58, con el objetivo de determinar si existen condiciones que afecten el crecimiento de la bacteria. En particular, se evalu la influencia del pH, temperatura y fuente de carbono

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sobre el crecimiento celular. Los resultados obtenidos evidenciaron un efecto negativo de pHs cidos sobre el crecimiento de la cepa de Rhizobum sp. G58, observndose una reduccin drstica del crecimiento a pH 4 y 5.5 durante las primeras 20 horas. Por el contrario, no se observaron diferencias significativas en el crecimiento de la cepa en pHs cercanos a la neutralidad ligeramente alcalinos (Figura 3A). El pH suele alterar la actividad y estructura de ciertas biomolculas lo cual puede influir de forma drstica sobre la actividad y viabilidad de las clulas. A pesar que las bacterias del gnero Rhizobium se consideran ligeramente acidfilas, nuestros resultados mostraron lo contrario, lo que puede estar asociado al suelo de donde fueron aislados (pH 7.5). En contraste, Cuadrado et al. (2009), reportaron cepas de rizobios de crecimiento rpido capaces de crecer bien a pHs entre 4 - 9 aislados del mismo cultivo en suelos del departamento de Bolvar, Colombia. Con respecto al efecto de la temperatura sobre el crecimiento celular, no se observaron cambios en la velocidad de crecimiento de la bacteria entre 28-43 C. Sin embargo, cuando se expuso el microorganismo a una temperatura de 43 C fue posible observar una disminucin considerable en la densidad ptica del cultivo con respecto al control, lo que podra ser indicativo de algn tipo de afectacin al metabolismo normal de la bacteria (Figura 3B). No obstante, Munvar y Wollum (1981) afirman que algunas cepas de rizobios son capaces de crecer a temperaturas entre 27 y 45 C. As mismo, Cuadrado et al. (2009), corroboraron la tolerancia a altas temperaturas de microorganismos de este gnero asociados a zonas tropicales.

Figura 3. Efecto de diferentes variables (A. pH; B. Temperatura; C. Consumo de glucosa y produccin de protena; crecimiento en diferentes carbohidratos D. Manitol E. Glucosa F. Sacarosa. Cada valor representa la media de tres rplicas. Diferente letra muestra diferencias estadsticas

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significativas mediante el test de Tukey HSD (P < 0,05). Las barras de error representan la desviacin estndar.

Con base en los resultados de consumo de glucosa determinada por el mtodo de Dubois (Figura 3C), se observ que la bacteria consume aceleradamente la fuente de azcar durante las 10 primeras horas. Sin embargo, se aprecia un consumo lento despus de las 12 horas, lo cual puede atribuirse al fenmeno de sntesis de exopolisacridos presentado en el medio de cultivo por la cepa de Rhizobium sp. G58. Adems, se evidencia que una cantidad de azcar se encuentra en el medio, al final de la fermentacin, motivo por el cual se puede pensar que existe una produccin de compuestos extracelulares asociadas en el medio. Se evaluaron tres fuentes de carbono a diferentes niveles, con el objetivo de determinar el efecto de altas y bajas concentraciones y del tipo de azcar sobre el crecimiento de la bacteria. Los resultados evidenciaron que el desarrollo de las cepas durante las primeras 18 horas de incubacin no fue afectado por las diferentes concentraciones de los azcares empleadas, demostrando que no hubo incidencia de la fuente de carbono sobre el crecimiento celular. Adicionalmente, los resultados establecen una correlacin entre la cantidad y revelan un aumento en la viscosidad del medio (Figura 3D, E y F); que puede presentarse posiblemente a la produccin de compuestos polimricos tal como lo reportan lancheros, 2001 y Pea et al. (2007).

4.3.2 Seleccin y caracterizacin fisicoqumica de los polmeros La seleccin de los polmeros se realiz con base a reportes en donde se evalu su uso sobre microorganismos de caractersticas similares (Denardin y Freire, 2000; Fernandes Jnior et al., 2009; Chen y Lin, 1994; Song et al., 2005; Bashan et al., 2002; Trivedi y Pandey, 2008). Los polmeros seleccionados fueron: alginato, hidroxipropilmetilcelulosaHPMC, Alcohol polivinlico-PVA, Polivinilprirrolidona-PVP, Carbmero y PolietilenglicolPEG. Se les evalu viscosidad y pH, comparndose con la informacin obtenida en literatura la cual fue reportada en la Tabla 4. Se evalu el grado de dispersabilidad de los polmeros en agua como solvente a las concentraciones reportadas y a dos niveles para determinar su subsiguiente manejo.

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Tabla 4. Caracterizacin de los polmeros utilizados para la inmovilizacin de la cepa G58

Polmero *Viscosidad (cP) pH Caractersticas Soluble en agua, agentes de suspensin Propiedades adhesivas, soluble en agua Propiedades estabilizantes Agentes de suspensin y adhesivas Estabilizante, viscosante Aplicaciones con microorganismos
Denardin y Freire, (2000); Rojas y Moreno, (2008).

Polietilenglicol 1 Polietilenglicol 2 Alcohol polivinlicoPVA Carbmero Alginato Sodio 1 Alginato Sodio 2 Hidroxipropimetil celulosa-HPMC Polivinilpirrolidona-PVP

100 250 280 12000*** 100-300 600-900 100

5,9 0,03 5,7 0,07 4.2 0,02 3.5 0,01 6,9 0,25 6,7 0,08 6,7 0,03

Temprano et al. (2002).

Deaker et al. (2004); Kwon et al. (2009).

Rojas y Moreno, (2008).

Bashan et al. (2002); Young et al. (2006). Yabur et al. (2007); Bashan y Gonzales, (1999).

Aglutinante, estabilizante Soluble en agua, Liberacin controlada Soluble en agua, bioadhesividad

** Suvorova et al. (1999);

Fernandes jnior et al. (2009). Haffez et al. (1991); Tittabutr et al. (2007)

< 100

6,5 0,05

*Viscosidad se midi empleando un viscosmetro (Brookfield DV-III Ultra, Brookfield Engineering Laboratories, Inc., USA) y se utiliz la aguja N 2 a una temperatura de 25C con una velocidad < 100 rpm, de acuerdo al polmero. ** No se han empleado hidroxipropilmetilcelulosa de acuerdo a la revisin de literatura citada; sin embargo, se han realizado trabajos con el polmero carboximetilcelulosa.*** Tomado de la literatura.

4.3.3 Seleccin de los polmeros con base en su efecto sobre la viabilidad celular Ocho polmeros fueron seleccionados con base en reportes que han demostrado sus cualidades sobre el mantenimiento de la viabilidad celular. Con el objetivo de determinar la compatibilidad de estos con la cepa G58, se evaluaron tres concentraciones de los polmeros las cuales fueron escogidas de acuerdo a la literatura y propiedades reolgicas de los mismos (Tabla 4). De los resultados obtenidos a partir de la prueba de compatibilidad, se pudo establecer que los polmeros que ms afectaron la viabilidad celular en la mayor concentracin fueron: PEG2 > PEG1 > PVA > Carbmero > PVP > HPMC > Alginato 1 > Alginato 2. De esta manera, los polmeros Alginato 2, Alginato 1 y HPMC se seleccionaron para estudios posteriores. Las pruebas de compatibilidad demostraron que los polmeros seleccionados no disminuyeron la viabilidad en menos de una unidad logartmica, lo que contrasta con los

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resultados obtenidos con los polmeros de polietilenglicol (Figura 4A y B) que afectaron la integridad de la bacteria disminuyendo en ms de dos unidades logartmicas su viabilidad. Polmeros como el alginato de sodio, presentaron mejores resultados en la viabilidad de la cepa de Rhizobium sp., G58 mostrando un efecto estadsticamente superior en comparacin con el testigo (Figura 4E y F). Estos resultados son contrarios a los reportados por Tittabutr et al. (2007); quienes emplearon porcentajes < 0,5% de este polmero presentando una disminucin de la viabilidad celular de cepas de rizobios; sin embargo este efecto fue dependiente del tipo de especie evaluada. Por lo tanto, es importante antes de utilizar los polmeros, realizar una caracterizacin fisicoqumica con el fin de obtener informacin que contribuya hacia el uso adecuada de estos materiales y su compatibilidad con bacterias promotoras de crecimiento. Se ha demostrado en trabajados realizados por Bashan et al. (2002) la implementacin de alginatos para la inmovilizacin de bacterias promotoras de crecimiento vegetal (PGPB), con mltiples beneficios en la agricultura, destacndose como uno de los polmeros ms compatibles con este tipo de bacterias al protegerlas contra condiciones ambientales adversas (Yabur et al., 2007). Se puede inferir que los alginatos empleados (Alginato 1 y 2), difieren notablemente en cuanto a la conformacin de su estructura qumica en bloques (Zimmermann et al., 2007), es decir, presentan diferentes unidades monomricas, por lo cual desempeen diferentes funciones de dureza flexibilidad dependiendo del tipo de bloque (M G) en su estructura. Sin embargo, los dos polmeros empleados no mostraron diferencias significativas entre s sobre la viabilidad de la cepa de Rhizobium sp. G58 manifestando un comportamiento similar en los dos casos (Figura 4E y F). De la misma forma, el polmero hidroxipropilmetilcelulosa-HPMC en las tres concentraciones evaluadas no present un efecto deletreo sobre la viabilidad de la bacteria, observndose diferencias significativas con el control sin emplear polmero en el medio (Figura 4G). Cabe mencionar que la hidroxipropilmetilcelulosa es un derivado semisinttico de la celulosa con grupos metilo e hidroxipropilo y es utilizado para liberacin controlada de diferentes principios activos gracias a las propiedades reolgicas que presenta (Kiil y Dam-Johansen, 2003). Se podra inferir que este polmero brinda beneficios como soporte de la bacteria en un mayor tiempo y adems pueda participar como agentes estabilizantes de suspensiones (Ansel et al., 2004). Autores como Fernandes Jnior et al. (2009) demostraron las cualidades de los derivados de la celulosa como es el caso de la carboximetilcelulosa-CMC, la cual aport ptimas condiciones para el sostenimiento de los rizobios en etapa de almacenamiento. Estos resultados son atribuidos a las caractersticas qumicas y

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propiedades reolgicas que la rigen (Rohr, 2007), siendo materiales novedosos para la inmovilizacin de bacterias fijadoras de nitrgeno. Con respecto a los polmeros de polietilenglicol (PEG) de diferentes pesos moleculares, se present una prdida de la viabilidad durante los dos meses en las tres concentraciones evaluadas. Para el caso del control se present mejor respuesta en comparacin con todos los tratamientos que empleaban polietilenglicol (Figura 4A y B). Trabajos similares han sido reportados por Denardin y Freire (2000) quienes utilizaron el polietilenglicol obteniendo baja viabilidad posterior con cepas de Bradyrhizobium elkanii. As mismo, trabajos realizados por Bushby y Marshall (1977) confirman que el efecto del polietilenglicol depende del gnero de rizobios. Mientras que trabajos reportados por Tittabutr et al. (2007) presentan resultados opuestos a los expuestos en este estudio. Estos resultados sobre el efecto en la viabilidad de algunos tipos de bacterias pueden ser atribuidos a la composicin qumica del polietilenglicol, el cual se utiliza en la industria farmacutica como agentes de suspensin y estabilizante, ejerciendo una actividad antibacteriana (Rowe et al., 2009). De igual manera, autores como Zahran y Sprent (1986) afirman que el polietilenglicol (PEG) inhibe el nmero de ndulos de la planta hasta un 50%, interfiriendo en el proceso de infeccin en los pelos radicales de la planta de haba (Vicia Faba L). En este sentido, cabe resaltar la necesidad de realizar estudios de los polmeros sobre la simbiosis rizobio-leguminosa para fundamentar aun ms los resultados, debido a que a nivel in vitro, los efectos del polietilenglicol (PEG) sobre la viabilidad celular son contradictorios y no satisfacen la totalidad de su efecto de forma integral. El polmero de polivinilpirrolidona-PVP, present una respuesta favorable en la viabilidad del microorganismo bajo las tres concentraciones evaluadas (Figura 4H). Estos resultados son similares a los encontrados por Tittabutr et al. (2007) los cuales demostraron que cuando emplearon PVP en concentraciones del 1 al 5% durante 6 meses no se present prdida de la viabilidad del microorganismo. Adems, pudieron concluir que la respuesta de este polmero estaba influenciada por el tipo de rizobios utilizado. En este contexto se destaca el trabajo realizado por Denardin y Freire (2000) los cuales investigaron las mezclas de diferentes gomas con dos polmeros sintticos, la polivinilpirrolidona (PVP) y el polietilenglicol (PEG). Los resultados de este estudio corroboran que las mezclas de dos gomas con el PVP mostraron una alta tasa de supervivencia de las clulas de Bradyrhizobium elkanii, mientras que se present un efecto sobre la viabilidad celular cuando fue utilizado el polmero de polietilenglicol (PEG).

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Figura 4. Efecto de ocho polmeros sobre la viabilidad de la cepa G58 durante dos meses de evaluacin. Cada valor representa la media de tres rplicas. Diferente letra muestra diferencias estadsticas
significativas mediante el test de Tukey HSD (P < 0,05). Las barras de error representan la desviacin estndar.

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4.3.4 Determinacin de propiedades adicionales de formacin de pelcula, permeabilidad e hinchamiento de los tres polmeros compatibles con la cepa de Rhizobium sp. G58

De acuerdo a los resultados obtenidos en las pruebas de compatibilidad fueron seleccionados los dos polmeros de alginato de sodio y la hidroxipropilmetilcelulosa y se utilizaron a una concentracin de 0,5% (p/v) en las siguientes evaluaciones, debido a que no presentaron diferencias significativas en los tres niveles estudiados anteriormente y as mismo, por las condiciones del proceso de recubrimiento mediante el lecho fluidizado. Se establecieron propiedades fsicas adicionales que nos permitieran relacionar la efectividad de los polmeros al ser empleados directamente en la planta, por lo cual se decidi evaluar los parmetros de hinchamiento, permeabilidad y formacin de pelcula (Tabla 5). Lo anterior, es relevante para analizar las condiciones de liberacin del principio activo en las matrices polimricas y correlacionar la eficiencia de su liberacin con la disposicin de la bacteria en condiciones del suelo.

Tabla 5. Caracterizacin de propiedades adicionales de los mejores polmeros seleccionados

Pelcula polimrica mtodo casting (mm) 0,004 0,02 0,002 0,01 0,003 0,02 Permeabilidad-WVT (g/m s) 0,0187 0,23 0,017 0,001 0,0198 0,15

Polmero

ndice de Hinchamiento-IH

HPMC Alginato Na 1 Alginato Na 2

1 0,08 0,2 0,04 0,6 0,01

* Se muestra la desviacin estndar para cada uno de los valores obtenidos de las variables medidas

Los resultados encontrados para la prueba de formacin de pelculas, evidencian la produccin de una pelcula polimrica mediante el mtodo de casting (Figura 5A); demostrando la capacidad de estos polmeros para integrar a su matriz diferentes principios activos de inters en las reas farmacuticas y aplicaciones biotecnolgicas de liberacin controlada (Perioli et al., 2004; Trivedy y Pandey, 2008). De esta manera, se infiere que los polmeros empleados bajo estas concentraciones manifestaron esta propiedad, por lo que posiblemente pudieran proteger al microorganismo y cederlo gradualmente bajo ciertas condiciones.

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Con respecto a los resultados de permeabilidad, se evidenci que todos los polmeros presentan algn grado de permeabilidad al vapor de agua (WVT). Sin embargo, las pelculas obtenidas con alginato (Figura 5B), presentan la mayor capacidad de permeacin, seguida de la pelcula de hidroxipropilmetilcelulosa. Los polmeros empleados permiten el transporte eficiente de vapor de agua a travs de su estructura (Perioli et al., 2004). Los valores obtenidos son similares a los resultados reportados para permeabilidad de membranas polimricas (Fulzele et al., 2002, Villalobos et al., 2006; Akgharia et al., 2006; Aungsupravate et al., 2008).

Figura 5. De izquierda a derecha. A. Formacin de pelculas polimricas, B. Permeabilidad de los polmeros e C. Hinchamiento de los polmeros

Por otra parte, se estableci el ndice de mxima cantidad de agua que los materiales polimricos estaran en capacidad de retener, antes de desintegrarse. Los resultados demuestran uniformidad en el proceso de hinchamiento durante el tiempo evaluado, informacin que se podra correlacionar en futuras formulaciones de liberacin controlada de los principios activos (Perioli et al., 2004). La observacin permiti evidenciar la rapidez con que las pelculas son capaces de hincharse (es decir, retener agua sin perder la forma original) encontrndose que en 4 minutos de exposicin, la pendiente de la curva de ganancia de peso disminuye significativamente, como se observa en la figura 5C. Adems, las pelculas tienden a alcanzar un mximo de agua retenida y saturarse, punto que no fue posible evidenciar en muchas de las pelculas debido a que durante el tiempo de la prueba perdieron su integridad, posiblemente por contar con un espesor menor. La capacidad de hinchamiento de una pelcula polimrica est condicionada por el equilibrio entre la accin de los grupos hidrfilos de la red (que estabilizan lquidos de bajo peso molecular en los poros de la estructura) y la fuerza elstica de sus enlaces que se opone al aumento de volumen. La hidroxipropilmetilcelulosa present el mayor efecto en la

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retencin de agua, posiblemente debido a que presenta mayores sustituyentes de carcter hidrfilos (Perioli et al., 2004); seguido de los alginatos, que posiblemente pueden ser atribuido a las caractersticas que tiene ste material de formar geles dbiles, con menor grado de entrecruzamiento y menor capacidad de retencin de agua (Lieberman, 1989). As mismo, estos materiales han sido extensamente empleados en el rea farmacutica para la liberacin controlada de frmacos mediante su habilidad de formar geles y permitir la cesin extendida por un periodo de tiempo (Andreopoulos y Tarantili, 2002; Ching et al., 2008)

4.4. Evaluacin en invernadero del efecto de los tres polmeros seleccionados sobre la actividad biolgica en frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp]

La inmovilizacin de microorganismos mediante la utilizacin de agentes polimricos ha sido ampliamente estudiado (Denardin y Freire, 2000; Fernandes Jnior et al., 2009), hasta el punto de convertirse en estrategia clave para la formulacin de inoculantes basados en este tipo de materiales y su implementacin en cultivos de inters comercial (Bashan et al., 2002). Es por esto, que autores como (Soares y Oliveira, 2001; Denardin y Freire, 2000), reportan una mayor contribucin de las propiedades que rigen los polmeros sin afectar la viabilidad de bacterias simbiticas, resaltando su mejor permanencia en el suelo y su contribucin en ptimos rendimientos en la planta, procesos de nodulacin y fijacin biolgica de nitrgeno. As mismo, al emplear polmeros se asegura mayor vida til de formulaciones basadas en microorganismos diazotrficos sin la prdida de las capacidades fisiolgicas de las bacterias (Deaker et al., 2004). Los resultados fueron obtenidos mediante el anlisis multivariado de componentes principales del efecto de los polmeros sobre la actividad biolgica en frjol cowpea (Figura 6). En total se tuvieron en cuenta 9 variables de respuesta (longitud de raz, longitud de parte area, nmero de ndulos, biomasa de los ndulos, fijacin biolgica de nitrgeno, peso fresco raz, peso fresco parte area, peso seco raz y peso seco parte area), por lo que se decidi reducir estadsticamente para tener un mejor anlisis del experimento y encontrar de una forma ms robusta, la simplificacin en el nmero de variables en un porcentaje representativo del total del ensayo.

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Figura 6. Respuesta biolgica del frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp], mediante la implementacin de polmeros con la cepa de Rhizobium sp., G58. A. Montaje en invernadero de los polmeros; B y C. Presencia de ndulos en las races de las plantas y D. Color rojizo del ndulo (indicador de efectivo)

De acuerdo a esto, el anlisis de componentes arroj que las tres primeras componentes explican un 89% de la variabilidad del experimento. Es decir, segn el anlisis e interpretacin de la informacin se observ que las variables que tenan una mayor influencia en los resultados obtenidos se presentaban bsicamente sobre el proceso de simbiosis entre la cepa de Rhizobium sp., G58 y la planta de frjol cowpea. De la variacin, el 48,8% pudo ser explicado por la primera componente principal (PC1), el 26,1% por la segunda componente (PC2) y 15,46% por la tercera componente principal (PC3). De aqu, la informacin contenida en las nueve variables de respuesta originales pudo ser resumida en tres, las cuales recolectaron la mayor informacin del ensayo (Tabla 6). El anlisis de carga factorial obtenido mediante el anlisis de componentes principalesACP, demuestra la influencia de cada una de las variables sobre las componentes

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principales. Este anlisis permiti correlacionar la primera componente principal (PC1) y definirla como: el establecimiento de la simbiosis entre la bacteria en estudio Rhizobium sp., G58 y la planta de frjol cowpea. As mismo, la segunda componente (PC2) se centr principalmente sobre el tamao de la planta. Mientras que, la tercera componente (PC3) se pudo correlacionar sobre el proceso de translocacin de nutrientes en la planta (Tabla 6).

Tabla 6. Anlisis de componentes principales-ACP del efecto de los polmeros sobre la actividad simbitica del Rhizobium sp. y la planta de frjol cowpea.

Componente Estadstica Eigenvalor % de la varianza % acumulativo Carga factorial Variables Long. Raz Long. PA N Ndulos ARA Biomasa Ndulos PF. Raz PF. Parte Area PS. Raz PS. Parte Area PC1 4,346 48,289 48,289 PC2 2,359 26,217 74,506 PC3 1,392 15,464 89,970

0,938 0,530 0,955 0,981 0,990 0,094 0,175 0,155 -0,518

-0,116 0,615 -0,137 -0,066 -0,038 0,935 -0,094 0,952 0,391

-0,122 0,419 -0,012 -0,041 0,052 -0,246 0,959 -0,135 0,446

Por lo tanto, se describi la contribucin de cada una de las componentes y su correlacin en el plano de componentes principales (Figura 7). Observando que cuando la componente principal 1 (PC1) se encuentra al lado positivo del eje indica un aumento en el establecimiento de la simbiosis entre la bacteria y la planta cuando fueron empleados los tratamientos con alginato e hidroxipropilmetilcelulosa-HPMC. Lo anterior puede ser atribuido a las aceleradas actividades metablicas que intervienen en el proceso de nodulacin, por lo que requiere la expresin de genes de la nodulacin especfica (nod), que conducen a la sntesis de un grupo de molculas de sealizacin que inducen la morfognesis de los ndulos y la acumulacin de nutrientes para dichos procesos (Panter et al., 2000). Para el caso, de (PC2) cuando los tratamientos se encuentran al lado negativo del eje indican una disminucin en el tamao de la planta. Y para el (PC3), cuando est en el lado positivo implica que en la especie vegetal hay una mayor translocacin de nutrientes hacia la parte area desde las races para su nutricin mineral. Es por esto, que cuando los rizobios fijan el nitrgeno de la atmsfera en las races mediante sus estructuras

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especializadas llamadas ndulos, se transfieren los asimilados hacia toda la planta para su crecimiento, siendo fuente de reserva para la acumulacin de nutrientes y su posterior transporte hacia el resto de la misma (Hirsch et al., 2001). De all se podra inferir que el tratamiento con el polmero alginato 1, pudo estimular la fijacin biolgica de nitrgeno (FBN) y consecuentemente, el transporte efectivo de asimilados hacia el resto de la planta, lo cual se ve reflejado en mayor contenido de biomasa seca y mayor tamao en la parte area; seguido de los tratamientos con HPMC y Alginato 2 respectivamente. En el experimento fue posible observar que hubo una correlacin positiva entre el nmero de ndulos y la actividad de reduccin de acetileno (P<0.05) (Tabla 7); lo cual puede ser atribuido posiblemente a un mayor tamao de los ndulos y coloracin interna, caracterstica que indica la efectividad en la fijacin biolgica de nitrgeno. Sin embargo, autores como Bcquer (2009) reportan que no existe una medida precisa que determine una mayor fijacin de nitrgeno con un mayor nmero de ndulos; debido a que en el suelo se pueden encontrar cepas de rizobios altamente efectivas que pueden formar pocos ndulos en las races de leguminosas presentando alta fijacin.

Tabla 7. Anlisis de correlacin entre las variables mediante componentes principales-ACP con los polmeros
Variables Long. Raz Long. PA N Ndulos ARA Biomasa Ndulos PF. Raz PF. P.Area PS. Raz PS. P.Area Long. Raz 1 0,345 0,909 0,924 0,905 0,014 0,051 0,045 -0,516 1 0,333 0,407 0,504 0,441 0,427 0,639 -0,032 1 0,992 0,966 0,014 0,146 -0,024 -0,409 1 0,986 0,072 0,125 0,067 -0,463 1 0,055 0,222 0,103 -0,479 1 -0,306 0,906 0,307 1 -0,159 0,228 1 0,126 1 Long. PA N Ndulos ARA Biomasa Ndulos PF. Raz PF. P.Area PS. Raz PS. P.Area

Con base en los resultados obtenidos a partir del anlisis de componentes principales, se pudo concluir que el tratamiento YM + alginato 1 es el que permite un mejor establecimiento de la simbiosis sin afectar el crecimiento de las plantas (Figura 7), de igual manera favorece la translocacin de nutrientes. Lo anterior pudo atribuirse a la estructura del alginato utilizado y su baja viscosidad (Zimmermann et al., 2007). En las figuras de las componentes se evidencia como las observaciones asociadas al tratamiento YM + alginato 1 se ubican en el cuadrante I del plano, lo que indica de acuerdo al anlisis de las cargas factoriales que presenta la mayor actividad biolgica. En el caso del YM + alginato 2, este

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permite una buena nodulacin; sin embargo, presenta un efecto negativo sobre el crecimiento de la planta, quiz esta respuesta se encuentre relacionada con su viscosidad; por lo que se puede inferir que interviene en la entrada de algunos minerales esenciales los cuales son necesarios para establecer ciertos procesos fisiolgicos, igualmente es evidente que puede interferir con la translocacin de algunos nutrientes lo que confirmara parcialmente la hiptesis propuesta (Figura 7). Cuando se utiliz el alginato 2, este tipo de polmero presenta un estructura ms rgida y una alta viscosidad (Zimmermann et al., 2007), por lo que pudo haber repercutido en una mejor respuesta. Estudios similares fueron obtenidos por Rawsthorne y Summerfield (1984) encontrando mejores resultados en fijacin de nitrgeno y mayor peso seco de los ndulos cuando se emple el alginato (agrigel) en comparacin con el tratamiento control. Para el caso del control absoluto, fue posible evidenciar una cantidad de biomasa considerable en las plantas de estudio sin el establecimiento de simbiosis lo cual sera indicativo de un aumento en tamao posiblemente como mecanismo de resistencia. Autores como Filho et al. (2006) sugieren que cuando las plantas se encuentran estresadas ya sea por una restriccin del recurso hdrico, estas pueden acelerar el crecimiento y madurez y reducir el periodo de acumulacin de reservas, de tal manera que no presentan un patrn normal de desarrollo y composicin qumica. Por otra parte, estudios similares han sido reportados por (Kohls et al., 1999) quienes demostraron una mejor respuesta en la nodulacin de la planta cuando emplearon polmeros retenedores de agua con cepas de Frankia sp., presentando diferencias significativas con los dems tratamientos.

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Figura 7. Anlisis de componentes principales de los tratamientos con polmeros. (A) Diagrama de dispersin del anlisis del experimento en invernadero con las componentes PC1 y PC2; (B) Diagrama de dispersin del anlisis del experimento en invernadero con las componentes PC1 y PC3; y (C) Diagrama de dispersin del anlisis del experimento en invernadero con las componentes PC2 y PC3. Tratamientos y relacin de smbolos: testigo absoluto (), medio YM (), YM + alginato 1 (), YM + alginato 2 (), YM + HPMC (). Cada smbolo es el promedio de tres mediciones.

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4.5. Evaluacin en invernadero del efecto de los prototipos de formulacin slidos sobre la actividad biolgica en frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp]

Por otra parte, se obtuvo el anlisis de componentes principales para los prototipos de formulacin slidos obtenidos mediante lecho fluido y su aplicacin en la planta (Figura 8) reduciendo el nmero de variables para una mejor interpretacin de los resultados obtenidos en invernadero.

Figura 8. Formulacin de prototipos slidos de biofertilizantes mediante lecho fluido y su respuesta biolgica en frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp]. A y B. Lecho fluidizado y pellets respectivamente. C. Viabilidad celular de la cepa G58 y D. Establecimiento de la nodulacin utilizando los prototipos en planta

Con respecto a los prototipos de formulacin slida, el anlisis multivariado obtenido explic un 84,5% de la variabilidad del experimento, que puede ser explicado mediante las tres

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componentes principales. De la variacin, el 40,67% pudo ser descrito por la primera componente principal (PC1), el 30% por la segunda componente (PC2) y el 13,77% por la tercera componente (PC3). De esta manera, el total del experimento fue reducido en tres factores principales (Tabla 8). El anlisis de carga factorial permiti correlacionar la primera componente principal (PC1) con la biomasa total de la planta de frjol cowpea. Para la segunda componente (PC2) implic evidentemente el mecanismo simbitico entre la bacteria en estudio Rhizobium sp., G58 y la planta. Y la tercera componente (PC3) demostr la correlacin sobre el proceso de translocacin de nutrientes en la planta (Tabla 8).

Tabla 8. Anlisis de componentes principales-ACP del efecto de los prototipos sobre la actividad simbitica del Rhizobium sp. y la planta de frjol cowpea.

Componente Estadstica Eigenvalor % de la varianza % acumulativo Carga factorial Variables Long. Raz Long. PA N Ndulos ARA Biomasa Ndulos PF. Raz PF. Parte Area PS. Raz PS. Parte Area PC1 3,661 40,679 40,679 PC2 2,704 30,049 70,728 PC3 1,240 13,772 84,500

0,405 0,550 0,358 0,593 0,360 0,777 0,642 0,937 0,832

-0,408 0,274 0,895 0,645 0,847 -0,451 -0,510 -0,176 -0,182

0,728 0,672 -0,014 -0,291 0,075 -0,358 -0,112 -0,163 -0,014

De acuerdo a los resultados obtenidos se pudo observar que el tratamiento con el alginato 1 nuevamente arroj los mejores resultados en cuanto al proceso de simbiosis y al proceso de transporte de nutrientes a la planta, lo anterior se determin en la figura de las componentes, presentando un comportamiento positivo sobre el eje del plano (Figura 9). Lo anterior pudo ser explicado, debido a un mayor desarrollo radical de la planta la cual fue estimulada posiblemente por la liberacin controlada del microorganismo en la formulacin slida, permitiendo la extraccin de mejor cantidad de nutrientes que pudieron ser translocados a las plantas para su metabolismo y nutricin (Faiguenbaum, 2003). Sin embargo, en cuanto a la biomasa de la planta, el tratamiento con alginato 1 no present ningn aporte, manifestando su participacin en la parte central izquierda (negativa) del

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plano. Por el contrario, en el tratamiento con el testigo absoluto no se present el establecimiento de la simbiosis; mientras que hubo una correlacin entre la biomasa de la planta y la translocacin de nutrientes. Este comportamiento obtenido nuevamente en el segundo ensayo pudo haberse presentado, a la condicin de estrs en que se encontraba la planta, por lo cual mostr una respuesta diferente, lo anterior ha sido referenciado por autores como (Bray, 2004; Blum, 2005) quienes afirman que la planta puede establecer algunas adaptaciones en respuesta a la deshidratacin, lo que provoca cambios en la expresin de protenas y su metabolismo en condiciones de dficit de agua. Ahora con respecto a los tratamientos de la bacteria en YM lquido, y en el prototipo slido sin polmero se observ baja nodulacin y bajo aporte en biomasa de la planta en comparacin con los dems tratamientos, destacndose la necesidad de utilizar soportes del tipo polimrico que puedan contribuir a un mejor sostenimiento de la bacteria sin afectar su actividad biolgica (Deaker et al., 2004). Por su parte, el tratamiento con HPMC, es nuevamente evidente el efecto que presenta sobre el proceso de translocacin de nutrientes (Figura 9). Cabe mencionar que el polmero hidroxipropilmetilcelulosaHPMC, es un polmero sinttico utilizado en la industria farmacutica para la liberacin controlada de frmacos en el tiempo gracias a su matriz hidroflica (Lee et al., 1999). Lo anterior, puede estar asociado muy posiblemente a un efecto indirecto sobre la translocacin de nutrientes desde la raz hacia la parte area de la planta, debido a su estructura, componentes adicionales propiedades reolgicas. Adems, este polmero fue el que present un mayor ndice de hinchamiento por lo que posiblemente pudo influir sobre el transporte de minerales en la planta y por ende la respuesta presentada. Sin embargo, su gran aporte se realiz en el establecimiento de la simbiosis y biomasa en la planta al presentar excelente nodulacin; por lo que es recomendable realizar una evaluacin en campo con el fin de establecer si realmente hay un efecto del polmero sobre dicho proceso se pudieron presentar otros factores externos que incidieron en el proceso de translocacin de nutrientes en la planta. Es de suma importancia resaltar que debido a que las plantas no haban llegado a su etapa final de floracin, muy posiblemente se present un desbalance nutricional en cuanto a la translocacin de nutrientes en el experimento utilizando los prototipos slidos, lo que se evidencia de forma general en los resultados aqu expuestos. Adems, se pudo presentar un efecto de factores ambientales, debido principalmente a que el cultivo de frjol cowpea se establece en climas tropicales y las condiciones climticas del pas por la ola invernal (temperatura, luz y humedad), no fueron las ms adecuadas a pesar de haberse realizado bajo invernadero; habiendo influido de modo indirecto y en

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consecuencia incidir en sus procesos metablicos como la respiracin, transporte y nodulacin (Prez y Torralba, 1997).

Figura 9. Anlisis de componentes principales de los tratamientos con prototipos. (A) Diagrama de dispersin del anlisis del experimento en invernadero con las componentes PC1 y PC2; (B) Diagrama de dispersin del anlisis del experimento en invernadero con las componentes PC1 y PC3. (C) Diagrama de dispersin del anlisis del experimento en invernaderos con las componentes

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PC2 y PC3. Tratamientos y relacin de smbolos: testigo absoluto (), medio YM lquido (), medio YM slido (), YM + HPMC (), YM + alginato 1 (), YM + alginato 2 ().Cada smbolo es el promedio de tres mediciones.

4.6. Evaluacin de diferentes propiedades de los prototipos

4.6.1 Evaluacin de las actividades de promocin de crecimiento en los prototipos de formulacin

Se determin las actividades de crecimiento de la cepa Rhizobium sp., G58 en los prototipos formulados con el fin de establecer los posibles cambios efectuados mediante la utilizacin de forma slida de los prototipos de formulacin. Los resultados obtenidos permitieron evidenciar que en la actividad de reduccin de acetileno (ARA) no se presentaron diferencias estadsticamente significativas entre los prototipos 2 y 3 utilizando los polmeros de alginato con respecto al testigo. Sin embargo, el prototipo 1 de HPMC, mostr diferencias apreciables en cuanto a la fijacin biolgica de nitrgeno en comparacin con todos los tratamientos especialmente con el control (Tabla 9). Es importante resaltar que no se observ ningn efecto sobre la actividad de fijacin biolgica de nitrgeno cuando la cepa de Rhizobium sp., G58 fue colocada bajo una formulacin slida, demostrando que esta capacidad biolgica no es alterada. Por lo tanto, se podra pensar que la formulacin slida es capaz de liberar el principio activo (bacteria) para el desarrollo del proceso de nodulacin en la planta. Autores como Mary et al. (1993) reportaron resultados similares a los obtenidos en este estudio, demostrando que el proceso de secado por aspersin mediante el lecho fluido no induce cambios en la habilidad de la cepa de Bradyrhizobium japonicum para la formacin de ndulos y la fijacin de nitrgeno.

En el caso, de las dos variables de produccin de compuestos indlicos (AIA) y porcentaje de humedad, estas no mostraron cambios significativos en todos los tratamientos evaluados. En contraste, estudios realizados por (Trivedy y Pandey, 2008) demostraron que dentro de las rizobacterias promotoras de crecimiento, las Pseudomonas no presentaron efectos en la capacidad de produccin de hormonas auxnicas de tipo indlico, as como la produccin de siderforos durante tres aos de almacenamiento empleando polmeros como el alginato.

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Adems, cuando se evalu la capacidad de produccin de fsforo (P) de los tres prototipos de formulacin slidos, los resultados sealan que esta actividad biolgica no fue afectada despus del proceso de secado por aspersin. Lo anterior es muy representativo, debido a que algunas bacterias del gnero Rhizobium sp., contribuyen a mejores resultados cuando la capacidad de solubilizacin de fsforo se encuentra presente, es decir, manifiesta mejores rendimientos tanto en la movilizacin de fsforo como de diferentes minerales esenciales en la planta en comparacin si esta actividad est ausente (Abril et al., 2003; Young et al., 2006).
Tabla 9. Evaluacin de las capacidades de promocin de crecimiento en los prototipos de formulacin slidos

Caractersticas Prototipos Control Prototipos Prototipo 1 HPMC Prototipo 2 Alg Na 1 Prototipo 3 Alg Na 2 ARA (nmol C2H4 /planta h ) c* 978,49 1647,33 b 1211,13 b 1201,26
a -1

AIA (g/ml) 19,86 0,06 a 20,71 0,05 a 22,39 0,31 a 20,24 0,01
a

P (g PO4/ml) 238,26 0,09 ab 289,17 0,06 ab 287,13 0,11 a 309,79 0,42

b

%Humedad 2,07 0,56 a 2,25 0,44 a 2,36 0,21 a 2,20 0,13

a

*Cada valor representa la media de tres rplicas. Diferente letra representa diferencias estadsticas significativas mediante el test de Tukey HSD (P < 0,05). El signo muestra la desviacin estndar.

La implementacin y aplicacin de bacterias promotoras de crecimiento mediante el proceso de encapsulacin brinda grandes ventajas sobre el establecimiento de los

microorganismos, permitiendo su proteccin mediante la inmovilizacin en las matrices polimricas y a su vez mejorando la inoculacin en el suelo (Cassidy et al., 1996). Por esta razn, se reduce la competicin microbiana, liberando gradualmente los microorganismos encapsulados con el propsito de implantar una mejor colonizacin de las races en las plantas bajo condiciones desfavorables (Bashan et al., 2002; Vassilev et al., 2001).

4.6.2 Perfiles de liberacin y degradacin de los prototipos bajo condiciones controladas

Se realizaron los perfiles de liberacin del activo en los prototipos de formulacin slidos durante 5 das. Se presentaron diferencias significativas entre el prototipo control (bacteria adherida a los pellets de azcar) y los tratamientos empleando HPMC (prototipo 1) y

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alginato 2 (prototipo 3). Los resultados obtenidos muestran una mayor liberacin del prototipo control y el alginato 1 (prototipo 2) en el tiempo (Figura 10A).

De acuerdo a esto, es posible inferir que existe una correlacin entre el ndice de liberacin de la bacteria con el porcentaje de degradacin de los pellets para tener disponible el microorganismo en el suelo. Trabajos similares han sido reportados por Bashan et al. (2002) donde demostraron la degradacin de las microesferas basadas en alginato de sodio y leche descremada durante 15 das; mostrando un mejor comportamiento en el desarrollo de la planta cuando se inmoviliz bajo este tipo de formulacin. En contraste, se observ una disminucin de la viabilidad del microorganismo durante el tiempo cuando se fueron degradando las microesferas.

Una vez analizada la viabilidad de la bacteria en condiciones semejantes a las del suelo, se realiz un perfil de degradacin de los prototipos evidenciando un 80% de degradacin del prototipo control, seguido de los prototipos con polmeros con un porcentaje del 60%, evidenciando diferencias significativas en el proceso de degradacin de los pellets durante los 5 das de evaluacin (Figura 10B).

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Figura 10.

A. Liberacin del principio activo (cepa Rhizobium sp., G58) y B. Porcentaje de

degradacin de los prototipos de formulacin, durante 5 das de evaluacin. Cada valor muestra la
media de tres rplicas. Diferente letra representa diferencias estadsticas significativas mediante el test de Tukey HSD (P < 0,05). Las barras de error representan la desviacin estndar.

De forma general, se evidenci una degradacin ms lenta de los prototipos empleando polmeros, lo cual es provocado por la utilizacin de este tipo de materiales que contribuyen a la liberacin ms controlada gracias a sus matrices polimricas y propiedades reolgicas que los conforman (Bashan, 1999; Cassidy et al., 1996; Trivedy y Pandey, 2008).

4.6.3 Microscopa electrnica de barrido-SEM y de transmisin-TEM

Adicional a esto, se le realiz observaciones mediante microscopa electrnica de barrido (SEM) y de transmisin (TEM) al prototipo alginato 1, el cual present mejores resultados en actividad biolgica entre la simbiosis rizobio-planta. Lo anterior se realiz con el objetivo de identificar la presencia de la cepa de Rhizobium sp., G58 en la superficie de los pellets bajo las formulaciones slidas, empleando polmeros. Varios estudios han sido reportados hacia la utilizacin de microscopias de alta gama en microorganismos diazotrficos (Berg et al., 1979; Kabir et al., 1995; Bianucci et al., 2011) para la visualizacin de estructuras representativas.

Los resultados obtenidos mediante microscopa electrnica de barrido permitieron establecer la permanencia de la bacteria en la superficie de los pellets que presentaban la incorporacin de los polmeros mediante la tcnica de recubrimiento en lecho fluidizado (Figura 11A y B), demostrando la capacidad de resistencia de la bacteria sometida al estrs de temperatura y del establecimiento de la bacteria mediante el recubrimiento realizado con el polmero de alginato de sodio. Estudios relacionados han sido reportados por Boza et al. (2004) donde evidenciaron la viabilidad de Beijerinckia sp. y su permanencia cuando fue utilizado el proceso de secado por atomizacin, presentndose una adherencia del microorganismo en la superficie de las micropartculas. En contraste, trabajos similares han sido obtenidos por Young et al. (2006) donde demuestran la inmovilizacin de Bacillus subtilis sobre la superficie de microesferas de alginato de baja viscosidad (500 m Pas) mediante microscopia electrnica de barrido, lo cual evidencia que el microorganismo se integra dentro de las matrices polimricas inducidos debido al fenmeno de intercambio inico.

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Por esta razn, es de gran relevancia implementar tcnicas de microscopa que permitan establecer la participacin de los materiales polimricos con ingredientes activos de inters biolgico, como es el caso de microorganismos fijadores de nitrgeno y su contribucin en la generacin de alternativas de desarrollo que permitan la inmovilizacin de bacterias para su proteccin a condiciones ambientales adversas.

De la misma forma autores como Puente et al. (1999) han empleado microscopa electrnica de barrido con el fin de identificar Azospirillum halopraeferans y Azospirillum brasilense en la superficies de las races de plantas y de esta manera determinar su contribucin al proceso de colonizacin de las races mediante la formacin de microfibrillas. A B

PHB PC MC AC PF

0,5 m

1,2 m

Figura 11. A y B. Microfotografa electrnica de barrido (R) Rhizobium sp. G58 superficie del pellets; C y D. Microfotografa electrnica de transmisin de la cepa de Rhizobium sp., G58. Abreviaciones: Cuerpo de inclusin de PHB: Poli--hidroxibutirato, PC: Pared celular, MC: Membrana celular, AC: cidocalcisomas, PF: Grnulos de polifosfato. C magnificacin 20000 X, escala de barras representa 0,5 m. D magnificacin 10000 X, escala de barras representa 1,2 m.

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De igual forma, los resultados obtenidos mediante microscopa electrnica de transmisin, reafirman la presencia de estructuras especializadas en el interior de la clula de Rhizobium sp. G58 (Figura 11C y D). Lo anterior es muy representativo, debido a que se puede argumentar que la bacteria se encuentra presente en los pellets recubiertos con los polmeros, presentando caractersticas propias del gnero Rhizobium sp., como es la formacin de cuerpos de inclusin que corresponderan a grnulos de polihidroxibutirato (Dazzo et al., 1984; Cevallos et al., 1996; Yang y Lin, 1998; Prell y Poole, 2006). De manera que la produccin de este tipo de compuestos de forma intracelular se estara formando principalmente cuando la bacteria se encuentra estresada debido a diferentes condiciones ambientales severas (Stainer et al., 1992; Zevenhuizen, 1981). Tal es el caso, de limitaciones fuertes por algn nutriente, exceso de fuentes carbonadas, por lo que la bacteria induce la formacin de PHB como fuente de reserva de carbono y energa (Reddy et al., 2003; Khanna y Srivastava, 2006). El anterior resultado, se pudo haber presentado en el proceso de recubrimiento, muy posiblemente a las condiciones del equipo que permitieron que la bacteria presentara algn estrs evidenciando cambios en su morfologa bajo este tipo de formulacin.

Por otra parte, el tamao observado de la cepa de Rhzobium sp. G58, mediante microscopa de transmisin es similar a lo reportado por autores como (Kuykendall et al., 2005). As mismo, se observ grnulos metacromticos de polifosfato (Figura C) que son polmeros lineales que actan como depsitos de almacenamiento de fsforo y energa para la formacin de ATP; dando una ventaja competitiva sobre otros microorganismos que no son capaces de acumular reservas internas (Serafim et al., 2002).

Adems, se visualiz orgnulos electro-densos de acidocalcisomas ricos en calcio y fosfato (Figura C) presentes en la bacteria G58, lo anterior se encuentra implicado en el almacenamiento de fsforo y de diversos iones metlicos, el metabolismo del polifosfato, el mantenimiento de pH intracelular, osmorregulacin y la homeostasis del calcio (Docampo et al. 2005; Seufferheld et al., 2011).

De igual manera, en estudios realizados por Bianucci et al. (2011), establecieron mediante microscopa electrnica de transmisin la acumulacin de cadmio intracelular por parte de Bradyrhizobium sp. provocando alteraciones morfolgicas, por lo cual la acumulacin de cadmio pudo ser reducida como respuesta al sistema primario de defensa del microorganismo.

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Conclusiones
La aplicacin de polmeros en formulaciones de inoculantes reviste de gran importancia actualmente como estrategia de innovacin tecnolgica encaminada hacia el mantenimiento de los microorganismos y su estabilidad metablica. Es por esto, que los resultados obtenidos en la investigacin permitieron establecer que los polmeros de alginato de sodio e hidroxipropilmetilcelulosa fueron los que presentaron una mejor respuesta sobre la viabilidad de la cepa de Rhizobium sp., sin efecto sobre las capacidades fisiolgicas de la bacteria. De igual manera, se determin la influencia de los polmeros sobre la actividad simbitica evidenciando que bajo condiciones de invernadero los resultados satisfacen las expectativas sobre el ptimo establecimiento de la simbiosis entre la bacteria y la planta de frjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] contribuyendo efectivamente en el proceso de nodulacin sin ningn efecto observado. En contraste, fue interesante observar que cuando se aplicaron las formulaciones slidas mediante el lecho fluidizado, fue evidente un mayor efecto sobre el desarrollo de la planta y establecimiento de la simbiosis con la formacin de ndulos de mejores condiciones. De aqu, se concluye que la implementacin de una formulacin slida logr una mejor liberacin de la bacteria de forma prolongada en el tiempo, permitiendo que se llevara a cabo el proceso de nodulacin de forma efectiva. En resumen, se comprob que las formulaciones empleando polmeros como vehculos son una de las opciones ms tangibles para la inmovilizacin de microorganismos benficos con miras a suplir las deficiencias de nitrgeno en los cultivos de leguminosas.

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Recomendaciones
Es indispensable utilizar tcnicas moleculares ms robustas prmers ms especficos que permitan identificar en mayor grado la especie bacteriana utilizada.

Se sugiere evaluar la actividad de la leghemoglobina con el objetivo de demostrar la efectividad de los ndulos y su capacidad de indicar que se est fijando activamente el nitrgeno por accin de la enzima nitrogenasa.

Determinar bajo condiciones de campo la capacidad de asociacin y efectividad de la cepa de Rhizobium sp. G58 en formulaciones con soportes polimricos y el aporte en cuanto a rendimientos de protena en grano.

Potencializar las capacidades fisiolgicas de la cepa de Rhizobium sp., G58 para su utilizacin en formulaciones con aditivos polimricos.

Marcar molecularmente la cepa de Rhizobium sp. G58 mediante la introduccin de genes reporteros gfp, que permitan determinar con exactitud que el proceso de nodulacin es mediado por la bacteria proveniente del prototipo de biofertilizante formulado.

Se sugiere realizar los estudios respectivo para el escalamiento del proceso, junto con el anlisis de costos involucrado.

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