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Laboratorio de Toxicologa 2012-I

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE QUMICA

DEPARTAMENTO DE FARMACIA

Manual de guiones experimentales para la enseanza y aprendizaje del laboratorio de Toxicologa (clave 1614)
Alejandra Quijano Mateos Araceli Prez Vzquez Bernardo Lucas Florentino Carlos Prez Muoz Claudia Rivera Guevara Daniel Rosas Ramrez Eduardo Hernndez Vzquez Francisco Hernndez Luis Francisco Jurez Gonzlez Francisco Snchez Bartez Jorge Cornejo Garrido Jos Alberto Rivera Chvez Juan Francisco Palacios Espinosa Manuel Gutirrez Aguilar Mara Elena Bravo Gmez Mariana Flores Torres Martha Leyte Lugo Paulina del Valle Prez Perla Carolina Castaeda Lpez Silvia G. Dvila Manzanilla Sitlali del Rosario Olgun Reyes Sol Cristians Niizawa Viridiana Morales Snchez

Facultad de Qumica, UNAM


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Mxico, D.F. 2010


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Laboratorio de Toxicologa 2012-I

NDICE
PRLOGO REGLAMENTO DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA LOS LABORATORIOS DE LA FACULTAD DE QUMICA REGLAMENTO DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA LOS LABORATORIOS DEL DEPARTAMENTO DE FARMACIA REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE HOJA DE SEGURIDAD DE REACTIVOS HOJA DE VALORACIN PARA LA EVALUACIN DEL BIENESTAR DE LOS ANIMALES DE EXPERIMENTACIN IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE TXICOS NO VOLTILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA CUANTIFICACIN DE CIANURO DE HIDRGENO, COMO TXICO VOLTIL, A PARTIR DE GLUCSIDOS CIANOGNICOS PRODUCCION DE METAHEMOGLOBINA POR NITRITOS Y EFECTO PROTECTOR DEL AZUL DE METILENO IN VIVO DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA QUERCETINA Y EL CIDO NORDIHIDROGUAYARTICO EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD GENOTXICA DE LA CICLOFOSFAMIDA UTILIZANDO LA TCNICA DE MICRONCLEOS EN MDULA SEA EFECTO TXICO DE LA ADMINISTRACIN DE PLOMO EN RATAS EFECTO DEL pH EN LA LIBERACIN DE PLOMO POR UTENSILIOS DE BARRO VIDRIADO DETERMINACIN DE ETANOL EN UNA MUESTRA PROBLEMA GUIONES COMPLEMENTARIOS EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DE TXICOS NO VOLTILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA DETERMINACION DE MALATION RESIDUAL Pgina 3 6

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PROLOGO
En noviembre de 2004, el H. Consejo Tcnico de la Facultad aprob las modificaciones al plan de estudios de la carrera de Qumica Farmacutico Biolgica (QFB) y en junio de 2005 fue aprobado por el Consejo Acadmico de las Ciencias Biolgicas y de la Salud (CAABYS). De tal manera, que a partir del semestre 06-I se inici la implantacin gradual del mapa curricular del plan de estudios 2005. En este nuevo mapa curricular, la asignatura terico-experimental de Toxicologa, con clave 1614, qued ubicada en el 6 semestre para la carrera de QFB. El diseo del actual contenido programtico de la asignatura, consider revisar los conocimientos bsicos de toxicologa como son citotoxicidad, bioactivacin txica, estrs oxidante, mutagnesis, carcinognesis y teratognesis, para integrarlos a las etapas de estudio sobre el riesgo de exposicin, toxocintica y toxodinamia de las reacciones adversas ocasionadas por xenobioticos frmacos, metales pesados y sustancias de abuso. A travs del aprendizaje de esta asignatura, se pretende contribuir al perfil del egresado en el diseo, evaluacin y produccin de medicamentos, produccin de reactivos para diagnstico, diagnstico de laboratorio, investigacin biomdica y conservacin del medio ambiente. En consecuencia, el grupo de profesores de toxicologa, en forma colegiada, decidi realizar la actualizacin y modificacin del curso prctico, incluyendo algunos temas de inters actual en esta asignatura, y rediseando los existentes de acuerdo a la reforma a la enseanza experimental (Hernndez y Llano, 1994). Siguiendo estos criterios, se implementaron dos nuevas prcticas con el apoyo del proyecto PE202006 a travs del Programa de Apoyo a Proyectos para la Innovacin y Mejoramiento de la Enseanza (PAPIME), lo cual permiti la adquisicin de equipos, materiales y reactivos para la enseanza experimental de esta asignatura. Con base a lo anterior, los autores presentamos el Manual de guiones experimentales para la enseanza y aprendizaje del laboratorio de Toxicologa. Este manual est constituido por ocho guiones experimentales que cubren las unidades temticas del curso terico (Tabla 1) y que permiten integrar, aplicar y relacionar los conocimientos tericos adquiridos en la asignatura. Estos guiones propician tambin la integracin de algunos de los conocimientos adquiridos previamente en asignaturas como Bioqumica, Farmacologa, Qumica Analtica, y Qumica Orgnica, as como su correspondiente aplicacin a la resolucin de problemas de esta rea. Finalmente, es importante mencionar que el manual incluye una seccin de Guiones experimentales complementarios los cuales refuerzan los conocimientos en toxicologa analtica. Se considera que ambos guiones se podran realizar en funcin del calendario escolar correspondiente.

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Tabla 1. Relacin entre las unidades temticas del curso terico y los guiones experimentales. Curso laboratorio Curso terico Guin experimental Unidad temtica Identificacin y cuantificacin de txicos no Introduccin a la Toxicologa voltiles en una muestra problema Cuantificacin de cianuro de hidrgeno, La biotransformacin de xenobiticos y como txico voltil, a partir de glucsidos su importancia toxicolgica. cianognicos Produccin de metahemoglobina por nitritos La biotransformacin de xenobiticos y y efecto protector del azul de metileno in vivo su importancia toxicolgica. Determinacin de la capacidad antioxidante de la quercetina y el cido El estrs oxidante nordihidroguayartico. Cuantificacin de microncleos en eritrocitos Mutagnesis, Carcinognesis y de mdula sea como indicador de Teratognesis genotoxicidad Efecto txico de plomo en ratas Toxicidad de metales pesados Efecto del pH en la liberacin de plomo por Toxicidad de metales pesados utensilios de barro vidriado Determinacin de etanol en una muestra Toxicidad de sustancias de abuso problema GUIONES COMPLEMENTARIOS Extraccin y cuantificacin de txicos no Introduccin a la toxicologa voltiles en una muestra problema La biotransformacin de xenobiticos y Determinacin de malatin residual su importancia toxicolgica

Los guiones experimentales se elaboraron siguiendo los criterios establecidos por la Reforma de la Enseanza Experimental, donde la adquisicin del conocimiento se da a la luz de las evidencias observables o medibles de los fenmenos que ocurren en el laboratorio. El estudiante es enfrentado a los mismos a travs de un problema bien definido, el cual debe ser resuelto encontrando las relaciones causa-efecto de stos a travs del trabajo experimental. Cada uno de los guiones est estructurado de la siguiente manera: OBJETIVO ACADMICO. Se establece para reforzar y enriquecer los conocimientos adquiridos en las clases tericas, as como el desarrollo de habilidades para el manejo de materiales y tcnicas
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analticas empleadas comnmente para determinar y/o identificar la presencia de xenobiticos. PROBLEMA Se plantea con la intencin de enfrentar al estudiante con fenmenos relacionados con el rea que le permita adquirir los conocimientos planteados en el OBJETIVO ACADMICO a travs del trabajo experimental; encontrando las relaciones causaefecto y relacionando estos hallazgos con el riesgo de intoxicacin y/o el potencial toxicolgico. DESARROLLO EXPERIMENTAL Describe el procedimiento y tcnicas utilizadas para el desarrollo y obtencin de resultados que permitan resolver el PROBLEMA. CUESTIONARIO Se incluye con la intencin de dirigir al estudiante hacia la resolucin del PROBLEMA, resaltando los aspectos vivenciales de la experiencia en el laboratorio y, de esta forma, reforzar el proceso cognoscitivo. APNDICE I : CONOCIMIENTOS PREVIOS ste apndice contiene un listado de los conceptos indispensables para que el estudiante comprenda el guin y sea capaz de resolver el PROBLEMA planteado. APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS En este apndice se indican las cantidades necesarias para la preparacin de los reactivos a emplear en el DESARROLLO EXPERIMENTAL. APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS Considerando que en cada sesin de laboratorio se generan un nmero importante de residuos se contempl la necesidad de indicar puntualmente cada uno de ellos as como la manera en que debern ser confinados y etiquetados para su posterior tratamiento. Los autores consideramos importante tambin incluir en el presente material el Reglamento de Higiene y Seguridad de la Facultad y del Departamento de Farmacia, para concientizar a los alumnos de la relevancia y carcter obligatorio de ambos, promoviendo de esta forma el desarrollo de actitudes apropiadas para un profesionista en el rea de las ciencias biolgicas y de la salud. Finalmente, los autores agradecemos el apoyo brindado a travs del proyecto PAPIME No. PE202006 de la Direccin General de Asuntos del Personal Acadmico (DGAPA) de la UNAM.
Hernndez Luna, M. y Llano Lomas, M. Propuesta de Reforma de la Enseanza Experimental. Revista del IMIQ, Ao XXV, vol. 07, 1994, pp. 5-7.

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Reglamento de Higiene y Seguridad para los Laboratorios de la Facultad de Qumica


ARTCULO 1. El presente Reglamento es aplicable en todos aquellos de la Facultad de Qumica en donde se realice trabajo experimental, sea de docencia o de investigacin. Estos sitios, para efectos del presente Reglamento, sern denominados laboratorios. Su observancia es obligatoria para el personal acadmico alumnos y trabajadores administrativos y no excluye otra reglamentacin que resulte aplicable. ARTCULO 2. Es necesario que el personal que trabaja en cada laboratorio conozca el sistema de alertamiento, las zonas de seguridad, las rutas de evacuacin, el equipo para combatir siniestros y las medidas de seguridad establecidas en cada laboratorio. ARTCULO 3. Los laboratorios debern a) Un control maestro para energa elctrica b) Un botiqun de primeros auxilios c) Extintores d) Un sistema de ventilacin adecuado e) Agua corriente f) Drenaje g) Un control maestro para suministro de gas h) Sealamientos de proteccin Civil estar acondicionados, como mnimo con lo siguiente:

ARTCULO 4. Todas las actividades que se realicen en los laboratorios debern estar supervisadas por un responsable. Los Departamentos acadmicos respectivos nombrarn a dicho responsable en sus reas correspondientes. ARTCULO 5. Al realizar actividades experimentales, nunca deber estar una persona sola en los laboratorios. El mnimo de personas deber ser, invariablemente, de 2. ARTCULO 6. Los usuarios debern abstenerse de dejar, en el lugar de trabajo, cosas de valor a la vista y cerrar las puertas de cubculos y laboratorios, as como cajones y archiveros, siempre que se ausente del laboratorio. ARTCULO 7. Para trabajar en los laboratorios es obligatorio que los estudiantes usen bata y lentes de seguridad. En el caso del personal acadmico y administrativo, el equipo de proteccin personal, lo dictaminar la Comisin Mixta de Higiene y Seguridad. Este equipo ser de uso obligatorio. El alumno que no tenga proteccin no podr permanecer en el laboratorio, siendo su responsabilidad contar con el equipo mencionado. Adems no podr trabajar ni permanecer dentro de los laboratorios, si no se encuentra su profesor o alguien responsable que los sustituya. ARTCULO 8. En los laboratorios queda prohibido: fumar, consumir alimentos o bebidas, el uso de lentes de contacto y el uso de zapatos abiertos (tipo huarache). ARTCULO 9. Para realizar trabajos con material radiactivo es obligatorio aprobar el curso de su manejo, as como la obtencin del dosmetro correspondiente. ARTCULO 10. Todas las substancias, equipos, materiales, etc., debern ser manejados con el mximo cuidado, atendiendo a las indicaciones de los manuales de uso o de los manuales de seguridad, segn el caso. ARTCULO 11. Las puertas de acceso y salidas de emergencias debern de estar siempre libres de obstculos, accesibles y en posibilidad de ser utilizadas ante cualquier eventualidad. El responsable del rea deber verificar esto, al menos una vez cada semana. ARTCULO 12. Las regaderas debern contar con el drenaje correspondiente, funcionar correctamente, estar lo ms alejadas que sea posible de instalaciones o controles elctricos y libres de todo obstculo que impida su correcto uso. El responsable del rea deber verificar esto, por lo menos una vez cada semana. ARTCULO 13. Los controles maestros de energa elctrica y suministros de gas para cada laboratorio debern estar sealados adecuadamente, de manera tal que sean identificados fcilmente. ARTCULO 14. En cada laboratorio deber existir al alcance de todas las personas que en l trabajen, un botiqun de primeros auxilios. El responsable del rea deber verificar, al menos una vez cada semana, e contenido del botiqun, para proceder a reponer los faltantes. ARTCULO 15. Los extintores de incendios debern ser de CO2, y de polvo qumico seco, segn lo determine la Subcomisin Mixta de Higiene y Seguridad y/o el Departamento de Bomberos de la Universidad; debern de recargarse cuando sea necesario, de conformidad con los resultados de la revisin o por haber sido utilizados.

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ARTCULO 16. En caso de emergencias, con incendios, derrames o personas accidentadas, dirigirse a la zona de seguridad establecida y/o activar el servicio de Emergencias 55 (red digital UNAM). Al activarlo: Identifquese: Nombre y Puesto. Ubicacin: D el mayor nmero de referencias fsicas posibles y las vas de acceso. Tipo de siniestro. Nmero de lesionados. Apoyo: Especifique si requiere apoyo adicional de vigilancia. Avisar de inmediato al encargado de la Seguridad del rea y a la Coordinacin de Seguridad. ARTCULO 17. Los sistemas de extraccin de gases debern de mantenerse siempre sin obstculos que impidan que cumplan con su funcin, debern de evaluarse al menos una vez cada mes, y debern recibir el mantenimiento preventivo o correctivo que los responsables de cada rea soliciten. ARTCULO 18. Tanto los sistemas de suministro de agua corriente como de drenaje, debern de recibir el mantenimiento preventivo o correctivo que los responsables de cada rea soliciten. ARTCULO 19. Los lugares en que se almacenen reactivos, disolventes, equipos, materiales, medios de cultivo, y todo aquello relacionado o necesario para que el trabajo en los laboratorios se lleve a cabo, estarn sujetos a este Reglamento en su totalidad. ARTCULO 20. Queda prohibido desechar sustancias al drenaje o por cualquier otro medio sin autorizacin del responsable del rea correspondiente. Los manuales de prcticas correspondientes debern incluir la forma correcta de desechar los residuos. ARTCULO 21. Para transferir lquidos con pipetas, deber utilizarse la llenadora correspondiente. Queda prohibido pipetear con la boca. ARTCULO 22. Al finalizar las actividades en el laboratorio, el responsable del rea deber verificar que queden cerradas las llaves de gas, agua, vaco, tanques de gases y aire, segn sea el caso; apagadas las bombas de vaco, circuitos elctrico, luces, etc. En caso de requerir que algn equipo trabaje de manera contina, deber dejarse en el interior y en el exterior del laboratorio correspondiente, en forma claramente visible y legible, la informacin acerca del tipo de reaccin o proceso en desarrollo, las posibilidades fuentes de problema, la manera de controlar los eventuales accidentes, y la forma de localizar al responsable del equipo. ARTCULO 23. Cuando se trabaje con sustancias txicas, deber identificarse plenamente el rea correspondiente. Nunca debern tomarse frascos por la tapa o el asa lateral, siempre debern tomarse con ambas manos, una en la base y la otra en la parte media. Adems se deber trabajar en rea con sistema de extraccin y equipo de proteccin personal (segn el manual correspondiente). ARTCULO 24. En cada laboratorio de la Facultad deber existir, de manera clara, visible y legible, la informacin acerca de los telfonos de emergencia a los cuales llamar en caso de requerirlo. ARTCULO 25. Todas aquellas cuestiones que no estn especficamente sealadas en el presente Reglamento, debern ser resueltas por la Direccin de la Facultad con la opinin de la Coordinacin de Seguridad, Prevencin de Riesgos y Proteccin Civil. ARTCULO 26. Cualquier alteracin en las condiciones de seguridad o en el cumplimiento del presente reglamento, deber ser reportado al responsable correspondiente. ARTCULO 27. Las personas a quienes se sorprenda haciendo mal uso de equipos, materiales, instalaciones, etc. propias de los laboratorios, de todo aquello mencionado en el artculo 2 del presente Reglamento, o de las sealizaciones instaladas para proteccin civil, sern sancionadas conforme a la Legislacin Universitaria, segn la gravedad de la falta cometida. ARTCULO 28. En el caso de los alumnos, las sanciones aplicables sern las que decida el H. Consejo Tcnico, conforme a las disposiciones de la Legislacin Universitaria. ARTCULO 29. Tratndose de personal acadmico y administrativo, se levantarn las actas correspondientes y se dictarn las sanciones conforme a las disposiciones de la Ley Federal del Trabajo. ARTCULO 30. Cada rea acadmica deber tener un Reglamento Interno de Higiene y Seguridad y ser de observancia obligatoria, siendo este complementario al presente Reglamento, en tanto no lo contravengan. TRANSITORIO NICO. El presente reglamento entrar en vigor el da siguiente de su publicacin en la gaceta de la propia Facultad.

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Reglamento de Higiene y Seguridad de los Laboratorios del Departamento de Farmacia


ARTCULO 1. El presente Reglamento es complementario del Reglamento de Higiene y Seguridad, para Laboratorios de la Facultad de Qumica de la UNAM, aprobado por el H. Consejo Tcnico el 28 de abril de 1994. Su observancia es obligatoria para el personal acadmico, alumnos y trabajadores administrativos, y no excluye otra reglamentacin que resulte aplicable. ARTCULO 2. REGLAS DE SEGURIDAD 2.1 Seguir todas las indicaciones de seguridad que se sealan en cada equipo o reactivo, as como las sealadas en cada prctica. 2.2 Queda prohibido correr dentro del laboratorio. 2.3 Todas las lesiones sufridas dentro del laboratorio, no importa qu tan insignificantes sean, debern darse a conocer al coordinador del laboratorio. 2.4 Antes de desarmar o limpiar un aparato elctrico, debe asegurarse de que est desconectado de la corriente elctrica. Nunca opere un equipo que desconoce, pregunte primero al laboratorista o al profesor. 2.5 No debe usarse material de vidrio roto o despostillado. 2.6 Si en su rea o equipo se va a efectuar algn servicio de mantenimiento, asegrese de dar aviso oportuno a todos los involucrados y comunquelo a la Coordinacin de Seguridad. 2.7 El alumno que necesite salir por cualquier motivo, deber comunicarlo a los profesores. 2.8 El alumno que acta como supervisor de cada equipo de trabajo, deber verificar, al finalizar la prctica, el orden y la limpieza de cubculos y equipos. 2.9 Al finalizar cada sesin prctica, los alumnos entregarn al profesor responsable de la asignatura o al laboratorista en turno, los cubculos y equipos empleados, limpios y en buen estado; asimismo debern informar cualquier defecto o anomala detectada en los mismos. 2.10 Deber colocar sus artculos personales en el sitio que para tal efecto se asignar en cada laboratorio. ARTCULO 3. MANUFACTURA DE MEDICAMENTOS 3.1 Todo el personal involucrado en la manufactura de medicamentos, deber cubrir totalmente su cabello con una cofia limpia y en buen estado. 3.2 Deber usar guantes de cirujano y cubrebocas limpios, en buen estado, cuando el proceso lo indique (por ejemplo, surtido y pesado de materias primas, etc.). 3.3 De preferencia debe portar zapatos cerrados con suela antiderrapante. 3.4 Queda prohibido introducir alimentos, bebidas o golosinas, excepto cuando as se requiera (Biofarmacia). 3.6 Quedan prohibidas las visitas. 3.7 Las puertas de los cubculos deben permanecer cerradas. ARTCULO 4. DISPOSICIN DE RESIDUOS BIOLGICOS 4.1 En caso de romper o derramar material contaminado, se deber agregar fenol al 5% y dejar actuar el desinfectante por 10 minutos. 4.2 Queda estrictamente prohibido arrojar medio de cultivo, disolventes orgnicos o productos biolgicos, al sistema de drenaje, as como a los colectores de basura; estos residuos se debern incorporar a recipientes que se localizan en cada laboratorio, para ser dispuestos adecuadamente. 4.3 Los cultivos deben esterilizarse antes de ser desechados; si se encuentran en material desechable, ste debe depositarse en los recipientes que se localizan en cada laboratorio. Estos residuos sern reciclados. 4.4 Otros desechos orgnicos (alimentos, animales, muestras biolgicas) se depositarn en los recipientes etiquetados que para este propsito se encuentran en cada laboratorio. 4.5 El material de plstico se depositar en otro recipiente especial. 4.6 El material de vidrio se colectar aparte, en el recipiente indicado. 4.7 El papel limpio de desecho se depositar en otra caja para ser reciclado. ARTCULO TRANSITORIO NICO. El presente Reglamento entrar en vigor al da siguiente de su aprobacin por el H. Consejo Tcnico de la Facultad.

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REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE


Fecha: Guin: Integrantes: Grupo : Equipo: Responsable:

UTILIZACIN DE REACTIVOS
Reactivo Cantidad empleada
(por equipo)

Observaciones anormales
(contaminado, ms de una fase, coloracin anormal, precipitados)

VIGILANCIA DE EQUIPO
Equipo
Hora de inicio de uso/ trmino (Cantidad pesada1, longitud de onda2, rpm3, tiempo4, 5 temperatura , disolvente 6 utilizado , aumento7, 8 volumen )

Condiciones de uso

Observaciones
(Sucio, no funciona adecuadamente, sin observaciones, anotar el nmero de equipo o inventario cuando considere que requiere mantenimiento)

Balanza1 Espectrofotmetro2 Centrfuga3,4 Microcentrfuga3,4 Estufa4,5 Rotaevaporador5,6 Microscopio7 Lmpara de luz UV Micropipeta8

TRATAMIENTO DE RESIDUOS
Residuo R0 R1 R2 R3 R4
+

Observaciones
(contenido, estado fsico, si hay ms de una fase o tiene precipitado)

CRETIB+ CR CR CR CR CR E E E E E T T T T T I I I I I B B B B B

Marque con una X, la(s) letra(s) correspondiente de acuerdo al sistema CRETIB (Corrosivo, Reactivo, Explosivo, Txico, Inflamable, Biolgico-Infeccioso)

_______________________________________________________________
(Nombre y firma del encargado de seguridad)

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HOJA DE SEGURIDAD DE REACTIVOS Investigue los siguientes datos (MSDS, Merck Index) y complete las siguientes tablas para cada sustancia a emplear. Posteriormente, en el Rombo de comunicacin de riesgos, indique el valor de 0 a 4, correspondiente a cada riesgo (Salud, Inflamabilidad, Reactividad y Caractersticas especficas) de acuerdo a la Clasificacin y grados de riesgo de las sustancias peligrosas (ANEXO 1 DEL REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE).
Reactivo: DL50/CL50 (rata): Punto de ignicin: Reactividad / Incompatibilidad: Caractersticas especficas: Equipo de proteccin personal: Reactivo: DL50/CL50 (rata): Punto de ignicin: Reactividad / Incompatibilidad: Caractersticas especficas: Equipo de proteccin personal: Reactivo: DL50/CL50 (rata): Punto de ignicin: Reactividad / Incompatibilidad: Caractersticas especficas: Equipo de proteccin personal: Reactivo: DL50/CL50 (rata): Punto de ignicin: Reactividad / Incompatibilidad: Caractersticas especficas: Equipo de proteccin personal: Reactivo: DL50/CL50 (rata): Punto de ignicin: Reactividad / Incompatibilidad: Caractersticas especficas: Equipo de proteccin personal:
En Equipo de proteccin personal indique la(s) letra(s) de identificacin correspondiente(s) con base en la tabla del ANEXO 1.

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ANEXO 1 DEL REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE CLASIFICACIN Y GRADOS DE RIESGO DE LAS SUSTANCIA QUMICAS

LETRAS DE IDENTIFICACIN PARA EL EQUIPO DE PROTECCIN PERSONAL


Letra A B C D E F G H I J K X Equipo de proteccin personal Anteojos de seguridad Anteojos de seguridad y guantes Anteojos de seguridad, guantes y mandil Careta, guantes y mandil Anteojos de seguridad, guantes y respirador para polvos Anteojos de seguridad, guantes, mandil y respirador para vapores Anteojos de seguridad, guantes y respirador para vapores Gafas de seguridad para salpicaduras, guantes, mandil y respirador para vapores Anteojos de seguridad, guantes y respirador para polvos y vapores Gafas de seguridad para salpicaduras, guantes, mandil y respirador para polvos y vapores Capucha con lnea de aire o equipo SCBA, guantes, traje completo de proteccin y botas Consulte con el supervisor las indicaciones especiales para el manejo de estas sustancias
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Hoja de valoracin para la evaluacin del bienestar de los animales de experimentacin


Debido a que el trabajo experimental del guin se desarrollar en cuatro sesiones de laboratorio y en tres de ellas los animales de experimentacin sern administrados con acetato de plomo va intraperitoneal, por recomendacin expresa del CICUAL, se realizar la revisin de los mismos posterior a la administracin del xenobitico. Para tal efecto, debern reportar las caractersticas enunciadas en los recuadros presentados a continuacin con la finalidad de identificar a los animales que puedan presentar dao provocado por una inadecuada administracin del acetato de plomo. En caso de detectar cualquier dao se deber reportar a los Profesores de laboratorio as como al responsable del bioterio, para que se realice la eutanasia del animal.
Fecha de inicio: Fecha de trmino:

Fecha Macroequipo responsable Hora * Actividad Aislado Pelo Erizado Frecuencia de respiracin Acicalamiento en el punto de administracin Presencia de herida o irritacin en la zona de aplicacin Inquisitivo o alerta al momento de sujetarlo Orificios sucios (diarrea u orina) Coloracin anormal de los ojos Extremidades azules Observaciones adicionales: Nombre del revisor Firma del responsable del bioterio * En caso de que una o varios animales presente poca actividad con respecto a la del control, anote los nmeros de las correspondientes. En caso de que la respuesta sea S, anote el Nmero de rata. Compare con los animales control. (#Rata) + R = rpida; D = dbil; N = normal. Compare con los animales control. Medidas Cientficas: Si se procede a la eutanasia de algn animal, favor de avisarle al profesor para que lleve a cabo este procedimiento. Se recomienda recuperar 3 mL de sangre y guardarla en un tubo heparinizado.

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IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE TXICOS NO VOLTILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA

OBJETIVOS ACADMICOS Que el alumno emplee mtodos de extraccin cida y bsica para separar txicos no voltiles de naturaleza cida y bsica en una muestra problema. Que el alumno emplee reacciones coloridas y cromatografa en capa fina (CCF) para la identificacin de txicos no voltiles en una muestra problema. Que el alumno cuantifique un txico no voltil en una muestra problema. PROBLEMA Separar e identificar escopolomina, paracetamol, cido 4-hidroxibenzoico y cido barbitrico de una muestra problema; y cuantificar el cido barbitrico presente. REACTIVOS Hidrxido de amonio (NH4OH) Metanol (MeOH) cido actico glacial (AcOH) Reactivo de Dragendorff * Reactivo de Dille-Koppanyi * Paracetamol cido tartrico * Solucin de cido clorhidrico 1N* Acetato de etilo (AcOEt) *Ver APNDICE II Solucin de NaOH al 10%* Acetato de etilo (AcOEt) Escopolamina Diclorometano (CH2Cl2) cido barbitrico cido 4-hidroxibenzoico Solucin acuosa de cido actico 2 M* Sulfato de sodio anhidro Solucin de NaHCO3 al 10%

Solucin saturada de nitrito de sodio (NaNO2) * cido clorhdrico (HCl)

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EQUIPO Rotaevaporador Lmpara de luz ultravioleta Bomba de aspersin Espectrofotmetro

MATERIAL POR E QUIPO (Primer sesin) Embudo de separacin de 250 mL Embudo de cola corta Matraz Erlenmeyer de 125 mL Matraz de bola de 50 mL Vaso de precipitados de 250 mL Vaso de precipitados de 100 mL Vidrio de reloj de 9 cm 2 Agitador de vidrio 2 Probeta de 10 mL 6 Pipeta graduada de 10 mL 2 Anillo metlico 5 Tubos de ensayo 4 Anillos de corcho 2 Pipeta Pasteur 1 2 2 2 8 2 4

MATERIAL POR E QUIPO (Segunda sesin) Cromatoplacas Vaso de precipitados de 100 mL 1 Tubos capilares 4 Pipeta graduada de 10 mL 3 2

MATERIAL PARA LA CURVA (Segunda sesin) Matraz volumtrico de 25 mL Matraz volumtrico de 10 mL Pipetas volumtricas de 5 mL 1 Pipeta volumtrica de 4 mL 4 Micropipetas de 100-1000 L 2 1 1

NOTA: El profesor proporcionara las celdas para las lecturas

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DESARROLLO EXPERIMENTAL El profesor proporcionar una muestra problema de 30 mL, la cual contiene los txicos no voltiles escopolamina, paracetamol, cido 4-hidroxibenzoico y cido barbitrico. PRIMERA SESION A) EXTRACCION CIDA 1. 2. 3. 4. A 15 mL de la muestra problema se agrega una solucin acuosa de cido tartrico al 10% hasta un pH = 2. La solucin cida se trasvasa a un embudo de separacin y se extrae con dos porciones de 15 mL de AcOEt, separando las fases orgnicas y reunindolas en un matraz. La fase orgnica se extrae con dos porciones de 15 mL de una solucin de bicarbonato de sodio (NaHCO3) al 10%, separando las fases acuosas y reunindolas en un matraz. En un embudo de cola corta se coloca un algodn en el fondo, posteriormente se adiciona sulfato de sodio anhidro hasta formar una capa de alrededor de 1 cm sobre el algodn. Filtrar la fase orgnica a travs de este dispositivo (proceso de secado sobre sulfato de sodio anhdro). La fase orgnica se concentra in vacuo y el residuo final se reconstituye con 2 mL de AcOEt. Etiquetar como fraccin A1. 5. A la fase acuosa que se obtuvo en el inciso 3 se le adiciona HCl concentrado hasta pH = 1 y posteriormente se extrae con dos porciones de 15 mL de AcOEt, separando las fases orgnicas y reunindolas en un matraz. 6. La fase orgnica obtenida en el inciso 5 se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se concentra in vacuo y el residuo final se reconstituye con dos mL de AcOEt. Etiquetar como fraccin A2. 7. A la fase acuosa obtenida en el inciso 2 se le adiciona gota a gota (aproximadamente 25 gotas) de una solucin de NaOH al 10% hasta pH = 10.

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8.

La solucin bsica se trasvasa a un embudo de separacin y se extrae con dos porciones de 15 mL de CH2Cl2, separando las fases orgnicas y reunindolas en un matraz.

9. 10. 11.

La fase orgnica se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se concentra in vacuo y el residuo final se reconstituye con 2 mL de CH2Cl2. Etiquetar como fraccin A3. A la fase acuosa obtenida en el inciso 8 se le adiciona HCl concentrado gota a gota hasta pH = 2. Etiquetar como fraccin A4. Tomar 2 mL de la fraccin A4 y llevar a sequedad con ayuda de una parrilla de calentamiento; el residuo obtenido se reconstituye en 2 mL de metanol y se conserva para su posterior anlisis con las pruebas de identificacin.

12.

El remanente de la fraccin A4 se conserva para la cuantificacin de cido barbitrico en la muestra en la segunda sesin.

B) EXTRACCION BSICA 1. 2. A 15 mL de la muestra problema se agrega una solucin de NaOH al 10% hasta un pH = 10 (aproximadamente 1 mL). La solucin bsica se trasvasa a un embudo de separacin y se extrae con dos porciones de 15 mL de CH2Cl2, separando las fases orgnicas y reunindolas en un matraz. 3. La fase orgnica obtenida en el inciso 2 se seca sobre sulfato de sodio anhdro y se lleva a sequedad a presin reducida. El residuo obtenido se reconstituye en 2 mL de MeOH. Etiquetar como fraccin B3. 4. 5. A la fase acuosa obtenida en el punto 2 se le adiciona gota agota una solucin de HCl 1N hasta pH = 7. La fase acuosa neutra se trasvasa a un embudo de separacin y se extrae con dos porciones de 15 mL de AcOEt. La fase orgnica obtenida se seca sobre sulfato de

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sodio anhidro, se concentra in vacuo y el residuo final se reconstituye en 2 mL de AcOEt. Etiquetar como fraccin B1. 6. La fase acuosa neutra se lleva a pH = 2 adicionando HCl 1N, posteriormente, esta fase se trasvasa a un embudo de separacin y se extrae con dos porciones de 15 mL de AcOEt. 7. La fase orgnica obtenida en el inciso 6 se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se concentra a presin reducida y el residuo final se reconstituye en dos mL de AcOEt. Etiquetar como fraccin B2. 8. 9. La fase acuosa resultante del punto 6 se etiqueta como fraccin B4. Tomar 2 mL de la fraccin B4 y llevar a sequedad con ayuda de una parrilla de calentamiento; el residuo obtenido se reconstituye en 2 mL de metanol y se conserva para su posterior anlisis. 10. El remanente de la fraccin B4 se conserva para la cuantificacin de cido barbitrico en la muestra durante la siguiente sesin. NOTA: El disolvente recuperado al final de la concentracin in vacuo se depositar en el contenedor etiquetado como R1 para A3 y B3 y en R2 para A1-2, 4 y B1-2, 4. R3. Los residuos de sulfato de sodio anhidro se depositan en el contenedor etiquetado como R3.

SEGUNDA SESION C) IDENTIFICACIN Cromatografa en capa fina Solicitar a los profesores dos placas para cromatografa en capa fina (CCF). Los anlisis por CCF se realizan en cromatoplaca de 5 cm X 2.5 cm, que consisten en placas de aluminio recubiertas con una capa de gel se slice (slica Kieselgel 60 F254 Merck) 1. Previamente, se aplicar en el lado izquierdo de una cromatoplaca (placa 1) la referencia de escopolamina, en la placa 2 la de cido barbitrico, en la placa 3 la referencia de
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paracetamol y en la 4 la de cido 4-hidroxibenzoico. Colocar la muestra de los residuos reconstituidos previamente aplicndolas en el lado derecho de cada una de las placas de acuerdo al siguiente esquema.

Esquema 1. CCF de las muestras en estudio. 2. Para la identificacin de la escopolamina emplear como sistema de elucin una mezcla de CH2Cl2-MeOH- NH4OH (9:1:0.1). NOTA: Para preparar este sistema de elucin es necesario mezclar bien el hidrxido de amonio y metanlo primero, y posteriormente verter la mezcla resultante en el CH2Cl2. 3. Para la identificacin del cido barbitrico emplear como sistema de elucin una mezcla de AcOEt-MeOH-AcOH (7:2:1). Agitar vigorosamente la mezcla de elucin antes de eluir la placa. 4. 5. 6. 7. Para la identificacin de paracetamol utilizar como sistema de elucin una mezcla CH2Cl2-MeOH (9:1). Para la identificacin de cido 4-hidroxibenzico utilizar como sistema de elucin una mezcla CH2Cl2-MeOH (9:1) + 10 gotas de AcOH, por cada 10 mL de mezcla. Saturar las cmaras durante 10 minutos antes de eluir las muestras en las cromatoplacas. Eluir hasta la lnea limite de elucin indicada en el esquema 1.
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8.

Visualizar la presencia de las sustancias con una lmpara de luz U.V. a 254 nm y posteriormente, revelar las cromatoplacas utilizando la solucin etiquetada como solucin reveladora de reactivo de Dragendorff para el caso del alcaloide (escopolamina), con una cmara de yodo para el cido barbitrico, y con sulfato crico amoniacal/H2SO4 para el paracetamol y cido 4-hidroxibenzoico.

9.

Calcular el factor de retencin (Rf) para cada sustancia de acuerdo al esquema 1 y comparar el valor obtenido con el de la referencia correspondiente.

10. Una vez identificados los componentes de sus fracciones desechar los sistemas de elucin de la siguiente forma: depositar la mezcla CH2Cl2-MeOH-NH4OH (9:1:0.1) en el contenedor etiquetado como R4; depositar la mezcla AcOEt-MeOH-AcOH (7:2:1) en el contenedor etiquetado como R5; depositar las mezclas que contengan CH2Cl2-MeOH-AcOH en el contenedor etiquetado como R6. Depositar las cromatoplacas en una bolsa de plstico etiquetada como R7

Identificacin por reacciones de color Con el excedente de las fracciones reconstituidas realizar los ensayos respectivos.

Escopolamina: reactivo de Dragendorff 1. Colocar 10 gotas de la fraccin reconstituida correspondiente a escopolamina en un tubo de ensayo y agregar 2 gotas de solucin reveladora de Dragendorff. 2. Realizar un control positivo con la muestra de referencia y un control negativo con CH2Cl2 para esta reaccin. Barbitricos: reactivo de Dille-Koppanyi 1. Colocar 10 gotas de la fraccin reconstituida correspondiente a barbitricos en un tubo y agregar dos gotas del reactivo A y una gota del reactivo B (Dille-Koppanyi). 2. Realizar un control positivo con la muestra de referencia y un control negativo con MeOH para esta reaccin.
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3. Una vez identificadas TODAS las fracciones desechar de la siguiente manera: Depositar las fracciones A4, B4 y los residuos de la reaccin de Dille-Koppanyi en el contenedor etiquetado como R8. Depositar las fracciones A3, B3 y los residuos de la reaccin de Dragendorff en el contenedor etiquetado como R9. Nota: Los residuos de paracetamol y cido 4-hidroxibenzoico se depositarn en los contenedores etiquetados como R10 y R11, respectivamente. D) CUANTIFICACIN DE CIDO BARBITRICO PREPARACIN DE LA CURVA PATRN DE CIDO BARBITRICO La curva patrn de cido barbitrico se prepara colocando en matraces volumtricos de 10 mL los volmenes de la solucin patrn de cido barbitrico indicados en la Tabla 1 y llevando al aforo con agua destilada:

Tabla 1. Curva patrn de cido barbitrico


No. de tubo Alicuota de la solucin patrn de cido barbitrico (mL) Concentracin de cido barbitrico (mg/mL)

1 2 3 4 5

0.0 1.5 3 6 8

BLANCO 0.45 0.90 1.80 2.40

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TRATAMIENTO

DE

LAS

FRACCIONES

QUE

CONTIENEN

CIDO

BARBITRICO: MUESTRA PROBLEMA, CURVA PATRN Y BLANCO 1. Colocar en tubos de ensaye 1 mL de cada una de las fracciones que contienen cido barbitrico (muestra problema, patrn y blanco). 2. Adicionar a cada uno de los tubos de ensaye 0.5 mL de la solucin saturada de NaNO2, 0.1 mL de la solucin de AcOH 2M y 2.4 mL de agua destilada. 3. Determinar la absorbancia de cada una de las muestras en el espectrofotmetro a 530 nm, utilizando como blanco el tubo nmero 1 de la curva (ver Tabla 1). 4. Despus de haber realizado la lectura de cada una de las muestras colocarlas en un contenedor etiquetado como R12.

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CUESTIONARIO. 1. En el caso de emplear una muestra biolgica indique cul es el objetivo de adicionar cido tartrico adems de ajustar el pH? 2. Una vez desarrollado el guin qu puntos del proceso y propiedades fisicoqumicas considera que son crticos para una eficiente extraccin de un xenobitico? 3. Reporte en la siguiente tabla los resultados que obtuvo en las pruebas de identificacin. Marque con una cruz si la reaccin fue positiva y un guin si fue negativa. Tabla 1. Resultados de las pruebas de identificacin Referencia Residuo escopolamina reconstituido de escopolamina Dragendorff Rf 4. Indique si su muestra contena cido barbitrico. Explique su respuesta. 5. Indique si su muestra contena escopolamina. Explique su respuesta. 6. Indique si su muestra contena cido 4-hidroxibenzoico y paracetamol. Explique su respuesta. 7. En la extraccin en medio cido cual es la finalidad de utilizar la solucin de NaHCO3 al 10%. 8. Cules son los puntos que considera crticos para la adecuada identificacin de los componentes en la muestra problema? Explique su respuesta. 9. Reporte en la siguiente tabla los valores de absorbancia obtenidos, e indique los valores de la regresin lineal. DilleKoppanyi Referencia Residuo barbitrico reconstituido de cido barbitrico

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Tabla 1. Absorbancias de la curva patrn Concentracin de cido barbitrico [mg/mL] 0.0 0.45 0.9 1.8 2.4 Pendiente (m) Ordenada al origen (b) Coeficiente de correlacin (r) 10. Interpole los valores de absorbancia en la curva y calcule la concentracin de cido Absorbancia

barbitrico en la muestra, indicando el procedimiento realizado para este clculo. 11. Calcule el porcentaje de recobro de cido barbitrico.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS. Clark E.E. Isolation and Identification of Drugs. Vol. I y II. Pharmaceutical Press, London, 1972. Bowman W.C. y Rand M.J. Farmacologa. Bases Bioqumicas y Patolgicas. (2 ed). Ed. Interamericana, Mxico, 1984. pp 42.2542.32. Blanke R.V. y Decker W.J. Analysis of Toxic substances. En Burtis C.A., Edward R.A. (Eds.) Textbook of clinical chemistry. Saunders, Philadelphia, 1986. pp 16701744. Benko A. (1985). Toxicological Analysis of Amobarbital and Glutethimide from Bone Tissue. Journal of Forensic Sciences 30, 708714, Cochin, J., Daly, J.W. (1963). The Use of Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Drugs. Isolation and Identification of Barbiturates and Nonbarbiturates Hypnotics from Urine, Blood and Tissues. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 139, 154159. Bruneton J. Alcaloides, Generalidades. En: Farmacognosia. Fitoquimica, Plantas Medicinales. Ed. Acribia, Zaragoza, Espaa, 2001, pp 775792. Aydn, A., Ercan ., Tacolu S. (2005). A novel method for the spectrophotometric determination of nitrite in water. Talanta 66, 11811186.
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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS. 1. Efectos txicos de la escopolamina y del cido barbitrico, cido 4-hidroxibenzoico y paracetamol. 2. Relacin del grado de disociacin de una sustancia con el pH del medio en el que se encuentra disuelto en funcin del valor de su pKa. 3. Valores de pKa de la escopolamina y el cido barbitrico, cido 4-hidroxibenzoico y paracetamol. 4. Forma ionizada y no ionizada de cada uno de ellos. 5. Solubilidad de una sustancia inica en medio acuoso y en un disolvente orgnico. 6. Densidad de los disolventes a emplear. 7. Fundamento de una extraccin mltiple y selectiva. 8. Sustancias que pueden precipitar protenas. 9. Especificar las especies qumicas que se encuentran en cada una de las fases obtenidas en los tratamientos cido y bsico 10. Objetivo de adicionar una solucin de NaOH 2.5 N en el proceso de extraccin cida. 11. Objetivo de adicionar una solucin de HCl 1N en el proceso de extraccin bsica. 12. Fundamento y esquema de la reaccin de Dragendorff. 13. Fundamento y esquema de la reaccin de Dille-Koppanyi. 14. Fundamento de la cromatografa en capa fina como herramienta de identificacin de sustancias qumicas utilizando luz UV, Yodo y reactivo de Dragendorff como agentes reveladores. 15. Reaccin involucrada en la cuantificacin de cido barbitrico. 16. Ley de Lambert y Beer

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APENDICE II: PREPARACION DE REACTIVOS Solucin de sulfato srico amoniacal en cido sulfrico. Pesar 12 g de sulfato srico amoniacal y adicionarlos lentamente y con agitacin constante sobre 350 g de hielo, posteriormente, adicionar 12.5 mL de H2SO4 concentrado manteniendo la agitacin. Una vez obtenida la solucin se filtra a travs de algodn. Guardar la solucin anterior en un frasco mbar. Reactivo de Dragendorff (Solucin reveladora) Solubilizar 2.6 g de carbonato de bismuto y 7.0 g de yoduro de sodio en 25 mL de cido actico glacial, calentar por 10 minutos a 40oC para solubilizar el reactivo. Dejar reposar por 12 horas y posteriormente filtrar la solucin. 20 mL del filtrado (solucin rojo-caf) se mezclan con 8 mL de acetato de etilo, la solucin anterior guardarla en un frasco mbar (la cual es estable por 6 meses). Reactivo A (Dille-Koppanyi) Solubilizar 1 g de acetato de cobalto tetrahidratado en 100 mL de metanol absoluto. Reactivo B (Dille-Koppanyi) Mezclar 5.0 mL de isopropilamina con 95 mL de metanol absoluto Solucin de hidrxido de sodio al 10% Disolver 10 g de NaOH en 100 mL de agua destilada. Solucin de cido clorhdrico 1 N Colocar 83 mL de HCl concentrado en un matraz aforado y adicionar agua destilada hasta 1 L.

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Solucin de cido tartrico al 10% Colocar 10 g en 100 mL de agua destilada. Solucin patrn de cido barbitrico 3 mg/mL Pesar 75.0 mg de cido barbitrico y transferir la pasada cuidadosamente a un matraz volumtrico de 25 mL, llevar al aforo con agua destilada. Solucin saturada de nitrito de sodio. (NaNO2) Pesar 82 g de NaNO2 y disolver en 100 mL de agua destilada. Solucin de cido actico 2 M. Medir 1.14 mL de cido actico glacial (densidad 1.049 g/mL) y agregarlos a 5 mL de agua, vaciar en un matraz volumtrico de 10 mL y aforar en seguida con agua destilada. APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS R1: Residuos de escopolamina en diclorometano. R2: Residuos de acetato de etilo. R3: Sulfato de sodio anhidro. R4: Mezcla CH2Cl2-MeOH (9:1) + 7 gotas de NH4OH R5: Mezcla MeOH-acetato de etilo-cido actico R6: Mezcla Diclorometano-MeOH-cido actico R7: Cromatoplacas R8: Reactivo de Dille-Koppanyi, cido barbitrico (fracciones A4 y B4), acetona y MeOH R9: Reactivo de Dragendorff, escopolamina (fracciones A3 y B3), CH2Cl2 y MeOH R10: Residuos de paracetamol. R11: cido 4-hidroxibenzico. R12: cido barbitrico, NaNO2, AcOH, acetona y MeOH

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