FOSFATASA ALCALINA

Equipo 04: Mariana Cobos Garca, Andrs Gonzlez

Mndez, Christian Rodolfo Rengel Garca y Cristian
Rodrguez Mateos.
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO
FACULTAD DE QUMICA
BIOQUMICA EXPERIMENTAL
SEMESTRE 2014-2
07/MARZO/2014
CINTICA
Los experimentos de cintica examinan la relacin que
existe entre la cantidad de producto (P) Formado en la
unidad de tiempo, [P]/t (donde es el smbolo
universal de cambio), de acuerdo a las condiciones
experimentales bajo las cuales se realiza la reaccin.
La base de la mayora de las determinaciones cinticas
es la observacin de como la velocidad (v), de una
reaccin vara directamente con la concentracin de
cada una de las sustancias que actan como reactivos
para producir el producto.
Por ejemplo, la ecuacin de velocidad para la
conversin, no enzimtica, de un sustrato (S) a un
producto por una reaccin de isomerizacin sera:

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CONSTANTE DE VELOCIDAD

El smbolo k es llamada constante de velocidad e
indica la relacin proporcional entre [S] y la
cantidad de producto producido por unidad de
tiempo, es decir indica la relacin que existe entre
la [S] y la velocidad de la reaccin.
Cada reaccin, bajo determinadas condiciones,
presenta una constante de velocidad caracterstica.
Las unidades en que se expresa la constante de
velocidad (k) sern s-1
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ENERGA LIBRE DE ACTIVACIN
El punto mximo en esta figura expresa el valor de la
Energa Libre de Activacin, es decir, la diferencia en
energa libre entre el(los) reactivo(s) y el estado de
transicin en donde se ha formado el intermediario de
alta energa necesario durante la conversin de
reactivos a productos.
El alto valor de esta energa libre de transicin, para la
formacin de este estado de alta energa, es lo que
propicia que las reacciones qumicas no catalizadas
sean frecuentemente demasiado lentas.
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VELOCIDAD DE LA REACCIN

Para que puedan reaccionar, las molculas deben
contener suficiente energa para sobrepasar la
barrera que impone el alcanzar el estado de
transicin.
En ausencia de un catalizador, en nuestro caso en
ausencia de una enzima, la cantidad de molculas
en una poblacin de reactivos que pueden poseer
esta energa es muy pequea y la capacidad de
formar producto es igualmente demasiado
pequea.
Por lo tanto la velocidad de la reaccin esta
determinada por el nmero de molculas con
energa suficiente para alcanzar el estado de
transicin.

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INHIBIDORES ENZIMTICOS


Los inhibidores enzimticos son molculas que se unen a
enzimas y disminuyen su actividad.
La unin de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato
al sitio activo de la enzima y obstaculizar que la enzima
catalice su reaccin correspondiente.
La unin del inhibidor puede ser reversible o irreversible.
Normalmente, los inhibidores irreversibles reaccionan con la
enzima de forma covalente y modifican su estructura qumica
a nivel de residuos esenciales de los aminocidos necesarios
para la actividad enzimtica.
En cambio, los inhibidores reversibles se unen a la enzima de
forma no covalente, dando lugar a diferentes tipos de
inhibiciones, dependiendo de la manera como el inhibidor se
une a la enzima o al complejo enzima-sustrato.

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INHIBICIN ENZIMTICA

Competitiva El Inhibidor se fija en el sitio activo de la enzima.
La inhibicin es reversible puesto que altas concentraciones
de sustrato compiten con el inhibidor. Depende de las
afinidades relativas de la enzima por su sustrato y por el
inhibidor. La Km aumenta, la Vmax permanece sin
cambios

No-competitiva El Inhibidor se fija en un sitio diferente al sitio
activo de la enzima. El complejo ESI (Enzima-Sustrato-
Inhibidor) no puede formar productos. Concentraciones altas
de sustrato no son competidoras. La Km no se modifica, la
Vmax disminuye

Un-competitiva o Anti-competitiva El inhibidor es capaz de
fijarse nicamente una vez que el complejo ES est ya
formado y el cambio en la conformacin de la enzima le
proporciona un sitio para su fijacin. Tanto la Km como la
Vmax disminuyen


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INHIBICIN COMPETITIVA
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INHIBICIN NO COMPETITIVA
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INHIBICIN ANTI-COMPETITIVA
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INHIBICIN POR SUSTRATO
La inhibicin por sustrato y por producto es donde el
sustrato o el producto de una reaccin enzimtica
inhiben la actividad enzimtica.
Este tipo de inhibicin puede seguir cualquier tipo de
patrn de inhibicin y es frecuentemente de gran
importancia en la regulacin del metabolismo celular.
En la inhibicin por sustrato hay una disminucin
progresiva de la actividad a altas concentraciones de
sustrato. Esto puede indicar la existencia de dos sitios
de unin entre sustrato y enzima. Cuando hay poco
sustrato, se ocupa el sitio de alta afinidad y sigue la
cintica normal. Sin embargo, a altas concentraciones,
el segundo sitio de inhibicin se ocupa, inhibiendo a la
enzima.

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CARACTERSTICAS GENERALES

Es una glicoprotena que se encarga de retirar
grupos fosfato de diversas molculas
(desfosforilacin), su estructura depende del sitio
donde se origina.

En general es un dmero con subunidades casi
idnticas teniendo cada una 2 molculas de Zinc;
una de ellas proporciona estabilidad a la enzima, la
otra le brinda propiedades catalticas y cuatro
puentes disulfuro.

Orto-fosfrico-monoster hidrolasa
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Se encuentran situadas en la membrana celular y entre
sus principales funciones se pueden mencionar:

Precipitacin del fosfato clcico en huesos.

Absorcin de fosfatos por el intestino.

Hidrlisis de esteres fosfticos del rin e hgado.

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Peso molecular: 140 -160 KDa

Punto isoelctrico:
La fosfatasa alcalina puede existir como
isoenzimas con un rango de pH 4.4 - 5.8

El pH ptimo: La enzima es ms estable en el
rango de pH 7.5-9.5

El pH ptimo para la actividad enzimtica
es de pH 8-10.

El pH ptimo cambiar dependiendo de sustrato, la
concentracin de sustrato, y la concentracin
inica.

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La enzima es una glicoprotena que contiene
aproximadamente 12% de carbohidratos (6% hexosas y
6% de otros azcares neutras).

La actividad mxima con fosfatasa alcalina se logra en la
presencia de magnesio.

Inhibidores fuertes de la fosfatasa alcalina incluyen
arseniato, cistena, yodo, fosfato inorgnico,
pirofosfato, fosfato de diisopropilo, fosfato de trifenilo, y
fluorofosfato de diisopropilo, y L-fenilalanina.
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REACCIN QUE CATALIZA

La determinacin de Fosfatasa Alcalina se lleva a cabo
mediante el mtodo del p-nitrofenil-fosfato: la fosfatasa
alcalina cataliza la hidrlisis del enlace ster fosfrico
entre un grupo orgnico y un grupo fosforilo a pH alcalino
(NaOH), liberando fosfato inorgnico y p-
nitrofenol.
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El p-nitrofenol es un compuesto que presenta
absorbancia a = 405 nm (color amarillo), por lo que
el aumento de la absorbancia del p-nitrofenol en
funcin del tiempo es un indicador de la actividad
enzimtica.

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La ALP es una hidrolasa responsable de la
eliminacin de grupos fosfato en las posiciones 5 -
y 3 - de muchas molculas, como los nucletidos,
protenas y alcaloides.
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FACTORES QUE MODIFICAN SU ACTIVIDAD
pH

Temperatura

Concentracin del sustrato

Presencia de un inhibidor
FOSFATASA ALCALINA BACTERIANA
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PRESENCIA DE LA FOSFATASA ALCALINA EN
BACTERIAS G(-)
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FOSFATASA ALCALINA EN HUMANOS
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PRESENCIA DE LA FOSFATASA ALCALINA EN HUMANOS
Epitelio Intestinal
Membranas de los
sinusoides y canalculos
del Hgado
Osteoblastos de Huesos
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Presente en la totalidad de tejidos corporales:

Epitelio intestinal (transporte de lpidos)
Osteoblastos (procesos de remodelacin sea)
Placenta (durante el primer trimestre de embarazo)
Hgado (membrana sinusoide y canalculos)


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ISOENZIMAS
ALP -1: se sintetiza en clulas epiteliales del canalculo
biliar. (10% act. Total ALP)
ALP -2 termolbil: estable a 56C, pierde actividad a
65C/30 min; se produce en clulas hepticas (25% act. total)
ALP -2 termoestable: no se degrada a 65C pero se inhibe
con fenilalanina, de origen placentario y en sangre durante
embarazo (1% act. total)
ALP pre-: origen en hueso, termolbil (se destruye a
56C/10 min) y constituye el 50% act. Total
ALP gamma: se inhibe con fenilalanina y se origina en
clulas intestinales
Fosfatasa alcalina de leucocitos (LAP): disminuye en
leucemia y aumenta en linfoma
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ENSAYO DE CINTICA ENZIMTICA
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3. Efecto del pH
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APLICACIONES:
La prueba de la fosfatasa alcalina (ALP o FA) se realiza
para:
Comprobar si hay enfermedad heptica o daos en el
hgado. Los sntomas de la enfermedad del hgado
pueden incluir ictericia, dolor abdominal, nuseas y
vmitos. Tambin se puede realizar una prueba de FA
para comprobar el hgado cuando se toman
medicamentos que pueden daarlo.

Controlar los problemas seos tales como raquitismo,
osteomalacia, tumores seos, enfermedad de Paget o
demasiada cantidad de la hormona que controla el
crecimiento del hueso (hormona paratiroidea). El nivel
de FA se puede utilizar para comprobar la eficacia del
tratamiento para la enfermedad de Paget o si se est
produciendo una deficiencia de vitamina D.

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Edad. En mayores de 60 aos se pueden obtener elevaciones de la
fosfatasa alcalina debido al proceso de involucin sea. En los nios y
adolescentes con crecimiento seo esta enzima est normalmente
elevada ya que una de las mayores fuentes de fosfatasa alcalina es el
hueso.

Embarazo. Principalmente durante el tercer trimestre, la placenta
produce fosfatasa alcalina, que est por encima del nivel normal,
alrededor de 125 a 250 UI/L. Esta elevacin no es un motivo de
preocupacin, ya que esta enzima es necesaria para la sntesis de
protenas en las clulas y tiene una parte vital en la calcificacin de los
huesos y cartlagos.

Hiperfosfatasemia benigna familiar. Se produce cuando hay un
aumento persistente de la fosfatasa alcalina en miembros de una misma
familia en ausencia de enfermedad o causa clara de hiperfosfatasemia.
Es poco frecuente y de naturaleza hereditaria.


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Valor de referencia:
IFCC, en UI/l a 30C
Adultos hombres < 60 aos 30-90 U/L
Adultos mujeres < 60 aos 30-80 U/L
Ambos > 60 aos 30-90 U/L
Nios (IFCC, en UI/L a 37C)
1-30 das H: 75-316 M: 48-406
1 Mes-1 ao H: 82-383 M: 124-341
1-3 aos H: 104-345 M: 108-317
4-6 aos H: 93-309 M: 96-297
7-9 aos H: 86-315 M: 69-325
10-12 aos H: 42-362 M: 51-332
13-15 aos H: 75-390 M: 50-162
16-18 aos H: 52-171 M: 47-119
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CONCENTRACIN PLASMTICA.
Los niveles son significativamente ms altos en las
mujeres embarazadas y nios.

ALP elevada indica que podra haber formacin activa
de hueso, ya que ALP es un subproducto de la
actividad osteoblstica (como el caso de la
enfermedad de Paget del hueso).

Los niveles tambin son elevados en personas con
enfermedad celiaca sin tratar.

Niveles bajos de FA son menos comunes que los
niveles elevados.

Las comidas grasas, diabetes, lceras, etc.; elevan la
concentracin plasmtica de FA heptica.

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Altos niveles de la fosfatasa pueden mostrar que los
conductos biliares estn obstruidos.

La concentracin de FA en plasma es la magnitud
bioqumica con mayor sensibilidad para diagnosticar las
colestasis (es la detencin del flujo de bilis hacia
el duodeno).

Frmacos que aumentan los niveles de FA heptica:
verapamilo, carbamazepina, fenitona, eritromicina, alo
purinol, ranitidina.

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REDUCCIN DE NIVELES DE FOSFATASA ALCALINA
Hipofosfatasia
Postmenopausia las mujeres que reciben terapia con
estrgenos debido a osteoporosis.
Hombres con ciruga reciente de corazn, malnutricin,
deficiencia de magnesio, hipotiroidismo o anemia severa.
Nios con acondroplasia y cretinismo.
Nios despus de un episodio severo de la enteritis.
Anemia perniciosa y aplsica.
Leucemia mielgena crnica
Enfermedad de Wilson
Anticonceptivos orales

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REFERENCIAS
Murray K., Robert; Bender A., David; Botham M.,
Kathleen; Kennelly J., Peter; Weil P., Anthony. (2009)
HARPER Bioqumica ilustrada 28 Ed., McGraw Hill,
Mxico, D.F. pp: 57
Fuentes, X., (1998) Bioqumica Clnica y Patologa
Molecular, 2
a
Ed., Revert, Vol II, Barcelona, Espaa.
pp: 868-869
DM Vasudevan; Sreekumari S; Kannan Vaidyanathan.
(2011) Texto de Bioqumica, 6 Ed., Cullar Ayala,
Guadalajara, Jalisco, Mxico. Pp: 270
http://books.google.com.mx/books?id=vOwqAAAAYAAJ
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&hl=es-
419&sa=X&ei=144TU7CkKuaS2QXDl4HYBw&ved=0CE
YQ6AEwBA#v=onepage&q=enzyme%20linked%20imm
unosorbent%20assay&f=false

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