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FOSFATASA ALCALINA

Equipo 04: Mariana Cobos García, Andrés González
Méndez, Christian Rodolfo Rengel García y Cristian
Rodríguez Mateos.
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE QUÍMICA
BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL
SEMESTRE 2014-2
07/MARZO/2014
CINÉTICA
 Los experimentos de cinética examinan la relación que
existe entre la cantidad de producto (P) Formado en la
unidad de tiempo, Δ[P]/Δt (donde Δ es el símbolo
universal de cambio), de acuerdo a las condiciones
experimentales bajo las cuales se realiza la reacción.
 La base de la mayoría de las determinaciones cinéticas
es la observación de como la velocidad (v), de una
reacción varía directamente con la concentración de
cada una de las sustancias que actúan como reactivos
para producir el producto.
 Por ejemplo, la ecuación de velocidad para la
conversión, no enzimática, de un sustrato (S) a un
producto por una reacción de isomerización sería:

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CONSTANTE DE VELOCIDAD

 El símbolo k es llamada constante de velocidad e
indica la relación proporcional entre [S] y la
cantidad de producto producido por unidad de
tiempo, es decir indica la relación que existe entre
la [S] y la velocidad de la reacción.
 Cada reacción, bajo determinadas condiciones,
presenta una constante de velocidad característica.
 Las unidades en que se expresa la constante de
velocidad (k) serán s-1
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ENERGÍA LIBRE DE ACTIVACIÓN
 El punto máximo en esta figura expresa el valor de la
Energía Libre de Activación, es decir, la diferencia en
energía libre entre el(los) reactivo(s) y el estado de
transición en donde se ha formado el intermediario de
alta energía necesario durante la conversión de
reactivos a productos.
 El alto valor de esta energía libre de transición, para la
formación de este estado de alta energía, es lo que
propicia que las reacciones químicas no catalizadas
sean frecuentemente demasiado lentas.
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VELOCIDAD DE LA REACCIÓN

 Para que puedan reaccionar, las moléculas deben
contener suficiente energía para sobrepasar la
barrera que impone el alcanzar el estado de
transición.
 En ausencia de un catalizador, en nuestro caso en
ausencia de una enzima, la cantidad de moléculas
en una población de reactivos que pueden poseer
esta energía es muy pequeña y la capacidad de
formar producto es igualmente demasiado
pequeña.
 Por lo tanto la velocidad de la reacción esta
determinada por el número de moléculas con
energía suficiente para alcanzar el estado de
transición.

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INHIBIDORES ENZIMÁTICOS


 Los inhibidores enzimáticos son moléculas que se unen a
enzimas y disminuyen su actividad.
 La unión de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato
al sitio activo de la enzima y obstaculizar que la enzima
catalice su reacción correspondiente.
 La unión del inhibidor puede ser reversible o irreversible.
 Normalmente, los inhibidores irreversibles reaccionan con la
enzima de forma covalente y modifican su estructura química
a nivel de residuos esenciales de los aminoácidos necesarios
para la actividad enzimática.
 En cambio, los inhibidores reversibles se unen a la enzima de
forma no covalente, dando lugar a diferentes tipos de
inhibiciones, dependiendo de la manera como el inhibidor se
une a la enzima o al complejo enzima-sustrato.

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INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

 Competitiva El Inhibidor se fija en el sitio activo de la enzima.
La inhibición es reversible puesto que altas concentraciones
de sustrato compiten con el inhibidor. Depende de las
afinidades relativas de la enzima por su sustrato y por el
inhibidor. La Km aumenta, la Vmax permanece sin
cambios

 No-competitiva El Inhibidor se fija en un sitio diferente al sitio
activo de la enzima. El complejo ESI (Enzima-Sustrato-
Inhibidor) no puede formar productos. Concentraciones altas
de sustrato no son competidoras. La Km no se modifica, la
Vmax disminuye

 Un-competitiva o Anti-competitiva El inhibidor es capaz de
fijarse únicamente una vez que el complejo ES está ya
formado y el cambio en la conformación de la enzima le
proporciona un sitio para su fijación. Tanto la Km como la
Vmax disminuyen


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INHIBICIÓN COMPETITIVA
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INHIBICIÓN NO COMPETITIVA
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INHIBICIÓN ANTI-COMPETITIVA
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INHIBICIÓN POR SUSTRATO
 La inhibición por sustrato y por producto es donde el
sustrato o el producto de una reacción enzimática
inhiben la actividad enzimática.
 Este tipo de inhibición puede seguir cualquier tipo de
patrón de inhibición y es frecuentemente de gran
importancia en la regulación del metabolismo celular.
 En la inhibición por sustrato hay una disminución
progresiva de la actividad a altas concentraciones de
sustrato. Esto puede indicar la existencia de dos sitios
de unión entre sustrato y enzima. Cuando hay poco
sustrato, se ocupa el sitio de alta afinidad y sigue la
cinética normal. Sin embargo, a altas concentraciones,
el segundo sitio de inhibición se ocupa, inhibiendo a la
enzima.

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CARACTERÍSTICAS GENERALES

 Es una glicoproteína que se encarga de retirar
grupos fosfato de diversas moléculas
(desfosforilación), su estructura depende del sitio
donde se origina.

 En general es un dímero con subunidades casi
idénticas teniendo cada una 2 moléculas de Zinc;
una de ellas proporciona estabilidad a la enzima, la
otra le brinda propiedades catalíticas y cuatro
puentes disulfuro.

 Orto-fosfórico-monoéster hidrolasa
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 Se encuentran situadas en la membrana celular y entre
sus principales funciones se pueden mencionar:

 Precipitación del fosfato cálcico en huesos.

 Absorción de fosfatos por el intestino.

 Hidrólisis de esteres fosfáticos del riñón e hígado.

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 Peso molecular: 140 -160 KDa

 Punto isoeléctrico:
La fosfatasa alcalina puede existir como
isoenzimas con un rango de pH 4.4 - 5.8

 El pH óptimo: La enzima es más estable en el
rango de pH 7.5-9.5

 El pH óptimo para la actividad enzimática
es de pH 8-10.

 El pH óptimo cambiará dependiendo de sustrato, la
concentración de sustrato, y la concentración
iónica.

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 La enzima es una glicoproteína que contiene
aproximadamente 12% de carbohidratos (6% hexosas y
6% de otros azúcares neutras).

 La actividad máxima con fosfatasa alcalina se logra en la
presencia de magnesio.

 Inhibidores fuertes de la fosfatasa alcalina incluyen
arseniato, cisteína, yodo, fosfato inorgánico,
pirofosfato, fosfato de diisopropilo, fosfato de trifenilo, y
fluorofosfato de diisopropilo, y L-fenilalanina.
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REACCIÓN QUE CATALIZA

 La determinación de Fosfatasa Alcalina se lleva a cabo
mediante el método del p-nitrofenil-fosfato: la fosfatasa
alcalina cataliza la hidrólisis del enlace éster fosfórico
entre un grupo orgánico y un grupo fosforilo a pH alcalino
(NaOH), liberando fosfato inorgánico y p-
nitrofenol.
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El p-nitrofenol es un compuesto que presenta
absorbancia a λ = 405 nm (color amarillo), por lo que
el aumento de la absorbancia del p-nitrofenol en
función del tiempo es un indicador de la actividad
enzimática.

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 La ALP es una hidrolasa responsable de la
eliminación de grupos fosfato en las posiciones 5 -
y 3 - de muchas moléculas, como los nucleótidos,
proteínas y alcaloides.
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FACTORES QUE MODIFICAN SU ACTIVIDAD
 pH

 Temperatura

 Concentración del sustrato

 Presencia de un inhibidor
FOSFATASA ALCALINA BACTERIANA
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PRESENCIA DE LA FOSFATASA ALCALINA EN
BACTERIAS G(-)
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FOSFATASA ALCALINA EN HUMANOS
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PRESENCIA DE LA FOSFATASA ALCALINA EN HUMANOS
Epitelio Intestinal
Membranas de los
sinusoides y canalículos
del Hígado
Osteoblastos de Huesos
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Presente en la totalidad de tejidos corporales:

 Epitelio intestinal (transporte de lípidos)
 Osteoblastos (procesos de remodelación ósea)
 Placenta (durante el primer trimestre de embarazo)
 Hígado (membrana sinusoide y canalículos)


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ISOENZIMAS
 ALP -1: se sintetiza en células epiteliales del canalículo
biliar. (10% act. Total ALP)
 ALP -2 termolábil: estable a 56°C, pierde actividad a
65°C/30 min; se produce en células hepáticas (25% act. total)
 ALP -2 termoestable: no se degrada a 65°C pero se inhibe
con fenilalanina, de origen placentario y en sangre durante
embarazo (1% act. total)
 ALP pre-β: origen en hueso, termolábil (se destruye a
56°C/10 min) y constituye el 50% act. Total
 ALP gamma: se inhibe con fenilalanina y se origina en
células intestinales
 Fosfatasa alcalina de leucocitos (LAP): disminuye en
leucemia y aumenta en linfoma
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ENSAYO DE CINÉTICA ENZIMÁTICA
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3. Efecto del pH
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APLICACIONES:
La prueba de la fosfatasa alcalina (ALP o FA) se realiza
para:
 Comprobar si hay enfermedad hepática o daños en el
hígado. Los síntomas de la enfermedad del hígado
pueden incluir ictericia, dolor abdominal, náuseas y
vómitos. También se puede realizar una prueba de FA
para comprobar el hígado cuando se toman
medicamentos que pueden dañarlo.

 Controlar los problemas óseos tales como raquitismo,
osteomalacia, tumores óseos, enfermedad de Paget o
demasiada cantidad de la hormona que controla el
crecimiento del hueso (hormona paratiroidea). El nivel
de FA se puede utilizar para comprobar la eficacia del
tratamiento para la enfermedad de Paget o si se está
produciendo una deficiencia de vitamina D.

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 Edad. En mayores de 60 años se pueden obtener elevaciones de la
fosfatasa alcalina debido al proceso de involución ósea. En los niños y
adolescentes con crecimiento óseo esta enzima está normalmente
elevada ya que una de las mayores fuentes de fosfatasa alcalina es el
hueso.

 Embarazo. Principalmente durante el tercer trimestre, la placenta
produce fosfatasa alcalina, que está por encima del nivel normal,
alrededor de 125 a 250 UI/L. Esta elevación no es un motivo de
preocupación, ya que esta enzima es necesaria para la síntesis de
proteínas en las células y tiene una parte vital en la calcificación de los
huesos y cartílagos.

 Hiperfosfatasemia benigna familiar. Se produce cuando hay un
aumento persistente de la fosfatasa alcalina en miembros de una misma
familia en ausencia de enfermedad o causa clara de hiperfosfatasemia.
Es poco frecuente y de naturaleza hereditaria.


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 Valor de referencia:
IFCC, en UI/l a 30°C
Adultos hombres < 60 años 30-90 U/L
Adultos mujeres < 60 años 30-80 U/L
Ambos > 60 años 30-90 U/L
Niños (IFCC, en UI/L a 37°C)
1-30 días H: 75-316 M: 48-406
1 Mes-1 año H: 82-383 M: 124-341
1-3 años H: 104-345 M: 108-317
4-6 años H: 93-309 M: 96-297
7-9 años H: 86-315 M: 69-325
10-12 años H: 42-362 M: 51-332
13-15 años H: 75-390 M: 50-162
16-18 años H: 52-171 M: 47-119
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CONCENTRACIÓN PLASMÁTICA….
 Los niveles son significativamente más altos en las
mujeres embarazadas y niños.

 ALP elevada indica que podría haber formación activa
de hueso, ya que ALP es un subproducto de la
actividad osteoblástica (como el caso de la
enfermedad de Paget del hueso).

 Los niveles también son elevados en personas con
enfermedad celiaca sin tratar.

 Niveles bajos de FA son menos comunes que los
niveles elevados.

 Las comidas grasas, diabetes, úlceras, etc.; elevan la
concentración plasmática de FA hepática.

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 Altos niveles de la fosfatasa pueden mostrar que los
conductos biliares están obstruidos.

 La concentración de FA en plasma es la magnitud
bioquímica con mayor sensibilidad para diagnosticar las
colestasis (es la detención del flujo de bilis hacia
el duodeno).

 Fármacos que aumentan los niveles de FA hepática:
verapamilo, carbamazepina, fenitoína, eritromicina, alo
purinol, ranitidina.

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REDUCCIÓN DE NIVELES DE FOSFATASA ALCALINA
 Hipofosfatasia
 Postmenopausia las mujeres que reciben terapia con
estrógenos debido a osteoporosis.
 Hombres con cirugía reciente de corazón, malnutrición,
deficiencia de magnesio, hipotiroidismo o anemia severa.
 Niños con acondroplasia y cretinismo.
 Niños después de un episodio severo de la enteritis.
 Anemia perniciosa y aplásica.
 Leucemia mielógena crónica
 Enfermedad de Wilson
 Anticonceptivos orales

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REFERENCIAS
 Murray K., Robert; Bender A., David; Botham M.,
Kathleen; Kennelly J., Peter; Weil P., Anthony. (2009)
“HARPER Bioquímica ilustrada” 28° Ed., McGraw Hill,
México, D.F. pp: 57
 Fuentes, X., (1998) “Bioquímica Clínica y Patología
Molecular”, 2
a
Ed., Reverté, Vol II, Barcelona, España.
pp: 868-869
 DM Vasudevan; Sreekumari S; Kannan Vaidyanathan.
(2011) “Texto de Bioquímica”, 6° Ed., Cuéllar Ayala,
Guadalajara, Jalisco, México. Pp: 270
 http://books.google.com.mx/books?id=vOwqAAAAYAAJ
&pg=PA30&dq=enzyme+linked+immunosorbent+assay
&hl=es-
419&sa=X&ei=144TU7CkKuaS2QXDl4HYBw&ved=0CE
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