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AISLAMIENTO, RECUENTO Y EVALUACIÓN CINÉTICA DEL CRECIMIENTO

MICROBIANO A PARTIR DE UNA MATRIZ AMBIENTAL

NUCLEICOS

GLORIA PATRICIA BLANDÓN TORRES


MARIA ALEJANDRA CARRILLO CASTAÑO
CATALINA VALENCIA MARTINEZ

DOCENTE: ERICA PAMELA FERNANDEZ CALLE


MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL Y AMBIENTAL

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
ESCUELA DE MICROBIOLOGIA
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Y AMBIENTAL

APARTADÓ ANTIOQUIA

2020
RESULTADOS

DATOS CRUDOS

A. AISLAMIENTO, RECUENTO E IDENTIFICACIÓN DE MORFOTIPO


MICROBIANOS A PARTIR DE UNA MUESTRA DE SUELO PRESENTE EN LA
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
Tabla #1. Identificación de morfotipos microbianos a partir de la
muestra de suelo
Características
Morfotipo Margen Forma Textura ópticas Pigmentación
A Entero Puntiforme Homogénea Opaca Amarillo paja
B Entero Circular Homogénea Opaca Amarillo paja
C Lobulado Rizoide Homogénea Opaca Amarillo paja
D Ondulado Puntiforme Homogénea Opaca Amarillo paja
E Ondulado Irregular Homogénea Opaca Amarillo paja

Tabla #2. Morfotipos presentes en los medios de cultivo con su respectiva dilución
10-3 10-5
-3 -4 -5
10 Duplicado 10 10 Duplicado
Morfotipos
A 2 2 1 NE 1
B 1 1 NE NE NE
C NE 1 NE NE NE
D NE NE NE 11 NE
E 2 NE NE 7 NE
NE: No encontrados.

Figura #1. Colonias obtenidas luego de realizar el aislamiento microbiano de la muestra de suelo.
B. IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS FERMENTADORAS DE GLUCOSA A
PARTIR DE UNA MUESTRA DE GALLINAZA.

Pesar 10g de suelo y pasarlos a 20 mL de agua


peptonada presente en frasco shock.

Aislamiento Aislar muestra de suelo por agotamiento en agar


A. MacConkey e incubar a 35°C por 24 horas.

¿Colonias
Sí fermentadoras No
de glucosa?
Realizar tinción Gram a
colonias aisladas y guardar
a 4°C el aislamiento A.
Tomar otra
colonia aislada.

¿Bacilos Gram
Sí No
ñí negativos?

Repicar colonia en agar nutritivo e Aislamiento


incubar a 36°C por 24 horas. B.

Verificar si el cultivo es axénico


con tinción Gram.

¿Bacilos Gram No

negativos?

Realizar prueba
oxidasa.

Sí ¿Oxidasa
No
positiva?
Descartar.
Repicar en agar
nutritivo e incubar a Aislamiento C.
35°C por 24 horas.

Incubar por punción en 2 tubos de O/F glucosa de 2-


4 colonias aisladas y guardar a 4°C el aislamiento C.

Aplicar a uno de los tubos aceite mineral.

Tapar tubos e incubar a 35°C por 24 horas.

¿Positivo
Sí para O/F? No

Tomar 1-2 colonias del Descartar.


aislamiento C e inocular en 2
tubos con agar MR-VP.

Incubar a 35°C por 24 horas.

Observar y reportar resultados obtenidos.

Figura #2. Flujograma de la práctica realizada.

Figura #3. Identificación de bacterias fermentadoras de glucosa aisladas en agar MacConkey.


C. EVALUACION DE LA CINÉTICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO DE
Escherichia coli Y Saccharomyces cerevisiae MEDIANTE
ESPECTROFOTOMETRÍA Y RECUENTO EN PLACA

Tabla #3. Resultados de cuantificación de biomasa por densidad óptica y recuento en placa de
Escherichia coli
E. coli

Tiempo de
Hora de
cultivo DO 600nm dilución UFC Duplicado UFC
lectura
(min)

10:30 0 -0,025 ___ ___ ___ ___ ___


11:30 60 -0,022 -0.020 ___ ___ ___ ___
12:30 120 0,033 0.034 1105 ___ ___
1:30 180 0,244 0.242 1732 1608
2:30 240 0,544 0.549 5200 ___ ___
3:30 300 0,708 0.687 780 ___ ___
4:30 360 0,897 0.895 1235 1121,25
5:30 420 0,971 0.947 350 300
____ : No realizado/Dato no tomado. Tabla
#4. Resultados de cuantificación de biomasa por densidad óptica y recuento en placa de
Saccharomyces cerevisiae.

S.cerevisiae

Hora Tiempo de
de cultivo DO 600nm dilución UFC Duplicado UFC
lectura (min)

10:30 0 0.029 ___ ___ ___ ___ ___


-3
10
11:30 60 0.038 0,032 364 10-3 265

12:30 120 0,046 0,052 10-2 1641.25 ___ ___


-4 -4
1:30 180 0,064 0,078 10 87 10
128
2:30 240 0,148 0,150 10-3 232 10-3 301
-5 -5
3:30 300 0,246 0,263 10 82 10 74
-5 -5
4:30 360 0,498 0,532 10 155 10
160
5:30 420 0,750 0,752 10-5 71 10-5
65
___: No
realizado/Dato no tomado.
DATOS PROCESADOS
A. AISLAMIENTO, RECUENTO E IDENTIFICACIÓN DE MORFOTIPO
MICROBIANOS A PARTIR DE UNA MUESTRA DE SUELO PRESENTE EN LA
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

Tabla #5: Recuento microbiano en UFC.


10-3
10-5
-3 -4 -5
Dilución 10 Duplicado 10 10 Duplicado

Colonias 4 7 1 19 2

Total de colonias por


dilución 11 1 21
Promedio de
colonias por dilución
(UFC) 5,5 1 10,5

RECUENTO MICROBIANO EN UFC/mL.

Dilución 10-3

5.5 UFC x 10 x 103 = 5,5x104 UFC/mL

Dilución 10-4

1UFC x 10 x 104 = 1x105 UFC/mL.

Dilución 10-5

10,5𝑈𝐹𝐶𝑥10𝑥105 = 1𝑥107 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿

RECUENTO MICROBIANO EN UFC/g

Dilución 10-3
5.5 x 106 UFC/ mL * 30 mL / 108211 g = 1,5 x 108 UFC/ g
Dilución 10-4
1 x 109 UFC/ mL * 30 mL / 108211 g = 2.8 x 109 UFC/ g

Dilución 10-5
10 x 1011 UFC/ mL * 30 mL / 108211 g = 2.8 x 1012 UFC/ g
Tabla # 6: Tabulación de resultados del recuento microbiano en UFC/ mL y UFC/g.

Diluciones UFC/mL UFC/ g


10-3 5.5x104 1,5 x 108
10-4 1x105 2.8 X 109
10-5 1x107 2.8 X 1012

Grafica #1. Predominancia de morfotipos por dilución.

B. IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS FERMENTADORAS DE GLUCOSA A


PARTIR DE UNA MUESTRA DE GALLINAZA.
Tabla # 7. Crecimiento de bacterias fermentadoras de lactosa en Agar MacConkey.

Aislamiento Resultados Colonias reaisladas

A1 Sin crecimiento ----


A2 Positivo 2 ( B1, B2)
A3 Positivo 1 (B3)
A4 Sin crecimiento ----
A= Aislamiento #1. B= Aislamiento #2. ---- = No se realizó aislamiento.

Tabla #8. Resultados de los diferentes procedimientos realizados para identificar bacteria
fermentadora de lactosa.
Aislamiento Tinción de Gram Oxidasa Resultados de prueba O/F
B1 Gram negativa Positiva ----
B2 Gram negativa Positiva ----
B3 Gram negativa Negativa Negativo
---- = No se realizó aislamiento

C. EVALUACIÓN DE LA CINÉTICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO DE


Escherichia coli Y Saccharomyces cerevisiae MEDIANTE
ESPECTROFOTOMETRÍA Y RECUENTO EN PLACA

Tabla #9. Promedio de UFC/mL y DO de S. cerevisiae y E.coli


Promedios de UFC/mL Promedios DO
Tiempos S. cerevisiae E.coli S. cerevisiae E.coli
0 ___ ___ 0,029 0,025
1 3,00E+06 ___ 0,035 0,042
2 2,00E+06 1,11E+06 0,072 0,0335
3 1,10E+07 1,70E+09 0,071 0,243
4 2,70E+06 5,20E+09 0,149 0,546
5 7,80E+07 7,80E+10 0,2545 0,697
6 1,60E+08 1,20E+11 0,515 0,896
7 6,80E+07 3,20E+11 0,751 0,959
___: Sin calculo/Sin datos

Curva de crecimiento Tiempo t en horas vs


DO
1.2

0.8
DO600nm

0.6 S. cerevisiae

0.4 E. coli

0.2

0
0 2 4 6 8
-0.2
Tiempo t en horas

Grafica #2. Curva de crecimiento de S. cerevisiae y E. coli


Curva de crecimiento en UFC/ml de E. coli
3.50E+11
Tabla #9 UFC/ml vs
Tiempo t en horas
3.00E+11 E. coli
2.50E+11
(UFC/ml) Tiempo t
1,11E+06 2
2.00E+11
1,70E+09 3
UFC/ml

1.50E+11 5,20E+09 4
1.00E+11 7,80E+10 5
5.00E+10 1,20E+11 6
3,20E+11 7
0.00E+00
0 1 2 3 4 5 6 7 8
-5.00E+10
Tiempo t (en horas)

Grafica#3. Crecimiento de E. coli en tiempo (horas) respecto a UFC/mL

Curva de crecimiento en UFC/mL de S. cerevisiae


1.80E+08
1.60E+08
1.40E+08 Tabla #10 UFC/mL vs
Tiempo t en horas
1.20E+08
s. cerevisiae tiempo t
1.00E+08
UFC/ml

3,00E+06 1
8.00E+07
2,00E+06 2
6.00E+07
1,10E+07 3
4.00E+07
2,70E+06 4
2.00E+07
0.00E+00
7,80E+07 5
-2.00E+07 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1,60E+08 6
Tiempo t (en horas) 6,80E+07 7

Grafica#4. Crecimiento de S. cerevisiae en Tiempo t vs UFC/mL.

Las pendientes se calcularon por medio de la ecuación:


𝑁𝑡2 − 𝑁𝑡1
𝑃=
𝑇2 − 𝑇1
Y fue aplicada de la siguiente manera:
(1,7𝑋109 − 1,1𝑋106 )
𝑃= = 28315000
(180 − 120)
Tabla#11. Pendientes de las UFC/mL para cada intervalo de tiempo de 1 hora
Tiempo S. cerevisiae E.coli
Pendiente Pendiente
UFC/mL (UFC/h) UFC/mL (UFC/h)
0 ___ ___ ___ ___
60 3,00E+06 ___ ___ ___
120 2,00E+06 -16666,66667 1,11E+06 ___
180 1,10E+07 1,50E+05 1,70E+09 28315000
240 2,70E+06 -138333.3333 5,20E+09 58333333,33
300 7,80E+07 1,26E+06 7,80E+10 1213333333
360 1,60E+08 1,37E+06 1,20E+11 700000000
420 6,80E+07 1533333,333 3,20E+11 33333333333
___:Sin datos /Sin calculo

Relacion entre DO y UFC/mL de S. cerevisiae


Tabla #12 Medición de
0.8 DO y UFC/mL de S.
y = 3E-09x + 0.0931
0.7 cerevisiae
R² = 0.547
0.6 s. cerevisiae
DO 600nm UFC/mL
DO 600nm

0.5
0,029 0,00E+00
0.4
0,035 3,00E+06
0.3
0,049 2,00E+06
0.2
0,071 1,10E+07
0.1
0,149 2,70E+06
0 0,2545 7,80E+07
-5.00E+07 0.00E+00 5.00E+07 1.00E+08 1.50E+08 2.00E+08
0,515 1,60E+08
UFC/mL
0,751 6,80E+07

Grafica #5 Relación entre DO y UFC/mL de S. cerevisiae


Relacion entre DO y UFC/mL
E. coli
1.4
1.2 y = 3E-12x + 0.2281
DO 600nm UFC/Ml
1 R² = 0.6144 -0,025 0,00E+00
DO 600nm

0.8 -0,021 0,00E+00


0.6 0,0335 1,11E+06
0.4 0,243 1,70E+09
0.2 0,5465 5,20E+09
0
0,6975 7,80E+10
-1.00E+11 0.00E+00
-0.2 1.00E+11 2.00E+11 3.00E+11 4.00E+11
UFC/mL 0,896 1,20E+11
0,959 3,20E+11
Grafica #6 Relación entre DO y UFC/mL de E. coli

Fase exponencial del crecimiento en E. coli


27 26.5

26 y = 1.27x + 17.89 25.5


R² = 0.8759 25.1
Ln (UFC/ml)

25

24

23 22.4

22
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo t (en horas)

Gráfica #7. Fase exponencial del crecimiento microbiano de E. coli UFC/mL en función del tiempo.

DISCUSIONES
Se tomó una muestra de suelo en la Universidad de Antioquia, con el fin de realizar la identificación
de la diversidad morfológica de los microorganismos presentes en dicha matriz ambiental, y así
mismo, realizar el conteo microbiano en placa. De acuerdo a los resultados obtenidos en el conteo de
UFC, se evidencia que estos se encuentran de manera ascendente, ya que la dilución 10 presenta -3

menor cantidad de colonias, mientras que la de 10 cuenta con mayor cantidad, estos resultados no
-5

son coherentes, debido a que las colonias presentes en la dilución 10 deben estar en menor cantidad, -5

ya que se encuentran más diluidas y por lo tanto la carga microbiana debería reducirse
significativamente en comparación a la menos diluida, en este caso la dilución 10 . Este error pudo -3

ser ocasionado al momento de adicionar la muestra en la caja de Petri, es decir, se adicionó la dilución
10 en la caja de Petri rotulada con la dilución 10 y viceversa (estos resultados se pueden encontrar
-3 -5

en la tabla #6).
En la identificación de morfotipos, se pudo observar que presentan igual textura, características
ópticas y pigmentación; distinto a su margen y forma, que sí varían entre cada uno de ellos. Dicha
igualdad entre ellos podría deberse al medio en el que se encuentran, ya que la muestra de suelo al
ser homogénea, evita que exista variedad morfotípica. También se logró evidenciar que el morfotipo
que más predominaba en todas las diluciones era el A. Sin embargo, en la dilución 10 se pudo -5

identificar mayor predominancia de los morfotipos D y E, aunque ésto no quiere decir que al tener
una misma morfología, sean la misma especie.
Luego de realizar el aislamiento en agar MacConkey y de acuerdo a las características que
presentaban las colonias que crecieron durante el tiempo de incubación se logró identificar las
colonias fermentadoras de lactosa ya que formaron un halo rosa a su alrededor, esto permitió
distinguirlas en comparación con las no fermentadoras de lactosa que estaban incoloras. Las
propiedades que contiene el medio, como sales biliares y cristal violeta, permiten la inhibición del
crecimiento de las bacterias Gram positivas y de Gram negativas que no hacen parte de la familia de
enterobacterias (Dibico, De, & Mexico, n.d.). En los resultados obtenidos a las 24 horas de haber
realizado la siembra de la muestra de gallinaza como se puede observar en la tabla 4, en el aislamiento
A1 y A4 no hubo crecimiento, por lo cual se puede inferir que en la muestra sembrada no habían
bacterias fermentadoras de lactosa ya que en las otras siembras realizadas si hubo crecimiento y
observación de fermentadoras de lactosa.

Debido a la tinción Gram se pudo realizar la confirmación de las bacterias identificadas como
fermentadoras de lactosa, en este caso Gram negativas. La composición de la pared celular de las
bacterias es de peptidoglicano, el cual tiene gran afinidad por el cristal violeta, el colorante lugol
forma un complejo con el cristal violeta lo cual no afecta la pared bacteriana ya que los poros de esta
no son cerrados por efecto del alcohol-acetona, la pared bacteriana se deshidrata y se destruye la
membrana externa ya que es soluble a la acción de solventes orgánicos. El efecto de la safranina es
teñir nuevamente a aquellas bacterias que no pudieron retener el complejo cristal-yodo (Esaú López-
Jácome et al., n.d.).
Las enterobacterias se caracterizan por la producción de la enzima catalasa. Como se muestra en la
tabla #5, se obtuvieron dos resultados positivos y uno negativo para la prueba oxidasa, lo cual quiere
decir que los resultados positivos son bacterias que producen la enzima citocromo oxidasa, mientras
que la prueba negativa muestra que no poseen esta enzima, debido a que en la cadena transportadora
de electrones, no utiliza el oxígeno sino otro compuesto para transferirlos (Mariana Dominguez, n.d.).

Al determinar la ruta metabólica para la fermentación de las bacterias Gram negativas se utilizó el
medio O/F (Oxidación/Fermentación) en el cual se inoculó una colonia. Se utilizaron dos tubos de
ensayo en el cual uno de ellos presentaba una condición anóxica y el otro una condición aeróbica.
Cuando se realizó el respectivo seguimiento para identificar su ruta metabólica no se obtuvo el
resultado esperado puesto que no se observó crecimiento, ni actividad fermentativa, como el cambio
del color del medio. Se infiere que la enterobacteria presente en el medio no es fermentadora de
lactosa (Aranguren, n.d.), por lo cual no se procede a realizar la prueba de MR-VP.

Dentro de los métodos que permiten determinar la cantidad de microorganismos que existen en una
matriz ambiental, encontramos que unos cuantifican en No. de células (UFC/mL o g) y otros
cuantifican la masa total de la población, siendo éste el caso en el cual la población bacteriana es
cuantificada por masa total a través de espectrofotometría, donde los valores de masa total son dados
en densidad óptica (DO). Como se observa en la tabla #3 conforme el tiempo en horas aumentaba la
biomasa medida en DO a 600nm también lo hacía, esto da a entender que posiblemente las células se
estaban reproduciendo y por supuesto aumento su biomasa generando, por esta razón los valores de
DO eran cada vez más altos. La anterior relación se evidencia en la gráfica #2, donde se observa una
relación directamente proporcional, debido a que a medida que avanza el tiempo aumenta la DO, a
partir de esto se puede confirmar que el tiempo influye en el aumento de la DO cuando se trata del
crecimiento microbiano. Por otro lado, en la gráfica #3 y #4 se obtuvo otro panorama que relaciona
el crecimiento microbiano en función del tiempo, en este caso la relación se establece entre la DO y
las UFC/mL calculadas luego del recuento, éstas gráficas comprueban que el crecimiento microbiano
si influye en el aumento de la DO. Dicho lo anterior, se puede decir que las tres gráficas (#2, #3 y #4)
arrojan información acerca del tiempo en horas en que las poblaciones estudiadas (E. coli y S.
cerevisiae) tardan en duplicarse (BenintendeS.Sanchez C.2012 ). Durante una práctica de laboratorio
se debe tener en cuenta que los errores son prácticamente inevitables, por lo tanto en este caso el error
se vio reflejado a la hora de realizar el análisis de la gráfica #3 que relaciona la DO y el tiempo en
horas de S. cerevisiae, ya que al pasar del tiempo 6 al 7 el crecimiento toma una dirección
descendente, lo cual no suena coherente con los resultados esperados en una fase exponencial, este
error se le puede atribuir a la cantidad de manipulaciones que realizaron las diferentes diluciones,
debido a que, cada manipulador posee un grado de error en procedimientos como el pipeteo, que en
este caso es la parte crucial de la que depende este método de medición, lo cual hace que el error sea
aumentado.
Además de los errores de manipulación ya mencionados, existen errores asociados al conteo de
colonias que dependen del observador, es decir, algunos integrantes posiblemente ubicaron menos
colonias, en una determinada placa, que otros; este error afectará directamente al cálculo de las
UFC/mL, ésto también se evidenció en la gráfica anteriormente mencionada (#3) justo en el intervalo
del tiempo 6 al 7. Por otro lado en la tabla #11 se observan los datos de las pendientes en ambas
poblaciones estudiadas (E. coli y S. cerevisiae), estas pendientes brindan la información respecto a la
velocidad de la duplicación generacional, osea el tiempo en que una célula tarda en duplicarse, cada
pendiente indica el número de células que han sido generadas en cada intervalo de tiempo, como se
logra evidenciar en la primera fase de crecimiento (gráfica #2), llamada latencia, es más corto para
E. coli (del tiempo 0 al tiempo 2) en comparación al de S. cerevisiae (del tiempo 0 al tiempo 3) esto
puede ser dado por el tiempo de duplicación generacional, teniendo en cuenta que E. coli es una célula
procariota con un sistema menos complejo que S. cerevisiae que es una eucariota con uno de mayor
complejidad respecto a estructuras y organelas que las componen, además de esto el tamaño de las
células también influyen en dicho tiempo de duplicación generacional, ya que las estructuras más
grandes requieren de mas material para ser producidas(Benito Jiménez, 2013).
Luego tenemos las gráficas #5 y #6, de las cuales se obtuvo una ecuación con un R que nos muestra
la correlación entre la variable dependiente y la independiente, a partir de esto se observa que tan
alejados están las UFC/mL de la DO, teniendo en cuenta que una buena correlación sería de R2: 0.99
aproximadamente y que las obtenidas con de R2:0.547 para S. cerevisiae y de R2:0.6144 para E. coli,
se puede a inferir que el grado de error del que se habla anteriormente con respecto al recuento de las
UFC/mL en la gráfica #3.
Por otra parte, la gráfica logarítmica Ln(UFC/mL) vs DO de S. cerevisiae no fue realizada, debido a
que la fase exponencial no contenía la cantidad de datos necesarias para realizar la regresión lineal,
razón por la cual solo se realizó la gráfica logarítmica Ln(UFC/mL) vs DO de E. coli (gráfica #7), en
la cual se obtiene un R2:0.8759 que aunque no expresa una buena correlación sirve para la
comparación de las variables DO y UFC/mL que demuestra que tan grande fue el error del recuento
en placa con respecto al error sistemático de la DO arrojado por el espectro.

CONCLUSIONES

Se lograron identificar los distintos morfotipos presentes en la muestra de suelo, de los cuales los que
más predominaron en los aislamientos fueron los morfotipos D y E. En el recuento microbiano
realizado se pudo evidenciar que la dilución con mayor UFC fue la dilución de 10 , datos incoherentes
-5

que pudieron ser ocasionada por errores experimentales.


En la identificación de bacterias fermentadoras de lactosa, se evidenció que en la muestra de gallinaza
no había existencia de dichas bacterias, ya que luego de realizar todos los procedimientos y llegar por
último a la prueba O/F no se logró ver cambio de color en el medio, lo cual permitió identificar que
la colonia aislada no era fermentadora de lactosa.
En la evaluación de la cinética del crecimiento microbiano, los resultados arrojan que las UFC, es
decir la biomasa, que se produce a partir de la duplicación generacional en función del tiempo, es en
efecto la que aumenta los niveles de DO. En cuanto a los resultados obtenidos por el recuento en
placa y DO se determina que el primer método es menos confiable que el segundo, ya que el error del
primero es mayor que el segundo, por lo tanto, sería más confiable determinar las UFC/ML a través
de la ecuación que se genera al realizar una gráfica de regresión lineal.
Las técnicas empleadas para realizar recuentos microbianos son buenas herramientas para poder
identificar la cantidad de microorganismos presentes en una muestra, ya sea a nivel industrial o
ambiental. Éstos métodos pueden ser usados siempre y cuando se tenga en cuenta el tipo de
microorganismo que se quiere analizar o el tipo de identificación que requiere realizar, ya que de
acuerdo a ésto, se utilizan los medios de cultivos indicados para dicha identificación y las condiciones
óptimas a las cuales se deben someter las muestras para que el microorganismo pueda tener un óptimo
crecimiento.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Aranguren, M. M. IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS.

Benito Jiménez, C. (2013). LA REPLICACIÓN. [ebook] Available at:


https://cutt.ly/Dr5L4YM [Accessed 1 Mar. 2020].

Benintende, S. and Sanchez, C. (2020). Crecimiento Bacteriano. [ebook] Available at:


https://cutt.ly/qr5Zc3v [Accessed 1 Mar. 2020].

Dibico, S. A., De, C. V, & Mexico, D. F. (2019). AGAR-AGAR.

Esaú López-Jácome, L., Hernández-Durán, M., Colín-Castro, C. A., Ortega-Peña, S.,


Cerón-González, G., & Franco-Cendejas, R. (2014). Las tinciones básicas en el
laboratorio de microbiología.

Mariana Dominguez. (2014). PRINCIPALES GÉNEROS DE BACTERIAS GRAM


NEGATIVAS. ENTEROBACTERIAS .