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MANUAL DE LABORATORIO DE BACTERIOLOGA I

AUTORES:
M.C. REYNA DEL CONSUELO ALMIRAY PINZN
M.C. GLORIA LEN TELLO
M.C. ALMA LPEZ GARCA
M.C. MARA SUSANA PERZ FERNNDEZ
M.C. PATRICIA GUADALUPE SUREZ ALBORES
D.C. FAUSTO TEJEDA TRUJILLO
M.S.P. CLAUDY LORENA VILLAGRN PADILLA
BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
2

NDICE





NMERO DE
PRCTICA
TTULO PGINA

Prctica 1

Aplicacin de los criterios de Cowan y Steel para
la identificacin de bacterias
3
Prctica 2

Caracterizacin de bacterias no fermentadoras 8
Prctica 3

Caracterizacin del gnero Pseudomonas

13
Prctica 4

Caracterizacin del gnero Haemophilus 15
Prctica 5 Caracterizacin del gnero Brucella 17

Prctica 6 Caracterizacin de bacterias de los gneros
Neisseria y Moraxella

19
Prctica 7

Caracterizacin de enterobacterias: lactosa
positivas

21
Prctica 8

Caracterizacin de enterobacterias: lactosa
negativas

25
Prctica 9

Caracterizacin del gnero Vibrio

28
Prctica 10 Caracterizacin de bacterias de los gneros
Streptococcus y Enterococcus

30
Prctica 11

Caracterizacin de bacterias del gnero
Staphylococcus
33

Prctica 12

Caracterizacin de bacilos Grampositivos: Bacillus 36
Bibliografa 38
3

PRACTICA No.1
APLICACIN DE LOS CRITERIOS DE COWAN Y STEEL PARA LA
IDENTIFICACIN DE BACTERIAS

Introduccin
La identificacin de una bacteria es la asignacin a un taxn segn una clasificacin dada y
consiste en la determinacin de las caractersticas fenotpicas y/o genotpicas y la comparacin de
estas caractersticas con los diferentes taxones de la clasificacin considerada. Las caractersticas
a determinar y su nmero depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en
la identificacin.

Cowan y Steel establecen un grupo de pruebas, denominadas pruebas primarias, con las
cuales se puede determinar el gnero, grupo de gneros o en algn caso, familia a la que
pertenece un aislamiento. Dichas pruebas son:

1.- Tincin de Gram.
2.- Tincin de Shaeffer-Fulton (slo en caso de tener bacilos Grampositivos (BGP)).
3.- Tincin de Ziehl-Neelsen (slo en caso de tener bacilos BGP).
4.- Metabolismo (Oxidativo/Fermentativo/Inerte).
5.- Produccin de catalasa.
6.- Produccin de oxidasa.
7.- Movilidad.
8.- Crecimiento de aerobios.
9.- Crecimiento de anaerobiosis.
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4
10.- Produccin de cido a partir de glucosa.

Tambin se pueden incluir pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie.
Estas dependern del gnero o familia determinado. (ejem. produccin de pigmentos, produccin
de indol a partir de triptfano, produccin de coagulasa, de fenilalanina desaminasa, etc.)

Objetivo
Realizar tomando como base los criterios establecidos por Cowan y Steel, las pruebas
bioqumicas fundamentales, que permiten la identificacin presuntiva de las bacterias de inters
mdico.

Material
Equipos de tincin de Gram Tubos con O/F con glucosa
Sensidiscos de oxidasa Placas con agar nutritivo o soya tripticasa
Reactivo para catalasa
Portaobjetos
Benzal
Algodn
Cepas de bacilos gramnegativos fermentadores y no fermentadores

Metodologa
Tomar una cepa problema a la cual se le realizar lo siguiente:
1. Inocular por estra cruzada una placa de agar nutritivo, incubar a 37C durante 24 h.
2. De una colonia aislada realizar la tincin de Gram (ver figura 1)
Hacer un frote de las colonias caracterizadas, tomando con el asa bacteriolgica una
pequea muestra de una colonia aislada y mezclarla con una gota de agua sobre un
portaobjetos. Extender esta suspensin y dejar secar.
Fijar el frote por calor deslizando el portaobjetos sobre la flama del mechero.
Cubrir el frote con cristal violeta y dejarlo actuar por un minuto. Escurrir el colorante
y lavar con chorro suave de agua corriente.
Cubrir el frote con lugol, dejarlo actuar por un min. Escurrir y lavar.
5
Decolorar el frote con alcohol-acetona, de 5-30 seg. Escurrir y lavar.
Cubrir el frote con safranina y dejarlo actuar por 30 seg. Escurrir y lavar.
Dejar secar al aire.
Observar el frote con objetivo de inmersin.
Determinar la morfologa microscpica y la respuesta a la Tincin de Gram de cada
cepa empleada.

Figura 1.Esquema y fundamento de tincin de gram
3. De una colonia aislada hacer la tincin de Shaeffer-Fulton (slo en caso de tener BGP)
(ver Figura 2).
Hacer un frote de las colonias caracterizadas, tomando con el asa bacteriolgica una
pequea muestra de una colonia aislada y mezclarla con una gota de agua sobre un
portaobjetos. Extender esta suspensin y dejar secar.
Fijar el frote por calor deslizando el portaobjetos sobre la flama del mechero.
Cubrir el frote con verde de malaquita a emisin de vapores y dejarlo actuar por un
minuto. Escurrir el colorante y lavar con chorro suave de agua corriente.
Cubrir el frote con safranina, como colorante de contraste dejarlo actuar por 1 min.
Escurrir y lavar.
Observar el frote con objetivo de inmersin y dibjala
6

Figura 2.Esquema y fundamento de tincin de Shaeffer y Fulton

4. De una colonia aislada realizar la tincin de Ziehl-Neelsen (slo en caso de tener BGP)
(ver Figura 3).
Hacer un frote de las colonias caracterizadas, tomando con el asa bacteriolgica una
pequea muestra de una colonia aislada y mezclarla con una gota de agua sobre un
portaobjetos. Extender esta suspensin y dejar secar.
Fijar el frote por calor deslizando el portaobjetos sobre la flama del mechero.
Cubrir el frote con fucsina fenicada a emisin de vapores durante 5 min. Escurrir el
colorante y lavar con chorro suave de agua corriente, no permitir que se seque el
colorante
Decolorar con alcohol-cido durante 7 min. Enjuagar con agua el portaobjetos y
quitar el exceso.
Aplicar azul de metileno durante 1 min, volver a enjuagar con un leve chorro de agua
e inclinar el portaobjetos hasta drenar el exceso de agua y secar al aire.
Colocar una pequea gota de aceite de inmersin y observar al microscopio con 100x


7

Figura 3.Esquema y fundamento de tincin de Gram
5. Inocular por picadura el medio O/F e incubar a 37C por 24 h (ver figura 4)


Figura 4. Metabolismo bacteriano en medio O/F
6. Inocular por picadura el medio MIO e incubar a 37C por 24 h, si se observa turbidez en
el tubo ser movilidad positiva y movilidad negativa cuando crece nicamente en la estra
7. Inocular por picadura una base de CTA con un carbohidrato e incubar a 37C por 24 h, si
se observa vire a color amarillo ser positivo a formacin de cido a partir de glucosa.
8. Del crecimiento en placa realizar las pruebas de oxidasa y catalasa.
9. Comparar los resultados en la tabla 1 e identificar familia o gnero.





8
Tabla 1. Identificacin de bacterias hetertrofas segn Cowan y Steel

Tincin de Gram
(cultivo fresco)
+ + + + + + + +
Forma coco Coco coco coco bastn bastn bastn bastn bastn bastn bastn bastn coco
Agrupacin racimos Racimos cadenas tetradas pares
Crecimiento
aerobio
+ + + + + + + + + + + +
Crecimiento
anaerobio
+ + + + + + + +
Esporas + + +
Movilidad + o + o + o + o + o + o - +
Catalasa + + + + + + + + +
Oxidase + + + +
Fermentacin de
glucosa a acido
o a acido+gas
+ + + + + (o ) + + +
O/F O F F O
Micrococcus X
Staphylococcus X
Streptococcus X
Lactococcus X
Enterococcus X
Leuconostoc X
Pediococcus X X
Aerococcus X
Lactobacillus X
Clostridium X
Bacillus X X
Alcaligenes X
Pseudomonas X
Enterobacterias X
Aeromonas X
Chromobacterium X
Neisseria X
Fuente: 3

Cuestionario:
1. Cul es la importancia de los criterios de Cowan y Steel?
2. Para qu sirve la tincin de Ziehl-Neelsen y cul es su fundamento?
3. Cul es el fundamento de la prueba de oxidasa y de catalasa y cmo se realiza en el
laboratorio?
9
4. En qu medios se puede realizar la prueba de movilidad y cmo se interpreta?
5. D cada uno de los criterios de Cowan y Steel efectuados a la cepa de estudio durante la
prctica, realiza dibujos y menciona tus resultados.
























10

PRACTICA No. 2
CARACTERIZACIN DE BACTERIAS NO FERMENTADORAS

Introduccin
Este grupo abarca microorganismos aerobios, no esporulados, que no utilizan a los carbohidratos
como fuente de energa o los utilizan a travs de vas metablicas diferentes a la fermentacin.

La importancia de estas bacterias radica fundamentalmente en su capacidad para infectar
hospederos inmunocomprometidos, por lo que cobran especial inters a nivel intrahospitalario,
donde adems es comn la presencia de cepas con marcadas caractersticas de resistencia a los
antimicrobianos de uso convencional. Dentro de este grupo se encuentran los siguientes gneros:
Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Alcaligenes, Flavobacterium, Agrobacterium, entre
otros.

Algunos de los indicios tempranos para detectar a un microorganismo no fermentador
seran los siguientes:

1. Falta de evidencias de fermentacin de la glucosa.
2. Positiva la prueba de oxidasa.
3. Carencia de crecimiento en el agar de Mac Conkey.

En la rutina bacteriolgica es necesario rapidez y bajo costo en la identificacin de este
grupo de bacterias, por lo que se sugiere se siga el esquema de King-Weaver para su
identificacin, el cual se basa en 4 pruebas (ver tabla 2):

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1. Utilizacin de glucosa (fermentador (F), oxidador (O) o no sacaroltico (NS)).
2. Capacidad de crecer en Mac Conkey.
3. Produccin de citocromo oxidasa.
4. Movilidad.

Tabla 2. Caractersticas de algunos gneros gramnegativos no fermentadores
GNERO METABOLISMO MOVILIDAD OXIDASA
CREC
MAC
CONKEY
OTRAS
CARACTERSTICAS
Pseudomonas O
+
flagelos polares

+ +
Desnitrifican nitratos
a N
2

Acinetobacter O NS

-

- + Parecen diplococos
Flavobacterium O
V
algunos
presentan
flagelos
pertricos
+
Escaso o
negativo
Requieren complejo B
Bordetella O V +
Escaso o
negativo
Requiere factores de
crecimiento
Moraxella O NS - +
Escaso o
negativo
Cocobacilar, difcil de
crecer.
Stenotrophomonas O
+
un solo flagelo
- +
Prueba de DNasa +
Produccin de cido a
partir de O/F con
maltosa
Alcaligenes O NS
+
flagelos
pertricos
+ - Aerobio estricto
Fuente: 3

Objetivo
Comprobar por medio de anlisis de laboratorio, el comportamiento caracterstico de cepas
bacterianas no fermentadoras de carbohidratos.

Material
Equipos de tincin de Gram Tubos con O/F con glucosa
Sensidiscos de oxidasa Placas con agar sangre de carnero
Reactivo para catalasa Placas con agar Mac Conkey
Portaobjetos Tubos con Medio MIO
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Benzal
Algodn
Caldos con BGNnF

Metodologa
1.- Sembrar por estra cruzada los medios en placa, procurando perforar el medio en la parte del
estriado masivo, en el caso del agar sangre carnero.
2.- Sembrar por picadura los medios O/F y MIO.
3.- Incubar 24 h a 37 C.
4.- Leer morfologa colonial.
5.- Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa y tincin de Gram.
6.- Leer pruebas bioqumicas.

Cuestionario:
1. Por qu es importante identificar a los BGNnF y qu gneros conforman dicho grupo?
2. Cules son las pruebas claves para sospechar de un BGNnF?
3. Mencione un esquema diferente al de King-Weaver para identificar a los BGNnF
4. De los BGNnF que gneros dan la prueba de oxidasa negativa, quines movilidad
negativa y quines son capaces de crecer en Mac Conkey?
5. De la cepa problema responde lo siguiente con ayuda de dibujos:
a) Morfologa colonial
b) Tincin de Gram
c) Pruebas de catalasa y oxidasa
d) Pruebas bioqumicas
e) Establecer si la cepa pertenece al grupo de BGNnF

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PRCTICA No.3
CARACTERIZACIN DEL GNERO Pseudomonas

Introduccin
Este gnero se encuentra ubicado dentro del grupo de BGNnF y ocupa dentro de stos, el primer
lugar como agente causal de infecciones intrahospitalarias, resaltando la capacidad de resistencia
presente en algunas cepas a desinfectantes elaborados a partir de sales cuaternarias de amonio.
De las especies que integran este gnero destacan: Pseudomonas aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps.
alcaligenes, Burkholderia cepacia (anteriormente llamada Pseudomonas cepacia). Siendo en el
ambiente clnico P. aeruginosa la especie aislada con mayor frecuencia (ver tabla 3).

Tabla 3. Caractersticas importantes del grupo fluorescente







Objetivo
Demostrar las particularidades bioqumicas y de cultivo del gnero Pseudomonas.

Material
Equipos de tincin de Gram Tubos con O/F con glucosa
Sensidiscos de oxidasa Placas con agar sangre de carnero
Prueba Pseudomonas
aeruginosa
Pseudomonas
fluorescens
Pseudomonas
putida
Piocianina + - -
Pioverdina + + +
Reduccin de nitratos V (74 %) V (19 %) -
Desarrollo a 42 C + - -
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Reactivo para catalasa Placas con agar Mac Conkey
Portaobjetos Tubos con agar MIO
Benzal Tubos con agar Sellers
Algodn
Cepas con diferentes especies de Pseudomonas

Metodologa
1. Sembrar por estra cruzada los medios en placa, procurando perforar el medio en la parte
del estriado masivo, en el caso del agar sangre carnero.
2. Sembrar por picadura los medios O/F y MIO.
3. Sembrar por picadura y estra el medio Sellers.
4. Incubar 24 h a 37 C.
5. Leer morfologa colonial.
6. Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa y tincin de
Gram.
7. Leer pruebas bioqumicas e identificar especie utilizando la tabla 3.

Cuestionario
1. Cul es la importancia del gnero Pseudomonas?
2. Qu pruebas de laboratorio permiten diferenciar una enterobacteria del gnero
Pseudomonas?
3. Para qu es til el medio O/F y cul es su fundamento?
4. Por qu es importante utilizar el medio Sellers, en la identificacin de Pseudomonas?
5. Qu pruebas de laboratorio son tiles para diferenciar especies de Pseudomonas?







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PRCTICA No. 4
CARACTERIZACIN DE BACTERIAS DEL GNERO Haemophilus

Introduccin
Los miembros del gnero Haemophilus son bacilos gramnegativos pequeos, inmviles, que
requieren de factores de crecimiento presentes en la sangre como el factor X, que es un grupo de
compuestos tetrapirrlicos termoestables, como la hemina. Mientras que el factor V, es el
dinucletido de nicotinamida adenina (NAD). Estos dos factores estn contenidos en los
eritrocitos, por lo tanto el agar chocolate es un buen medio de cultivo para la recuperacin de
Haemophilus. Las especies de Haemophilus humanos, estn vinculadas en su mayora con
infecciones del tracto respiratorio superior a excepcin de H. ducreyi que es un patgeno de
tracto genital.

Objetivo
Identificar el gnero Haemophilus
Material
Equipos de tincin de Gram Placas de agar chocolate
Sensidiscos de oxidasa Placas con agar soya tripticasa
Reactivo para catalasa Sensidiscos con factores V y X
Portaobjetos Benzal
Algodn Cepas de Haemophilus spp
Placas con agar sangre de carnero
Tubos con medio urea
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Metodologa
1. Sembrar por estra cruzada una placa de agar chocolate.
2. Incubar 48-72 h a 37 C.
3. Leer morfologa colonial.
4. Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa y tincin de
Gram.
5. Realizar pruebas de identificacin de especie en agar soya tripticasa con sensidiscos
impregnados de los factores V y X.

Cuestionario:
1. Cul es la importancia clnica de Haemophilus?
2. Existe algn agar comercial para el aislamiento de Haemophilus?
3. Menciona la(s) especies de Haemophilus que requieran el factor V, la(s) que requiera el
factor X y la(s) que requiera ambos factores.
4. Cmo definen Cowan y Steel a ste gnero?
5. Existe otras pruebas en la actualidad ms rpidas que el cultivo convencional para el
diagnstico de Haemophilus?












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PRCTICA No. 5
CARACTERIZACIN DE BACTERIAS DEL GNERO Brucella

Introduccin
El gnero Brucella abarca un grupo de microorganismos que son cocobacilos diminutos de
tincin dbil, considerados como parsitos intracelulares facultativos y desarrollo lento en agar
sangre. Son responsables de la brucelosis, considerada enfermedad zoontica, que se adquiere por
estar en contacto con animales infectados o por la ingesta de productos lcteos no pasteurizados,
la cual es difcil de diagnosticar, debido al amplio espectro de manifestaciones clnicas asociadas.
Se conocen pocas especies de Brucella, con ligera especificidad del husped: B.
melitensis infecta cabras y ovejas, B. abortus infecta vacas, B. suis infecta cerdos, B. ovis infecta
ovejas y B. neotomae infecta cerdos.
Objetivo
Identificar al gnero Brucella.

Material
Equipos de tincin de Gram.
Sensidiscos de oxidasa .
Reactivo para catalasa.
Cepas de Brucella spp.
Botellas para hemocultivo
Placas de agar sangre
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Tubos para prueba de urea
Colorantes fucsina bsica, tionina y azul de tionina.

Metodologa
1. Sembrar en botellas para hemocultivo.
2. Incubar a 35 C durante 4-6 semanas.
3. Hacer subcultivos en agar sangre y chocolate.
4. Identificar especies, mediante pruebas bioqumicas como necesidad de CO
2
, produccin
de ureasa y sensibilidad a los colorantes fucsina bsica, tionina y azul de tionina.

Cuestionario:
1 Cul es la importancia clnica del gnero Brucella?
2 Qu especies de Brucella requieren CO
2
para crecer, cuales producen H
2
S y cuales
ureasa?
3 Cul es la dosis infectiva de Brucella?
4 Qu dao les puede causar Brucella a las vacas?
5 En qu consiste la prueba de Rosa de Bengala?












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PRCTICA No.6
CARACTERIZACIN DE BACTERIAS DE LOS GNEROS Neisseria y
Moraxella

Introduccin
Los miembros del gnero Neisseria son microorganismos gramnegativos cocoides o baciliares
que pueden encontrarse en pares o en cadenas cortas. Son inmviles, no forman esporas y
producen cido a partir de carbohidratos lo que permite identificar especies. Neisseria
gonorrhoeae es la especie de importancia en salud publica ya que se adquiere por transmisin
sexual.
Neisseria catarrhalis ahora conocida como Moraxella catarrhalis, puede ser responsable
de infecciones respiratorias principalmente en nios y ancianos, crece en agar chocolate y agar
nutritivo, no produce cido a partir de glucosa, maltosa, fructosa, sacarosa no lactosa.

Objetivo
Identificar los gneros Neisseria y Moraxella.

Material
Equipos de tincin de Gram Placas de agar Thayer-Martin
Sensidiscos de oxidasa Placas con agar chocolate
Reactivo para catalasa Placas con agar nutritivo
Portaobjetos Benzal
Algodn Placas con agar DNAsa
Cepas de Neisseria spp
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Cepas de Moraxella spp.
Tubos con CTA con diferentes carbohidratos

Metodologa
Para Neisseria
1. Sembrar una placa de Thayer-Martin en forma de Z y luego estriar.
2. Incubar 24-48 horas a 37 C.
3. Leer morfologa colonial.
4. Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa y tincin de
Gram.
5. Realizar pruebas de identificacin de especie en bases de CTA con diferentes
carbohidratos.

Para Moraxella
1. Sembrar en agar chocolate y agar nutritivo.
2. Incubar 24-48 horas a 37 C.
3. Leer morfologa colonial.
4. Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa, tincin de Gram
y DNAsa.

Cuestionario:
1. Cul es la importancia clnica de Neisseria gonorrhoeae?
2. Qu tipo de medio es el Thayer-Martin?
3. Menciona las especies de Neisseria y su comportamiento frente a los diferentes
carbohidratos.
4. Cul es la importancia clnica de Moraxella catarrhalis?
5. Qu tipo de muestra debe utilizarse para la bsqueda de Neisseria gonorrhoeae y cual
para Moraxella catarrhalis?



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PRCTICA No.7
CARACTERIZACIN DE ENTEROBACTERIAS: LACTOSA POSITIVAS

Introduccin
La familia Enterobacteriaceae est conformada por un nmero importante de especies, que
incluyen bacilos gramnegativos, con metabolismo fermentador, anaerobios facultativos, catalasa
positivos, oxidasa negativos, la mayora son mviles, reducen los nitratos a nitritos, y no
presentan condiciones nutritivas exigentes, crecen muy bien en agar Mac Conkey.

La familia Enterobacteriaceae tiene como nicho ecolgico el tracto intestinal de gran
variedad de seres vivos, incluyendo al hombre, lo cual facilita su presencia prcticamente en todo
lugar. La mayora de las enterobacterias son parte importante de la microbiota intestinal,
comportndose como patgenos solo en el caso de pacientes inmunocomprometidos (patgenos
oportunistas).

Con el objeto de facilitar la caracterizacin de esta familia se ha dividido con base a la
capacidad de fermentar lactosa en dos grupos: lactosa positivos, los que la fermentan y los lactosa
negativos los que no poseen el sistema enzimtico que les permite llevar a cabo el proceso.
Tambin es necesario el empleo de pruebas bioqumicas y fisiolgicas para establecer el grupo
bacteriano.

La fermentacin bacteriana de la lactosa es ms compleja que la de la glucosa. La lactosa
es un disacrido compuesto por glucosa y galactosa, unidas entre si por un enlace glucosdico.
Para que una bacteria pueda metabolizar a la lactosa debe tener a la enzima beta-galactsido
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permeasa, que transporta a la lactosa al interior de la bacteria y la beta-galactosidasa, necesaria
para hidrolizar el enlace glucosdico y liberar a la glucosa y galactosa, finalmente la glucosa entra
a la ruta de Embden-Meyerhof para la formacin de cidos mixtos los cuales pueden ser
detectados en un medio de cultivo con un indicador de pH (ver tabla 4).

Objetivo
Determinar por medio de ensayos de laboratorio las caractersticas bioqumicas que definen a la
familia Enterobacteriaceae y a las enterobacterias lactosa positivas.

Material
Equipos de tincin de Gram Placas de agar Mac Conkey
Sensidiscos de oxidasa Placas con agar EMB
Reactivo para catalasa Benzal
Portaobjetos
Algodn
Cepas de Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter.
Tubos con medios TSI, LIA, MIO, CITRATO Y UREA para pruebas bioqumicas.

Metodologa
1. Sembrar por estra cruzada placas de Mac Conkey y EMB.
2. Inocular pruebas bioqumicas.
3. Inocular galeras.
4. Incubar.
5. Leer morfologa colonial, pruebas bioqumicas, realizar tincin de Gram, catalasa,
oxidasa.
6. Comparar resultados en la tabla 4 y establecer gnero y especie.





23
Tabla 4. Diferenciacin de enterobacterias mediante pruebas bioqumicas

Fuente: Seccin Entrica y Rama de Entrenamiento Bacteriolgico. CDC
24
Cuestionario:
1. Cul es la importancia mdica de esta familia?
2. Las enterobacterias se han clasificado en dos grupos: lactosas (+) y lactosas (-), qu
gneros de importancia mdica se encuentran en cada uno de estos grupos?
3. De las bacterias lactosa positivas menciona a las inmviles y a las que son capaces de
producir H
2
S?
4. Cules son las pruebas bioqumicas que permiten identificar a las enterobacterias y
menciona el fundamento bioqumico de cada una de ellas?
5. De la cepa problema responde lo siguiente con ayuda de dibujos:
a) Morfologa colonial.
b) Tincin de Gram.
c) Pruebas de catalasa y oxidasa.
d) Pruebas bioqumicas.
e) Establecer gnero y especie de la cepa problema.

















25



PRCTICA No. 8
CARACTERIZACIN DE ENTEROBACTERIAS: LACTOSA
NEGATIVAS

Introduccin
Dentro de las bacterias lactosa negativas se encuentran los patgenos primarios como es el caso
de Salmonella spp, Shigella spp y Yersinia spp.

La tribu Salmonelleae contiene un nico gnero Salmonella y reciben el nombre del
bilogo estadounidense Salmon. Esta tribu est relacionada con la salmonelosis que es una causa
importante de enfermedad entrica bacteriana en seres humanos y animales. Se estima que
ocurren 1.4 millones de casos anuales de salmonelosis en seres humanos en los Estados Unidos.
Estas infecciones son causadas por ingesta de alimentos, agua o leche contaminados con
excremento de animales o humanos. Las salmonelas son patgenos primarios de los animales
inferiores como vacas, cerdos, mascotas, etc. que constituyen la fuente principal de salmonelosis
no tifoidea en los humanos. Mientras que Salmonella typhi es especfico del humano y causa
fiebre tifoidea.

La shigelosis es la ms contagiosa de las diarreas causada por Shigella, la enfermedad es
transmitida por va fecal-oral y se requieren tan solo 200 bacterias viables para producir la
enfermedad.

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Se conocen 3 especies del gnero Yersinia: Y. pestis, Y, pseudotuberculosis y Y.
enterocolitica. La peste bubnica es causada por Y. pestis, es una enfermedad de la antigedad
que persiste en los tiempos modernos, es una enfermedad zoontica, transmitida por un roedor a
otro o del roedor al hombre a travs de las pulgas (ver tabla 4).

Objetivo
Determinar por medio de ensayos de laboratorio las caractersticas bioqumicas que definen a la
familia Enterobacteriaceae y a las enterobacterias lactosa negativas.

Material
Equipos de tincin de Gram Placas de agar Mac Conkey
Sensidiscos de oxidasa Placas con agar Salmonella-Shigellla (SS)
Reactivo para catalasa Benzal
Portaobjetos Cepas de Salmonella sp, Shigella sp, Proteus sp
Algodn
Tubos con medios TSI, LIA, MIO, CITRATO Y UREA para pruebas bioqumicas

Metodologa
1. Sembrar por estra cruzada placas de Mac Conkey y SS.
2. Inocular pruebas bioqumicas.
3. Inocular galeras.
4. Incubar 24 h a 37 C.
5. Leer morfologa colonial, pruebas bioqumicas, realizar tincin de Gram, catalasa,
oxidasa.
6. Comparar resultados con ayuda de la tabla 4 y establecer gnero y especie.

Cuestionario:
1. Qu gneros son lactosa negativa?
2. Cul es la importancia de las enterobacterias lactosa negativas?
3. De las lactosas negativas, menciona a las enterobacterias inmviles y a las que son
capaces de producir H
2
S?
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4. Cul es una caracterstica importante de la tribu Proteae y porqu?
5. De la cepa problema responde lo siguiente con ayuda de dibujos:
a) Morfologa colonial
b) Tincin de Gram
c) Pruebas de catalasa y oxidasa
d) Pruebas bioqumicas
e) Establecer gnero y especie de la cepa problema




















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PRCTICA No. 9

CARACTERIZACIN DEL GNERO Vibrio

Introduccin
Este gnero se define como bacilos gramnegativos, fermentadores, mviles, catalasa y oxidasa
positivas. Algunas especies se caracterizan por ser haloflicas. Todos los gneros se consideran
patgenos, resaltando en particular Vibrio cholerae por ser el agente causal del clera,
enfermedad que se presenta comnmente en forma epidmica, sobre todo en pases en vas de
desarrollo (ver tabla 5).
Tabla 5. Diferenciacin entre biotipos de Vibrio cholerae

Prueba Clsica El Tor
Prueba del filamento + +
-hemlisis en agar sangre de carnero - +
Prueba de CAMP - +
Prueba de Voges-Poskauer - +
Aglutinacin de eritrocitos de pollo - +
Sensibilidad a 50 U de polimixina B S R
Susceptibilidad al fago IV S R

Objetivo
Determinar con base a las pruebas de laboratorio correspondientes, las caractersticas
bioqumicas ms relevantes de este gnero.

Material
Equipos de tincin de Gram Placas de agar Mac Conkey
BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
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Sensidiscos de oxidasa Placas de agar TCBS
Reactivo para catalasa Benzal
Portaobjetos Cepas de Vibrio cholerae y V. parahaemolyticus.
Algodn
Tubos con medios TSI, LIA, MIO, CITRATO Y UREA para pruebas bioqumicas


Metodologa
1.- Sembrar por estra cruzada los medios en placa.
2.- Sembrar las pruebas bioqumicas convencionales.
3.- Incubar 24 horas a 37 C.
4.- Leer morfologa colonial.
5.- Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa y tincin de Gram.
6.- Leer pruebas bioqumicas.

Cuestionario:
1. Qu gneros conforman a la familia Vibrionaceae?
2. Cul es la importancia clnica del gnero Vibrio?
3. Indique el mecanismo de patogenicidad de Vibrio cholerae.
4. Qu pruebas permiten diferenciar entre las especies de Vibrio?
5. De la cepa problema responde lo siguiente con ayuda de dibujos:
a) Morfologa colonial
b) Tincin de Gram
c) Pruebas de catalasa y oxidasa
d) Pruebas bioqumicas
e) Establecer gnero y especie de la cepa problema

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PRCTICA No.10
CARACTERIZACIN DE BACTERIAS DE LOS GNEROS Streptococcus y
Enterococcus

Introduccin
Estos gneros se caracterizan por ser cocos Grampositivos agrupados en pares o cadenas,
generalmente inmviles, catalasa negativos en general, no esporulados, aerobios y anaerobios
facultativos con metabolismo fermentativo en el que producen cido lctico, frmico, etanol y
CO
2
, crecen ptimamente a 37 C.
Enterococcus se encuentran de manera natural en muchos organismos, incluidos los
humanos, como parte de su flora intestinal. Son microorganismos muy resistentes, capaces de
tolerar concentraciones relativamente altas de sales y cidos.
El gnero de mayor inters mdico son los Streptococcus. Algunas especies forman parte
de la flora normal del hombre y otras estn relacionadas con cuadros clnicos de amigdalitis,
celulitis, erisipela, faringitis, rinitis, fiebre escarlatina, sepsis puerperal, neumona, endocarditis
bacteriana, caries, meningitis, infecciones en vas urinarias y heridas, fiebre reumtica, glomrulo
nefritis y conjuntivitis purulenta.

Objetivo
Caracterizar bioqumicamente a las especies ms importantes de ambos gneros.

Material
Equipos de tincin de Gram Placas con agar sangre de carnero
BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
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Sensidiscos de oxidasa Caldos BHI con Streptococcus pyogenes
Reactivo para catalasa Caldos BHI con Streptococcus agalactiae
Portaobjetos Caldos con Staphylococcus aureus
Algodn Caldos BHI con Enterococcus sp
Benzal Caldos con BHI con 6.5 % de NaCl
Placas con agar bilis-esculina Sensidiscos con bacitracina (0.04 UI)
Sensidiscos con optoquina

Metodologa

HEMLISIS



ALFA BETA NO HEMLISIS
(GAMA)
Crece en 6.5% NaCl

Soluble en bilis Sensible a bacitracina: S. pyogenes Ennegrece la bilis
Sensible a optoquina esculina

CAMP +
Hidrlisis del hipurato +: S. agalactiae
S. pneumoniae Enterococcus

1. Sembrar por estra cruzada una placa de agar sangre carnero.
2. Realizar pruebas de CAMP.
3. Realizar pruebas de sensibilidad a bacitracina.
4. Realizar pruebas de sensibilidad a optoquina.
5. Realizar tincin de Gram y observar al microscopio.
6. Incubar 24 horas a 37 C.
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7. Leer morfologa colonial.
8. Interpretar resultados.

Cuestionario
1. Cul es la definicin del gnero Streptococcus?
2. Cul es el fundamento de la prueba de CAMP?
3. Para qu se utiliza la prueba de sensibilidad a bacitracina y optoquina?
4. De la cepa problema responde lo siguiente con ayuda de dibujos:
a) Morfologa colonial
b) Tincin de Gram
c) Pruebas de catalasa y oxidasa
d) Otras pruebas
e) Establecer si la cepa en estudio pertenece al gnero de Streptococcus, de ser positiva la
respuesta, menciona la especie.
5. Menciona las especies ms importantes de Streptococcus y qu enfermedad producen.












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PRCTICA No.11
CARACTERIZACIN DE BACTERIAS DEL GNERO Staphylococcus

Introduccin
Este gnero est constituido por cocos grampositivos, agrupados en racimos, catalasa positiva
con metabolismo fermentativo. Son responsables principalmente de infecciones supurativas de la
piel y tejidos blandos. As como de infecciones oportunistas. Se reconocen 3 especies de
importancia mdica: Sta. aureus, Sta. epidermidis, Sta. saprophyticus (ver tabla 6).

Tabla 6. Diferenciacin de las especies de Staphylococcus












Objetivo
PRUEBAS DE
LABORATORIO
S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus
Color de las colonias Amarillo-
blanco
Blanco Blanco
Hemlisis en agar sangre + +/- -
Crecimiento anaerobio + + +/-
Coagulasa y DNasa + - -
Fermentacin de la glucosa + + +
Fermentacin del manitol + - -/+
Novobiocina Sensible Sensible Resistente
BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
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Observar las caractersticas ms relevantes del gnero, resaltando aquellas que permiten su
diferenciacin con otros cocos grampositivos de cercana filiacin.

Material
Equipos de tincin de Gram Placas con agar sangre de carnero
Sensidiscos de oxidasa Cepas de Staphylococcus aureus
Reactivo para catalasa Cepas de Staphylococcus epidermidis
Portaobjetos Cepas de Staphylococcus saprophyticus
Algodn Placas con agar DNasa
Benzal Plasma de conejo
Sensidiscos con novobiocina
Placas con agar sal y manitol

Metodologa
1. Sembrar por estra cruzada una placa de agar sangre y una de agar sal y manitol.
2. Incubar 24 h a 37 C.
3. Leer morfologa colonial y microscpica.
4. Realizar pruebas de identificacin de especie.
5. Interpretar resultados.

Cuestionario:
1. Cul es la definicin e importancia del gnero Staphylococcus?
2. Qu prueba permite diferenciar entre el gnero Streptococcus y Staphylococcus?
3. Cul es el fundamento de la prueba de coagulasa y cmo se realiza en el laboratorio?
4. Cules son los ingredientes del agar de sal y manitol y por qu es importante utilizarlo
para la identificacin de este gnero y no de otros?
5. De la cepa problema responde lo siguiente con ayuda de dibujos:
6. Morfologa colonial
7. Tincin de Gram
8. Pruebas de catalasa y oxidasa.
9. Otras pruebas
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10. Establecer si la cepa en estudio pertenece al gnero de Staphylococcus, de ser positiva la
respuesta, menciona la especie.





















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PRCTICA 12
CARACTERIZACIN DE BACILOS GRAMPOSITIVOS: Bacillus

Introduccin
Los microorganismos del gnero Bacillus son bacilos Grampositivos, formadores de endosporas,
catalasa positivos, son mviles excepto B. anthracis y -hemolticos excepto B. anthracis. Este
gnero es ubicuo en la naturaleza ya que posee endosporas y stas pueden permanecer en campos
contaminados por periodos de 10 hasta 30 aos. B. anthracis es el agente causal de ntrax en
animales, principalmente vacas y ovejas, as como en el humano (ver tabla 7).

Tabla 7. Caracteres mnimos para diferenciar Bacillus anthracis de Bacillus cereus


Bacillus anthracis
Bacillus cereus
Lecitinasa + +
Colonias rugosas + +
Morfologa
Bacilar; extremos
rectangulares
bacilar; extremos
redondeados
Movilidad - +
Cpsula

+
-
Hemlisis

-
+
Colonias lisas (capsulacin en agar
bicarbonato de sodio 0.7%)

+
-
Sensibilidad a penicilina

+
-
BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA

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Objetivo
Identificar por pruebas de laboratorio al gnero Bacillus.

Material
Equipos de tincin de Gram Placas con agar sangre de carnero
Placas con agar nutritivo Equipo para tincin de Shaeffer-Fulton
Reactivo para catalasa Cepas de Bacillus sp
Portaobjetos Sensidiscos de oxidasa
Algodn Caldo nutritivo
Benzal Tubos con gelatina

Metodologa
1. Inocular una placa de agar sangre carnero.
2. Inocular un tubo de caldo nutritivo e incubarlo a 42 C.
3. Inocular un tubo con gelatina e incubarlo a 4 C por 7 das.
4. Leer morfologa colonial, buscar hemlisis, hacer tincin de Gram y Shaeffer-Fulton
5. Interpretar resultados.

Cuestionario
1. Cul es el fundamento de la tincin de Shaeffer-Fulton y cmo se realiza en el
laboratorio?
2. Menciona otras pruebas para diferenciar especies de Bacillus.
3. Menciona medios de cultivo para el aislamiento de Bacillus.
4. Menciona las medidas de seguridad que debe tener el laboratorio para poder trabajar con
Bacillus anthracis.
5. De la cepa problema responde lo siguiente con ayuda de dibujos:
a) Morfologa colonial.
b) Tincin de Gram.
c) Pruebas de catalasa y oxidasa.
d) Otras pruebas.
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Bibliografa
1. Bailey and Scott. 2009. Diagnstico Microbiolgico. 12. edicin. Ed Mdica
Panamericana.
2. Bergeys 1994. Manual. Determinative bacteriology. 9a. edicin. Williams & Wilkins.
3. Cowan y Steel.1988. Manual para la identificacin de bacterias de inters mdico. Ed.
Panamericana.
4. HernndezMndez, J.T y cols. 2003. Bacteriologa Mdica Diagnstica. Instituto
Politcnico Nacional. 2. edicin. Ed. Cullar.
5. Jawetz, Melnick y Adelberg. 2001. Microbiologa Mdica. 25. edicin. Ed. Mc Graw Hill
6. Koneman. 2003. Diagnstico Microbiolgico. 5. Edicin. Ed. Mdica Panamericana.
7. Mc Faddin 1998. Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Inters
Mdico. Ed. Panamericana.
8. NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002.