Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed.

Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.

Cuenta en placa de bacterias

OBJETIVOS Realizar adecuadamente la tcnica de cuenta en placa para diversos grupos microbianos de importancia en alimentos. Interpretar adecuadamente los resultados de la cuenta en placa y sus implicaciones en la calidad del alimento.

GENERALIDADES Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la tcnica comnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta tcnica no pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el medio de cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia de oxgeno, permiten seleccionar grupos de bacterias cuya presencia es importante en diferentes alimentos; por ejemplo, las bacterias mesoflicas aerobias, o mesfilos aerobios son un indicador general de la poblacin que pueden estar presente en una muestra y, por lo tanto, de la higiene con que ha sido manejado el producto. Este grupo en particular, se determina en la mayor parte de los alimentos, pero para algunos productos, tambin es importante determinar la presencia de bacterias termoflicas, psicroflicas y/o psicrotrficas para predecir la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento. La tcnica bsica es la misma, pero cambian las condiciones de incubacin, medios de cultivo y algunos otros detalles, que se mencionan en la tcnica. Si se modifican las condiciones de incubacin o se somete la muestra a algn tratamiento previo, el mtodo puede aplicarse tambin a la deteccin de otros grupos como anaerobios o esporulados, desde luego, con la adecuada seleccin de medios de cultivo. El mtodo permite numerosas fuentes de variacin, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de diversos factores por lo que es muy importante apegarse a la tcnica y controlar cuidadosamente las condiciones. FUNDAMENTO La tcnica se basa en contar las unidades formadoras de colonias o UFC presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio de cultivo de eleccin despus de un cierto tiempo de incubacin a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese microorganismo o microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC. Para que
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las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo; la tcnica para realizar este procedimiento se describe en Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlsis microbiolgico. NOTAS El medio de cultivo no debe fundirse ms de una vez, y debe mantenerse en bao de agua regulado a 45 C, durante el tiempo suficiente para que alcance esta temperatura, y hasta su utilizacin. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente, hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, con 90 mL de solucin amortiguadora de fosfatos o agua peptonada a. 4 a 6 tubos de ensayo de 16 x 150 con tapn de rosca, con 9 mL de solucin amortiguadora de fosfatos o agua peptonada a. 6 a 12 tubos de 22 x 175 con 20 mL c/u (o un matraz con 130 250 mL) de agar triptona-glucosa-extracto de levadura (agar para cuenta estndar) fundido y mantenido en bao de agua a 45 1.0 C (para tcnica de vertido en placa) a. 6 a 12 cajas de Petri con 20 mL c/u de agar tripotna-glucosa-extracto de levadura (agar cuenta estndar) estriles o el medio requerido en la tcnica a.

MATERIAL Y EQUIPO Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de 1.0C, provista con termmetro calibrado a. Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador b. Registrador mecnico o electrnico b Microscopio ptico b Bao de agua con termmetro, que mantenga la temperatura a 45 1.0 Ca Utensilios estriles (cuchillo, tenedor, cuchara, pinzas) para tomar muestra a Pipetas bacteriolgicas de 10 mL, estriles, con algodn en el extremo superior (las necesarias, de acuerdo con las diluciones) a. Pipetas bacteriolgicas de 1 mL, estriles, con algodn en el extremo superior (las necesarias, de acuerdo con las diluciones) a. Varillas de vidrio estriles (en escuadra o L) a. Pipetas Pasteur estriles a 8 a 12 cajas Petri estriles a
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Stomacher (homogeneizador peristltico) a Bolsas estriles para stomacher a

NOTAS
a b

Material necesario al inicio de la prctica Material necesario a las 24 y 48 horas de iniciada la prctica

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CUENTA EN PLACA DE BACTERIAS

Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 mL de 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

10-1
Pesar 10 g de muestra en condiciones de asepsia Homogenizar con 90.0 mL de solucion diluyente

10-2

10-3

10-4

Adicionar de 15 a 20 mL de agar triptona extracto de levadura fundido y enfriado a 45 C en

Depositar 1.0 mL de cada dilucin en cajas de Petri estriles por duplicado

Homogeneizar muestra y el mediante

la agar

Incubar las cajas en posicin invertida A 37 C por 24 a 48 h

Contar aquellas placas que tengan entre 25 a 250 colonias y reportar como UFC/g o mL de muestra
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PROCEDIMIENTO 1. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la tcnica de Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. 2. Tcnica de vertido en placa. 1. Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin y la adicin de medio de cultivo se puedan realizar cmoda y libremente. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de inocular. 2. Inocular por duplicado, 1 mL de la dilucin correspondiente en cada caja, mediante pipeta estril. Agregar de 18 a 20 mL del medio fundido y mantenido a 45 C. Para homogenizar, mezclar mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr la completa incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos. 3. Incluir una caja sin inculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad. 4. Incubar las cajas en posicin invertida durante el tiempo y a la temperatura que se requiera, segn el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, como se indica en el cuadro 1.

3. Tcnica de extensin superficial en placa. 1. Distribuir las cajas con el medio estril en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin se pueda realizar cmoda y libremente. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de inocular. 2. Inocular por duplicado, 0.1 mL de la dilucin correspondiente en cada caja, mediante pipeta estril. Para distribuir de manera homognea, extender el inculo utilizando una varilla de vidrio estril (en forma de escuadra o L) haciendo movimientos giratorios de manera perpendicular al medio de cultivo, hasta lograr la completa incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el inculo se absorba antes de incubar (se recomienda un tiempo de espera aproximado de 10 minutos). El tiempo transcurrido desde el momento en que la
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muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se inocula en el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos. 3. Incluir una caja sin inculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad. 4. Incubar las cajas en posicin invertida durante el tiempo y a la temperatura que se requiera, segn el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, como se indica a continuacin. CUADRO 1. Condiciones de incubacin para cuenta en placa de diferentes grupos Grupo Bacteriano Termoflicos Mesoflicos Psicrotrficos Psicroflicos Temperatura 55 2C 35 2C 20 2C 5 2C Tiempo de Incubacin 48 2 h 48 2 h de 3 a 5 das de 7 a 10 das

5. Despus de la incubacin, contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de mohos y levaduras; si se sospecha que es una colonia de este grupo de microorganismos, se recomienda confirmar por microscopa), incluyendo las colonias puntiformes. Si hay desarrollo extendido o un nmero de colonias superior al del rango de sensibilidad del mtodo, aplicar las reglas indicadas en RESULTADOS. Realizar microscopa para resolver los casos en los que no se puedan distinguir las colonias de las partculas pequeas de alimento. Utilizar el registrador para contar las colonias. RESULTADOS La seleccin de las cajas que se toman en cuenta para los clculos es muy importante para la confiabilidad de los resultados; a continuacin se especifican las reglas generales para seleccionarlas, pero conviene enfatizar que la seleccin de cajas obedece a criterios: lgicos (elegir las que estn en rango), estadsticos (considerar los duplicados y el mayor nmero posible de datos) y funcionales (a falta de datos representativos, tomar los mejores disponibles).

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Las reglas para seleccionar las cajas para los clculos son las siguientes: 1. Se consideran representativas las cajas que tienen un nmero de colonias dentro del rango de sensibilidad del mtodo, en este caso, entre 25 y 250 UFC. 2. Una vez seleccionadas las cajas y hechos los promedios correspondientes, se aplica el factor de dilucin, que es el inverso y se redondea el nmero a 2 cifras significativas (o dgitos) y potencias de 10. Cuando el tercer dgito del promedio es 4 o menor, se omite dejando el nmero de 2 cifras significativas . Por ejemplo, si en una caja se cuentan 312 UFC, se debe reportar como 31 X 101, porque el tercer dgito es 2 y se redondea al segundo dgito. Cuando el tercer dgito es 5 o superior, el segundo dgito se redondea al siguiente, por ejemplo si en una caja se cuantifican 199 UFC se reportar como 20 x 101 UFC, porque el tercer dgito es superior a 5. En el ejemplo 5 del cuadro 2, el promedio es de 237.5 en la dilucin 10-3, por lo que se reportar como 24 x 104 UFC. 3. Cuando las 2 placas de una dilucin contienen un nmero de colonias caractersticas dentro del rango de sensibilidad del mtodo, se promedian los nmeros y se multiplica por el inverso de la dilucin. 4. Cuando hay una placa con crecimiento extendido, no se consideran sta ni su duplicado. 5. Cuando una de las 2 placas de una dilucin es representativa y la otra no, se consideran ambas y se promedian. 6. Cuando hay placas representativas en 2 diluciones subsecuentes, se promedian cada una con su duplicado (aunque el duplicado no lo sea), se aplica el factor de dilucin a cada una y luego se promedia nuevamente. 7. Si en las placas no hay colonias (o no son caractersticas del grupo en estudio), reportar el resultado como: menos de un (grupo) en 10-x (la ms baja utilizada), por ejemplo < 100 / g si la dilucin ms baja fue 10-2 < 1 / mL si la muestra se sembr directamente, sin diluciones. Se agrega la leyenda: valor estimado. 8. Si no hay placas representativas pero hay alguna con un nmero menor de UFC., se consideran las de la menor dilucin y se agrega valor estimado. 9. Cuando el nmero de colonias por placa exceda de 250, contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribucin de colonias. Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del rea de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 2, respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri de 100 mm de dimetro contiene 65 cuadros de la cuadrcula del contador. Agregar la leyenda "valor estimado". 10. Se cuentan como una sola colonia: Cadenas o pequeos grupos no separadas claramente entre s, que parecen ser causadas por la desintegracin de un cmulo de bacterias y que estn separadas de otras colonias o cadenas.
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Colonias extendidas como pelcula entre el fondo de la caja y el agar y que se diferencian claramente de otras. Colonias como pelcula en las orillas de la caja, sobre la superficie del agar.

11. Se considera crecimiento extendido el que se presenta cuando las colonias abarcan ms del 50 % de la superficie de la caja, con o sin inhibicin de crecimiento; en ese caso, y/o cuando la inhibicin exceda el 25 % de la superficie de la caja, se considera que las placas no son representativas y por lo tanto no se toman en cuenta.

El Cuadro 2, ejemplifica la aplicacin de estos lineamientos; consultarlo para seleccionar las cajas a considerar en los clculos.

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CUADRO 2. Ejemplos para el clculo de resultados de cuenta en placa, utilizando ensayos por duplicado. (Rango de sensibilidad: 25 a 250 colonias) Serie Ejemplo duplic. 1 A B A Diluc iones 10-2 10-3 10-4 > 250 > 250 > 250 178 190 220 B A B A B A B A B A B A B > 250 18 14 > 250 > 250 > 250 > 250 0 0 > 250 > 250 > 250 > 250 138 2 0 > 250 > 250 240 235 0 0 240 268 216 262 28 0 0 512 495 34 Crecim extend. 0 0 24 19 23 42 16 17 25 Resultado UFC. / g o mL 18 x 104

Observaciones Si estn dentro del rango, se promedian los datos de la dilucin 10-3 (184 x 103 se redondea a 18 x 104) En este caso se promedian datos de diluc. 10-3 (= 179 x 103,pasa a 180 x 103 18 x 104). Por otra parte se promedia datos de dilucin 10-4 (= 27 x 104). Finalmente se promedian los resultados de ambas diluciones y se redondea el resultado final Se promedian datos de diluc. 10-2 ; aunque estn fuera de rango, son los ms cercanos. Se anota valor estimado Se toma la ms alta que se pueda contar, aunque sea en cuadrantes o cuadrcula y se anota valor estimado. Se ignora la dilucin 10-4 por el crecimiento extendido; se promedian los datos de 10-3, se redondea 237.5 a 240.

23 x 104

3 4 5

16 x 102 valor estimado 50 x 105 valor estimado 24 x 104

Se reporta como < 1 en la dilucin ms baja que se utiliz, en este caso 10-2. Se registra como sensibilidad del mtodo. 7 Se promedia el nico dato que est dentro del rango (240), con su duplicado, aunque ste salga del rango (268). 4 8 28 x 10 Se consideran las placas que estn dentro del rango y se promedian con sus duplicados, aunque stos salgan. Finalmente se promedian los resultados de ambas diluciones 4 9 A > 250 215 20 23 x 10 Se promedian datos de 10-3 , se promedian datos de 10-4 B > 250 235 26 se realizan los clculos como en el ejemplo 2 Las cifras sombreadas son las que se consideran adecuadas para realizar los clculos.
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< 100 valor estimado 25 x 104

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CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS Reportar como se indica a continuacin, con potencias de 10: dos cifras significativas y

Bacterias mesoflicas aerobias en placa en agar triptona extracto de levadura incubadas por ____ h. a _____ C: _______ UFC / g ( / mL) de muestra. Sustituir mesoflicas por termoflicas, psicroflicas psicrotrficas, segn corresponda, anotando el tiempo y la temperatura correspondientes. Si se analiz un alimento para el cual existe norma y existe especificacin sobre el grupo estudiado, incluir en el reporte si el alimento cumple o no con la norma. BIBLIOGRAFA Secretara de Salud. NOM-109-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Procedimiento para la Toma, Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. Norma Oficial Mexicana. Mxico. Secretara de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. Norma Oficial Mexicana. Mxico. Secretara de Salud. NOM-092-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo para la cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. Norma Oficial Mexicana. Mxico. Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. Swanson K.M., Petran R.L., Hanlin J.H. (2001) Culture Methods for Enumeration of Microorganisms. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 53-67. International Commission on Microbial Specifications of Foods (2005) Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

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